Pruebas bioqumicas

Mayte Perea Mrquez.

Cuarto de anlisis clnicos.

Materia: Bacteriologa.

Maestra: Dedreca Gough Miranda.

A 24 de Abril del 2013.

INTRODUCCIN
Los microorganismos a diferencia de las plantas no son capaces de crear materia orgnica a partir de elementos inorgnicos, por eso, han de nutrirse a expensa del medio en que se encuentren, y de ah que en el interior de estos ocurran una serie de reacciones de sntesis y de descomposicin de sustancias orgnicas, las cuales reciben el nombre de metabolismo. A partir de estas caractersticas metablicas se realizan pruebas obtenidas para la identificacin de microorganismos y productos obtenidos de la relacin microorganismo-medio. Otro de los aspectos importantes de la realizacin de estas pruebas, es que a partir de estas ayudan a dar una respuesta ante la posible contaminacin de los alimentos por medio de microorganismos patgenos. Las tcnicas de bioqumica han proporcionado una herramienta til para la deteccin directa de los microorganismos contaminantes. La identificacin bacteriana se puede realizar por medio de una serie de anlisis que necesitan de diferentes cultivos y procedimientos para llegar a identificar las especies bacterianas que contaminan. La identificacin bacteriana se realiza tras el estudio de las caractersticas tintoriales, morfolgicas y bioqumicas de los microorganismos. La identificacin bioqumica se basa en la habilidad de las bacterias de producir enzimas fcilmente detectables, en las caractersticas metablicas especficas de cada microrganismo.

Una identificacin bacteriana se puede realizar tras el estudio de las caractersticas tintoriales, morfolgicas y bioqumicas de los microorganismos. La identificacin bioqumica se fundamenta en las caractersticas metablicas especficas de cada microorganismo, en la deteccin de la actividad de ciertas enzimas, etc. Al igual que la mayor parte de los seres vivos, las bacterias son capaces de modificar el ambiente que las

rodea, captando sustancias necesarias para su multiplicacin y liberando al medio productos de desecho, enzimas, exotoxinas, etc. Las interacciones que cada tipo bacteriano establece con el entorno son propias y caractersticas. Esta especificidad depende del genotipo de la bacteria y se expresa en un determinado equipo enzimtico. Por ello, la caracterizacin de dichas enzimas es una herramienta til para identificacin y clasificacin bacteriana. Con este fin, existe en el mercado una gran variedad de medios de cultivo diseados no solo para permitir el crecimiento y la multiplicacin de los microorganismos, sino tambin para inhibir los de algunos (medios selectivos) o resaltar determinadas caractersticas metablicas (medios diferenciales). Las actividades enzimticas son ampliamente utilizadas para diferenciar a las bacterias. Incluso las bacterias estrechamente relacionadas pueden ser separadas en especies diferentes. Mediante el empleo de pruebas bioqumicas, por ejemplo para determinar su capacidad de fermentar un conjunto de hidratos de carbono seleccionados. La identificacin plena de los coliformes requiere a menudo una serie de pruebas bioqumicas. Dado que las bacterias pueden metabolizar (o fermentar) ciertos azucares con formacin de cidos, la turbidez (crecimiento) o el cambio de color del medio de alcalino a acido tiles para determinar cules son los azucares que utiliza un microorganismo concreto. La expresin de una enzima como la ureasa y la deteccin de productos terminales del metabolismo como indol (un producto de metabolismo del triptfano) son otras pruebas tiles

Kligler
Es un medio de cultivo utilizado para la identificacin de enterobacterias, en funcin de su capacidad para: Fermentar glucosa Fermentar lactosa Producir gas a partir de la fermentacin Producir hidrgeno sulfurado

