UNIVERSIDAD NACIONAL AGRARIA LA MOLINA

3ra PRCTICA Cultivos y siembras de los microorganismos

Curso: Microbiologa pesquera

Alumna: Marilli Milagros Sosa Sarmiento

Profesora: Nancy Martinez Ordinola

Grupo: F*

Mesa: 1

Fecha de ejecucin: 4 abril del 2011

Fecha de entrega: 12 abril del 2011

2011

INTRODUCCION Cultivar un microorganismo significa promover intencionalmente el desarrollo de ste en medios de cultivo y condiciones de laboratorio controladas. La poblacin de microorganismos desarrollada en un medio se denomina cultivo. En Microbiologa se entiende como siembra el proceso mediante el cual se lleva una porcin de una poblacin de microorganismos, denominada entonces inculo, de un cultivo crecido a un medio nutritivo para su crecimiento.

REVISION BIBLIOGRAFICA Para poder estudiar los microorganismos, se necesita como requisito previo poder cultivarlos en condiciones de laboratorio y, por tanto inicialmente deben ser aislados. Para ello, se dispone de muestras, que muchas veces suelen presentar los Siguientes problemas: -Que no existe la cantidad suficiente de microorganismos que se busca. -Que las muestras contengan varios tipos de microorganismos, pacte de los cuales son contaminantes, hacindose necesario su aislamiento inicial para obtener cultivos puros. SIEMBRA Procedimiento que consiste en inocular a los microorganismos en medios de cultivo adecuados para que se desarrollen y multipliquen, de acuerdo a sus exigencias vitales, para que en condiciones ptimas de temperatura y tiempo de inoculacin, puedan desarrollarse y multiplicarse IN VITRO. Se siembra con dos finalidades: a. Para hacer un aislamiento. b. Para hacer un transplante AISLAMIENTO Permite la separacin de los microorganismos al estado de pureza a partir de una muestra problema. Se requiere un medio slido con gran superficie para que los microorganismos al ser diseminados sobre el medio, generen su progenie (cepa) por formacin de colonias separadas. Si se aslan especies distintas, cada colonia tendr caractersticas especiales, la morfologa bacteriana ser tambin distintiva. TRANSPLANTE Significa la separacin previa de la cepa a un medio de cultivo apropiado en Tubo, que puede ser lquido o slido. Se conserva la cepa pura, y por subsiguientes transplantes en medios Especiales, se logra conocer las propiedades culturales y bioqumicas y como Resultado la identificacin especfica. Los trasplantes se pueden realizar: 1.De lquido a slido. 2. De lquido a lquido. 3. De slido a slido. 4. De slido a lquido. LOS CULTIVOS Cultivo puro Consta de una poblacin de clulas derivadas todas ellas de una clula Parental. Los microorganismos se cultivan en el laboratorio sobre materiales nutritivos denominados medios. Se dispone de una gran cantidad de medios y la clase que se debe de utilizar depende de muchos factores, uno de los cuales es la clase de microorganismos que se va a cultivar.

Una colonia es visible a simple vista. Cada colonia diferente es presumiblemente un cultivo puro de una sola clase de microorganismo. Cultivo impuro Son cultivos mixtos, es el que contiene dos o ms cepas de microorganismos.

METODOS DE SIEMBRA A. TRANSPLANTE, RESIEMBRA O REPIQUE Este mtodo se emplea cuando se tiene una cepa y se quiere mantenerla al estado activo, para lo cual se transfiere peridicamente a medios de cultivos nuevos.

SLIDO-SLIDO AGAR NUTRITIVO EN POSICIN VERTICAL (picadura profunda) Se suelen tomar con hilo de siembra aunque en algunas ocasiones tambin puede hacerse con asa de siembra. Consiste en introducir el asa en el medio de cultivo que se encuentra en el tubo hasta el fondo de esta y en posicin central. Esta tcnica se utiliza para la siembra de medios de cultivo semislidos Ej. Medio de oxidacin - fermentacin de Hugh-Leiffson.

AGAR NUTRITIVO EN POSICIN INCLINADA (estras) Se toma con asa de siembra previamente esterilizada por flameado una cantidad de muestra adecuada. Se aade al tubo desde el fondo de la superficie de sta realizando movimientos ascendentes en zig - zag hasta completar toda la superficie del medio. Este mtodo es utilizado para conservar cepas durante largos perodos, as como para la realizacin de ciertas pruebas bioqumicas como la prueba de ureasa.

