NOM-242-ssa1 PESCADOS NUEVA PDF

Jueves 10 de febrero de 2011
DIARIO OFICIAL
(Segunda Seccin)
SEGUNDA SECCION
PODER EJECUTIVO
SECRETARIA DE SALUD
NORMA Oficial Mexicana NOM-242-SSA1-2009, Productos y servicios. Productos de la pesca frescos,
refrigerados, congelados y procesados. Especificaciones sanitarias y mtodos de prueba.
Al margen un sello con el Escudo Nacional, que dice: Estados Unidos Mexicanos.- Secretara de Salud.
MIGUEL ANGEL TOSCANO VELASCO, Comisionado Federal para la Proteccin contra Riesgos
Sanitarios y Presidente del Comit Consultivo Nacional de Normalizacin de Regulacin y Fomento Sanitario,
con fundamento en lo dispuesto por el artculo 39 de la Ley Orgnica de la Administracin Pblica Federal; 4
de la Ley Federal de Procedimiento Administrativo; 3 fraccin XXIV, 13 apartado A) fracciones I y II, 17 bis
fraccin III, 194 fraccin I, 195, 197, 199, 201, 214 y 215 fraccin I de la Ley General de Salud; 47 fraccin IV
de la Ley Federal sobre Metrologa y Normalizacin; 28 del Reglamento de la Ley Federal sobre Metrologa y
Normalizacin; 2 literal C fraccin X, 36 y 37 del Reglamento Interior de la Secretara de Salud; 1 fraccin IV,
4, 8, 15, 80, 91, 92, 93, 97 y 98 del Reglamento de Control Sanitario de Productos y Servicios; 3 fracciones I
inciso c y II, 10 fraccin IV del Reglamento de la Comisin Federal para la Proteccin contra Riesgos
Sanitarios, tengo a bien ordenar la publicacin en el Diario Oficial de la Federacin, de la Norma Oficial
Mexicana NOM-242-SSA1-2009, Productos y servicios. Productos de la pesca frescos, refrigerados,
congelados y procesados. Especificaciones sanitarias y mtodos de prueba.
CONSIDERANDO
Que en cumplimiento a lo previsto en el artculo 46 fraccin I de la Ley Federal sobre Metrologa y
Normalizacin, el Subcomit de Productos y Servicios present en el ao del 2005 al Comit Consultivo
Nacional de Normalizacin de Regulacin y Fomento Sanitario, el anteproyecto de norma oficial mexicana;
Que con fecha 25 de agosto de 2008, en cumplimiento del acuerdo del Comit y lo previsto en el artculo
47 fraccin I de la Ley Federal sobre Metrologa y Normalizacin, se public el Proyecto de Norma Oficial
Mexicana PROY-NOM-242-SSA1-2005, Productos y servicios. Productos de la pesca frescos, refrigerados,
congelados y procesados. Especificaciones sanitarias y mtodos de prueba, en el Diario Oficial de la
Federacin, a efecto de que dentro de los sesenta das naturales posteriores a dicha publicacin, los
interesados presentaran sus comentarios al Comit Consultivo Nacional de Normalizacin de Regulacin y
Fomento Sanitario;
Que con fecha previa, fue publicada en el Diario Oficial de la Federacin, la respuesta a los comentarios
recibidos por el mencionado Comit, en los trminos del artculo 47 fraccin III de la Ley Federal sobre
Metrologa y Normalizacin y
Que en atencin a las anteriores consideraciones, contando con la aprobacin del Comit Consultivo
Nacional de Normalizacin de Regulacin y Fomento Sanitario, he tenido a bien ordenar la publicacin de la
Norma Oficial Mexicana NOM-242-SSA1-2009. Productos y servicios. Productos de la pesca frescos,
refrigerados, congelados y procesados. Especificaciones sanitarias y mtodos de prueba.
PREFACIO
En la elaboracin de la presente Norma participaron los siguientes organismos e instituciones:
SECRETARIA DE SALUD
Comisin Federal para la Proteccin contra Riesgos Sanitarios
CAMARA NACIONAL DE LAS INDUSTRIAS PESQUERA Y ACUICOLA
INSTITUTO POLITECNICO NACIONAL
Escuela Nacional de Ciencias Biolgicas
PESCADOS INDUSTRIALIZADOS, S.A. DE C.V.
AHUMADOS NORUEGOS, S.A. DE C.V.
INDICE
1. Objetivo y campo de aplicacin
2. Referencias
3. Definiciones
4. Smbolos y abreviaturas
5. Clasificacin
6. Prcticas de higiene y sanidad
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7. Especificaciones sanitarias
8. Clasificacin de reas
9. Muestreo
10. Mtodos de prueba
11. Etiquetado
12. Envase y embalaje
13. Concordancia con normas internacionales y mexicanas
14. Bibliografa
15. Observancia de la Norma
16. Vigencia
Apndice Normativo A: Aditivos
Apndice Normativo B: Mtodos de prueba
1. Objetivo y campo de aplicacin
1.1 Esta Norma Oficial Mexicana tiene por objeto establecer los requisitos sanitarios para: las reas de
captura de moluscos bivalvos; los establecimientos que procesan productos de la pesca frescos, refrigerados,
congelados y procesados, incluyendo las embarcaciones de pesca y recoleccin, as como las
especificaciones sanitarias que deben cumplir dichos productos.
1.2 Esta Norma Oficial Mexicana es de observancia obligatoria en el Territorio Nacional para las personas
fsicas o morales que se dediquen a la captura, extraccin, procesamiento, conservacin, almacenamiento,
distribucin, transporte, venta o importacin de productos de la pesca.
2. Referencias
Esta norma se complementa con las siguientes normas oficiales mexicanas o las que las sustituyan:
2.1. Norma Oficial Mexicana NOM-051-SCFI/SSA1-2010. Especificaciones generales de etiquetado para
alimentos y bebidas no alcohlicas preenvasados Informacin comercial y sanitaria.
2.2. Norma Oficial Mexicana NOM-084-SCFI-1994. Informacin comercial-especificaciones de informacin
comercial y sanitaria para productos de atn y bonita preenvasados.
2.3. Norma Oficial Mexicana NOM-086-SSA1-1994. Bienes y servicios. Alimentos y bebidas no alcohlicas
con modificaciones en su composicin. Especificaciones nutrimentales.
2.4. Norma Oficial Mexicana NOM-251-SSA1-2009. Prcticas de higiene para el proceso de alimentos,
bebidas o suplementos alimenticios.
2.5. Norma Oficial Mexicana NOM-127-SSA1-1994. Salud ambiental. Agua para uso y consumo humanoLmites permisibles de la calidad y tratamientos a que debe someterse el agua para su potabilizacin.
2.6. Norma Oficial Mexicana NOM-128-SSA1-1994. Bienes y servicios. Que establece la aplicacin de un
sistema de anlisis de riesgos y control de puntos crticos en la Planta Industrial Procesadora de Productos de
la Pesca.
2.7. Norma Oficial Mexicana NOM-130-SSA1-1995. Bienes y servicios. Alimentos envasados en
recipientes de cierre hermtico y sometidos a tratamiento trmico. Disposiciones y especificaciones sanitarias.
2.8. Norma Oficial Mexicana NOM-201-SSA1-2002. Productos y servicios. Agua y hielo para consumo
humano, envasados y a granel. Especificaciones sanitarias.
3. Definiciones
Para fines de esta Norma Oficial Mexicana, se entiende por:
3.1 Aditivo o Aditivo para alimentos, cualquier sustancia permitida que, sin tener propiedades nutritivas,
se incluya en la formulacin de los productos y que acte como estabilizante, conservador o modificador de
sus caractersticas organolpticas, para favorecer ya sea su estabilidad, conservacin, apariencia o
aceptabilidad.