Fundamento: Es un medio que contiene peptona de carne y triptena que suministran los nutrientes necesarios para el desarrollo de las bacterias. Tambin contiene lactosa y glucosa como carbohidratos fermentables. El rojo de fenol es el indicador de pH que vira el medio a color amarillo ante la produccin de cido (pH debajo de 6,8) producto de la fermentacin de la glucosa o la lactosa, en medios alcalinos (por encima de 8,2) se torna rojo. Tambin contiene tiosulfato de sodio como sustrato para la produccin de cido sulfhdrico; citrato de hierro y amonio como fuente de iones Fe3+. Estos ltimos de combinan con el cido sulfhdrico el cual se reduce a sulfuro de hidrgeno y al reaccionar con una sal de hierro se transforma en

sulfuro de hierro que se detecta por la formacin de coloracin negra en el tubo Procedimiento para la inoculacin Con el asa o la aguja bacteriolgica se toma una asada de la bacteria en estudio o una colonia y se pincha el agar hasta el fondo para posteriormente realizar una siembra en estriacin en el bisel Interpretacin de resultados: Kligler Alcalino/alcalino. Se observa rojo en el taco (no fermenta glucosa) y rojo en el bisel (no fermenta lactosa. Es un aerobio estricto. Ejemplo Pseudomonas aeruginosa Kligler Acido/alcalino: Se observa amarillo en el taco (fermenta la glucosa) y rojo en el bisel (no fermenta la lactosa. Es un anaerobio facultativo. Ejemplo: Salmonella typhi Kligler cido/Acido: amarillo en el taco (fermenta glucosa) y amarillo en el bisel (fermenta lactosa) Es un anaerobio facultativo. Ejemplo: Escherichia coli El caso de observar el fondo o taco de color rojo y el bisel amarillo no debe ocurrir puesto que indicara fermentacin de lactosa pero no de glucosa y al ser la lactosa un carbohidrato ms complejo que la glucosa una bacteria que lo fermente necesariamente debe fermentar la glucosa. De ocurrir sera un error de inoculacin (no se pinch el fondo del agar) Formacin de burbujas indica produccin de gas

Ennegrecimiento indica produccin de hidrgeno sulfurado

TSI Agar
Medio universalmente empleado para la diferenciacin de enterobacterias, en base a la fermentacin de glucosa, lactosa, sacarosa y a la produccin de cido sulfhdrico. Fundamento En el medio de cultivo, el extracto de carne y la pluripeptona, aportan los nutrientes adecuados para el desarrollo bacteriano. La lactosa, sacarosa y glucosa son los hidratos de carbono fermentables. El tiosulfato de sodio es el sustrato necesario para la produccin de cido sulfhdrico, el sulfato de hierro y amonio, es la fuente de iones Fe3+ , los cuales se combinan con el cido sulfhdrico y producen sulfuro de hierro, de color negro. El rojo de fenol es el indicador de pH, y el cloruro de sodio mantiene el balance osmtico. Por fermentacin de azcares, se producen cidos, que se detectan por medio del indicador rojo de fenol, el cual vira al color amarillo en medio cido. El tiosulfato de sodio se reduce a sulfuro de hidrgeno el que

reacciona luego con una sal de hierro proporcionando el tpico sulfuro de hierro de color negro. Frmula (en gramos por litro) Extracto de carne Pluripeptona Cloruro de sodio Lactosa Sacarosa Glucosa Sulfato de hierro y amonio Tiosulfato de sodio Rojo de fenol Agar pH final: 7.3 0.2 3.0 20.0 5.0 10.0 10.0 1.0 0.2 0.2 0.025 13.0 Suspender 62,5 g del polvo por litro de agua destilada. Mezclar bien y calentar con agitacin frecuente, hervir 1 o 2 minutos hasta disolucin total. Llenar hasta la tercera parte de los tubos de ensayo. Esterilizar a 121C por 15 minutos. Enfriar en pico de flauta profundo. Instrucciones

Siembra A partir de un cultivo puro, sembrar en TSI, picando el fondo y extendiendo sobre la superficie del medio. Incubacin A 35-37C durante 24 horas, en aerobiosis.

