Determinacion de La Lisina

INTRODUCCION
La lisina (abreviada Lys o K) es un aminocido componente de las protenas

sintetizadas por los seres vivos, es uno de los 10 aminocidos esenciales para los
seres humanos, los ingredientes, se diferencian unos de otros, no slo en el contenido
de protena bruta, sino tambin y de una forma sustancial en su composicin de
aminocidos.
Los ingredientes de origen animal como por ejemplo la harina de pescado, se
caracterizan por su excepcional contenido de lisina y aminocidos azufrados, mientras
que los insumos de origen vegetal y muy especialmente las tortas de soya se
caracterizan por ser deficitarios en metionina y cistina.
Cabe considerar que existen en la literatura diferentes ejemplos sobre tcnicas que
hacen posible la optimizacin de los medios de cultivo. La mayora de estas, basan la
formulacin de los mismos en la composicin elemental del microorganismo a estudiar
o de otros similares que puedan servir de referencia para realizar un balance de
materia apropiado, esto puede ser un punto de partida para la formulacin y
optimizacin de un medio de cultivo en particular, pero no suficiente ya que el
crecimiento celular tiene implcito otros factores que determinan la estequiometria del
mismo.
Por lo expuesto anteriormente, se puede decir que una de las tcnicas ms eficientes
para la optimizacin de procesos es La Metodologa de Superficie de Respuesta
(MSR); la cual tiene como objetivo principal determinar las condiciones de operacin
ptima para un sistema, o determinar la regin del espacio de los factores en la que se
satisfacen las condiciones de operacin.
DETERMINACION DE LA LISINA
Materiales y Mtodos
Microorganismo: Se utiliz una cepa de Corynebacterium glutamicun (GIGO)
productora de L-lisina, resistente a 5-2 (aminoetil) - L-cistena (AEC) y auxotrfica para
Leucina (Leu-), Homoserina (Hom-).
Materiales: Se utilizaron reactivos marca Sigma. Riedel de Han, Difco Co, y
Ultralab.El ensilado de pescado.
Medios de Cultivo: La cepa GIGO conservada a 8 C en estras de medio rico fue
inoculada con un asa de platino en un medio de precultivo que contiene por litro de
agua destilada: glucosa, 20 g; extracto de levadura 5 g; NaCl, 2,5 g; Tiamina, 300 g;
biotina, 400 g, pH 7,2.
Los cultivos realizados en Erlen meyer con bafles se incubaban a 30 C en un agitador
rotatorio (200 r.p.m.) durante 16h. Para la produccin de L-lisina, 10% de este
precultivo fue transferido a una fiola con un medio que contiene los diferentes
componentes a las concentraciones establecidas de acuerdo al diseo experimental
planteado y un volumen final 20 ml.
Como control se emple el medio con melaza utilizado previo a la optimizacin, el cual
contiene por litro de agua: melaza 200g (100 g azcares totales); ensilado de pescado,
65 g; biotina, 0,5 mg; tiamina 0,3 mg; (NH 4)2SO4, 60 g; KH2PO4, 1 g; K2HPO4, 1 g;
FeSO4, 0,01 g; MgSO4, 0,4 g; MnSO4, 0,01 g.
Los medios fueron esterilizados por autoclave (121 C 20 min.). Las vitaminas se
esterilizaron por filtracin (Millipore 0,22) y la glucosa y la melaza por autoclave pero
separadas de los dems componentes del medio. La solucin de ensilado de pescado
(EP), se prepar suspendiendo 12 g de EP en 40 ml de agua destilada, se dej hervir
durante 15 minutos, se clarific por filtracin (Whatman No. 1 y se afor al volumen
inicial de 40 ml. Para reconstituir el medio de cultivo esta suspensin se adicion a la
solucin de sales y azcares previamente preparada.
El pH fue ajustado a 7,4 con KOH en estado slido a fin de evitar alteraciones
significativas del volumen final y para mantener el pH en el curso de la fermentacin,
se agreg 55 mg/ml CaCO3. Finalmente los cultivos se incubaban a 30 C, en un
agitador rotatorio (250 r.p.m.) durante 144 h.
Mtodo: La determinacin de L-lisina se realiz por el mtodo Colorimtrico de

Chinard (1952). Los azcares totales en los jugos de fermentacin se determinaron
por el mtodo de antrona
Determinaciones
Para el seguimiento de la cintica de fermentacin, a diferentes tiempos durante la
fermentacin se tomaron muestras para realizar las estimaciones de biomasa, L-lisina
excretada y azcares consumidos. La biomasa fue determinada por turbidimetra (600
nm) y la conversin a peso seco se efectuaba mediante una curva de calibracin
previamente realizada. Colorimtrico de Chinard (1952).
Las estimaciones de subproductos de fermentacin (cidos orgnicos) se realizaron
por cromatografa lquida de alta resolucin (HPLC, Waters Corporation) a 210 nm
usando una columna RS-pak KC-811 y cido fosfrico como fase mvil (0,1%).
Diseo Experimental
Para poder caracterizar la superficie de respuesta cercana al ptimo de produccin de
L-lisina se utiliz un diseo compuesto central de precisin uniforme (ver Tabla 1), con
cinco variables independientes (ensilado de pescado, melaza, (NH4)2SO4, KH2PO4 y
K2HPO4) y como variable dependiente la cantidad de L-lisina excretada. Este diseo
contempla 52 tratamientos, de los cuales 32 (2 5) corresponden a un factorial, 10
tratamientos centrales y 10 tratamientos axiales con = 2,191.
RESULTADOS Y DISCUSIN
Reduccin del nmero de componentes del medio de cultivo
La presencia de vitaminas, tales como biotina y tiamina, as como de microelementos
(Fe, Mg y Mn) en la melaza de caa de azcar. Con la finalidad de probar si la melaza
utilizada provee los elementos mencionadas, los cuales son agregados exgenamente
al medio de cultivo, se procedi a suprimir estos componentes de dicho medio.
Para tal fin, se prepararon combinaciones de medio de cultivo en los cuales
selectivamente se suprimieron las vitaminas (biotina y tiamina) y las sales FeSO 4,
MnSO4, y MgSO4. Estos ensayos fueron realizados por duplicado y transcurridas 144 h
de fermentacin se tomaron muestras de cultivo a fin de evaluar la biomasa producida
y L-lisina excretada. Como control se utiliz el medio de produccin de 10