3.2 Agua de mar limpia, al agua de mar o salobre que no presente contaminacin microbiolgica,
sustancias txicas o plancton marino txico en cantidades tales que puedan afectar la calidad sanitaria de los
productos de la pesca.
3.3 Agua para uso y consumo humano (agua potable), agua que no contiene contaminantes objetables,
qumicos o agentes infecciosos y que no causa efectos nocivos para la salud.
3.4 Ahumado, procedimiento que consiste en someter el alimento al efecto del humo originado en la
combustin de madera no resinosa y/o extractos con sabor a humo.
3.5 Ahumado en caliente, someter el producto a temperaturas y periodos suficientes para lograr la
coagulacin trmica de la protena.
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3.6 Ahumado en fro, someter el producto a temperaturas a las que no muestre seales de coagulacin
trmica de la protena.
3.7 Almacenaje hmedo, al almacenamiento temporal de moluscos bivalvos provenientes de reas de
cultivo con clasificacin aprobada o condicionalmente aprobada, ya sea en contenedores o flotantes en
cuerpos naturales de agua o en tanques que contengan agua de mar natural o sinttica.
3.8 Area aprobada, zona de produccin de moluscos bivalvos, en la cual un estudio sanitario elaborado
bajo los criterios tcnicos establecidos por la autoridad, as como el monitoreo y las actividades de vigilancia,
indican que no existe contaminacin por materia fecal, microorganismos patgenos, sustancias txicas
nocivas y/o biotoxinas marinas.
3.9 Area condicionalmente aprobada, zona de produccin de moluscos bivalvos que cumple con los
criterios para la clasificacin aprobada, excepto bajo ciertas condiciones descritas en un estudio sanitario.
3.10 Area condicionalmente restringida, al rea de produccin de moluscos bivalvos que cumple con
los criterios para la clasificacin restringida excepto bajo ciertas condiciones descritas en un estudio sanitario,
y de la cual los moluscos bivalvos extrados estarn sujetos a un proceso de tratamiento de reinstalacin o
depuracin, tratamiento trmico u otro proceso que elimine organismos patgenos.
3.11 Area de cultivo, cosecha o produccin, a cualquier lugar que sustenta o puede sustentar el
crecimiento de moluscos bivalvos, por medios naturales o artificiales, y en la cual hay cantidad suficiente para
su comercializacin, incluyendo los sitios de acuacultura e instalaciones relacionadas.
3.12 Area prohibida, al rea donde no est permitido la recoleccin de moluscos bivalvos, para cualquier
propsito; excepto para la obtencin de semilla para acuacultura.
3.13 Area restringida, al rea de produccin de moluscos bivalvos donde la recoleccin requiere permiso
de la autoridad, y una vez recolectados los moluscos bivalvos, estn sujetos a un proceso de tratamiento de
reinstalacin o depuracin, tratamiento trmico u otro proceso que elimine organismos patgenos.
3.14 Biotoxinas marinas, sustancias de estructura molecular, mecanismos de accin y actividad biolgica
diversa, que pueden clasificarse atendiendo a sus diferentes efectos toxicolgicos. Son generadas por
especies fitoplanctnicas txicas tales como Alexandrium catenella, Gymnodinium catenatum, Pyrodinium
bahamense en su variedad compressum, Pseudonitzschia pungens, Gonyaulax, spp, Dinophysis spp, Karenia
brevis, entre otras especies, as como toxinas de origen natural presentes en algunos peces de inters
comercial.
3.15 Buenas prcticas de fabricacin (BPF), para el caso de los aditivos se refiere a la cantidad mnima
indispensable para lograr el efecto deseado.
3.16 Congelacin, al mtodo fsico que se efecta por medio de equipo especial para lograr una
reduccin de la temperatura de los productos que garantice que su centro trmico est congelado.
3.17 Depuracin, proceso realizado para la reduccin de organismos patgenos que pueden estar
presentes en los moluscos, mediante la utilizacin de un ambiente acutico controlado como proceso de
tratamiento.
3.18 Distribucin, accin de repartir algo (materia prima, producto, etc.) y de llevarlo al punto o lugar en
que se ha de utilizar.
3.19 Embalaje, material que envuelve, contiene y protege los productos preenvasados, para efectos de su
almacenamiento y transporte.
3.20 Embarcacin menor, a la unidad de pesca que no cuenta con maquinaria de cubierta accionada con
fuerza electromotriz para el auxilio de las operaciones de pesca, utiliza nicamente hielo para la conservacin
del producto y tiene una autonoma de 3 das. Las embarcaciones con capacidad hasta 5 toneladas no podrn
realizar operaciones de pesca por ms de 24 horas.
3.21 Embarcacin pesquera, unidad de pesca con motor estacionario y una o ms cubiertas con eslora
superior a los 10.5 m, que pueden tener o no equipo electrnico de navegacin y apoyo a la pesca, que le
permite tener una autonoma mayor de 3 das, y los sistemas de pesca pueden ser operados con apoyo de
medios mecnicos. Se puede efectuar la congelacin de los productos de la pesca, precedida, en caso
necesario, de labores de preparacin como el sangrado, descabezado, eviscerado y extraccin de las aletas,
y seguida, si es preciso, del envasado o embalado.
3.22 Embarcacin pesquera de mediana altura, a la unidad de pesca con motor estacionario y una
cubierta, con eslora de 10 a 27 m; con equipo electrnico de navegacin y apoyo a la pesca, que le permite
tener una autonoma mxima de 25 das, los sistemas de pesca son operados manualmente o con apoyo de
medios mecnicos.
3.23 Enhielado, al mtodo de conservacin fsico con el cual se mantiene la temperatura interna del
producto a un mximo de 4C, con la utilizacin de hielo potable.
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3.24 Envases hermticamente cerrados, aquellos que se han previsto para proteger el contenido contra
la entrada de microorganismos.
3.25 Envase, cualquier recipiente, o envoltura en el cual est contenido el producto preenvasado para su
venta al consumidor.
3.26 Esterilizacin comercial, al tratamiento trmico que libera al producto de formas viables de
microorganismos patgenos (incluyendo esporas) que afecten la salud y causantes de descomposicin, as
como aquellos capaces de desarrollarse en los alimentos sin refrigeracin bajo condiciones normales de
almacenamiento y distribucin.
3.27 Estudio sanitario, el informe escrito, de la evaluacin de todos los factores ambientales, incluyendo
las fuentes de contaminacin actuales o potenciales, directas o indirectas que pudieran alterar la calidad del
agua en un rea de cultivo de moluscos bivalvos.
3.28 Etiqueta, cualquier rtulo, marbete, inscripcin, imagen u otra materia descriptiva o grfica, escrita,
impresa, estarcida, marcada, grabada en alto o bajo relieve, adherida, sobrepuesta o fijada al envase del
producto preenvasado o, cuando no sea posible por las caractersticas del producto, al embalaje.
3.29 Eviscerado, a la accin de retirar las vsceras.
3.30 Expendio, rea o establecimiento donde se exhiben o comercializan los productos objeto de esta
norma.
3.31 Inocuo, al que no causa dao a la salud.
3.32 Lmite mximo, a la cantidad establecida de aditivos, microorganismos, parsitos, materia extraa,
plaguicidas, radionclidos, biotoxinas, residuos de medicamentos, metales pesados y metaloides, entre otros,
que no se deben exceder en un alimento, bebida o materia prima.