AGAR SEMI INCLINADO (PICADURA Y ESTRIA) Consiste en la utilizacin de las dos tcnicas anteriormente descritas. Este mtodo se lleva a cabo cuando el medio es slido y est inclinado. Primero se realiza la siembra por picadura y posteriormente la siembra por estra ej. Prueba de medio KIA y la prueba en medio citrato entre otras

B.1. AISLAMIENTO AISLAMIENTO POR AGOTAMIENTO DE SUPERFICIE CON AGUJA DE KOLLE Con el asa de siembra (previamente esterilizado por flameado) se construye una cantidad adecuada de muestra problema depositando el inculo en uno de los extremos superiores de la placa, a partir de aqu se realizar movimientos en zig - zag de un extremo a otro de la placa no tomndose en ningn momento nuevos inculos y no levantndose el asa hasta concluir la siembra en toda la placa.

B.2. AISLAMIENTO POR DILUCION Se dispondr de un batera de tubos con medio de cultivo especfico o agua Estril segn los casos. Se adicionar una cantidad de muestra liquida o slida en los tubos sabiendo la cantidad de muestra o inculo que se aade en el tubo inicial. Se agitar hasta homogenizar. Con la pipeta estril se tomar una cantidad exacta y se adiciona al segundo tubo, que se homogenizar repetimos la operacin anterior con el tercer tubo y as sucesivamente hasta obtener la dilucin deseada. Con la dilucin obtenida por ej. l0-4 y 10-5 inocularen placas de cultivo una cantidad exacta y extender con el asa de Digrasky previamente estril. Incubar a temperatura ptima de 24 horas y posteriormente recontar. Existen muchas variaciones de este mtodo. Una de ellas es hacerlo en medio de cultivo agar, donde se mezcla en los tubos la muestra y se diluye hasta obtener la dilucin deseada; posteriormente son vertidos en placas y se le deja solidificar.

MATERIALES Y METODOS A. TRANSPLANTE, RESIEMBRA O REPIQUE Materiales o o o o o tubos con agar nutritivo en posicin vertical tubos con agar nutritivo en posicin inclinada tubos con agar TSI (Triple azcar hierro ) en posicin semiinclinada tubos con cultivos puros de m.o de 18 a 24 horas asa y aguja de kolle, esptulas drigalsky, plumn

Modo operatorio o o o o o o anotar el nombre de la cepa esterilizar la aguja o asa de kolle a la llama del mechero tomar con la mano izquierda el tubo que contiene la cepa, destaparlo con dedos meique flamear la boca del tubo introducir la aguja de kolle esterilizada en el tubo que contiene la cepa y proceder sacar el inoculo(porcin de cultivo que se requiere repicar), luego colocarle su tapon destapar el otro tubo de igual forma que el anterior e introducir el inoculo ,haciendo una picadura profunda en el agar en posicin vertical, por estras en agar inclinado, por suspensin en el medio liquido y por estras y picadura profunda en el agar semiinclinada

o o o

flamear la boca del tubo y taponar esterilizar la aguja o asa de kolle incubar la estufa 37CX 24 horas

B. CULTIVO POR AISLAMIENTO Este mtodo se emplea cuando se tiene una mezcla de m.o. que se quieren aislar o enumerar B.1. AISLAMIENTO POR AGOTAMIENTO DE SUPERFICIE CON AGUJA DE KOLLE Materiales o o o Placas con agar XLD (Agar Xilosa lisina desoxicolato) Cultivo impuro Asa de kolle

Modo operativo o o o o esterilizar un asa de siembra por flameado en la llama y enfriar introducirla en la suspensin bacteriana para recoger una muestra sembrar haciendo estras sobre la superficie de un medio slido en una placa Petri, y volver a esterilizar el asa, tocar en la zona de la placa ya sembrada y hacer un segundo grupo de estras en una regin nueva de la placa. Repetir el proceso una tercera y una cuarta vez, hasta conseguir que los grupos de clulas se diluyan y se separen clulas aisladas. Despus de la incubacin, se desarrollan colonias aisladas

B.2. AISLAMIENTO POR DILUCION B.2.1 POR EXTENSION DE SUPERFICIE Materiales o o o o Placas con PCA (plate count Agar) Tubos conteniendo diluciones hechas a partir de una muestra de pescado Pipetas serologicas estriles 1ml Esptulas drigalsky

Modo operativo o o Tomar 3 placas conteniendo en el medio PCA, sealar con las diluciones 10-1,10-2,10-3. Con una pipeta estril de 1ml , tomar 0.1ml de la dilucin 10-3 y colocarla en la placa correspondiente, con la misma pipeta tomar 0.1 ml de la dilucin 10-2 y colocarla en su placa Con la esptula de extensin esterilizada, extender el inoculo por toda la superficie, empezando por la mas diluida 10-3.

