Test Ames

ESCUELA ACADEMICO PROFESIONAL DE MICROBILOGA Y
PARASITOLOGA
FISIOLOGA Y GENTICA MICROBIANA

TES DE AMES
DOCENTES:
MERCADO MARTINEZ, PEDRO

LLENQUE DIAZ, LUIS ALBERTO
ALVARADO IBAEZ, JUAN CARLOS
MUOZ RIOS, MIGUEL ANGEL
INTEGRANTES:
BARRANZUELA MENDOCILLA ALICE
GUTIERREZ ARAUJO MAYRA
RODRGUEZ IBAEZ MILAGROS
CICLO: VIII
TRUJILLO PER
2013
TES DE AMES
I.
INTRODUCCIN:
Las variaciones fenotpicas producidas por las mutaciones nosilenciosas son transmitidas a la descendencia. Es decir, una vez
producido el cambio, este es permanente, pero no necesariamente
irreversible ( solamente las grandes delecciones son irreversibles).
La revesibilidad de las mutaciones suele deberse a una segunda
mutacin supresora que restaura el fenotipo original. La 2da mutacin
suprime los efectos de la 1ra, pero no restaura el genotipo original. Por
lo tanto, tras la mutacin supresora, la clula queda con dos
mutaciones.
La supresin se clasifica a su vez en:
a) Supresin indirecta: No se corrige el producto del primer gen,
pero la 2da mutacin anula las consecuencias fenotpicas.
Ejemplos:
Se abre una nueva va para la sntesis del producto
afectado por la 1ra mutacin.
El producto mutado de la 2da mutacin puede sustituir al
producto de la primera.
Se provoca un cambio en el medio intracelular, que hace
que el producto alterado de la primera mutacin vuelve a
ser funcional.
b) Supresin directa: la 2da corrige el producto del primer gen
mutado. Puede ser de dos tipos principales:
Supresin intragnica: La 2da mutacin ocurre en el
mismo gen donde ocurri la primera. Se abre una nueva
va para la sntesis del producto afectado por la 1ra
mutacin.
Supresion intergnica (=extragenica): La mutacin
supresora afecta a otro gen, que suele ser uno de los
genes implicados en la maquinaria de traduccin del
ARNm: ARNt y protenas ribosmicas.
Habitualmente la genotoxicidad o riesgo potencial de las mezclas
complejas se determina mediante bioensayos, pero sin duda el test de
Ames es el ms empleado, se basa precisamente en ver si las
sustancias son mutgenos frente a bacterias (es decir se comprueba si
tras el tratamiento de un cultivo bacteriano con la sustancia en cuestin,
aumenta la tasa de aparicin de mutantes.
Se ha estudiado la mutagenicidad de algunas sustancias qumicas

empleando la prueba de Ames. Las bacterias empleadas son cepas
auxotrficas de Salmonella typhhimurium poseedoras de un gen
mutante que las hace incapaces de producir histidina en un medio
apropiado. Este efecto puede ser revertido con una mutacin causada
por el agente a estudiar, el cual hace que el gen recupere su funcin y
permita la proliferacin de colonias en un medio carente de histidina.
Las cepas de Salmonella typhirium comnmente empleadas para este
modelo son la TA97A, TA98, TA100, TA102 y TA1535. Esta prueba
tambin emplea extracto de hgado de roedores que contienes enzimas
capaces de metabolizar el potencial carcingeno, causando
alteraciones en el ADN, o mutaciones.
La mayora de los mutgenos a los que las poblaciones estn
expuestas son componentes de mezclas complejas de sustancias las
cuales llegan al hgado que el principal lugar de depuracin de
sustancias qumicas as como exgenas como los frmacos. El papel
central del hgado en la depuracin y transformacin de sustancias
qumicas hace que sea un rgano muy susceptible a intoxicaciones, El
metabolismo de los frmacos suele ser dividida en dos fases. La fase 1
incluye un conjunto de reacciones qumicas que preparan a la droga
para entrar a la fase 2. Estas reacciones incluyen reduccin-oxidacin,
hidrlisis, hidratacin y muchas otras menos frecuentes. Estos procesos
aumentan la solubilidad de la droga en el agua y puede generar
metabolitos que son qumicamente activos y potencialmente txicos.
Mientras que en la fase 2, la mayora de las reacciones qumicas
ocurren en el citoplasma e incluyen principalmente la conjugacin con
compuestos endgenos por medio de enzimas transferasas. Al final de
la fase 2, aquellos productos de la fase 1 que sean qumicamente
activos se vuelven relativamente inertes y disponibles para su fcil
eliminacin del cuerpo.
MUTACIN INDUCIDA: Son aqullas provocadas por factores externos
(mutgenos) que pueden ser producidas por agentes qumicos como el

uretano. Los agentes qumicos como el uretano causan anlogos de
bases que son sustancias con una estructura en anillo similar a las
bases naturales de los cidos nucleicos, pero con propiedades
qumicas diferentes, propiciando as transiciones (Una transicin viene
dada por la sustitucin de una base prica por otra base prica (A
G), o una base pirimidnica por otra base pirimidnica (C T)).
II.
OBJETIVO:
Comprobar si el uretano al 1% y la ua de gato al 100% se comportan

como sustancias mutagnicas frente a cultivos de E. coli protrotrfica y
mutante his -
III.
MATERIALES:
MATERIAL BIOLGICO:
-
Cultivo de E. coli auxotrfico