3.33 Lote, a la cantidad de producto, elaborado en un mismo ciclo, integrado por unidades homogneas, e
identificado con un cdigo especfico.
3.34 Marea roja, evento natural de incremento de la biomasa fitoplanctnica en una regin en particular,
donde la o las especies dominantes son generadoras de biotoxinas marinas. Tambin se denomina
Florecimiento de Algas Nocivas (FAN).
3.35 Materia extraa, a la sustancia, resto o desecho orgnico o inorgnico, ajeno al producto, que se
presenta por contaminacin o por malas prcticas de fabricacin e higiene del mismo durante su proceso,
considerndose entre otros: excretas, pelos de cualquier especie, huesos, insectos, vidrio, madera, metal o
joyera.
3.36 Metal pesado y metaloide, a los elementos qumicos que tienen un peso atmico entre 63 y 208 y
una gravedad especfica mayor de 4,0; que por su naturaleza presenta una gran reactividad y que
dependiendo de su concentracin, forma qumica o su acumulacin en el organismo, pueden causar efectos
indeseables en el metabolismo.
3.37 Mtodos de prueba, al procedimiento tcnico utilizado para la determinacin de parmetros o
caractersticas de un producto, proceso o servicio.
3.38 Molusco bivalvo, todas las especies de moluscos lamelibranquios que se alimentan por filtracin,
que cuentan con dos valvas, ejemplo ostiones, mejillones o almejas.
3.39 Parsito, al organismo que vive a expensas de otro organismo vivo, provocndole dao.
3.40 Pasteurizacin, tratamiento trmico que generalmente se realiza a temperatura por debajo de los
100C y se aplica para la destruccin de microorganismos patgenos viables y la inactivacin de enzimas.
3.41 Proceso, al conjunto de actividades relativas a la obtencin, elaboracin, fabricacin, preparacin,
conservacin, mezclado, acondicionamiento, envasado, manipulacin, transporte, distribucin, almacenamiento
y expendio o suministro al pblico de productos.
3.42 Producto a granel, al producto que debe pesarse, medirse o contarse en presencia del consumidor
al momento de su venta.
3.43 Producto de la pesca, a cualquier producto para consumo humano, derivado en parte o su totalidad
de los recursos de la flora y fauna acuticas, sean peces, crustceos, moluscos, equinodermos.
3.44 Producto de la pesca congelado, a los peces, crustceos, moluscos, equinodermos, u otros
animales y vegetales que han sido objeto de un proceso de disminucin de temperatura lo suficientemente
bajo para conservar la calidad sanitaria.
3.45 Producto de la pesca fresco refrigerado, es aquel que cumpliendo con las normas microbiolgicas
e higinicas establecidas no ha sido sometido a proceso alguno de conservacin, excepto la refrigeracin
mecnica o el enhielado.
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3.46 Producto de la pesca procesado, es aquel que ha sido sometido a un proceso tecnolgico para su
conservacin y su consumo posterior, a excepcin de los refrigerados y congelados.
3.47 Producto preenvasado, al producto que cuando es colocado en un envase de cualquier naturaleza,
no se encuentra presente el consumidor y la cantidad de producto contenido en l no puede ser alterada, a
menos que el envase sea abierto o modificado perceptiblemente.
3.48 Rastreabilidad, la capacidad para seguir el desplazamiento de los productos de la pesca a travs de
una o varias etapas especificadas de su proceso, conocido tambin como trazabilidad.
3.49 Refrigeracin, al mtodo fsico de conservacin con el cual se mantiene la temperatura interna de un
producto a mximo 4C.
3.50 Reinstalacin, proceso utilizado para movilizar moluscos bivalvos cosechados en reas clasificadas
como restringidas o condicionalmente restringidas, a un rea de cosecha clasificada como aprobada o
condicionalmente aprobada, con el propsito de reducir la presencia de microorganismos patgenos, mismos
que se determinan mediante el indicador del grupo coliforme (coliformes fecales o E. coli), utilizando la
permanencia en este ambiente como proceso de tratamiento.
3.51 Residuos de medicamentos veterinarios, compuestos qumicos que pueden encontrarse en la
materia prima, producto en proceso o producto terminado, derivados de su aplicacin en la acuicultura, y que
representa riesgo a la salud humana.
3.52 Salazn en seco, procedimiento que consiste en mezclar el pescado con sal, azcar y/u otros
ingredientes secos aptos para consumo humano, de manera que los lquidos secretados se eliminen.
3.53 Salmuera, solucin de sal en agua, que puede contener azcar y/u otros ingredientes aptos para
consumo humano.
3.54 Sistema PEPS (primeras entradas-primeras salidas), serie de operaciones que consiste en
garantizar la rotacin de los productos de acuerdo a su fecha de recepcin, su vida til o vida de anaquel.
3.55 Subproducto, material generado durante la produccin de un producto principal, que se puede
utilizar como materia prima para otros productos, los cuales pueden ser apto o no para consumo humano.
3.56 Tratamiento trmico, mtodo fsico que consiste en someter a una fuente de calor suficiente por un
tiempo apropiado al producto, antes o despus de ser envasado en recipientes de cierre hermtico con el fin
de lograr una estabilidad biolgica.
3.57 Transporte, al vehculo, remolque o contenedor, elevadores, montacargas, escaleras mecnicas,
bandas u otros en el se trasladan los productos objeto de esta norma.
3.58 Veda sanitaria, medida de seguridad consistente en la prohibicin temporal o permanente para
captura, comercializacin y consumo de productos de la pesca para consumo humano, con el objeto de
proteger la salud de la poblacin.
3.59 Zonas de produccin y extraccin (captura) de los productos de la pesca, zona geogrficamente
delimitada en la cual la autoridad competente emite un permiso o concesin acucola, para la explotacin
comercial de determinadas especies acuticas.
4. Smbolos y abreviaturas
4.1 Cuando en esta Norma se haga referencia a los siguientes smbolos y abreviaturas se entiende por:
Aw
actividad de agua
BPF
buenas prcticas de fabricacin
grado Celsius
GR
grado reactivo
hora
cm
centmetro
gramo
HPLC
siglas en ingls de cromatografa de lquidos de alta resolucin
kg
kilogramo
litro
mg
miligramo
mL
mililitro
ppm
partes por milln
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min
minutos
microgramo
normalidad
mm
milmetro
NMP
nmero ms probable
No
Nmero
SO2
dixido de azufre
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Ton
tonelada
pH
potencial de hidrgeno
P2O5
pentxido de fsforo
PEPS
primeras entradas-primeras salidas
UFC
unidades formadoras de colonias
UR
unidades ratn
volumen
por ciento
ms menos
menos
por
>
mayor que
>
mayor o igual que
<
menor que
igual
4.2 Cuando en la presente norma se mencione:

Acuerdo,
debe entenderse que se trata del Acuerdo por el que se determinan las sustancias
permitidas como aditivos y coadyuvantes en alimentos, bebidas y suplementos alimenticios.
Ley,
debe entenderse que se trata de la Ley General de Salud.
Reglamento, debe entenderse que se trata del Reglamento de Control Sanitario de Productos y Servicios.
