CALCULOS DE VALIDACION

DE METODOS ANALITICOS
Laboratorio de Control Fisicoquimico y
Microbiologico de Medicamentos y Afines II
Por: Carlos Mario Aguirre D. Q.F U de A
Abril de 2013

CALCULOS DE VALIDACION
DE METODOS ANALITICOS

CALCULOS DE LINEALIDAD
Regresin Lineal y demostracin Linealidad Prueba ANOVA
Intervalo de confianza para el intercepto Prueba t
Intervalo de confianza para la pendiente Prueba t

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EXCEL
Paso1. Crear una tabla con los datos bsicos para realizar clculos, calculo de
sumatorias

En Excel los exponentes se colocan con

el smbolo ^, Ejemplo: necesitamos sacar
el cuadrado de 2, entonces en la celda de
Excel colocamos =2^2

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EXCEL

Paso2. Calcular pendiente e intercepto por Excel

Para calcular la pendiente se dice en la celda donde se desea

mostrar el valor = y se selecciona insertar funcin fx, se
selecciona estadsticas y se escoge de la lista la opcin
PENDIENTE, se despliega otro recuadro y en conocido y se
seleccionan todos los datos de rea o absorbancia obtenidos y
en conocido x todos los datos de pesos para cada muestra.
Para el intercepto es lo mismo pero se selecciona de la lista

CALCULOS DE VALIDACION DE METODOS ANALITICOS EN

EXCEL

Paso3. Calcular coeficientes r y r2

Para calcular la pendiente se dice en la celda donde se desea

mostrar el valor = y se selecciona insertar funcin fx, se
selecciona estadsticas y se escoge de la lista la opcin
COEF.DE.CORREL, se despliega otro recuadro y Matriz1 se
seleccionan todos los datos peso obtenidos y en Matriz2 todos
los datos de rea o absorbancia para cada muestra. Para
calcular r2 elevamos al cuadrado el valor obtenido para r en
otra celda

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EXCEL

Paso4. Calcular s2x,y, n

Para los posteriores clculos de la desviacin estndar de la pendiente Sb y del intercepto Sa requerimos calcular el valor de la
desviacin estndar de X con respecto a Y y el numero de datos n
Sx,y= (Y2-(a*Y)-(b*XY))/n-2 para este calculo debimos haber calculado primero n, esto se hace con la funcin estadstica
CONTAR

Para calcular n se dice en la celda donde se desea mostrar el valor = y se selecciona insertar funcin fx, se
selecciona estadsticas y se escoge de la lista la opcin CONTAR, se despliega otro recuadro y en Valor1 se
seleccionan todos los datos peso obtenidos, en este caso n=9, con estos datos en otra celda ya hacemos el
calculo segn la formula de S2x,y ya que tenemos todos los datos para calcularlo

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EXCEL
Paso5. Calcular Suma de cuadrados inexplicada (Ssi), explicada (Sse) y Total
(SSt)
Para los posteriores clculos de la desviacin estndar de la pendiente Sb y del intercepto Sa requerimos calcular el valor de la
suma de cuadrados explicada, inexplicada y total.
SSt = Y2-((Y)2/n)
Sse=b2*(X2-((X)2/n))
Ssi= SST-SSe

Paso6. Calcular Desviacin estndar para la pendiente (Sb) y para el intercepto (Sa)
Sb=(SSinexplicada/(x2-(x/r2)))
Sa=((Sb2)*(x/n))

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EXCEL
Paso6. Realizar el anlisis de varianza (ANOVA)
Para esto comenzamos construyendo la tabla ANOVA y realizando los clculos de los cuadrados medios del error y el
Estadstico F

Para el modelo ANOVA los grados de libertad de la regresin son 1,00, los grados de libertad para el residual son igual a n-2 y
para el total igual a n-1

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EXCEL
Paso6. Realizar el anlisis de varianza (ANOVA)
Para esto comenzamos construyendo la tabla ANOVA y realizando los clculos de los cuadrados medios del error y el
Estadstico F

Para el F tabulado no se requiere tener una tabla estadstica ya que Excel da la posibilidad de obtener este valor para ello usamos la funcin
=DISTR.F.INV(), dentro de los parntesis se coloca el valor de alfa, luego ;el valor de n-2;el valor de n-1, en este ejemplo la formula seria
=DISTR.F.INV(0,05;7,00;8,00)