componentes y melaza descrito en materiales y mtodos.
Los resultados indican que en relacin a los parmetros biomasa producida y L-lisina
excretada, no hay diferencias significativas entre el control y las diferentes variantes
probadas. Ello indica que la adicin de melaza al medio de cultivo provee ciertos
componentes en cantidades no limitantes, sin que sea necesaria su adicin exgena,
por lo que estos pueden ser suprimidos de la formulacin original del medio de cultivo.
Segundo ejemplo
LISINA HIERRO AGAR

Medio de cultivo utilizado para diferenciar microorganismos, especialmente Salmonella
spp., basado en la decarboxilacin / desaminacin de la lisina y en la produccin de
cido sulfhdrico es el Carpenter (1960).
FUNDAMENTO
En el medio de cultivo, la peptona y el extracto de levadura aportan los nutrientes para
el desarrollo bacteriano. La glucosa es el hidrato de carbono fermentable y la lisina es
el sustrato utilizado para detectar la presencia de las enzimas decarboxilasa y
deaminasa. El citrato de hierro, amonio y el tiosulfato de sodio, son los indicadores de
la produccin de cido sulfhdrico. El purpura de bromocresol, es el indicador de pH, el
cual es de color amarillo a pH igual o menor a 5.2, y de color violeta a pH igual o
mayor a 6.8.
Por decarboxilacin de la lisina, se produce la amina cadaverina, que alcaliniza el
medio y esto produce el viraje del indicador al color violeta, tiene lugar en medio cido,
por lo que es necesaria que la glucosa sea previamente fermentada.
Los microorganismos que no producen lisina decarboxilasa, pero que son
fermentadores de la glucosa, producen un viraje de la totalidad del medio de cultivo al
amarillo, pero a las 24 hs de incubacin se observa el pico de color violeta debido al
consumo de las peptonas, y el fondo amarillo.
Las cepas de los gneros Proteus, Providencia y algunas cepas de Morganella,
desaminan la lisina, esto produce un cido alfa-ceto-carbnico, el cual, con la sal de
hierro y bajo la influencia del oxgeno forma un color rojizo en la superficie del medio.
Frmula (en gramos por litro)

Peptona de gelatina
5.0
Extracto de levadura
3.0
Glucosa
1.0
Lisina
10.0
Citrato de hierro y amonio
0.5
Tiosulfato de sodio
0.04
Prpura de bromocresol
0.02
Agar
15.0
Instrucciones
Suspender 35 g del medio deshidratado

en un litro de agua destilada. Dejar
embeber unos 15 minutos. Calentar
cuidadosamente, agitando con frecuencia
y hervir durante un minuto hasta la
disolucin completa. Distribuir y esterilizar
a 121C durante 15 minutos. Enfriar en
pico de flauta dejando un fondo vertical
apto para la puncin.
pH final: 6.7 0.2
Siembra
Por puncin profunda con aguja de inoculacin.
Incubacin
En aerobiosis, durante 24 horas a 35-37 C.
RESULTADOS
1-Decarboxilacin de la lisina:
-Prueba
-Prueba
Positiva:
Negativa:
Pico
Pico
violeta/fondo
violeta/fondo
violeta.
amarillo.
2-Desaminacin de la lisina:
Pico rojizo/fondo amarillo. Esto sucede con cepas del gnero Proteus, Providencia y
alguna
cepas
de
Morganella
spp.
3-Produccin de cido sulfhdrico:
-Prueba positiva: Ennegrecimiento del medio (especialmente en el lmite del pico y
fondo)
CONCLUSION
La utilizacin de la Metodologa de Superficie de Respuesta (MSR), permiti la
formulacin de un medio de cultivo para la produccin de L-lisina por una cepa (GIGO)
de Corynebacterium glutamicum. Mediante sta tcnica, se logr un mejoramiento de
la produccin tomando en cuenta todas las variables (Melaza, ensilado de pescado,
(NH4)2SO4, K2HPO4, KH2PO4) de manera simultnea y estableciendo la influencia de
cada una sobre la cantidad de L-lisina producida. Con un mnimo de ensayos fue
posible localizar mejorar la produccin de L-lisina, observndose un incremento de la
concentracin final del aminocido (34%) con respecto al valor obtenido en el medio
original.
-Prueba positiva: Ennegrecimiento del medio (especialmente en el lmite del pico y

fondo)

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INTRODUCCION

La lisina (abreviada Lys o K) es un aminocido componente de las protenas

Mtodo: La determinacin de L-lisina se realiz por el mtodo Colorimtrico de

y L-lisina excretada. Como control se utiliz el medio de produccin de 10

LISINA HIERRO AGAR

Frmula (en gramos por litro)

Citrato de hierro y amonio

Suspender 35 g del medio deshidratado

pH final: 6.7 0.2

-Prueba positiva: Ennegrecimiento del medio (especialmente en el lmite del pico y

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