Resultados 1-Pico alcalino/fondo cido (pico rojo/fondo amarillo): el microorganismo solamente fermenta la glucosa. 2-Pico cido/fondo cido (pico amarillo/fondo amarillo): el microorganismo fermenta glucosa, lactosa y/o sacarosa. 3-Pico alcalino/fondo alcalino (pico rojo/fondo rojo): el microorganismo es no fermentador de azcares. 4-La presencia de burbujas, o ruptura del medio de cultivo, indica que el microorganismo produce gas. 5-El ennegrecimiento del medio indica que el microorganismo produce cido sulfhdrico. Microorganismo Pico/Fondo Produccin de gas Produccin de cido sulfhdrico + + -

E. coli ATCC 25922

A/A

K. pneumoniae ATCC A/A 700603 P. mirabilis ATCC 43071 K/A

S. typhimurium ATCC K/A 14028 S. enteritidis ATCC 13076 S. flexneri ATCC 12022 P. aeruginosa ATCC 27853 K/A

K/A

K/K

A: cido K: alcalino

FEA (fenil, etil, amina)

Esta prueba determina la capacidad de un organismo para desaminar el aminocido fenilalanina en cido fenilpirvico por su actividad enzimtica de fenilalanina desaminasa, con la consiguiente acidez resultante. Esta actividad enzimtica es caracterstica de todas las especies del gnero Proteus y del grupo Providencia por lo que se usa para separar ambos gneros de otras enterobacterias Se cultiva el microorganismo en agar fenilalanina sembrando la superficie del slant con abundante inculo e incubando durante 12-16 horas. Seguidamente se aade 0,2ml de una solucin de cloruro frrico al 10% de manera que inunde todo el crecimiento. La presencia de cido fenilpirvico (prueba positiva) se manifiesta por la aparicin de un color caracterstico verde oscuro o verde-azulado. Si permanece del color inicial amarillo (prueba negativa)

MIO (movilidad, Indol, ornitina)

Medio usado para la identificacin de Enterobacteriaceae en base a su movilidad, actividad de ornitina decarboxilasa y produccin de Indol.

Fundamento Medio de cultivo semislido, altamente nutritivo debido a la presencia de extracto de levadura, peptona y triptena. Adems, la triptena aporta grandes cantidades de triptfano, sustrato de la enzima triptofanasa, para la realizacin de la prueba del Indol. La dextrosa es el hidrato de carbono fermentable, la ornitina es el sustrato para la deteccin de la enzima ornitina decarboxilasa, el prpura de bromocresol es el indicador de pH,

que en medio alcalino es de color prpura y en medio cido es amarillo. Por su composicin, es posible detectar 3 reacciones en un mismo tubo: movilidad, presencia de ornitina decarboxilasa e indol. La movilidad se demuestra por un enturbiamiento del medio o por crecimiento que difunde ms all de la lnea de inoculacin. La reaccin positiva a la ornitina est dada por un color prpura del medio. Debido a la fermentacin de la glucosa se reduce el pH produciendo una condicin cida y originando que el indicador de pH prpura de bromocresol vire al amarillo. La presencia de acidez, otorga condiciones ptimas para la actividad de la enzima ornitina decarboxilasa, la cual decarboxila la ornitina presente. Por decarboxilacin, se alcaliniza el medio, con el consecuente viraje del indicador hacia el color prpura. El indol, es producido a partir del triptofano por los microorganismos que contienen la enzima triptofanasa. El desarrollo de un color rojo luego de agregar unas gotas de reactivo de Kovacs o de Erlich, indica un resultado positivo. Frmula (en gramos por litro) Dextrosa Extracto de levadura Peptona Triptena Clorhidrato de Lornitina Agar 1.0 3.0 10.0 10.0 5.0 2.0 Suspender 31 g del polvo en un litro de agua destilada. Calentar a ebullicin hasta completa disolucin. Distribuir en tubos y esterilizar 15 minutos a 121C. Instrucciones

Prpura de bromocresol 0.02 pH final: 6.5 0.2

Siembra A partir de un cultivo puro del microorganismo en estudio, inocular por puncin profunda con ansa recta.

Incubacin En aerobiosis, durante 18-24 horas a 35-37 C.