5. Clasificacin
Los productos objeto de esta norma por el tratamiento al que han sido sometidos se clasifican en:
5.1 Productos de la pesca frescos, refrigerados y congelados; y
5.2 Productos de la pesca procesados, los que a su vez se clasifican en:
5.2.1 Productos cocidos refrigerados y congelados.
5.2.2 Envasados en recipientes de cierre hermtico y sometido a tratamiento trmico.
5.2.2.1 Esterilizados comercialmente.
5.2.2.2 Pasteurizados.
5.2.3 Ahumados.
5.2.4 Salados y secos-salados.
5.2.5 Semipreparados.
5.2.6 Crudos o precocidos empanizados o rebozados y congelados.
5.2.7 Crudos marinados o en salmuera.
5.2.8 Emulsionados.
6. Prcticas de higiene y sanidad
Los productos objeto de esta norma, deben de cumplir las siguientes especificaciones:
6.1 En el proceso de los productos objeto de esta norma, se debe cumplir con lo establecido en la NOM251-SSA1-2009, sealada en el apartado de referencias.
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6.2 Todas las materias primas empleadas en la elaboracin de los productos deben cumplir con los
ordenamientos legales aplicables.
6.3 Control documental del proceso.
6.3.1 Adicionalmente a lo establecido en otros ordenamientos se debe contar con la documentacin
establecida en la tabla No 1 y cumplir con lo siguiente:
6.3.1.1 Los registros o bitcoras deben estar foliados o numerados,
6.3.1.2 Contar con documentos que demuestren la veracidad de la informacin
6.3.1.3 Conservarse por lo menos durante el tiempo establecido en la NOM-128-SSA1-1994, sealada en
el apartado de referencias.
6.3.1.4 Todos los documentos deben contar con los datos que permitan identificar a la persona que
supervisa.
Tabla No. 1. Informacin adicional de las diferentes etapas del proceso.
REGISTRO DE:
Recepcin de
materias primas
INFORMACION
Origen (zona de captura o produccin, rastreable por lote de produccin,
cuando aplique).
Condiciones de recepcin, conservacin y transporte, cuando aplique.
El informe de resultados de anlisis, adems debe incluir: nombre comn y
cientfico de la materia prima, condiciones de toma y transporte de muestra
(caractersticas de la muestra), fecha de anlisis.
Almacenamiento del
producto
Control del Sistema PEPS.
Area de proceso
Temperatura del rea.

Temperatura y tiempo, durante la manipulacin y el procesamiento del producto.
Determinacin de cloro residual en el agua utilizada en el proceso, como
mnimo una vez al da al inicio del proceso, incluir hora en que se realiza la
determinacin.
Informe de resultados de anlisis microbiolgicos y fisicoqumicos, como mnimo
semestralmente.
Distribucin de
producto terminado
Condiciones de transporte y comercializacin.
Control o
erradicacin de
fauna nociva
Hojas tcnicas de las sustancias.
Control de destino del producto por lotes que garantice su rastreabilidad.
Estado de salud del Tipo de anlisis, al menos deben realizarse exudado farngeo
coproparasitoscpico, es recomendable adems realizar reacciones febriles.
personal del rea de
produccin y
Fecha de anlisis.
expendio, en su caso
Resultados y en su caso seguimiento.
Laboratorio responsable.
Mantenimiento del
equipo
Tipo de mantenimiento (preventivo o correctivo).
Lo anterior de conformidad con el trmite SSA-04-015. Conservacin de informacin sobre el proceso de

produccin y con el SSA-04-022. Conservacin de registros de los parmetros de operacin en
establecimientos dedicados al proceso de productos de la pesca y sus derivados.
6.4 Embarcaciones de pesca y recoleccin.
6.4.1 Las embarcaciones pesqueras deben contar al menos con una bodega exclusiva para la
conservacin refrigerada o congelada de los productos de captura. Las embarcaciones menores deben tener
contenedores empleados exclusivamente para almacenar producto.
6.4.2 Las bodegas deben reunir los siguientes requisitos:
6.4.2.1 Estar aislada trmicamente;
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6.4.2.2 Estar revestida interiormente con materiales resistentes a la corrosin, lisos y de fcil limpieza y
desinfeccin.
6.4.2.3 Las bodegas de almacenamiento de productos de la pesca deben estar separadas de las salas de
mquinas, de los cuartos de servicio de la tripulacin y no podrn ser usados para productos que por su
naturaleza puedan contaminarlos.
6.4.2.4 En caso de que los almacenes se utilicen para otro fin el responsable de la embarcacin deben
garantizar que cuenten con los utensilios, procedimientos y productos para la limpieza y desinfeccin que
garanticen que los productos de la pesca no puedan contaminarse.
6.4.2.5 Contar con sistemas que garanticen la conservacin del producto.
6.4.2.6 Cuando se conserven productos de la pesca enhielados; deben contar con un sistema de drenaje
que permita la salida del agua de fusin.
6.4.3 Las embarcaciones pesqueras menores, deben estibar el producto en recipientes con suficiente hielo
que garantice su conservacin. Este tipo de embarcaciones no deben mantener el producto en estas
condiciones por periodos mayores de veinticuatro horas.
6.4.4 Las embarcaciones pesqueras que estn provistas de un sistema de refrigeracin no deben
mantener el producto en estas condiciones por periodos mayores de veinticinco das.
6.4.5 Las embarcaciones pesqueras de mediana altura y mayores, deben disponer de un sistema de
abastecimiento de agua potable abundante o de agua de mar limpia. Asimismo, deben contar con un sistema
de desinfeccin, con el fin de facilitar el lavado y saneamiento de las reas de confinacin del producto y
limpieza general del barco, antes de salir del puerto y despus de la descarga.
6.4.6 Las embarcaciones, partes y equipos empleados para la extraccin, deben quedar libres de
pescados, mariscos o fragmentos de stos, as como de otras materias orgnicas susceptibles de
descomposicin que puedan contaminar el producto, en su caso se pueden lavar con agua potable o agua de
mar limpia antes o despus de cada operacin de pesca o por lo menos una vez al da.
6.4.7 La cubierta y todo el equipo de cubierta, inmediatamente despus de descargar la captura, debe
limpiarse, desinfectarse y, en su caso, enjuagarse.
6.4.8 Los productos de la pesca enhielados o refrigerados deben mantenerse a 4C como mximo, y a 7C
en el caso de los productos vivos; mientras que los congelados deben mantenerse a 18C como mximo, y
para los pescados enteros congelados en salmuera y destinados a la fabricacin de conservas, se pueden
tolerar temperaturas no superiores a 9C.
6.5 Extraccin o cosecha de moluscos bivalvos.
6.5.1 La extraccin o cosecha y manejo de los moluscos bivalvos debe sujetarse a lo siguiente:
6.5.1.1 Extraerse o cosecharse de reas aprobadas, aprobadas condicionalmente, condicionalmente
restringidas o restringidas bajo vigilancia sanitaria y libres de marea roja.
6.5.1.2 Ser inocuos, o en caso de provenir de reas condicionalmente restringidas o restringidas,
someterse a un proceso de reinstalacin, depuracin, pasteurizacin, tratamiento trmico u otro proceso que
garantice la eliminacin de organismos patgenos. Estos procesos deben llevarse a cabo mediante
lineamientos tcnicos sujetos a evaluacin por parte de la autoridad.
6.5.1.3 Lavarse con agua de mar limpia procedente de rea aprobada o con agua potable.
6.5.1.4 Realizar el almacenamiento hmedo en contenedores o flotadores en cuerpos naturales de agua o
en tanques que contengan agua de mar natural o sinttica. Este proceso debe llevarse a cabo de conformidad
con lineamientos tcnicos sujetos a evaluacin por parte de la autoridad.
6.5.1.5 Almacenarse de tal forma que se eviten abrasiones, en bodegas ventiladas y libres de fauna nociva
o domstica.
6.5.1.6 Lavarse, en caso de separacin de la concha, con agua potable y manipularse rpidamente, para
su inmediata refrigeracin, congelacin o venta.
