Polimorfizam dužine restrikcijskih fragmenata
Polimorfizam dužine restrikcijskih fragmenata (Restriction Fragment Length Polymorphism: RFLP), u molekularnoj biologiji, predstavlja varijaciju u homolognim sekvencama DNK. Odnosi se na polimorfizam uzoraka homolognih DNK molekula iz različitih restrikcijskih lokacija, a koje se dobiju primjenom laboratorijske tehnike koja omogućuje njihovu identifikaciju.
U RFLP, DNK uzorak se pomoću restrikcijskih enzimaa, cijepa na komade, a samim tim restrikcijski fragmenti su u gel elektroforezi razdvojeni u skladu sa njihovim dužinama. Ovaj metod je već u velikoj mjeri zastario zbog uspona tehnologija jeftinog sekvenciranja DNK. RFLP je bila prva tehnika DNK profiliranja, dovoljno jeftina za širu primjenu. Bila je važan alat u mapiranju genoma, lokalizaciji gena kod genetskih poremećaja, te kod procjene rizika kod pojava nasljednih bolesti i testiranja roditeljstva.[1]
Metodi analize
uredi
Osnovna tehnika za otkrivanje RFLP uključuje fragmentiranje uzoraka DNK pomoću restrikcijskih enzima, koja može prepoznati i smanjiti DNK gdje god se javlja specifična kratka sekvenca parova baza, u procesu koji je poznat pod imenom restrikcijska digestija. Rezultirajući DNK fragmenti se zatim razdvajaju po dužini u procesu agarne gel elektroforeze i prebacivanja u membranu primjenom Southern blot postupka. Hibridizacija membrane se odvija obilježenim DNK sondama, a zatim određuje dužina fragmenata koje su komplementarne sondi. Jedan RFLP nastaje kada dužina otkrivenih fragmenata međusobno varira. Svaka dužina fragmenta se smatra alelom i može se koristiti u genetičkoj analizi.
RFLP može biti podijeljen u paradigme jedno- (SLP) i multi-lokusnih (MLP) sondi. Metoda SLP se obično više koristi u odnosu na MLP jer je osjetljivija, te daje bolje mogućnosti kod analiziranja mješovitih uzoraka DNK. Osim toga, podaci mogu dobiti čak i kada su primjerci DNK oštećeni (naprimjer, kada se nalazi u fosilnim ostacima kostiju).[1]
Primjeri
uredi
Postoje dva zajednička mehanizma po kojima mogu varirati veličine određenih restrikcijskih fragmenata. U prvom, mali segment genoma je otkriven DNK sondom (deblje linije). Kod alela A, genom je isječen restrikcijskim enzimima na tri lokacije, u neposrednoj blizini (trokuta), ali samo desni fragment će biti otkriven sondom. Kod alela a, restrikcijsko mjesto 2 se izgubilo nakon mutacije, tako da sonda sada otkriva veće fragmente idući sa mjesta 1 do 3. Drugi dijagram pokazuje kako ova varijacija veličine fragmenta izgleda na Southern blotu i kako će se svaki alel (dva po jedinki) možda biti naslijeđen kod ostalih članova neke porodice.
U trećem prikazu, sonde i restrikcijski enzimi su izabrani za otkrivanje područja genoma koji uključuje varijablu segmenta (varijabilni broj tandemskih ponavljanja (VNTR). Kod alela c postoji pet ponavljanja u VNTR, a sonda otkriva više fragmenata između dva mjesta restrikcije. U alelu "d" postoje samo dva ponavljanja u VNTR, tako da sonda otkriva kraći fragment između ista dva mjesta restrikcije. Ostali genetički procesi, kao što su insercije (umetanja), delecije (gubljenje, brisanje) translokacije (premještanja) i inverzije (obrtanja), mogu dovesti do pojave RFLP.
Za analizu RFLP uzima se mnogo veći uzorak DNK nego za kratka tandemska ponavljanja (STR).
Primjena
urediAnaliza varijacije RFLP u genomima bila je vitalno sredstvo u mapiranju genoma i analizi genetske bolesti. Da su istraživači pokušavali da na početku odrede hromozomsku lokaciju određenog gena bolesti, analizirali bi DNK članova porodice pogođene bolešću i tražili RFLP alele koji pokazuju sličan obrazac nasljeđivanja kao i onu kod bolesti (vidi Genetska povezanost). Jednom kada je gen za bolest lokaliziran, RFLP analiza druge porodice kako bi se moglo otkriti tko je bio izložen riziku od bolesti, ili koji od članova porodice je vjerovatno bio genetski nosilac mutantnih gena.
Analiza RFLP-a je također bila osnova za rane metode genetskog uzimanja otisaka prstiju, korisne u identifikaciji uzoraka sa mjesta zločina, u određivanju očinstva, te u karakterizaciji genetske raznolikosti ili uzgojnih obrazaca kod životinja.
Reference
uredi- ^ a b Marjanović D., Primorac D. (2009): Molekularna forenzična genetika. Institut za genetičko inženjerstvo i biotehnologiju (INGEB), Sarajevo, ISBN 978-9958-9344-6-9.