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EXCEL
Paso7. Realizar la prueba de Hiptesis acerca de la linealidad del mtodo y
comparar los valores Fcalculado y F tabulado
Se plantean las Hiptesis nula y alterna, la nula establece la hiptesis que no hay relacin entre variables y la alterna que si
existe dicha relacin. Si Fcalculado>Ftabulado, se rechaza Ho y se acepta H1 lo cual quiere decir que si existe relacin lineal
entre cantidad y rea, para el caso que hemos venido trabajando, vemos que Fcalculado (21038,9655) es mucho mayor que
Ftabulado (3,50) con 0,05 de probabilidad

Hasta aqu hemos probado que existe una relacin lineal entre las variables, sin embargo debemos probar que en todos los
rangos existe una adecuada proporcionalidad en todos los rangos de concentracin ensayados (pendiente positiva mayor a cero)
y que el intercepto pasa por cero, para ello debemos realizar pruebas de intervalos de confianza para el intercepto y la pendiente,
empleando pruebas t.

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EXCEL
Paso8. Realizar las pruebas de intervalo de confianza para la pendiente y el
intercepto
Calculo de intervalos de confianza para la pendiente
Tcalculado para la pendiente= (b-0)/Sb
Intervalo de confianza superior para la pendiente= b + (ttabulado*Sb)
Intervalo de confianza inferior para la pendiente= b - (ttabulado*Sb)
Para el t tabulado no se requiere tener una tabla estadstica ya que Excel da la posibilidad de obtener este valor para ello usamos la
funcin =DISTR.T.INV(), dentro de los parntesis se coloca el valor de alfa, luego ;el valor de n-2 en este ejemplo la formula seria
=DISTR.F.INV(0,05;7,00) con el valor de t tabulado obtenido se haran los clculos de intervalos de confianza para la pendiente.

Calculo de intervalos de confianza para el intercepto

Tcalculado para la pendiente= (r*n-2)/(1-r2)
Intervalo de confianza superior para el intercepto= a + (ttabulado*Sa)
Intervalo de confianza inferior para el intercepto= a - (ttabulado*Sa)
Para el t tabulado no se requiere tener una tabla estadstica ya que Excel da la posibilidad de obtener este valor para ello usamos la
funcin =DISTR.T.INV(), dentro de los parntesis se coloca el valor de alfa, luego ;el valor de n-2 en este ejemplo la formula seria
=DISTR.F.INV(0,05;7,00) con el valor de t tabulado obtenido se haran los clculos de intervalos de confianza para la pendiente.

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EXCEL

Paso9. Realizar la prueba de hiptesis para los intervalo de confianza para la

pendiente y el intercepto

Estas pruebas cumplen para la pendiente si el intervalo superior e inferior de la pendiente no incluye el cero, es decir el
valor de ninguno de los dos intervalos es igual a cero o negativo
Estas pruebas cumplen para la intercepto si el intervalo superior e inferior de la intercepto incluyen el cero, es decir el valor
de alguno de los dos intervalos es igual a cero o negativo

CALCULOS DE VALIDACION DE METODOS ANALITICOS EN

EXCEL

Con los clculos anteriormente realizados ya hemos comprobado que el mtodo

es lineal en todos los intervalos de concentracin ensayados mediante el ANOVA
y la comprobacin de los intervalos de confianza para el intercepto y la
pendiente, nos resta comprobar la exactitud y precisin del mtodo en cada uno
de los intervalos de concentracin ensayados para de esta forma establecer el
rango y adicionalmente comprobar la repetibilidad y la precisin intermedia. La
selectividad se establece principalmente por medio de calculo de parmetros
cromatograficos como la resolucin y comparacin de espectros de absorcin,
continuaremos entonces con los clculos de exactitud y precisin.