6.5.2 Para la depuracin de los moluscos bivalvos, se debe observar lo siguiente:
6.5.2.1 La cantidad de agua que reciban debe ser de mar, limpia, continua y suficiente para el volumen de
organismos por depurar, el cual no debe ser superior a la capacidad del centro o rea de depuracin.
6.5.2.2 El funcionamiento del sistema de depuracin debe permitir que los moluscos bivalvos vivos
vuelvan a alimentarse por filtracin, eliminen los residuos contaminantes y se mantengan con vida en
condiciones adecuadas despus de la depuracin previa a envasado, almacenamiento y transporte anteriores
a la puesta en el mercado.
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6.5.2.3 Los lotes de organismos no se deben mezclar, a menos que los procesadores cuenten con un
procedimiento de mezclado sujeto a evaluacin y vigilancia por parte de la autoridad sanitaria.
6.5.2.4 Independientemente del proceso de depuracin empleado, su duracin no debe ser inferior a las
48 h.
6.5.3 La duracin del proceso de reinstalacin debe ser al menos de 15 das, y la eficiencia del proceso
estar sujeta a evaluacin por parte de la autoridad sanitaria, en trminos de las disposiciones jurdicas
aplicables.
6.6 Manejo de producto a bordo.
6.6.1 El producto capturado, al ser descargado en la cubierta de las embarcaciones, debe manipularse
cuidando que no se golpee o dae y se evite su contaminacin.
6.6.2 En el momento que sea factible y de acuerdo a la naturaleza del producto, se debe lavar y en su
caso, extraerle las vsceras, evitando que los desperdicios entren en contacto con los productos destinados al
consumo humano. El producto se debe mantener enhielado, en refrigeracin o en congelacin hasta que sea
entregado para su procesamiento.
6.6.3 El producto, una vez libre de vsceras, cabeza o concha, debe lavarse con agua de mar limpia o
agua potable; en el caso de los pescados, esto debe hacerse hasta que cese el sangrado.
6.6.4 Para los productos enhielados, la cavidad abdominal del pescado libre de vsceras, debe llenarse
con hielo y cubrirse con el mismo al estibarlo. El hielo que haya sido previamente utilizado con algn otro
propsito, no debe ser usado para enfriar el producto.
6.6.5 Las vsceras, as como los desechos destinados al consumo animal o al uso industrial no alimentario,
deben conservarse en condiciones que eviten su descomposicin y separarlos de los de consumo humano.
6.6.6 La descarga debe realizarse en recipientes limpios y en el menor tiempo posible, cuidando que no
sea lanzado desde la bodega a la cubierta, a la plataforma del muelle o al medio de transporte.
6.7 Equipo.
6.7.1 Todo el equipo empleado para lavar, manipular, transportar, enfriar y almacenar los productos de la
pesca a bordo de las embarcaciones y en los establecimientos debe ser de material resistente, liso e inocuo,
que permita su fcil limpieza y desinfeccin y encontrarse en buen estado de mantenimiento.
6.7.2 Los recipientes, equipo y utensilios que se empleen en la manipulacin, almacenamiento o
transporte de los productos pesqueros, a bordo de las embarcaciones y en los establecimientos en tierra
deben por lo menos limpiarse al final de la jornada y desinfectarse al inicio de la jornada y, en su caso,
enjuagarse con agua potable, o agua de mar limpia.
6.8 Establecimientos.
6.8.1 Deben permitir la limpieza y desinfeccin de las reas, y el flujo lineal y continuo de los productos
desde su recepcin hasta su embarque, as como del rea personal y de los materiales, de tal forma que se
evite la contaminacin del producto en todo momento.
6.8.2 Los agentes de limpieza y desinfeccin no deben estar en las reas de proceso cuando se realice la
manipulacin del producto ni emplearse de forma que provoquen su contaminacin o adulteracin.
6.8.3 Las reas e instalaciones para lavado y/o desinfeccin de materias primas, productos, utensilios y
equipo y para manos del personal deben estar identificadas
6.8.4 Para las reas de proceso en donde el producto est expuesto debe cumplir con lo siguiente:
6.8.4.1 El rea de recepcin debe estar cubierta, limpia y ser especfica para la actividad.
6.8.4.2 Las cmaras de refrigeracin y congelacin deben estar construidas con materiales resistentes a la
corrosin, tener acabados lisos, ser de fcil limpieza y desinfeccin.
6.8.5 Se debe contar con almacenes especficos para: ingredientes, aditivos y material de empaque.
6.8.6 Se debe contar con depsito de hielo, cmaras frigorficas o almacn para producto refrigerado o
congelado, segn el caso.
6.8.7 Despus de ser lavados y desinfectados, los equipos y utensilios de trabajo que no se estn
utilizando, deben estar protegidos de cualquier forma de contaminacin.
6.8.8 Se debe contar con reas especficas para el lavado y desinfeccin de botas y mandiles, as como
para el secado y escurrido de stos, con los correspondientes accesorios.
6.8.9 Se debe contar con un rea especfica de vestidores que cuente con un lugar para guardar los
objetos personales.
6.9 Procesamiento de los productos de la pesca.
(Segunda Seccin)
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6.9.1 Se debe contar con un sistema de potabilizacin que asegure la calidad sanitaria del agua utilizada
en el proceso. El mantenimiento del mismo es responsabilidad del procesador, de acuerdo a las
especificaciones establecidas por el fabricante del equipo.
6.9.2 El hielo que se utilice en la conservacin y proceso de los productos objeto de esta norma debe
cumplir con lo establecido en la NOM-201-SSA1-2002, sealada en el apartado de referencias.
6.9.3 La industrializacin de los subproductos de la pesca no destinadas a consumo humano debe
realizarse en reas separadas fsicamente de aquellas en que se elaboren productos destinados al consumo
humano.
6.9.4 La temperatura de las cmaras utilizadas para conservar el producto congelado debe garantizar que
la temperatura en el centro trmico de los productos se mantenga a -18C o inferior.
6.9.5 La temperatura de las cmaras utilizadas para conservar el producto refrigerado debe garantizar que
la temperatura del centro trmico de los productos, se mantenga a 4C o inferior, y de 7C o inferior en el caso
de moluscos bivalvos.
6.9.6 El producto en el que se sospeche la presencia de parsitos debe ser sujeto a un tratamiento previo
de congelacin a -18C o menor por un tiempo no inferior a 24 horas.
6.9.7 La temperatura de las cmaras de refrigeracin deben leerse y registrarse por lo menos cada 4
horas, o deben utilizarse registros continuos y automticos. Las cmaras utilizadas para congelar y conservar
el producto a esta temperatura deben contar nicamente con registros continuos y automticos.
6.9.8 Durante el lavado de los productos de la pesca, se debe utilizar agua potable fra o agua de mar
limpia, cuando aplique y disponer de instalaciones adecuadas para la manipulacin.
6.10 Descongelacin.
6.10.1 El mtodo de descongelacin aplicado a los productos no debe representar una fuente de
contaminacin para el mismo. La temperatura interna del producto no debe exceder los 4C.
6.10.2 La descongelacin se debe efectuar en lugares cerrados y en condiciones de higiene.
6.10.3 Cuando se emplee agua como medio de descongelacin sta debe ser potable, y la circulacin
debe ser suficiente para lograr una descongelacin uniforme.
6.11 Manejo de desechos.
6.11.1 Las embarcaciones pesqueras y los establecimientos deben eliminar sus desechos, de conformidad
con las disposiciones aplicables.
