PRUEBAS INMUNOLGICAS DE LABORATORIO

TEMA 20
Reacciones de Precipitacin
Las reacciones de precipitacin, son las mas simples de las reacciones antgeno/anticuerpo y
en ellas se visualiza un precipitado visible, cuando reacciona un (ag) soluble (precipitgeno) y su
(ac) correspondiente (precipitina). Los precipitgenos pueden ser cualquier sustancia antignica en
suspensin coloidal, como protenas sricas, toxinas, extractos de bacterias, parsitos, hongos, etc.
Mecanismo de Reaccin
Las reacciones de precipitacin y aglutinacin tienen un mismo mecanismo de reaccin, y su
diferencia depende de la naturaleza del Ag. En las reacciones de precipitacin el Ag adems de ser
soluble, debe ser multivalente (es decir, debe contar con varias copias del mismo determinante
antignico). Ello conlleva a la formacin gradual de un entrecruzamiento o red entre los Acs
divalentes y los determinantes antignicos de Ags adyacentes, que al alcanzar ciertas dimensiones,
el complejo formado precipita. La unin del precipitgeno y la precipitina ocurre rpidamente en
segundos, pero la formacin de los precipitados y por lo tanto, su visualizacin, puede demorar
desde minutos, horas y hasta das.
Modalidades de las Reacciones de Precipitacin
Las reacciones de precipitacin se pueden realizar en: 1- Medio lquido y 2semislido.

Medio

Medio Semislido: Inmunodifusin

Las reacciones de inmunodifusin, son tcnicas de precipitacin que utilizan el agar con
medio de soporte, en donde el Ag y/o el Ac van a difundir y en el sitio donde se encuentren en sus
proporciones ptimas, aparecer una linea, un anillo o un arco de precipitacin. Esta tcnica fue
introducida por Oudin en 1946, con su mtodo de difusin simple en un tubo.
Agar: polisacrido derivado de ciertas algas, que viene en forma granulada y se disuelve en agua
destilada o amortiguador (buffer) caliente. La solucin al alcanzar la temperatura ambiente queda en
estado semislido
La inmunodifusin se usa para el anlisis cualitativo, semicuantitativo y cuantitativo de
antgenos y anticuerpos en el suero y otros lquidos corporales. La interpretacin del anlisis es el
desarrollo de una reaccin de precipitacin (la formacin de un complejo antgeno- anticuerpo
insoluble a partir de un antgeno y anticuerpo soluble).
Inmunodifusin Doble de Ouchterlony: Es una de las tcnicas mas utilizadas para evaluar en
forma cualitativa o semicuantitativa la presencia de Ags o Acs en una muestra biolgica. Se
fundamenta en el principio de que el Ag y el Ac difunden a travs del agar formando lneas de
precipitacin que representan complejos inmunes, los cuales pueden analizarse visualmente. Esta
prueba permite relacionar varios Ags o Acs a travs de 3 tipos de patrones: patrn de identidad, de
no identidad y de identidad parcial.
Patrn de Identidad: Patrn caracterizado por la formacin de dos lneas de precipitacin que
confluyen en un punto y significa que en 2 muestras biolgicas existe la presencia del mismo
anticuerpo especfico para un determinado antgeno.
Patrn de No Identidad: Patrn caracterizado por la formacin de 2 lneas de precipitacin que se
cruzan por completo y significa que en una muestra biolgica existe la presencia de 2 anticuerpos
diferentes, especficos para 2 antgenos.

Patrn de Identidad Parcial: Patrn caracterizado por la formacin de 2 lneas de precipitacin que
no se suponen por completo, debido a que los antgenos comparten un determinante antignico
(Ags que reaccionan cruzadamente), con la consecuente formacin de un espoln, debido a que una
de las lneas de precipitacin se proyecta en el agar.
Utilidad Clnica de la Inmunodifusin de Ouchterlony

Posibilidad de hacer diagnstico y evaluar la evolucin de enfermedades infecciosas

producidas por bacterias, hongos, virus y parsitos.

Inmunodifusin Radial de Mancini: Se Fundamenta en el principio de que exista una relacin

cuantitativa entre la cantidad de Ag colocado en un pozo de una lmina de Agar-Ac y el dimetro del
anillo de precipitacin resultante.
Para ello, se aade Ac a un gel de agar, que a continuacin se vierte sobre un alamina de
vidrio y se deja solidificar. Cuando el agar ya esta slido, se excavan en el mismo unos, unos
pocillos y se aade a cada uno un volumen estandr del Ag problema a diferentes concentraciones.
Las placas se incuban durante un periodo mnimo de 24 horas, durante el cual el Ag se difunde
hacia el exterior de los pocillos y forma complejos con el A. Estos se siguen difundiendo hacia el
exterior, unindose cada vez mas a cantidad de Ac, hasta que se alcanza el punto de equivalencia y
los inmunocomplejos precipitan formando un anillo. La superficie que abarca el anillo, que es funcin
del cuadrado de su dimetro, es proporcional a la concentracin del Ag. La concentracin de la
muestra problema se determina mediante interpolacin a partir de una curva de calibracin. El
proceso tambin se puede llevar a la inversa, utilizando un gel con Ag para determinar
concentraciones desconocidas de Ac.
Utilidad Clinica de la Inmunodifusin Radial de Mancini

Determinacin cuantitativa de Igs: IgA, IgG e IgM

Determinacin cuantitativa de C3 Y C4(componentes del complemento)

