Imunohistohemija

Imunohistohemija (IHC) je istovremeno i nauka o istoimenoj oblasti i proces otkrivanja antigena (tj. proteina) u ćelijama, nakon disekcije tkiva koja korist princip vezanja antitijela, posebno za antigene u bioloških tkiva e. IHC je imenovana po korijenu "imuno", u odnosu na antitijela se koriste u postupku i "histo," što znači tkivo (u odnosu na imunocitohemiju. Postupak je koncipirao i prvi implementirao Albert Coons, 1941.

Imunohistohemijsko bojenje se naširoko koristi u dijagnostici abnormalnih ćelija, kao što su one koje se nalaze u kancerogenim tumorima. Specifični molekulski markeri su karakteristični za određene ćelijske aktivnosti, kao što su proliferacija ili smrt ćelija (apoptoza). Imunohistohemija se naširoko koristi u osnovnim istraživanjima da shvate distribuciju i lokalizaciju biomarkera i različito izraženih proteina u različitim dijelovima bioloških tkiva.

Vizualizacija interakcije antitijelo-antigen se može postići na nekoliko načina. Najčešći primjer je da se antitijela konjugiraju na enzim, kao što je peroksidaza, koji može katalizirati reakcije koje proizvode boju. Alternativno, antitijela mogu također biti označena fluoroforama, kao što su florescein ili rodamin.

Priprema uzorka

Priprema uzorka je ključna za ispoljavanje ćelijske morfologije, arhitekture tkiva i antigenosti ciljnih epitopa. To zahtijeva pravilno prikupljanju tkiva, fiksaciju i sekcioniranje. Za fiksiranje tkiva, često se koristi rastvor paraformaldehida, ali se mogu koristiti i druge supstance. Tkivo se onda može rezati ili koristiti cijelo, što ovisi o cilju eksperimenta ili samog tkiva. Prije sekcioniranja, uzorak tkiva može biti ugrađen u medij, kao što je parafinski vosak ili ledeni kriomedij. Sekcije mogu biti odsijecane raznim instrumentima, a najčešće su to mikrotom ili kriostat, a nareže se niz presjeka debljine 4-40 μm. Te kriške se onda montiraju na slajdovima i dehidriraju i peru, koristeći seriju rastućih koncentracija alkohola, kao naprimjer: 50%, 75%, 90%, 95%, 100%. Zatim se preparati očiste pomoću deterdženta kao šti je ksilen prije nego što je snimaju pod mikroskopom. Ovisno o načinu fiksiranja i čuvanja tkiva, uzorak može zahtijevati dodatne korake kako bi epitopi bili na raspolaganju za vezanje antitijela, uključujući otklanjanje parafina i pronalaženje antigena. Za formalinom fiksiranana parafinizirana tkiva, često je potrebno tragač antigenima, što i uključuje prethodno tretiranje preparata zagrijavanjem ili proteazama. Ovi koraci mogu napraviti razliku između stanja koje pokazuje da li su ciljni antigeni obojeni ili ne .

Ovisno o prirodi tkiva i metodu otkrivanja antigena, može biti biti potrebno da se, prije bojenja antitijela, blokiraju ili ugase endogeni biotin ili enzimi.

Iako antitijela pokazuju preferencijalni afinitet za specifične epitope, mogu se djelomično ili slabo vezati za mjesta na nespecifičnim proteinima (koja se naziva reaktivna mjesta) koji su slična i srodna mJesta vezanja ciljnog antigena. Veliki iznos nespecifičnih vezanja uzroka visokog obojenja će maskirati stvarno stanje i otežati otkrivanje ciljnog antigena. Da bi se smanjila boja pozadine IHC, primjenjuju se ICC i drugi imunobojeći metodi, tako da se uzorci se inkubiraju sa tamponom koji blokira reaktivne lokacije na koje se primarno ili sekundarno antitijela mogu drugačije vezati. Zajedničko blokiranja u Western blot postupku uključujde normalni serum, nemasno suho mlijeko, BSA ili želatin. Za postizanje veće efikasnosti, dostupni su komercijalne vlasničke formulacije. Metodi za otklanjanje pozadine bojenja uključuju razrjeđivanje primarnog ili sekundarnog antitijela, promjenom vremena ili temperature inkubacije i korištenjem drugačiji sistem za detekciju ili različita primarna antitijela. Kontrola kvaliteta treba, kao minimum, uključivati tkiva poznate ekspresije antigena kao pozitivnu kontrolu.Potrebno je i negativno kontrolno tkivo za koje je poznato da ne ispoljava antigen, kao i test tkivo koje ispitivno na isti način sa propuštanjem primarnog antitijela (ili bolje apsorpcija primarnog antitijela).

Također pogledajte

• Citohemija
• Hromogena in situ hibridizacija

Vanjski linkovi

• Ramos-Vara JA, Miller MA (2014). "When tissue antigens and antibodies get along: revisiting the technical aspects of immunohistochemistry--the red, brown, and blue technique". Veterinary Pathology. 51 (1): 42–87. doi:10.1177/0300985813505879. PMID 24129895.CS1 održavanje: upotreba parametra authors (link)
• Overview of Immunohistochemistry--describes all aspects of IHC including sample prep, staining and troubleshooting
• IHC Tip 1: Antigen retrieval - should I do PIER or HIER?
• Histochemical Staining Methods - University of Rochester Department of Pathology
• Immunohistochemistry Staining Protocol Arhivirano 15. 10. 2007. na Wayback Machine
• Burnett R, Guichard Y, Barale E (1997). "Immunohistochemistry for light microscopy in safety evaluation of therapeutic agents: an overview". Toxicology. 119 (1): 83–93. doi:10.1016/S0300-483X(96)03600-1. PMID 9129199.CS1 održavanje: upotreba parametra authors (link)
• Immunohistochemistry na US National Library of Medicine Medical Subject Headings (MeSH)
• Joyner, A.; Wall, N. (2008). "Immunohistochemistry of Whole-Mount Mouse Embryos". Cold Spring Harbor Protocols. 2008 (2): pdb.prot4820. doi:10.1101/pdb.prot4820.