Cultivo de E. coli protrotrfico
Hgado de Mus musculus
Uretano al 1% y ua de gato al 100%.
Solucin Salina Fisiolgica Estril (SSFE)
MATERIAL DE VIDRIO, EQUIPOS DE LABORATORIO Y REACTIVOS:

-
Placas Petri
Morteros
Tubo Nefelmetro de Mac Farland N1
Pipetas
Hisopos
Micropipeta
Estuche de diseccin
Gasa
Frascos de 50 ml
MEDIOS DE CULTIVO:
-
Agar Mnimo de Davies

Agar Nutritivo
IV.
PROCEDIMIENTO:
PREPARACIN Y OBTENCIN DE LA SOLUCIN PROBLEMA:
Tener dos especmenes de Mus musculus y extraer el hgado.
Cada hgado ser colocado en un mortero diferente con 5ml de

solucin salina fisiolgica estril para triturarlo.
A un mortero agregar 5 ml de Uretano al 1% e Incubar por 2

horas, al cual llamaremos Solucin problema N 1.
Al otro mortero agregar y 1 ml de ua de gato al 100% e Incubar

por 2 horas, al cual llamaremos Solucin problema N 2.
Pasado el tiempo de incubacin filtrar con una gasa cada una de

las soluciones en diferentes frascos estriles correspondientes.
Rotular dichos frascos.
PREPARACIN Y OBTENCIN DE LA SUSPENSIN:
Realizar una suspensin del cultivo de Escherichia coli

prototrfico en SSF, equivalente al tubo N 1 del Nefelmetro de
Mac Farland.
De igual manera realizar otra suspensin, pero esta vez con

Escherichia coli auxotrfico.
Tomar 0.1 ml de cada suspensin y realizar una siembra por

superficie en dos placas diferentes de Agar Mnimo de Davies.
Esperar de 2 a 3 min que sequen las placas y realizar en cada

una de ellas 5 hoyitos equidistantes uno de otro. Tener en cuenta
que uno de los hoyitos ira al centro para que nos sirva como
control.
Teniendo las dos placas de AMD sembradas con sus respectivas

bacterias, realizar lo siguiente a ambas: Agregar en el hoyito
central 50ul de solucin salina fisiolgica estril, a dos hoyos
agregar la solucin problema N 1 (a uno agregar 10ul y al otro

50ul), a los dos hoyos restantes agregar la solucin problema N
2 (a uno agregar 10ul y al otro 50ul).
V.
Incubar las placas a 37C por 24 horas y luego realizar la lectura.
Nota: Realizar lo mismo en Agar nutritivo, para que nos sirva

como controles
RESULTADOS:
Para E.coli prototrfico
Ilustracin 1: Placa de AMD sembrada con E. coli prototrfico
Halo de inhibicin
Ilustracin 2: Hoyo con 50ul de Uretano.

Observacin de halo de inhibicin
Para E.coli auxotrfico
Ilustracin 3: Placa de AMD sembrada con E. coli auxotrfico
Halo de crecimiento
Ilustracin 4: Hoyo con 50ul de Uretano.

Observacin de halo de crecimiento
VI.
DISCUSIN:
En los resultados se observ crecimiento del cultivo auxotrfico

como del cultivo prototrfico en sus respectivas placas con agar
nutritivo, esto se debe a que ambos cultivos crecen en medios
enriquecidos es por eso que se us como control.
En el caso de las placas con agar mnimo de Davies, en la placa

que contena el cultivo auxotrfico no tena que observarse
ningn crecimiento, ya que este cultivo no puede crecer en un
medio mnimo de nutrientes, por lo tanto si estuviramos ante una
sustancia mutgena tendra que observarse lo contrario. En los
resultados no se observ crecimiento alrededor de los hoyos a
excepcin del hoyo con 50 ul de uretano al 100% en donde si
hubo crecimiento esto se evidencio por el crecimiento en el halo
de difusin de la solucin con uretano. Mientras que en la placa
con agar mnimo de Davies que contena el cultivo prototrfico si
tena que observarse crecimiento ya que este cultivo tiene la
capacidad de crecer en medios mnimos de nutrientes por lo tanto
si estuviramos ante una sustancia mutgena tendra que
suceder lo contrario. en los resultados se observ que hubo

crecimiento en toda la placa menos en el halo de difusin que se
form alrededor del hoyo que contena el uretano 50 ul.
VII.
VIII.
CONCLUSION:
El uretano al 1% si se comporta como una sustancia mutgena

frente a cultivos de E. coli protrotrfica y mutante his .
La ua de gato al al 100% no se comportan como sustancias