Inmunoelectroforesis: este es un mtodo que combina el principio de la electroforesis zonal, es

decir, la separacin de las protenas presentes en una muestra biolgica, mediante la aplicacin de
un campo elctrico y la inmunodifusin doble. Una vez separadas las protenas de la muestra se
hacen reaccionar con Acs especficos y al difundir ambos elementos (Ag y Ac), se forman arcos de
precipitacin caractersticos. Por lo tanto, se puede obtener la identificacin y cuantificacin
aproximada de protenas individuales presentes en el suero, orina u otros lquidos biolgicos.
En esta tcnica, se cubre una portaobjetos con agar o agarosa fundidos en una solucin
amortiguadora alcalina. Una vez gelificado, se abre un pocillo para colocar la muestra bilogica y un
canal para los anticuerpos especficos. Colocada la muestra se procede a aplicar una diferencia de
potencial para que ocurra la separacin de las diferentes protenas de la muestra, durante 30 a 60
minutos. Entonces se colocan los anticuerpos en el canal y se permite que las protenas (Ags) y los
Acs difundan duante 18 24 horas.
En el caso particular en el que por ejemplo se sospeche de una mieloma productor de IgG,
se utiliza un suero control, en el cual la concentracin de IgG es normal y se realiza la corrida
electrofortica simultneamente con el suero problema. Luego se aade anti-IgG humana en el
canal y se espera a que ambos reactantes difundan libremente. El arco de precipitacin formado con
el suero del paciente se compara con el arco formado por el suero control.
Utilidad Clnica de la Inmunoelectroforesis

Diagnostico de Paraproteinemias (por ejemplo: Mieloma Multiple)

Identificacin de cantidades elevadas de protenas presentes en el liquido cefalorraqudeo,
en pacientes con diversas enfermedades neurolgicas.

Disminucin o ausencia de inmunoglobulinas en diversos trastornos de deficiencia

inmunitaria.

Hay reacciones de precipitacin anormales, llamadas de floculacin, en las que la

precipitacin se observa solamente en un intervalo muy estrecho de concentraciones relativas de
Ag y Ac; los agregados insolubles no se forman hasta que se ha aadido una cantidad relativamente
grande de Ag. Estas reacciones son producidas solamente por ciertos antisueros como por ejemplo:
antisueros de caballo contra la toxina diftrica y contra algunas toxinas estreptoccicas, algunos
antisueros humanos contra la tiroglobulina y anticuerpos no treponmicos humano contra la
cardiolipina del corazon de buey, utilizado en el diagnostico serolgico de sfilis, mediante la prueba
V.D.R.L.
Diagnstico serolgico de la sfilis (prueba de V.D.R.L)
La sfilis es una enfermedad de transmisin sexual de evolucin crnica, con periodos
asintomticos, cuyo agente etiolgico es Treponema pallidum. Esta enfermadad se caracteriza por la
presencia de una lesin primaria (denominada chancro), una erupcin secundaria que afecta la piel
y las membranas mucosas, largos perodos de latencia y lesiones tardas en la piel, los huesos, las
vsceras, los ojos, el sistema nervioso y el cardiovascular. Treponema pallidum es un patgeno
exclusivo del hombre, quien es su nico reservorio. Se adquiere por contacto directo
(fundamentalmente por contacto sexual) con una lesin de sfilis reciente, por va transplacentaria y
raras veces por transfusiones de sangre; penetra a travs de la mucosa sana o la piel erosionada y
rpidamente se disemina en el organismo, por lo que la infeccin es sistmica desde etapas
precoces.
Existen bsicamente dos estrategias que son utilizadas en la prctica para el diagnstico de
la enfermedad:
a) Examen directo
b) Las reacciones serolgicas.
El objetivo del examen directo consiste en demostrar la presencia de T. pallidum en los exudados
de las lesiones primarias (chancro) o en las serosidades de las lesiones secundarias cutneosmucosas. La finalidad de las reacciones serolgicas es demostrar la presencia de anticuerpos contra
Treponema pallidum o antgenos relacionados (ej. Cardiolipina) en muestras obtenidas del paciente
(ej. Suero, plasma y lquido cefalorraqudeo).
En la mayora de las ocasiones, existen dificultades o no es posible realizar el diagnstico
directo, por lo que el diagnstico indirecto o serolgico de la enfermedad se ha convertido en el
procedimiento mas frecuente. Los anticuerpos producidos como consecuencia de la infeccin por
Treponema pallidum, se clasifican operacionalmente en dos tipos: a) anticuerpos no treponmicos
(reciben tambin la denominacin de anticuerpos reaginicos o reginas sifilticas), los cuales
reaccionan con antgenos lipdicos (ej. Cardiolipina) y b) anticuerpos treponmicos que reaccionan
con Treponema pallidum o sus antgenos especficos.
Fundamento metodolgico de la prueba de V.D.R.L
Uno de los mtodos de laboratorio mas utilizados para establecer el diagnostico serolgico
de la sfilis es la pruba conocida como V.D.R.L. En la prueba en referencia, una suspensin de
cardiolipina(con lecitina y colesterol) en buffer salino es mezclado con el suero del paciente, se agita
en un rotador mecnico y luego de un perodo de incubacin adecuado (4 minutos) se observa
microscpicamente. Si el suero contiene anticuerpos reagnicos o anticuerpos no treponmicos se
observan flculis ( conglomerados) producto de la reaccin Ag-Ac. Esta prueba puede realizarse de
manera cualitativa y semicuantitativa
Lectura

Reporte

Se observa una suspensin homognea de partculas delgadas y

cortas, semejantes a agujas, sin la presencia de conglomerados
(grumos).
Se observa la presencia de numerosos conglomerados pequeos
repartidos entre partculas sueltas.
Se observa la presencia de conglomerados relativamente
voluminosos medianos y grandes sobre un fondo claro.