CALCULOS DE VALIDACION
DE METODOS ANALITICOS

CALCULOS DE EXACTITUD Y
PRECISION
Prueba t para determinacin del sesgo
Comparacin de resultados de ensayos de precision

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EXCEL
EXACTITUD

Ejemplo: STD Ws: 25,1mg /100 *1/10 rea (Rs= 20620) Potencia (P)=100,0%
Prep. Muestra: 25,2mg*/100*1/10 rea (Rm=20650)
%Recuperado= (25,1mg/100mL)*(1/10mL)*(100mL/25,2mg)*
(10mL/1)*(20650/20620)*100.0%
%Recuperado= 99,7%
%

A1/D2)*(D1/Wm)*(D2/A1m)*(Rm/Rs)*P

Para cada muestra se calcula el porcentaje recuperado empleando los datos de rea para el estndar y cada muestra

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EXCEL
EXACTITUD
Nivel de concentracin
terico%

cantidad(mg)

Area de Pico

%Recuperado

%Concentracin real

%recuperado

%Concentracin real

80

20,00

15687,00

95,9

76,7

80

20,10

15720,00

95,6

76,5

80

20,20

15780,00

95,5

76,4

100

25,20

20650,00

100,1

100,1

100

25,00

20580,00

100,6

100,6

100

25,10

20610,00

100,3

100,3

120

30,30

25695,00

103,6

124,4

120

30,50

25750,00

103,2

123,8

120

30,00

25530,00

104,0

124,8

Para cada muestra se calculo el porcentaje recuperado empleando los datos de rea para el estndar y el modelo de calculo
de la diapositiva anterior, luego se calcula la concentracin real equivalente empleando el %Recuperado obtenido y el nivel
terico de concentracin
Ya teniendo estos datos calculados empleamos los datos de %Recuperado para realizar los clculos de t calculado para la
prueba de exactitud
%Concentracin real= (%Recuperado*Nivel terico de concentracin)/100

CALCULOS DE VALIDACION DE METODOS ANALITICOS EN

EXCEL
EXACTITUD

tcalculado=100- x/s*n

Concentracin%

Promedio porcentaje desviacion

recuperado
estandar (s)

80

95,6

100

100,4

120

103,6

0,20
0,23
0,41

tcalculado

n-2

alfa

ttabulado

3
3
3

12,65
-0,9
-5,0

1
1
1

0,05

12,7

Para cada nivel de concentracin tenemos 3 datos, para cada nivel

sacamos el promedio de porcentaje recuperado, sacamos la desviacin
estndar para los datos de cada nivel, el valor de n que en este caso es
igual a 3 para cada nivel, luego calculamos el tcalculado para cada nivel
con la formula mostrada arriba. Para mostrar el ttabulado, sacamos el valor
n-2 que en este caso es igual a 1 y trabajamos con un valor de alfa igual a
0,05, el ttabulado lo obtenemos con la funcin =DIST,T.INV(0,05;1) y nos da
un valor de 12,7
Si tcalculado<ttabulado entonces se rechaza Ho
y puede afirmarse que el mtodo es exacto. Esto debe hacerse para cada nivel de concentracin

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EXCEL
PRECISION REPETIBILIDAD O PRECISION
INTRAENSAYO
Tomamos parte de la tabla del ejemplo anterior y calculamos para cada nivel de
concentracin ensayado la desviacin estndar relativa (%RSD). Generalmente para
mtodos en los que se determinan principios en cantidades altas como son los ensayos de
valoracin de productos farmacuticos que no impliquen un procedimiento de
derivatizacion, extraccin o pretratamiento complejo, el criterio de aceptacin establecido
es no mayor a 2,0%
Promedio porcentaje recuperado

desviacin estndar (s)

%RSD

95,6

0,2
0,2
0,4

0,2
0,2
0,4

Concentracin%
80
100

100,4

120

103,6

%RSD=(Desviacin estndar/promedio) X 100

CALCULOS DE VALIDACION DE METODOS ANALITICOS EN

EXCEL
PRECISION
Para definir el %RSD tambin existen algunas guas como la farmacopea europea que
establece segn el rango de valoracin esperado un mximo de %RSD permitida

CALCULOS DE VALIDACION DE METODOS ANALITICOS EN

EXCEL
PRECISION PRECISION INTERMEDIA O
INTERENSAYO
Esta precisin se calcula cuando hay datos de dos anlisis de dos analistas diferentes en
das diferentes dentro del mismo laboratorio, generalmente un criterio de aceptacin
establecido es que el %RSD obtenido por el analista 1 no debe ser mayor a 2 veces el
%RSD obtenido por el analista 2. Para el ejemplo mostrado debajo el mtodo puede
considerarse de buena precisin intermedia ya que el %RSD del analista no excede en mas
de 2 veces el %RSD obtenido por el analista 2.