Resultados 1-Movilidad: -Resultado positivo: presencia de turbidez o crecimiento mas all de la lnea de siembra. -Resultado negativo: crecimiento solamente en la lnea de siembra. 2-Ornitina decarboxilasa: -Resultado positivo: color prpura. -Resultado negativo: color amarillo. A veces se puede desarrollar un color violceo en la superficie del medio.

3-Prueba del indol: La prueba de indol se realiza una vez que se ha determinado la movilidad y la prueba de ornitina. -Resultado positivo: color rojo al agregar el reactivo revelador. -Resultado negativo: el color del reactivo revelador permanece incoloroamarillento.

Microorganismo

Crecimiento Movilidad

Indol

Ornitina decarboxilasa + -

E. coli ATCC 25922 K. pneumoniae ATCC 700603 P. mirabilis ATCC 43071

Bueno Bueno

+ -

+ -

Bueno

Caractersticas del medio Medio preparado: prpura transparente a ligeramente opalescente.

Citrato
El citrato de sodio es una sal del cido ctrico, un compuesto orgnico simple que constituye uno de los metabolitos del ciclo de los cidos tricarboxilicos. Generalmente los microorganismos que emplean el citrato como nica fuente de carbono, utilizan sales de amonio como nica fuente

de nitrgeno. El metabolismo del citrato realizado, por algunas bacterias se realiza por el ciclo de Krebs y requiere el desdoblamiento del citrato por la enzima citritasa (citrato-oxalacetato-liasa o citrato desmolasa) en presencia de magnesio o manganeso y de transportadores como citrato permeasas. La citritasa acta sobre el citrato produciendo cido oxalacetico y acetato; productos que son convertidos enzimticamente a piruvato y dixido de carbono. Durante esta reaccin el medio comienza a alcalinizarse por el CO2 que se genera, el cual se combina con el agua y el sodio para formar Carbonato un producto alcalino, este carbonato da la alcalinidad que produce el cambio de color del indicador de pH del medio de verde a azul Prusia oscuro (indicador: azul de bromotimol, amarillo a pH< de 6.0 y azul a pH > de 7.6). El medio incluye citrato como nica fuente de carbono y fosfato de amonio como nica fuente de nitrgeno.

Inocular el tubo con agar citrato de Simmons realizando siembra por estra tomando una colonia del microorganismo en estudio. Incubar a 37 grados C por 24 horas. El desarrollo de un color azul intenso en 24-48 horas indica una prueba positiva y revela que el microorganismo en estudio ha sido capaz de utilizar el citrato en el medio con la formacin de productos alcalinos. La prueba tambin es positiva en ausencia de color azul si existe crecimiento del microorganismo a lo largo de la estra de inoculacin.

Citrato

Malonato
El malonato de sodio, es una sal orgnica que es utilizada por las bacterias como nica fuente de carbono con formaron de productos alcalinos que se evidencia por un viraje de verde a azul del indicador del medio, azul de Bromotimol. Si un microorganismo es capaz de utilizar el malonato de sodio como nica fuente de carbono, al mismo tiempo que utilizar el sulfato de amonio como fuente de nitrgeno, se produce un aumento de la alcalinidad que se debe a la formacin de Hidrxido de sodio (NaOH). Inocular 1-2 asadas del microorganismo en el Caldo Malonato, incubar a 37 C por 24 horas. El cambio de color de verde a azul indica una prueba positiva. Si permanece del mismo color es negativa.

Rojo de metilo
Para Determinar la capacidad de un microorganismo para producir y mantener estables los productos terminales cidos de la fermentacin de la glucosa y vencer la capacidad amortiguadora del sistema. La prueba Rojo de metilo es cuantitativa para la produccin de acido y requiere que los microorganismos produzcan cidos fuertes a partir de la glucosa, de forma que el medio del pH descienda a menos de 4.4. Esta distincin puede hacerse a travs del indicador Rojo de metilo que presenta color amarillo por encima de un pH de 5.1 y solo presenta color rojo cuando el pH desciende a 4.4. Utilizando rojo de metilo como indicador. Inocular en el caldo RMVP con una colonia del cultivo del microorganismo en estudio. Incubar 24-48 horas a 37 C. finalizado este periodo adicionar 5 gotas del revelador Rojo de metilo.