No
(NR)

Reactivo

Dbilmente
Reactivo (DR)
Reactivo (R)

Los procedimientos cualitativos nicamente permiten demostrar la presencia (muestra

reactiva) o ausencia (muestra no reactiva) de los anticuerpos no treponmicos en la muestra
analizada. Los procedimientos semicuantitativos (en el caso del V.D.R.L. se denomina V.D.R.L.
cuantitativo) permiten la obtencin de ttulos de anticuerpos que se correlacionan bastante bien con
el estado clnico del paciente, de manera que son usadas para evaluar la eficacia de los tratamientos
(el titulo de Acs no treponmicos tiende a disminuir con el tiempo en la medida que el paciente
mejora).
Si en la muestra de suero se detecta la presencia de anticuerpos reaginicos (V.D.R.L. cualitativo), se
realizara entonces la prueba semicuantitativa (V.D.R.L. cuantitativo), realizando diluciones seriadas
del suero. El titulo corresponder a la mayor dilucin del suero donde se produzca un resultado
reactivo. A continuacin se presentan dos ejemplos que muestran los resultados obtenidos despus
de realizado el V.D.R.L. cuantitativo y el reporte correspondiente, segn el caso o suero examinado.
El reporte mencionado le es enviado posteriormente al mdico que prescribi la prueba en
referencia.

Reacciones de Aglutinacin y Hemaglutinacin

Las pruebas de aglutinacin, son aquellas reacciones que se caracterizan por la formacin de
agregados visibles, cuando se mezclan antgenos (Ags) particulados o insolubles (aglutingenos)
con sus anticuerpos (Acs) especficos (aglutininas). Los aglutingenos mas frecuentes utilizados en
la reaccin son: bacterias, partculas inertes (de latex, poliestireno, bentonita, etc) sobre la cual se
han acoplado Ags solubles. Los agentes que actan como antgenos no necesariamente deben
estar vivos, porque reaccionan igual estando muertos.
En estas reacciones tambin se utilizan glbulos rojos, bien sea para detectar Ags propios de
su membrana (tipificacin ABO y factor Rh) o tambin para ser utilizados como reactivos en varias
pruebas de laboratorio. Cuando se utilizan como reactivos, previamente se absorben sobre su
superficie Ags solubles o Acs, se dice que los globulos rojos se han sensibilizado in vitro. Cuando se
utilizan globulos rojos, la reaccin se denomina hemaglutinacin y los Acs involucrados,
hemaglutininas.
1. Generalidades de las reacciones de Aglutinacin
Estas pruebas pueden detectar el Ag o el Ac en una muestra biolgica y se puede realizar en
forma cualitativa o semicuantitativa, no pudindose obtener resultados cuantitativos exactos. Sin
embargo, la facilidad con que se ejecutan y la capacidad que tienen para detectar pequeas
cantidades de Ag o Ac (alta sensibilidad) las hacen muy tiles en el inmunodiagnstico.
2. Mecanismo de la reaccin
La unin del aglutingeno y la aglutinina ocurre en segundos, pero la formacin de los agregados,
puede tardar desde minutos hasta horas o das. En estas reacciones el Ag o aglutingeno debe ser

multivalente. Esto conlleva la formacin gradual de un entrecruzamiento (una red) entre el Ac y los
determinantes antignicos, que al final de la reaccin da como resultado la formacin de grumos
visibles.
3. Utilidad Clnica de las reacciones de Aglutinacn:

Deteccin de aglutininas en el suero de pacientes con: salmonelosis, brucelosis,

leptospirosis, fiebres tficas, etc.
Determinacin del Factor Reumatoideo en la Artritis Reumatoidea.
Determinacin en suero de Protena C Reactiva (PCR) en procesos inflamatorios.
Determinacin en orina de Gonadotrofina Corinica Humana (GCH) (prueba de
embarazo).

4. Utilidad Clinica de las reacciones de Hemaglutinacin:

Tipificacin ABO y Factor Rh

Determinacin de Acs anti-Toxoplasma gondi y anti-tripanosoma cruzi.

Prueba de la Anti-Inmunoglobulina Humana (Prueba de Coombs)

Este es un mtodo ingenioso para detectar Acs incompletos o bloqueantes. Estos Acs
probablemente son molculas bivalentes que forman un enlace mongamo (a grupos antignicos de
repeticin de la superficie celular), por lo que no se produce la reaccin de aglutinacin. (Figura 6)
Otros autores explican esta observacin, basndose en el hecho de que en la superficie celular no
hay suficientes determinantes antignicos para que los Acs superen la repulsin electrosttica
normal que existen entre los Ags.(figura7)

Para la obtencin de la anti-inmunoglobulina humana o reactivo de Coombs puede utilizarse

diversos mtodos inmunoqumicos, uno de ellos es el denominado fraccionamiento Igs humanas.
Luego de esta fraccin se inyecta a una especie animal heterloga (conejo, carnero). El animal
empezara a producir Acs contra las Igs humanas (reactivo de coombs polivalente)

La prueba de Coombs tiene 2 modalidades:

Prueba de Coombs Directa: Detecta la presencia de Acs imcompletos sobre glbulos rojos
provenientes de individuos sensibilizados. El ejemplo clsico, es la deteccin de Acs anti-Rh
sobre los glbulos rojos de un recin nacido Rh positivo, cuya madre es Rh negativo.
Cuando una mujer es factor Rh negativo, que da embarazada y el hijo es factor Rh positivo,
entonces de acuerdo al estado funcional de la placenta o en el momento del parto los
eritrocitos fetales pueden pasar a la circulacin materna. Los glbulos rojos fetales son
antignicamente extraos a la madre y ella empieza a producir anticuerpos anti-Rh positivo.
Estos Acs son de la clase IgG y tienen capacidad de atravesar la placenta, por lo que
reacciones con factor Rh positivo de los glbulos rojos del feto, quedando recubiertos de
estos Acs. Estos glbulos rojos empiezan a ser lisados por el complemento o son destruidos
en el bazo y el feto empieza a sufrir de anemia. Cuando el nio nace y se sospecha de
anemia hemoltica del recin nacido, el mdico ordena Coombs directo para detectar los Acs
anti-Rh positivos sobre los glbulos rojos del recin nacido. Para ello se le extrae sangre al
recin nacido y sus glbulos rojos se hacen reaccionar con el Reactivo de Coombs.

Prueba de Coombs Indirecta: Detecta la presencia de Acs incompletos en el suero, mediante

una reaccin en 2 etapas, que comprende la incubacin de la muestra srica con glbulos
rojos con el objeto de sensibilizarlos y en una segunda etapa ocurre la aglutinacin de los
glbulos rojos sensibilizados por el reactivo de Coombs.
En la misma circunstancia del ejemplo anterior, es importante determinar el ttulo de Acs antiRh en la mujer embarazada. Para ello en una primera etapa se hacen reaccionar glbulos rojos
conocidos (Rh positivos) con el suero de la paciente. Luego de un periodo de incubacin, en una
segunda etapa se aade el reactivo de Coombs (anti-Ig) y si la mujer tiene Acs anti-Rh positivos
se observar la aglutinacin de los glbulos rojos.

Las pruebas de Coombs pueden usarse para detectar:

Detectar Acs incompletos sobre la membrana plasmtica del glbulo rojo en individuos
sensiblizados (coombs directo)
Anemias hemolticas inducidas por frmacos
Anemia hemoltica del recin nacido
Anemias hemolticas autoinmunitarias
Detectar Acs incompletos que se encuentran libres en el suero (coombs indirecto)

Pruebas de Inmunofluorescencia

Existen sustancias denominadas fluorocromos, que emiten una luz o radiacin lumnica
(fluorescencia) cuya longitud de onda se ubica dentro del espectro visible cuando se les hace incidir
otra luz de menor longitud de onda (mayor energa), como la luz ultravioleta. Entre estas se pueden
mencionar: Fluorescena, Rodamina y naranja de acridina. Estas sustancias tienen la propiedad de
que puedan acoplarse a molculas proteicas tales como los Acs formndose conjugados (Ac al que
se le ha acoplado un fluorocromo) que pueden ser utilizados para detectar Ags presentes en la
membrana celular, inmunocomplejos depositados en tejidos y Acs de una determinada especificidad
circulantes en lquidos orgnicos.
Con base a lo expuesto, el principio bsico en el que se fundamentan las pruebas de
inmunofluorescencia, es hacer reaccionar un Ac especfico conjugado a un fluorocromo con el Ag
correspondiente y la reaccin Ag-Ac. Cabe destacar, que en la apreciacin de estas reacciones se
usan equipos para permitir visualizar la fluorescencia emitida por el fluorocromo en forma cualitativa
(ej., microscopios de fluorescencia) o cuantitativa (ej., microfluormetros).
Los tipos de muestras que se pueden examinar mediante las pruebas de
inmunofluorescencia incluyen cortes o biopsias de tejido, alimentos envasados contaminados,
suspensiones celulares y lquidos orgnicos.
Existen varias modalidades de las pruebas de inmunofluorescencia, de estas las que se
realizan con mayor frecuencia figuran la inmunofluorescencia directa e indirecta.
En la inmunofluorescencia directa se utilizan Acs conjugados a fluorocromos especficos
contra bacterias, virus, hongos, y parsitos tambin anti inmunoglobulina humana conjugada a un
fluorocromo (ej., en casos de la deteccin de complejos inmunolgicos en diversos tejidos). El
objetivo de esta modalidad es demostrar la presencia del Ag correspondiente en la muestra que se
est examinando. Entre sus utilidades:

Deteccinn del virus de la rabia en cortes de tejido cerebral de animales

Deteccin de inmunocomplejos depositados en biopsias de rganos como piel o rin
Deteccin de gonococos en secreciones uretrales
Deteccin de Chlamydia trachomatis en frotis endocervical
Deteccin de Treponema pallidum en frotis de los exudados de las lesiones pimarias o en las
serosidades de las lesiones secundarias cutneomucosas de pacientes con sfilis.
Identificacin y contaje de clulas B y T en sangre perifrica humana

El objetivo de la inmunofluorescencia indirecta es la deteccin de Acs especficos contra un

determinado Ag presente en un lquido orgnico, para ello en una primera etapa del
procedimiento se hace reaccionar la muestra antignica con Acs especficos presentes en el
suero del paciente. En la segunda etapa se agrega anti-inmunoglobulina humana conjugada a un
fluorocromo. Si en la primera etapa se produce la reaccin Ag-Ac, se fijar el conjugado de antiinmunoglobulina humana y por tanto habr fluorescencia entre sus utilidades:

Deteccin de Acs antinucleares en pacientes con lupus eritematoso sistmico y de

otros autoanticuerpos en enfermedades autoinmunes.
Deteccin de Acs especficos que contribuyen al diagnstico serolgico de
enfermedades infecciosas como sfilis, rubeola, sarampin, toxoplasmosis,
tripanosomiasis (mal de chagas)

Radioinmunoanlisis
Estas pruebas se fundamentan en que son procedimientos en los cuales se utilizan Ags o
Acs marcados con un isotopo radiactivo con el objeto de estudiar Ags o Acs de una determinada
especificidad en muestras biolgicas. La reaccin Ag-Ac se evidencia en estas pruebas mediante la

emisin radiactiva por parte del isotopo que fue utilizado para el marcaje respectivo. La
radioactividad emitida puede ser medida por instrumentos adaptados para tal fin.
Es importante destacar, que estas pruebas tienen importantes limitaciones ya que el costo
de los equipos ya que el costo de los equipos y reactivos radioactivos es muy elevado, adems,
existen potenciales problemas de contaminacin ambiental por el tratamiento inadecuado de los
desechos y por otra parte riesgo de contaminacin para el personal de laboratotio. Estas limitaciones
y ante el advenimiento de pruebas muy sensibles y especficas que no presentan las desventajas
mencionadas (ej., ELISA), han limitado en la actualidad el uso de estos procedimientos.
El Radioinmunoanlisis ha sido utilizado en la determinacin de: hormonas, drogas,
frmacos, IgE total, IgE especfica contra un determinado alrgeno, Acs contra parsitos, bacterias y
virus, Ags bacterianos, virales y parasitarios.

Pruebas Imunoenzimticas (ELISA)

Estas pruebas se basan en la deteccin de complejos Ag-Ac mediante el empleo de enzimas
unidas al Ag o al Ac, los cuales actan sobre determinados sustratos para dar origen a productos
coloreados que pueden ser medidos espectrofotomtricamente. La intensidad del color ser
directamente proporcional a la cantidad de complejos Ag-Ac que se ha formado y por tanto
directamente proporcional a la concentracin del Ac o Ag investigado en la muestra analizada (ej.,
suero). Estas pruebas constituyen una de las herramientas actuales mas tiles en el laboratorio de
inmunodiagnstico debido a que las mismas presentan las siguientes ventajas:

Alta sensibilidad y especificidad

Son pruebas de gran aplicabilidad clnica
Son de fcil realizacin
Son pruebas cuyos resultados se obtienen en un tiempo relativamente corto
Son pruebas seguras ya que los reactivos empleados no presentan riesgos a la salud
Los reactivos empleados por lo general son bastantes estables.

Las pruebas de ELISA se pueden realizar de diversas formas o modalidades segn el

objetivo propuesto, entre estas modalidades figuran el mtodo indirecto y el mtodo de captura,
tambin denominado de doble Ac sndwich. Mediante la aplicacin del mtodo indirecto, es
posible detectar en muestras obtenidas de pacientes Acs de una determinada especificidad de
combinacin antignica, mientras que el desarrollo de la modalidad de captura o de doble Ac,
permite la deteccin de Ags diversos en la muestra analizada (ej., AgsHB son herramientas muy
tiles para establecer el diagnstico de diferentes enfermedades humanas.
Las aplicaciones de ELISA abarcan un espectro amplio de enfermedades infecciosas,
enfermedades autoinmunes, deteccin de marcadores tumorales, enfermedades endocrinas,
cuantificacin de drogas, medicamentos, hormonas, marcadores virales, etc. Aplicaciones
clnicas:
Deteccin de Acs diversos, entre los que figuran: anti-VIH, anti-citomegalovirus
humano (IgM/IgG) anti-virus del sarampin, antivirus de la hepatitis B los 2 tambin
con (IgM/IgG), anti-esperma, anti-ovario, autoanticuerpos de diferentes
especificidades.
Deteccin de Acs, tales como: Ags HB, hormonas tiroideas, hormonas de la
fertilidad, hormonas esteroideas, ferritina, interleuquinas, interferon gamma, factor de
necrosis tumoral, antgeno prosttico especfico
Dentro de las aplicaciones de estas pruebas inmunoenzimticas, figura la deteccin
serolgica de Acs de clase IgM especfica contra una gran variedad de antgenos
de diferentes microorganismos infecciosos (ej., IgM anti-toxoplasma gondii, IgM anti-

Tripanosoma cruzi, IgM anti-virus dengue). La presencia de Acs de clase IgM

antgeno especfica es indicativo que la infeccin ocurri recientemente. En casos de
los nios recin nacidos se correlaciona con infeccin congnita o que la infeccin
ocurri durante el nacimiento.