6.11.2 Los recipientes para despojos y materiales de desecho, deben ser de material impermeable.
6.12 Personal.
6.12.1 La empresa debe asegurarse que al inicio de cada turno, el personal del proceso cuente con el
equipo de trabajo como son los mandiles, guantes, botas y cofias en condiciones higinicas, batas,
cubreboca, pantaln, camisolas, zapatos cerrados, overoles, ropa trmica o cualquier otra indumentaria para
la realizacin de sus actividades.
6.12.2 El personal no podr usar la indumentaria de trabajo fuera del establecimiento. As mismo el
personal de las reas sucias no debe ingresar hacia reas limpias para evitar posibles contaminaciones y si
regresara a reas de proceso debe tomar las medidas de higiene necesarias.
6.13 Transporte.
6.13.1 Los vehculos destinados al transporte de los productos de la pesca deben cumplir con los
siguientes requisitos sanitarios, segn corresponda:
6.13.1.1 Los acabados del interior de la caja deben ser de material resistente a la corrosin, de fcil
limpieza y desinfeccin y encontrarse en buen estado de mantenimiento y en su caso, contar con un sistema
para el drenaje del agua de deshielo.
6.13.1.2 Los productos no deben entrar en contacto directo con pisos y paredes.
6.13.2 El transporte de los productos de la pesca frescos, con duracin mxima de 5 horas, puede
efectuarse en vehculos de caja abierta o de plataforma siempre y cuando el producto enhielado se coloque
dentro de contenedores cerrados que permitan la salida de agua de fusin.
6.13.3 El enhielado debe hacerse colocando, capas alternas de hielo triturado hasta una altura mxima de
un metro; la primera y ltima capas deben ser de hielo. Para el caso de los moluscos bivalvos, el enhielado
debe garantizar que no se altera dicha condicin.
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(Segunda Seccin)
6.13.4 El transporte de los productos de la pesca con una duracin mayor de ms de 5 horas de
transportacin, debe contar con sistemas de refrigeracin o congelacin e indicador y registrador de
temperatura.
6.13.5 El transporte de los productos de la pesca refrigerados se debe realizar a una temperatura de 4C
como mximo y 7C en caso de los productos vivos.
6.13.6 El interior de las cajas de los vehculos, los recipientes empleados para el estibado y dems
superficies que estn en contacto con el producto, deben lavarse con agua potable y desinfectarse antes y
despus de cada viaje.
6.14 Expendio.
6.14.1 En las reas donde se expendan los productos de la pesca frescos refrigerados, no podrn ser
utilizadas para elaborar productos de la pesca procesados o alimentos preparados.
6.14.2 Deben contar con un rea especfica para almacenar los productos, ya sea enhielado, refrigerado o
congelado.
6.14.3 Se debe contar con un rea especfica para productos no aptos para consumo.
6.14.4 El hielo que se emplee debe cumplir con lo siguiente:
6.14.4.1 Ser para consumo humano.
6.14.4.2 Almacenarse de tal forma que se evite su contaminacin.
6.14.4.3 El que se haya utilizado para conservar los productos no debe ser reutilizado.
6.14.5 No deben permanecer en esta rea productos en envases abiertos o con la envoltura rota.
6.14.6 La estiba, debe realizarse de manera que se evite el rompimiento y exudacin de empaques y
envolturas.
6.14.7 Las unidades de refrigeracin y congelacin, deben contar con termo-registradores con termmetro
en lugar visible que permitan monitorear la temperatura.
6.14.8 El importador, distribuidor y comercializador, cada uno en el mbito de su responsabilidad, deben
observar que se mantengan las condiciones de almacenamiento establecidas en este ordenamiento.
6.14.9 Los productos de la pesca que se presenten para su exhibicin y venta al pblico, deben colocarse
en mostradores de material resistente, con superficie lisa, y de fcil limpieza y desinfeccin, con inclinacin
necesaria para permitir el escurrimiento del agua de deshielo. Si la exhibicin y venta se realiza en charolas,
stas deben ser de material inocuo u otro material anticorrosivo que sea de fcil limpieza y desinfeccin o
desechables.
6.14.10 Durante el pesado del producto, se debe evitar el contacto directo con las bsculas.
6.14.11 Los utensilios de corte debern permanecer en solucin desinfectante cuando no se estn
utilizando.
6.14.12 Las unidades de refrigeracin deben mantenerse a una temperatura que permita al producto
permanecer a no ms de 4C en forma constante. Asimismo, las unidades de congelacin deben mantenerse
a una temperatura que garantice que los productos mantengan una temperatura de -18C en el centro trmico.
Ambas unidades deben contar con termmetros en lugar visible.
6.15 Disposiciones especficas.
6.15.1 Productos cocidos refrigerados y congelados.
6.15.1.1 Los productos congelados no envasados, inmediatamente, deben glasearse o empacarse para
protegerlos contra la deshidratacin y la oxidacin, durante su permanencia en el almacn frigorfico.
6.15.1.2 Los productos de la pesca, que se utilicen como materia prima deben conservarse refrigerados o
congelados, con la excepcin de los moluscos bivalvos vivos, que deben manejarse enhielados o con
refrigeracin mecnica.
6.15.1.3 La recepcin de los productos objeto de este proceso deben ser vivos para langosta, cangrejo o
jaibas y moluscos bivalvos, y frescos para camarn.
6.15.1.4 El rea de recepcin de estos productos podr contar con estanques para la conservacin del
producto vivo antes de su proceso, los cuales contarn con equipos para la recirculacin de agua de mar
limpia.
6.15.1.5 Para el adormecimiento de estos productos se debe emplear agua potable o agua de mar limpia;
adicionalmente se podr utilizar metabisulfito de sodio.
6.15.1.6 El rea de cocimiento de los productos debe ser independiente del rea destinada a la recepcin.
(Segunda Seccin)
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6.15.1.7 Para el cocimiento se debe contar con instalaciones que proporcionen una fuente de
calentamiento que no est en contacto directo con el agua de coccin. En caso de utilizar vapor como fuente
de calor se debe contar con instalaciones que eviten que sus residuos contaminen el producto.
6.15.1.8 La temperatura de coccin de los productos debe ser en su centro trmico de 82 a 93C, y podr
adicionarse hasta 5% de cloruro de sodio.
6.15.1.9 Una vez concluida la coccin se debe iniciar el enfriamiento del producto cocido en agua fra a
una temperatura no superior de 4C por un tiempo suficiente hasta alcanzar una temperatura inferior a 30C
en el centro trmico del mismo. Para el enfriamiento del agua se podr emplear hielo y/o equipos de
refrigeracin. El agua empleada para enfriamiento no debe reutilizarse.
6.15.1.10 Seguido del enfriamiento los productos deben someterse a un lavado con agua potable a
presin con el fin de eliminar los residuos que se acumulen durante la coccin.
6.15.1.11 Posterior al lavado los productos se deben refrigerar, por un tiempo suficiente para alcanzar una
temperatura de 4C en su centro trmico, de esta operacin se deben llevar registros grficos de tiempo y
temperatura. Cuando por exceso de agua se someta el producto a un escurrimiento o estilado previo a la
refrigeracin, con el fin de eliminar el agua residual, esta operacin se debe efectuar en charolas y en un rea
separada de donde se efecte la coccin y la recepcin. El escurrido no debe ser superior a 4 horas y la
temperatura del rea debe permanecer entre 15 y 20C.
6.15.1.12 Posterior a la refrigeracin se debe realizar el empaque ya sea de manera individual o en forma
colectiva. El rea de empaque debe mantenerse a una temperatura entre 15 y 20C y en ningn momento el
producto debe sobrepasar los 4C en su centro trmico.