Incubar las placas 37CX 24 horas

B.2.2. POR DERRAME O VERTIDO EN PLACA Materiales o o o o Medio PCA Placas petri estriles Diluciones a partir del msculo de pescado Pipetas estriles

Modo operativo o o o o o o o Sealar 3 placas estriles, identificando las diluciones y las respectivas anotaciones Con una pipeta estril de 1ml,tomar 1ml de la dilucin 10-3 y dejar caer a la placa estril Con la misma pipeta, hacer lo mismo 10-2, 10-1 las diluciones Colocar 15ml de medio PCA, dentro de las placas, sobre el inoculo, mezclar bien mediante movimientos suaves. Esperar que solidifique el medio Colocar la estufa 37cX24 horas Las placas se incuban invertidas

RESULTADOS Y DISCUSION TRANSPLANTE, RESIEMBRA O REPIQUE a) En tubos sembrados por picadura profunda (agar posicin vertical) Se observo el tubo filiforme, el desarrollo limitado a la lnea de inoculacin, donde el asa de kolle inoculo, en esa parte se observo un leve crecimiento vertical casi escaso , color transparente

b) en tubos sembrados por estras ( agar posicin inclinado)

El crecimiento bacteriano se desarrollo moderadamente en la forma inclinada tipo hojuelas de turbidez y una forma mucosa Consistencia viscosa, pigmentacin transparente

c) caldo nutritivo Cambio de color desarrollo abundante de microorganismos En el fondo del tubo crecimiento bacteriano d) Agar semi inclinado Los cambios de color tanto en la vertical como la inclinada

AISLAMIENTO POR AGOTAMIENTO DE SUPERFICIE CON AGUJA DE KOLLE

Se observo los resultados para la siembra por tcnica de estra por agotamientono fueron los ms exactos; puesto que no se obtuvo la forma deseada indicando que pudo haber errores durante la realizacin de sta, sobre todo al esparcir los microorganismos en zic-zac. Se debi dejar una mayor distancia entre cada trazo para poder diferenciar o distinguir mejor la forma de cada colonia. Con los resultados obtenidos es casi imposible definir la forma de las colonias presentes. El color es rojo

AISLAMIENTO POR DILUCION Despus de 24 horas de haber hecho la siembra de los microorganismos por la tcnica de agotamiento a superficie, estras por sectores y de dilucin a profundidad, se observ el notorio crecimiento y la formacin de nuevas colonias indicando que la siembra de microorganismos se hizo correctamente y que el medio de cultivo era el apropiado, es decir, contaba con los nutrientes necesarios para el crecimiento de los microorganismos utilizados (cepa de bacilos y cepa roja). Si el medio de cultivo no hubiese sido rico nutricionalmente era muy posible que el crecimiento de los microorganismos se diera ms lento; con lo que no se habra podido apreciar la formacin de nuevas colonias en tal tiempo. POR EXTENSION DE SUPERFICIE

POR DERRAME

CONCLUSIONES Todos los microorganismos viven y se multiplican gracias a substratos nutritivos que se encuentran en el medio ambiente de forma natural. Nosotros podemos reproducir dichas condiciones en el laboratorio, a fin de observar la presencia, ausencia o comportamiento de determinados microorganismos. Este mtodo de anlisis se llama "medios de cultivo" y es en estos medios donde se "siembran bacterias" Aprend y desarrollamos las diferentes tcnicas y procesos en la siembra de los medios de cultivo as como nos pudimos percatar de que hay diferentes medios de cultivo y que cada uno tiene nutrientes especficos para cada tipo de de microorganismos. Hay diferentes formas de de inocular (sembrar) dependiendo la necesidad de las bacterias.

RECOMEDACIONES La principal advertencia consiste en trabajar siempre prximos a la llama del mechero que, debido a las corrientes de conveccin verticales que genera, es capaz de crear un ambiente estril en la zona inmediatamente alrededor y debajo de la llama. Todo este proceso hay que llevarlo a cabo con instrumentos y medios previamente esterilizados y siguiendo las instrucciones de los monitores de prcticas. Con estos talleres tambin comprendimos lo importante que es el cuidado que se debe tener cuando se esta trabajando en el laboratorio y la manera como se debe manipular los cultivos de microorganismos, tambin la asepsia que se debe tener en el laboratorio y con los instrumentos que se utilizan para que las cosas salgan bien y evitar las contaminaciones. Conocer los mtodos de siembra es importantsimo ya que cada uno de ellos nos muestra algo diferente.

BIBLIOGRAFIA Microbiologa. Pelczar / Reid / Chan. Cuarta Edicin. Editorial Mc Graw Hill. Mxico, 1993. http://www.scribd.com/doc/14173487/6-AISLAMIENTO-DE-MICROORGANISMOS http://www.slideshare.net/fer2895/cultivo-de-bacterias-hipotesis http://www.danival.org/notasmicro/medioscult/_madre_medios.html