Analista 1 Da 1
Promedio porcentaje recuperado

desviacin estndar (s)

%RSD

0,2
0,2
0,4

Concentracin%
80

95,6

100

100,4

120

103,6

0,2
0,2
0,4

Promedio porcentaje recuperado

desviacin estndar (s)

%RSD

0,3
0,3
0,7

0,3
0,3
0,7

Analista 2 Da 2
Concentracin%
80

97,0

100

100,8

120

102,8

CROMATOGRAFIA LIQUIDA HPLC

VALIDACION DE METODOS
SELECTIVIDAD

CROMATOGRAFIA LIQUIDA HPLC

VALIDACION DE METODOS

Selectividad y Especificidad
La selectividad de un mtodo analtico se define como la
capacidad de este para discriminar la respuesta instrumental
correspondiente a un analito de otras respuestas instrumentales
de otros analitos o interferencias, se mide generalmente por la
resolucin, la mayor parte de los mtodos empleados son
selectivos mas no especficos.
La especificidad es la capacidad de un mtodo de arrojar
respuestas instrumentales debidas nicamente al analito de
inters sin otras respuestas de otras sustancias. Ejemplos:
mtodos inmunoquimicos (antgeno-anticuerpo), mtodos
radioqumicos con isotopos radioactivos.

CROMATOGRAFIA LIQUIDA HPLC

VALIDACION DE METODOS

Selectividad y Especificidad
Las condiciones mnimas para evaluar la selectividad de una
metodologa son:
Condiciones normales con o sin adicin de interferencias.
Termlisis a temperaturas variables 40C, 50C u 80C.
Degradacin alcalina: con NaOH al 1N
Degradacin acida: con HCl 1N
Degradacin oxidativa: con H2O2 al 4% o NaHSO3
Fotolisis
En cada caso la degradacin no debera ser menor al 10% ni mayor al 30%, ya que por debajo del 10%
podran no aparecer todas las posibles interferencias, y por encima del 30% podran aparecer
interferencias que no son comunes (artefactos) que podran no verse en la vida real.

CROMATOGRAFIA LIQUIDA HPLC

VALIDACION DE METODOS
LINEALIDAD Y RANGO

LINEALIDAD- mg ABACAVIR SULFATO VS AREA DE PICO

35000000,00

y = 710572x + 248516
R = 0,9991

AREA DE PICO

30000000,00
25000000,00
20000000,00

ABACAVIR SULFATO

15000000,00
Lineal (ABACAVIR SULFATO )

10000000,00
5000000,00
0,00
0,00

10,00

20,00

30,00

mg ABACAVIR SULFATO

40,00

50,00

CROMATOGRAFIA LIQUIDA HPLC

VALIDACION DE METODOS

Linealidad y Rango
La linealidad de un mtodo es la capacidad que tiene este para
producir respuestas instrumentales que son directamente o por
medio de transformaciones matemticas proporcionales a la
concentracin de analito en la muestra. Se puede trabajar en
diferentes niveles.
El Rango es la concentracin mxima y mnima entre las cuales
se ha demostrado una adecuada precisin y exactitud.

CROMATOGRAFIA LIQUIDA HPLC

VALIDACION DE METODOS
PRECISIN Y EXACTITUD

Baja precisin y
exactitud

precisin y exactitud
media

Precisin alta y
exactitud baja

Precisin y exactitud
altas

CROMATOGRAFIA LIQUIDA HPLC

VALIDACION DE METODOS

Exactitud
Es la capacidad de un mtodo para generar resultados
experimentales cercanos a un valor de referencia o aceptado
como verdadero, la medicin de la exactitud se hace por medio
de pruebas t.