El desarrollo de un color rojo estable en la superficie del medio indica que la produccin de cido es suficiente como para bajar el pH a 4.4 y es una prueba positiva. Cuando ocurre la formacin de un color amarillo la prueba es negativa.

SIM (SULFURO-INDOL-MOTILIDAD)
El indol, es uno de los productos de la degradacin metablicas del amino cido triptofano. Las bacterias que producen la enzima triptofanasa son capaces de hidrolizar y desaminar el triptofano con produccin de Indol, cido pirvico y amoniaco. La prueba del indo est basada en la formacin de un complejo rojo cuando el Indol reacciona con el grupo aldehdo pdimetilaminobenzaldehido. Este es el principio activo del reactivo de Kovacs. Inocular al medio realizando siembra por picadura hasta la mitad del medio a partir del cultivo del microorganismo en estudio. Incubar 24 horas a 37 grados C. al finalizar este periodo aadir 5 gotas del reactivo de Kovacs por la pared del tubo.

El desarrollo de un color rojo-fucsia en la interfase del reactivo y de los medio segundos despus aadir el reactivo de Kovacs indica la presencia de indol y por lo tanto una prueba positiva.

LIA (LISINA-HIERRO)
Es un medio que sirve para demostrar la produccin de dos enzimas: la lisina descarboxilasa y la lisina desaminasa, adems la presencia de sales de hierro sirve para detectar la produccin de H2S por algunos microorganismos. La decarboxilacin de la lisina ocurre en ambiente anaerbico o sea en el fondo del tubo y se pone de manifiesto por la alcalinizacin del medio produciendo un viraje del indicador prpura de bromocresol. La presencia de glucosa en los componentes del LIA determina primero una reaccin de fermentacin, produciendo acidificacin y cambio de color del medio a amarillo y el pH favorable para la reaccin de decarboxilacin que ocurre despus, volviendo a su color violeta original la parte del fondo del tubo. La desaminacion de la lisina que se puede producir por los gneros Proteus y Providencia tiene lugar en la parte superior del tubo produciendo acido a cetocarbonico que al combinarse con la sal de hierro y en presencia de oxigeno forma un color violeta rojizo. La produccin de H2S se evidencia

por la presencia de un precipitado negro por utilizacin de las sales de hierro Inocular realizando siembra mixta con doble picadura a partir de una colonia del cultivo del microorganismo en estudio e incubar 24 horas a 37 grados C. A: Reaccin acida. Color amarillo K: Reaccin alcalina. Color violeta R: Reaccin alcalina: color rojo K/K: Descarboxilacion lisina K/A: Fermentacin glucosa. Descarboxilacion lisina R/A: Desaminacion lisina. Fermentacin glucosa

TSI (TRES AZUCARES-HIERRO)

Es una prueba usada para la fermentacin de la glucosa, lactosa y sacarosa y la produccin de H2S por parte de la bacteria sumndole produccin de gas. El cambio de color rojo-anaranjado (color inicial del medio) a amarillo indica fermentacin. Si se fermenta nicamente la glucosa el cambio de color del medio ocurre solamente en el fondo debido a que se encuentra 10 veces menos concentrada que la sacarosa y la lactosa, adems los radicales libres no son suficientes para hacer virar el medio. Si se fermentan los 3 azucares hay cambio de color tanto en la superficie como en el fondo. La presencia de burbujas que rompen el medio y a veces tienden a expulsarlo indica presencia de gas como producto final de la fermentacin. La produccin de H2S se manifiesta por la aparicin de un precipitado color negro debido a la reduccin de la sal de hierro presente en el medio. Inocular el medio realizando siembra mixta del microorganismo en estudio, incubar a 37 grados C por 24 horas. A: Reaccin acida. Color amarillo A/A: Fermentacin 3 azucares

K: Reaccin alcalina. Color roja naranja K/A: Fermentacin de la glucosa Burbujas: Produccin de gas Precipitado negro: Formacin H2S K/K: No hay fermentacin de los 3