Western-Blot (Inmunotransferencia- Inmunoelectrotransferencia)

La prueba WB es una tcnica que incluye la transferencia de protenas desde un gel a una
membrana. Este procedimiento proporciona un medio muy especfico para identificar reactividad de
Acs en muestras biolgicas. Esta tcnica se puede realizar con la finalidad de detectar la presencia
de Acs contra una determinada protena antignica o identificar un determinado Ag. La prueba se
realiza en 3 etapas:
1- Separacin de los Ags mediante electroforesis en gel de dodecil sulfato sdico-poliacrilamida
(SDS-PAGE)
2- Transferencia de los Ags proteicos separados en la electroforesis inicial, desde el gel a una
matriz de soporte
3- Deteccin de los Acs especficos contra los Ags transferidos al papel de nitrocelulosa
identificacin de de los Ags transferidos a la matriz de soporte mencionada
Uno de los usos mas frecuentes de la WB es la confirmacin de las pruebas de deteccin
serolgica reactivas para Acs anti-VIH. En este caso, los Ags virales se separan mediante
electroforesis en gel de SDS-PAGE. El tratamiento del lisado viral con SDS imparte una carga
negativa a las protenas. Las protenas virales en seguida son objeto de electroforesis en un gel
de poliacrilamida. Como las protenas estn cargadas negativamente migrarn al polo positivo y
se separan en funcin de su peso molecular. Las protenas mas grandes tendrn una distancia
de migracin inferior a la exhibida por las protenas de menor peso molecular.
Para la deteccin de Acs contra los Ags del VIH, las protenas se transfieren del gel a la
matriz de soporte (papel de nitrocelulosa). Esta transferencia tiene como resultado una copia
exacta del patrn del gel en matriz. La tira de papel de nitrocelulosa donde se han transferido los
Ags virales se incuba con el suero del paciente. Cabe destacar, que tiras de papel de
nitrocelulosa similares se incuban simultneamente con sueros controles positivos y negativos.
Si el suero del paciente tiene Acs especficos contra los Ags del VIH, estos interaccionarn con
los Ags virales respectivos. Despus del lavado para eliminar todo aquello que no se haya
combinado, se procede a revelar la reaccin Ag-Ac.
Existen varios procedimientos de revelado, uno de los mas utilizados es agregar
antiinmunoglobulina humana conjugada a una enzima. El conjugado en referencia se combinar
con el Ac anti-VIH que esta interaccionando con el Ag fijado a la matriz de nitrocelulosa de un
determinado peso molecular. Seguidamente se agrega el sustrato de la enzima, el cual se
transformar en productos insolubles coloreados que precipitan en la zona de reaccin, dejando
una mancha coloreada visible al ojo humano. La presencia del precipitado coloreado es
indicativo que el suero del paciente tena Acs contra la protena antignica de VIH.
Cabe destacar, que el suero del paciente puede tener Acs especficos contra diferentes
protenas virales de diferentes pesos moleculares, por lo que mediante esta prueba pueden
detectarse la presencia de estos. Las reaccionas se reportan como positivas cuando una lnea
de precipitacin coloreada se forma en la zona del papel de nitrocelulosa donde estaba presente
el correspondiente Ag viral de un determinado peso molecular.
La prueba WB ha demostrado ser muy til en la identificacin de ags importantes en
microorganismos bacterianos, micticos, virales y parasitarios, adems tiene otras aplicaciones
clnicas aparte de ser utilizada como prueba confirmatoria de la infeccin por VIH:
Diagnstico de enfermedad gastrointestinal autoinmune
Diagnstico de enfermedad reumatoide autoinmune
Diagnstico de Vasculitis autoinmune

Unidad Hemoltica CH50 se define como la cantidad de suero necesario para realizar el 50 % de
hemlisis de una suspensin de eritrocitos de carnero, sensibilizados con anticuerpos anticarnero de
conejo (hemolisina).
Pruebas de Inmunohemlisis (Complemento Hemoltico Total CH50)
Principio de la Inmunohemlisis: Se refiere a la liberacin de hemoglobina por parte de eritrocitos,
luego que ste interacta con un Ac especfico para determinantes antignicos situados en su
superficie, debido a la participacin del sistema del complemento en el suero de un paciente. Las
clulas utilizadas son glbulos rojos de carnero o de conejo.
Anlisis Cuantitativo de la actividad hemoltica del complemento (Prueba del Complemento
Hemoltico Total CH50: Es una prueba funcional que refleja la actividad de los componentes de la va
clsica del complemento. Esta prueba resulta til para evaluar la integridad del sistema,
particularmente en casos de deficiencias genticas donde la ausencia de uno de los componentes
se refleja en ttulos bajos de Unidades Hemolticas CH50.
Principio: El anlisis cuantitativo de la actividad hemoltica del complemento, basado en la unidad
hemoltica CH50 depende de la capacidad de la va clsica del complemento para inducir la
hemlisis de eritrocitos de carnero sensibilizados con cantidades ptimas de anticuerpos
antieritrocito (hemolisina). Luego se aade el suero del paciente y finalmente se determina el grado
o porcentaje de hemlisis. La hemlisis ocasionada por los componentes de la va clsica del
complemento se mide de manera espectrofomtrica y puede relacionarse la cantidad de suero con
la cantidad de hemoglobina liberada.
Determinacin del ttulo en la Prueba de Complemento Hemoltico Total CH50: Para la realizacin de
la prueba, inicialmente se aade a una serie de tubos de ensayos cantidades variables y crecientes
del suero diluido 1/50 en estudio al sistema indicador (eritrocitos de carnero mas anticuerpos
antieritrocitos) Despus de un periodo de incubacin adecuado se determina la cantidad de
hemoglobina liberada con ayuda de un espectrofotmetro. Seguidamente se determina el porcentaje
de hemlisis obtenida en cada tubo. A continuacin se grafica en un papel milimetrado porcentaje de
hemlisis (ordenada) y el volumen de suero diluido 1/50 que se agreg a cada tubo (abscisa) lo que
permite calcular el volumen de suero diluido 1/50 necesario para causar la hemlisis del 50% de los
eritrocitos indicadores, el valor obtenido constituye la unidad hemoltica CH50. Finalmente se
determina el ttulo el cual es reportado al mdico que prescribi la prueba.

