Izolace DNA

Izolace DNA je proces získání DNA ze zkoumaného vzorku pomocí kombinace fyzikálních a chemických metod. Získaná DNA slouží například pro forenzní biologii nebo rekombinantní DNA technologie. DNA byla poprvé izolována roku 1869 Friedrichem Miescherem,^[1] v současné době se jedná o rutinní techniku molekulární biologie.

Základní postup izolace DNA

Lýze buněk, která zajišťuje rozbití buněčné stěny a uvolní DNA. Používá se kombinace fyzikálních a chemických postupů. Důležitou roli hraje využití detergentů, které rozrušují membrány. V případě buněk s pevnými buněčnými stěnami musí dojít k enzymatickému nebo mechanickému rozrušení.
Enzymatické odstranění RNA pomocí RNáz, případně i rozštěpení proteinů proteázami.
Přečištění DNA od detergentů a ostatních složek lyzačního roztoku, proteinů, solí a dalších nečistot
- Srážení alkoholem, nejčastěji ethanolem nebo isopropanolem, ve kterých DNA není rozpustná a je možné izolovat centrifugací. Pro efektivní srážení se často zvyšuje iontová síla přidáním octanu sodného nebo jiné soli
- Fenol-chloroformová extrakce, při které se ke vzorku přidá fenol denaturující proteiny, které se vysráží na mezifázi vytvářené mezi fenolovou a vodnou fází. Zbytky fenolu jsou odstraněny přidáním chloroformu, který se pro svou vysokou hustotu snadno odděluje od vodné fáze. Pro izolaci DNA se využívá fenol v bazickém pufru, ve kterém RNA není stabilní.
- Izolace pomocí minikolony využívající schopnost DNA vázat se na sklo nebo křemelinu v přítomnosti chaotropních solí, kterou jsou schopny vytvářet vazby zároveň se záporně nabitým sklem i záporně nabitou DNA. Po promytí ethanolem obsahujícím chaotropní soli a odstranění nečistot může být DNA uvolněna vodou nebo vhodným pufrem
Po izolaci je DNA obvykle uchovávána v ultračisté vodě nebo ve vhodném pufru. Nejčastěji se používá slabě alkalický TE pufr, který obsahuje Tris udržující pH kolem 8 a EDTA chelatující dvoumocné kationty, které jsou nezbytné pro funkci DNáz a tak stabilizuje vzorek.

Zvláštní případy izolace DNA

Podle typu vzorku, ze kterého probíhá izolace DNA, a podle požadované čistoty získané DNA, musí být zvolena vhodná technika izolace. Typickými vzorky, které jsou obtížně zpracovatelné a musí být pro ně využívána specifická technika, jsou například

archeologické vzorky obsahující starou, částečně degradovadou DNA
vzorky obsahující inhibitory PCR, například humusové kyseliny z půdy, indigo používané k barvení džínů nebo hemoglobin z krve
vzorky z mikroorganismů s pevnou buněčnou stěnou, jako jsou houby, například kvasinky

Naopak při izolaci plazmidové DNA se využívá toho, že při lýzi buněk a následném sražení proteinů je chromozomální DNA zachycena mezi sraženými proteiny a jednoduchou centrifugací je možno odstranit většinu nečistot. Rozpustná frakce obsahující malé kruhové molekuly plasmidové DNA se následně oddělí a srážením se z ní izoluje DNA.

Odkazy

Literatura

VONDREJS, Vladimír; STORCHOVÁ, Zuzana. Genové inženýrství, I. Praha: Karolinum, 1997.

Související články

Externí odkazy

Obrázky, zvuky či videa k tématu izolace DNA na Wikimedia Commons

Reference

↑ DAHM, Ralf. Discovering DNA: Friedrich Miescher and the early years of nucleic acid research. Human Genetics. NaN-NaN-NaN, roč. 122, čís. 6, s. 565–581. DOI 10.1007/s00439-007-0433-0.

[1] DAHM, Ralf. Discovering DNA: Friedrich Miescher and the early years of nucleic acid research. Human Genetics. NaN-NaN-NaN, roč. 122, čís. 6, s. 565–581. DOI 10.1007/s00439-007-0433-0.

[1]