CROMATOGRAFIA LIQUIDA HPLC

VALIDACION DE METODOS

Precisin
La precisin expresa la cercana entre series de valores
individuales obtenidos en el anlisis de una muestra homognea
en condiciones de operacin idnticas o variables. Existen tres
tipos de precisin diferentes:
Repetibilidad
Precisin intermedia
Reproducibilidad
La repetibilidad expresa la precisin obtenida bajo las mismas
condiciones de operacin (intraensayo) para una serie de
muestras obtenidas por un mismo analista en un solo da.

CROMATOGRAFIA LIQUIDA HPLC

VALIDACION DE METODOS

Precisin
Precisin intermedia: Expresa el grado de precisin en
condiciones operativas diferentes (diferentes analistas,
diferentes das, diferentes equipos), se expresa tambin como
precisin intralaboratorio o interensayo.
Reproducibilidad: Expresa el grado de precisin cuando se
cambia de laboratorio (precisin interlaboratorio), esta precisin
es la evaluada en los estudios de colaboracin interlaboratorios
y son los que llevan a cabo por ejemplo laboratorios estatales y
la USP para validar y aprobar las metodologas para
monografas individuales.

CROMATOGRAFIA LIQUIDA HPLC

VALIDACION DE METODOS

ROBUSTEZ
La robustez de un mtodo s define como la capacidad de este para mantener
su desempeo ante pequeas pero deliberadas modificaciones en las
condiciones de operacin. Los estudios de robustez se realizan para evaluar que
posibles cambios que deban efectuarse en la vida real por alguna situacin no
afectaran los resultados que arroja el mtodo, la evaluacin de este parmetro
se hace principalmente por tcnicas estadsticas factoriales como la de YoudenSteiner, Placket-Burmann o el cuadrado latino, parmetros generalmente
estudiado son la dilucin de la muestra, la longitud de onda, el pH de la fase
mvil, el volumen de inyeccin, la temperatura, la longitud de columna, entre
otros parmetros, no existe una regla especifica para llevar a cabo estos
estudios y depende de los desarrolladores de mtodos y quien realiza la
validacin realizar el diseo de estos estudios de acuerdo con las condiciones de
su laboratorio.

CROMATOGRAFIA LIQUIDA HPLC

VALIDACION DE METODOS
LIMITE DE DETECCIN Y
CUANTIFICACIN

Distribucin,
campana o trompeta
de Horwitz

VWD1 A, Wavelength=254 nm (C:\PROYEC~1\PBQ-008\VOLUNT~2\VOLUN~29\21010001.D)

mAU

Lmite Superior

-0.04
-0.045
-0.05
-0.055
-0.06
-0.065
-0.07
-0.075

Lmite Inferior

-0.08
9

9.1

9.2

9.3

9.4

9.5

min

CROMATOGRAFIA LIQUIDA HPLC

VALIDACION DE METODOS

Limites de cuantificacin (LC) y deteccin (LD)

Limite de deteccin (LD): Es la mnima cantidad de un
analito que puede ser detectada pero no cuantificada con
exactitud. Equivale a tres veces la relacin seal/Ruido (S/N).
Limite de cuantificacin (LC): Es la mnima cantidad de un
analito que puede ser detectada y cuantificada con exactitud y
precisin aceptables. Se establece como aquella concentracin
que es 10 veces la relacin seal/Ruido (S/N).

CROMATOGRAFIA LIQUIDA HPLC

VALIDACION DE METODOS

Guas o normatividad aplicable a validacin de mtodos

analticos y literatura recomendada
<621>Cromatografia en USP35 aunque no es relativo a validacin all se dan parmetros
bsicos que deben cumplir los mtodos cromatograficos que deben tenerse en cuenta a la
hora de validar.
<1092> Procedimiento de disolucin: Desarrollo y validacin
<1223> Validacin de mtodos microbiolgicos alternativos
<1224> Transferencia de procedimientos analticos
<1225> Validacin de procedimientos compndiales
<1226> Verificacin de procedimientos compndiales
<1227> Validacin de recuperacin microbiana de artculos farmacopeicos
Gua ICH Q2(R1) Validacin de procedimientos analticos: Texto y metodologa (1996)
De Muth, J.Basic statistical and pharmaceutical statistical applications. Ed Marcel
Dekker;inc. New York. 1999