Pruebas de Neutralizacin
La neutralizacin o actividad neutralizante se refiere a la capacidad de un suero inmune
especfico (antisuero o acs especficos) de reducir o inhibir la actividad biolgica de un
microorganismo o de algn producto derivado del mismo. Esta propiedad de los Acs ha permitido
desarrollar un conjunto de tcnicas de laboratorio, las cuales se identifican de manera genrica con
el trmino de pruebas o reacciones de neutralizacin. Estas pruebas presentan varias
modalidades, las cuales estn directamente relacionadas con el tipo de microorganismo o producto
derivado del mismo, cuya actividad biolgica ha sido objeto de neutralizacin total o parcial por un
determinado Ac o antisuero especfico.
Modalidades de las pruebas de neutralizacin
La mayora de las pruebas de neutralizacin que tienen utilidad clnica se pueden agrupar en
3 modalidades:
Neutralizacin de toxinas (exotoxinas) y productos extracelulares secretados por bacterias.
Neutralizacin de enzimas
Neutralizacin Viral
Neutralizacin de Toxinas bacterianas y productos extracelulares secretados por bacterias
Algunos microorganismos bacterianos elaboran y secretan toxinas, enzimas y otros
productos (hemolisinas, leucocidinas, hialuronidasa, entre otros). Dichos productos contribuyen a la
patogenicidad, virulencia y poder invasivo de las bacterias. Muchos de estos productos son
inmunognicos, por lo que estimulan en el hospedador una respuesta inmune humoral especfica
contra los mismos. Un ejemplo de este tipo de prueba lo constituye la prueba de Antiestreptolisina
O la cual es til en el diagnstico de infecciones causadas por estreptococos beta hemolticos del
grupo A (bacterias patgenas al hombre) estos pueden ocasionar enfermedades, tales como
infecciones agudas (ej., faringitis estreptoccicas), erisipela (inflamacin de la piel), escarlatina
(erupcin eritemato-papulosa difusa) y procesos tardos, producto de complicaciones de infecciones
estreptoccicas no tratadas (ej., fiebre reumtica y glomerulonefritis aguda). Este grupo bacteriano
produce Estreptolisina O y la secretan a los tejidos infectados; esta es una hemolisina y ocasiona

la hemlisis de eritrocitos (ej., eritrocitos humanos, de carnero y de conejo). Los pacientes infectados
producen Acs Antiestreptolisina O que neutralizan la actividad hemoltica de la estreptolisina O.
Los Acs mencionados se encuentran presentes en casi todas las personas a ttulos bajos. Debido a
que estas infecciones son comunes, un ttulo alto o creciente es indicativo de infeccin reciente por
estos microorganismos.

El Fundamento metodolgico de la misma se resume de la siguiente manera:

Se colocan diluciones (crecientes) de un suero (paciente) en presencia de un volumen
constante de estreptolisina O
Se produce la reaccin Ag/Ac que neutraliza la actividad hemoltica de la estreptolisina O
La neutralizacin se evidencia por la inhibicin de la hemlisis al agregar un volumen
constante de una suspensin de eritrocitos (3,5%)
El ttulo de Antiestreptolisina O se calcula determinando la recproca (el inverso) de la
mxima dilucin del suero del paciente capaz de neutralizar totalmente a la Estreptolisina
O ( es decir, lamayor dilucin del suero donde no se observa hemlisis alguna)
El ttulo se expresa en unidades Todd/ml
Valores referenciales normales oscilan alrededor de 166 unidades Todd/ml.

Pruebas Drmicas de Hipersensibilidad Retardada

La prueba de piel de hipersensibilidad retardada es la tcnica mas antigua para evaluar la
inmunidad mediada por clulas. A pesar del desarrollo de multitud de procedimientos complejos para
la evaluacin de la inmunidad celular, las pruebas intradrmicas, relativamente simple, permanece
como un arma muy til y a menudo contribuye para establecer el diagnstico de diversas patologas.
La reaccin de hipersensibilidad retardada es una respuesta inmune adaptativa mediada por
clulas que se genera como consecuencia de la inyeccin intradrmica de un Ag a la cual la persona
se han sensibilizado previamente, es decir, la respuesta es inducida por los linfocitos T de memoria
inmunolgica que se generaron como producto de una respuesta previa contra el Ag que se
administra a nivel de piel.
Al nivel celular la inyeccin de un Ag causa una inflamacin detectable e infiltracin de
clulas mononucleares dentro de las primeras 16 horas. La reaccin se intensifica alcanzado su
mximo 48-72 horas despus de la inyeccin observndose en la superficie de la piel un rea
eritematosa y una induracin palpable, siendo esta ltima verdaderamente significativa y la que
determina si la prueba es positiva o negativa.
Estas pruebas detectan hipersensibilidad cutnea a un antgeno o grupos de antgenos. Sin
embargo, cuando se efectan pruebas para una enfermedad infecciosa, una respuesta positiva no
indica una infeccin activa con el microorganismo, sino ms bien exposicin previa al
microorganismo.
La incapacidad para reaccionar contra un conjunto de antgenos cutneos habitualmente
utilizados en este tipo de pruebas se denomina anergia o anergia cutnea, lo que sugiere que la
respuesta inmune celular del paciente est deteriorada. Los trastornos clnicos vinculados con este
estado anrgico se observan en una gran varieadad de afecciones tales como: inmunodeficiencias
congnitas, inmunodeficiencias adquiridas, enfermedades coexistentes, enfermedades infecciosas y
tratamientos farmacolgicos
Para el desarrollo de estas pruebas se utilizan antgenos de diversos microorganismos. Entre
los antgenos que con mayor frecuencia se utilizan en nuestro pas para realizar este tipo de prueba
drmica:
PPD
Tuberculina
Candidina
Extracto antignico del hongo candida albicans
Sk/SD
(estreptoquinasa/estreptodornasa) Enzimasproducidas porbacterias(estreptococos)

Trycophyton

Extracto antignico del hongo

La prueba se considera positiva si el promedio de los 2 dimetros perpendiculares de la

induracin resultan mayores o iguales a 5 mm por el contrario la prueba resultara negativa si el
dimetro de la induracin es inferior a 5 mm o si se observa slo eritema.