6.15.1.13 Una vez empacado, el producto debe congelarse y conservarse a temperatura de 18C o
inferior, y debe contarse con registro grfico de las temperaturas hasta su embarque.
6.15.1.14 Una vez terminada la coccin y de acuerdo a la naturaleza del producto, se podr emplear
equipo de Congelacin Rpida Individual (IQF), siempre y cuando esta operacin sea seguida del empaque.
6.15.2 Productos envasados en recipientes de cierre hermtico y sometidos a tratamiento trmico.
Los productos envasados en recipientes de cierre hermtico sometidos a tratamiento trmico, adems de
cumplir con lo establecido en la Norma Oficial Mexicana NOM-130-SSA1-1995, sealada en el apartado de
referencias, deben cumplir con lo siguiente:
6.15.2.1 Pasteurizados.
6.15.2.1.1 Una vez terminada la etapa de enfriamiento y de acuerdo a la naturaleza del producto, ser
enviado al rea de separacin de carne y seleccin, la cual debe ser un rea independiente y con temperatura
medio-ambiental de entre 15 y 20C. El proceso de separacin de la carne, limpieza y clasificacin no debe
superar las 4 horas y durante esta fase el producto no podr superar una temperatura de 4C.
6.15.2.1.2 En el caso de que el producto cocido se refrigere para su posterior seleccionado o pelado, el
almacenamiento no debe superar las 18 horas hasta su tratamiento trmico posterior.
6.15.2.1.3 Con el fin de eliminar completamente los restos de caparazn o concha de la carne,
adicionalmente se podrn inspeccionar con luz negra o luz ultravioleta.
6.15.2.1.4 Una vez separada la carne y de acuerdo a la naturaleza del producto, se proceder al envasado
y cerrado en recipientes que estn diseados para el procesamiento trmico. En el caso de cerrado con
sistemas de doble cierre se deben efectuar pruebas peridicas y llevar registros que evalen la efectividad del
mismo.
6.15.2.1.5 Cuando se utilicen materiales para el envasado distintos a los recipientes descritos en el punto
anterior la empresa debe efectuar pruebas para la evaluacin de los cierres de dichos envases de acuerdo a
las especificaciones del fabricante. En todo momento el material utilizado para el envasado del producto debe
garantizar la impermeabilidad del mismo.
6.15.2.1.6 El equipo debe contar entre sus componentes con un sistema para graficar las constantes de
temperatura y tiempo como mnimo, as como con un termmetro de mercurio u otro equivalente que pueda
ser calibrado y/o certificado.
6.15.2.1.7 Si se utilizan procedimientos de pasteurizacin con sistemas de inmersin en agua caliente, la
tina con el agua de cocimiento debe ser precalentada de acuerdo a las especificaciones del proceso,
asimismo la circulacin de agua y la temperatura se debe mantener constante durante el tiempo del proceso.
6.15.2.1.8 Una vez pasteurizados los productos deben someterse a enfriamiento con agua potable a una
temperatura no superior a 4C. El proceso de enfriamiento concluir cuando los productos hayan alcanzado
una temperatura de 4C en su centro trmico, y una vez terminado el enfriamiento deben ser sometidos a
refrigeracin. Se deben implementar controles de cinta testigo o tinta termosensible que permitan distinguir un
producto no pasteurizado de uno pasteurizado.
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(Segunda Seccin)
6.15.2.1.9 Se deben llevar controles grficos de la temperatura de conservacin durante la refrigeracin de

los productos pasteurizados hasta su distribucin.
6.15.2.1.10 Los estudios de penetracin de calor deben ser revalidados despus de que se efecten
mantenimientos mayores a los equipos o por lo menos cada 2 aos de la operacin continua del equipo.
6.15.2.2 Esterilizados comercialmente.
6.15.2.2.1 Se debe contar con un estudio de penetracin de calor para cada uno de los productos que
sean sometidos a tratamiento trmico, el cual debe estar sustentado cientficamente.
6.15.2.2.2 No debe existir en una misma carga de la autoclave producto de la pesca envasado en
recipientes de cierre hermtico de distintos tamaos.
6.15.2.2.3 Durante el manejo del envase se debe cuidar que ste no sufra dao fsico y evitar la corrosin.
6.15.2.2.4 Precoccin y otros tratamientos previos.
6.15.2.2.4.1 Se debe contar con control de parmetros de tiempo y temperatura por escrito.
6.15.2.2.4.2 Se debe tener cuidado para evitar que las especies susceptibles de desarrollar histamina
alcancen una temperatura mayor a 4C, si esto sucede, el tiempo de exposicin no debe ser mayor a cuatro
horas, antes de la precoccin.
6.15.2.2.4.3 Con la excepcin de los productos que se envasan an calientes, el enfriamiento del producto
precocido debe efectuarse con la mayor rapidez posible, con el fin de evitar la proliferacin o produccin de
toxinas, y en condiciones que eviten la contaminacin del producto.
6.15.2.2.5 Los establecimientos deben destinar un rea de cuarentena, para el control interno de una
muestra representativa de los productos con pH > 4,6 con el fin de comprobar que: la manipulacin de los
ingredientes antes del tratamiento, el tratamiento trmico, el enfriamiento y el cierre del envase fueron los
adecuados. Durante este tiempo se realizarn pruebas de incubacin de 30 a 37C durante 10-14 das, para
despus realizar anlisis microbiolgicos.
6.15.3 Ahumados.
6.15.3.1 Todos los pescados crudos que van a ser ahumados deben conservarse congelados o en su caso
refrigerados, hasta que vayan a ser procesados.
6.15.3.2 En el salado en seco, el producto debe regresarse al rea de refrigeracin o pasarse a la cmara
de ahumado inmediatamente despus de la aplicacin de la sal.
6.15.3.3 Cuando el proceso de ahumado se lleve a cabo con madera, sta no debe ser resinosa y debe
estar exenta de polvo y sustancias perjudiciales. No debe emplearse para la produccin de humo, madera que
haya sido pintada, barnizada o que haya sido expuesta a qumicos.
6.15.3.4 Los productos ahumados no deben presentar manchas rojizas o verdosas, de origen mictico o
microbiano.
6.15.3.5 El secado despus del ahumado debe llevarse a cabo a temperaturas de refrigeracin.
6.15.3.6 El producto ahumado debe mantenerse en refrigeracin a una temperatura mxima de 4C o en
congelacin a una temperatura mxima de -18C.
6.15.3.7 El pescado sometido al proceso de ahumado en caliente y aquel con sabor a humo, para ser
empacado, necesita calentarse continuamente a una temperatura interna de cuando menos 63C en todo el
pescado, por un mnimo de 30 minutos y salarse, para contener no menos de 3,0 por ciento de sal en base
hmeda en el producto terminado. En el caso de ser empacado al vaco en atmsfera modificada y controlada
necesita ser salado, para contener no menos de 3,5 por ciento de sal en base hmeda en el producto
terminado. El contenido de sal puede disminuir al 3,0 por ciento, siempre y cuando la temperatura a que se
someta no sea menor de 82C, durante 5 minutos o relacin equivalente.
6.15.3.8 El pescado sometido al proceso de ahumado en fro o aqul con sabor ahumado, que no es
empacado al vaco, debe ser salado en salmuera o salado en seco, para contener cuando menos 3,5 por
ciento de sal en base hmeda en el producto terminado. Sin embargo, cuando dicho pescado contiene no
menos de 100 mg/kg de nitrito de sodio debe contener no menos de 3,0 por ciento de sal en base hmeda en
el producto terminado. Cuando este tipo de producto se congela inmediatamente despus del ahumado y el
enfriamiento, y permanece en ese estado a lo largo de todo el almacenamiento, distribucin y
comercializacin subsecuentes, debe contener no menos de 2,5 por ciento de sal en base hmeda en el
producto terminado.