mutagnicas frente a cultivos de E. coli protrotrfica y mutante
his-.
REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS:
1. Brooks, G. y col. MICROBIOLOGIA MEDICA DE JAWETZ,
MELNICK Y ADELBERG.16ava.ed.Edit. El manual moderno.
Mxico D.F. Mxico.1999.
2. Claxton L.R.,Houk V.S. and Hughes T.J. GENOTOXIXITY OF
INDUSTRIAL WASTES AND EFFUENTS. Mutation Res.
410:237-243.1998.
3. Houk V.S.THE GENOTOXICITY OF INDUSTRIAL WASTES AND
EFLUENTS. A review.Mutation Res. 1992. 277:91-138.
4. Mims, C. y J.Playfar. MICROBIOLOGIA MEDICA. 2da. Ed. Edit.
Hartcourt Brace. Barcelona Espaa. 1999.
5. Murria, P. y G. Kobayashi. MICROBIOLOGIA MEDICA. 2da. Ed.
Edit. Hartcourt Brace. Barcelona Espaa. 1999.
6. Donald Blumenthal; Laurence Brunton; Keith Parker; Lazo, John
S.; Iain Buxton. Goodman and Gilman's Pharmacological Basis of
Therapeutics Digital Edition. McGraw-Hill Professional. ISBN 007-146804-8.
7. Skett, Paul; Gibson, G. Gordon (2001). Introduction to drug
metabolism. Cheltenham, UK: Nelson Thornes Publishers. ISBN
0-7487-6011-3.
8. Lynch T, Price A (2007). The effect of cytochrome P450
metabolism on drug response, interactions, and adverse effects.
American family physician 76 (3): pp. 3916. PMID 17708140.
IX.
ANEXOS:
Ilustracin 5: Diseccin del espcimen Mus musculus
Ilustracin 6: Localizacin del hgado y extraccin
Ilustracin 7: Triturando el hgado de Mus musculus
Ilustracin 8: Incubacin de las soluciones problemas
Ilustracin 9: Filtrando las soluciones problemas
Ilustracin 10: Obtencin del filtrado de las soluciones problemas
Cultivos prototrficos
Cultivo auxotrficos
Ilustracin 11: Cultivos prototrficas y auxotrficas de E.coli
Ilustracin 12: Realizando las suspensiones bacterianas
Ilustracin 13: Realizando la siembra de las bacterias por suspensin
Ilustracin 14: Agregando a los hoyos la solucin control (SSF) y luego las
soluciones problemas

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FISIOLOGA Y GENTICA MICROBIANA

MERCADO MARTINEZ, PEDRO

Se ha estudiado la mutagenicidad de algunas sustancias qumicas

(mutgenos) que pueden ser producidas por agentes qumicos como el

Comprobar si el uretano al 1% y la ua de gato al 100% se comportan

Cultivo de E. coli auxotrfico

MATERIAL DE VIDRIO, EQUIPOS DE LABORATORIO Y REACTIVOS:

Agar Mnimo de Davies

Tener dos especmenes de Mus musculus y extraer el hgado.

Cada hgado ser colocado en un mortero diferente con 5ml de

A un mortero agregar 5 ml de Uretano al 1% e Incubar por 2

Al otro mortero agregar y 1 ml de ua de gato al 100% e Incubar

Pasado el tiempo de incubacin filtrar con una gasa cada una de

PREPARACIN Y OBTENCIN DE LA SUSPENSIN:

Realizar una suspensin del cultivo de Escherichia coli

De igual manera realizar otra suspensin, pero esta vez con

Tomar 0.1 ml de cada suspensin y realizar una siembra por

Esperar de 2 a 3 min que sequen las placas y realizar en cada

Teniendo las dos placas de AMD sembradas con sus respectivas

agregar la solucin problema N 1 (a uno agregar 10ul y al otro

Incubar las placas a 37C por 24 horas y luego realizar la lectura.

Nota: Realizar lo mismo en Agar nutritivo, para que nos sirva

Para E.coli prototrfico

Ilustracin 1: Placa de AMD sembrada con E. coli prototrfico

Ilustracin 2: Hoyo con 50ul de Uretano.

Para E.coli auxotrfico

Ilustracin 3: Placa de AMD sembrada con E. coli auxotrfico

Ilustracin 4: Hoyo con 50ul de Uretano.

En los resultados se observ crecimiento del cultivo auxotrfico

En el caso de las placas con agar mnimo de Davies, en la placa

suceder lo contrario. en los resultados se observ que hubo

El uretano al 1% si se comporta como una sustancia mutgena

La ua de gato al al 100% no se comportan como sustancias

Ilustracin 5: Diseccin del espcimen Mus musculus

Ilustracin 6: Localizacin del hgado y extraccin

Ilustracin 7: Triturando el hgado de Mus musculus

Ilustracin 8: Incubacin de las soluciones problemas

Ilustracin 9: Filtrando las soluciones problemas

Ilustracin 10: Obtencin del filtrado de las soluciones problemas

Ilustracin 11: Cultivos prototrficas y auxotrficas de E.coli

Ilustracin 12: Realizando las suspensiones bacterianas

Ilustracin 13: Realizando la siembra de las bacterias por suspensin

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