Utilidad: Las pruebas de hipersensibilidad retardada tambin son de gran valor en estudios
epidemiolgicos, ya que permite evidenciar infecciones previas ocasionadas por microorganismos
bacterianos, micticos y parasitarios, estos estudios epidemiolgicos son de utilidad para determinar
la prevalencia de la infeccin y/o la endenmicidad de un microorganismo en una determinada
poblacin. Entre los Ags utilizados en nuestro pas para realizar estos estudios epidemiolgicos
figuran: tuberculina, leishmanina, toxoplasmina, histoplasmina y paracoccidiodina.
Indice CD4/CD8
Se estima que del total de los linfocitos de sangre perifrica humana entre 70 y 75% son
linfocitos T, mientras que el 20% son clulas B y el resto de los linfocitos pueden considerarse
clulas nula o clulas NK. Asimismo, se ha sealado que en sangre perifrica y en la mayora de los
tejidos linfoides secundarios la proporcin de clulas CD4+ es de 65% mientras que la proporcin de
clulas CD8+ es de 35%. Muchos laboratorios expresan los resultados de contaje de clulas
cooperadoras/citotxicas, como un ndice o cociente (ndice CD4/CD8) cuyo valor de referencia
norma se ha establecido entre 1,5 y 2.

Pruebas de Transformacin Linfoblstica

Las pruebas de transformacin linfoblstica miden la capacidad funcional de los linfocitos de
proliferar luego de un estimulo inducido por un Ag o mitgeno y es por lo tanto una prueba de
inmunocompetencia. La activacin de linfocitos es una tcnica in vitro comnmente utilizada para
evaluar la inmunidad celular y es aplicable en los casos de pacientes con inmunodeficiencias
congnitas o adquiridas, autoinmunidad, enfermedades infecciosas, cncer, entre otras. Estas
pruebas permiten la exploracin invitro de la depresin invivo de la inmunidad mediada por clulas
en combinacin con otras pruebas de inmunidad celular y el seguimiento longitudinal del hospedador
inmunocomprometido.
Este procedimiento se refiere a una correlacin in vitro de un proceso que ocurre
normalmente in vivo cuando el Ag interacta con linfocitos especficamente sensibilizados en el
individuo. Asi, cuando los linfocitos aislados de sangre perifrica son cultivados in vitro en presencia
de mitogenos o antgenos stos proliferan en respuesta al estmulo; lo que se conoce como
blastognesis o transformacin blstica.
Cuando los linfocitos son estimulados ocurre una gran variedad de cambios morfolgicos y
bioqumicos que incluyen fenmenos tales como incremento en: la formacin de linfoblastos, sntesis
de protenas y sntesis de ADN. Este ltimo evento tardo es el que a la larga origina la divisin
celular y constituye la base de la mayor parte de los anlisis de relevancia clnica para la
transformacin de linfocitos. Es precisamente la sntesis de ADN lo que los inmunlogos utilizan
como indicador de activacin linfocitaria.
Los activadores policlonales mitgenos, son sustancias capaces de inducir la
proliferacin de linfocitos pertenecientes a mltiples clones, en otras palabras los mitgenos
estimulan en forma no especfica la linfoblastognesis de mltiples clones celulares sin la
sensibilizacin previa del individuo e independientemente de la especificidad de combinacin
antignica de su receptor de membrana.

En el caso de los activadores oligoclonales o antgenos utilizados en las pruebas de

transformacin linfoblstica, la blastognesis o activacin de los linfocitos depender de la
sensibilizacin previa que in vivo haya tenido el individuo con el antgeno en particular. Adems, la
respuesta ser producto de la activacin de un nmero restringido de clones de linfocitos
sensibilizados, es decir, solo se estimularn aquellos clones de linfocitos que posean en su
membrana receptores antignicos capaces de interactuar con los determinantes antignicos que
tenga el antgeno utilizado en la prueba, la misma es por lo tanto especfica. Entre los antgenos ms
utilizados en la prueba de transformacin linfoblstica en nuestro pas, figuran:PPD, extracto de
Candida albicans (candidina), toxoide tetnico y la estreptolisina O.
Utilidad Clnica
Los ensayos de transformacin linfoblstica proveen un medio prctico y adecuado para
determinar y controlar estados de inmunodeficiencia gentica y adquirida. Adems provee un
indicador sensible de funcin linfocitaria deprimida, asi como tambin los efectos de diversas
terapias inmunoestimulantes o inmunosupresoras. Se ha sugerido que el grado de deterioro de la
reactividad linfoctica en paciente con cncer y el mejoramiento de stas siguiente a la reseccin o
quimioterapia, se puede utilizar como indicadores del pronstico de estado inmunitario de estos
pacientes. Asimismo, provee una poderosa herramienta para detectar reacciones inmunitarias hacia
agentes patgenos, alrgenos y autoantgenos.