VOGES PROSKAUER (VP)

Determinar la capacidad de algunas bacterias para generar un producto final neutro (acetoina y 2,3 Butanodiol) a partir de la fermentacin d ela glucosa. Los productos neutros formados en la presencia de oxigeno atmosfrico, alcalisis (Hidrxido de Potasio al 40%) y peptonas, se oxidan en diacetilo, reactante para el color producido en la reaccin. El Alfa naftol acta como catalizador para revelar un complejo color rojo. Solucin A: Alfa naftol al 5% en etanol absoluto Solucin B: Hidrxido de Potasio al 40% en agua destilada.

Inocular en RMVP con una colonia del cultivo del microorganismo en estudio. Incubar a 37 C por 24 horas. Al finalizar este periodo adicionar 6 gotas (0.6ml) de la solucin A y 2 gotas (0.2ml) de la solucin B. dejar en reposo durante 10-15 minutos.

Una prueba positiva est indicada por el desarrollo de un color rojo a los 15 minutos de aadido los reactivos reveladores por la presencia de acetoina. Una prueba negativa da un color cobrizo.

Medio OF (Oxidacin Fermentacin)

Fundamento: Determinan el metabolismo oxidativo o fermentativo de un hidrato de carbono o su falta de utilizacin. Se usa el medio O-F de Hugh y Leifson que contiene peptonas e hidratos de carbono en una relacin 1:5. Al ser menor la concentracin de peptonas, hay menor produccin de productos de oxidacin a partir de los AA que tienden a elevar el pH y pueden neutralizar los cidos dbiles producidos por los microorganismos no fermentadores. Procedimiento: Se utilizan 2 tubos con el medio O-F, se hace la siembra con ansa de punta hasta el fondo de los dos tubos. Uno de los tubos queda expuesto al aire, y el otro se cubre con vaselina estril.

Interpretacin:
Microorganismos oxidativo: producen cido solo en el tubo abierto, expuesto al O2 atmosfrico. Por lo que solamente el tubo expuesto al aire atmosfrico cambia su color original a amarillo. Microorganismos fermentadores: producen cido en los 2 tubos. O sea que los dos tubos viran del verde al amarillo. Bacterias sacarolticas: son inertes a este medio que conserva su pH alcalino despus de la incubacin, conservando su color original.

Rojo de Fenol
El Caldo Rojo de Fenol y Sacarosa es utilizado para la diferenciacin de cultivos puros, en base a su capacidad para fermentar la sacarosa. La capacidad de las bacterias de fermentar carbohidratos es utilizada como un criterio para su

Identificacin. El medio provee los requerimientos nutricionales para el crecimiento de los Microorganismos y contiene Rojo de Fenol como indicador de pH. Este indicador fue utilizado Por Vera obtenindose resultados altamente confiables. La peptona provee la fuente de nitrgeno para el buen desarrollo de los microorganismos, el Cloruro de Sodio mantiene el balance osmtico del medio y el Rojo de Fenol acta como Indicador, virando de color rojo-naranja a amarillo en presencia del cido producido por la fermentacin del azcar. Peptona de Casena 10.0 Cloruro de Sodio 5.0 Sacarosa 5.0 Rojo de Fenol 0.018 pH final 7.4 0.2 Mtodo: Suspender 20 g del medio en un litro de agua purificada. Calentar con agitacin suave hasta su completa disolucin. Dispensar en tubos (con campana de Durham si se requiere), tapar y esterilizar en autoclave a 116-118C durante 15 minutos. No sobrecalentar. Procedimiento:

1. Inocular el medio con una gota de una suspensin hecha con un cultivo puro. 2. Incubar a 35 2C durante 4-18 horas con las tapas flojas. 3. Examinar los tubos para evaluar crecimiento, produccin de cido y produccin de gas. La presencia de un color amarillo indica la una reaccin positiva para la fermentacin de la Sacarosa. La presencia de una o ms burbujas en la campana de Durham indica una reaccin positiva para la produccin de gas.