6.15.3.9 El pescado sometido a proceso de ahumado en fro y aqul con sabor a ahumado para ser
empacado al vaco, con atmsfera modificada o controlada, debe ser salado en salmuera o salado en seco,
para contener cuando menos 3,0 por ciento de sal en base hmeda en el producto terminado y no menos de
100 mg/kg de nitrito de sodio. Si no se utiliza el nitrito de sodio, el contenido de sal en base hmeda en el
producto terminado debe ser cuando menos de 3,5 por ciento.
(Segunda Seccin)
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6.15.3.10 Los lmites de contenido de sal citados en los puntos 6.15.3.7, 6.15.3.8 y 6.15.3.9 pueden
substituirse por cualquier combinacin de sal y otros aditivos permitidos que permitan obtener una Aw menor
a 0,95 en la temperatura de almacenaje.
6.15.4 Salados y secos-salados.
6.15.4.1 Generales
6.15.4.1.1 El producto no debe presentar las siguientes caractersticas: manchas rojizas o rosas, tejido
muscular blando, disgregacin de su fibra y olor putrefacto.
6.15.4.1.2 Deben almacenarse en un lugar seco, protegido contra la contaminacin y bien ventilado.
6.15.4.2 Salado
6.15.4.2.1 Las salmueras utilizadas en los productos deben estar preparadas con agua potable y sal grado
alimentario.
6.15.4.2.2 Se debe controlar con regularidad la salmuera con un salinmetro y mantener su concentracin
al nivel necesario aadiendo sal slida.
6.15.4.2.3 Si el pescado ha de permanecer en salmuera para alcanzar la maduracin, la primera debe
conservarse limpia, eliminando la espuma grasa que se forme.
6.15.4.3 Salazn en seco
6.15.4.3.1 Debe efectuarse en una cmara fra a una temperatura inferior de 7C.
6.15.4.3.2 En el salado en seco, el producto debe regresarse al rea de refrigeracin inmediatamente
despus de la aplicacin de la sal.
6.15.4.4 Desalazn
Cuando sea necesario desalar el producto debe emplearse agua potable, que se cambiar con la
frecuencia necesaria, hasta alcanzar la concentracin deseada.
6.15.4.5 Secado
El secado debe prevenir la formacin de la toxina de Clostridium botulinum.
7. Especificaciones sanitarias
7.1 Los productos objeto de esta norma, deben ajustarse a las siguientes especificaciones:
7.1.1 Sensoriales.
7.1.1.1 Productos vivos, frescos, refrigerados y congelados, deben presentar las siguientes caractersticas:
7.1.1.1.1 Pescados:
7.1.1.1.1.1 La piel debe estar hmeda y brillante, bien adherida a los tejidos subyacentes;
7.1.1.1.1.2 La mucosidad, en las especies que la posean, debe ser acuosa y transparente, sin olor que d
indicios de descomposicin;
7.1.1.1.1.3 Las branquias deben presentar un color brillante de rosado al rojo intenso, hmedas y
brillantes, que no sufre modificacin al tacto, con olor marino salino, suave o neutro, excepto las especies de
elasmobranquios, como el tiburn o la raya, donde pueden tener un ligero olor amoniacal;
7.1.1.1.1.4 El abdomen debe ser terso, sin diferencia externa con la lnea ventral; al corte, los tejidos
deben ofrecer resistencia; con el poro anal cerrado; las vsceras de colores vivos y bien diferenciados; las
paredes interiores brillantes, los vasos sanguneos llenos y resistentes a la presin digital; y con olor marino
salino, suave o neutro, excepto las especies de elasmobranquios, como el tiburn o la raya, donde pueden
tener un ligero olor amoniacal, y
7.1.1.1.1.5 Los msculos deben presentar elasticidad marcada, firmemente adheridos a los tejidos
subyacentes y que no se desprendan de ellos al ejercer presin digital; con el color brillante natural
caracterstico, al primer corte.
7.1.1.1.2 Crustceos frescos:
7.1.1.1.2.1 El exoesqueleto debe estar ligeramente hmedo, brillante y consistente, firmemente adherido
en sus secciones;
7.1.1.1.2.2 Los apndices deben ser resistentes y firmes, firmemente adheridos al cuerpo;
7.1.1.1.2.3 El olor debe ser marino salino, suave o neutro;
7.1.1.1.2.4 La piel debe estar lisa, hmeda y brillante, sin manchas rojizas o extraas a la especie;
7.1.1.1.2.5 El color debe ser el caracterstico de cada especie, y en algunas ocasiones a la estimulacin
pudiera cambiar;
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(Segunda Seccin)
7.1.1.1.2.6 El olor debe ser marino salino, suave o neutro, excepto algunas especies como el calamar, que
pueden tener un olor ligeramente amoniacal;
7.1.1.1.2.7 Las ventosas deben estar firmemente adheridas al cuerpo, enteras y bien definidas, con
succin, y en el caso del calamar deber estar presente la rdula;
7.1.1.1.2.8 En los productos con vsceras, stas deben estar completas, firmes y bien adheridas;
7.1.1.1.2.9 Contar con msculos hmedos, bien adheridos a las valvas y tener aspecto esponjoso, de color
cenizo claro en los ostiones y amarillento en las almejas y mejillones, los cuales pueden tener variaciones por
especie, y
7.1.1.1.2.10 En los gasterpodos el msculo debe estar firmemente adheridos a la concha, la cual debe
estar completa y dura.
7.1.2 Fsicas.
7.1.2.1 Materia extraa.
Los productos de la pesca frescos, refrigerados y congelados y procesados, deben estar exentos de
materia extraa.
7.1.3 Qumicas.
7.1.3.1 Productos frescos, refrigerados y congelados (Parte comestible)
ESPECIFICACION
Nitrgeno amoniacal
ESPECIES
LIMITE MAXIMO
Pescados (en msculo)
35 mg/100 g
Crustceos
100 mg/kg como SO2
Dixido de azufre
pH
Moluscos:
Histamina
Carne
6,0 6,5
lquido intravalvar
7,0 7,25
Peces de las familias: Clupeidae, Scombridae,

Scombresocidae, Pomatomidae y Coryphaenidae.
Tales como atn, bonito, macarela y sardinas.
100 mg/kg
7.1.3.2 Productos de la pesca procesados

ESPECIFICACION
LIMITE MAXIMO (mg/kg)
Histamina *
100
* Para especies de las familias Scombridae, Clupeidae, Coryphenidae, Scombresocidae y Pomatomidae.

7.1.4 Fisicoqumicas.
7.1.4.1.1 Salados y secos-salados
ESPECIFICACIONES
Aw
0,85
Humedad
40 %
Cloruro de sodio
20 %
7.1.5 Microbiolgicas.
7.1.5.1 Productos frescos, refrigerados y congelados (Parte comestible)
ESPECIFICACION
ESPECIES
Coliformes fecales y/o E.

coli
Vibrio cholerae O:1 y

O:1
no
LIMITE MAXIMO
Pescados y crustceos
400 NMP/g
Moluscos bivalvos
230 NMP/100 g de carne

y lquido valvar
Moluscos cefalpodos y gasterpodos
230 NMP/100 g de carne
Moluscos bivalvos
Ausente en 50 g
Dems productos de la pesca*
Ausente en 50 g
(Segunda Seccin)
DIARIO OFICIAL
Salmonella spp
Vibrio parahaemolyticus *
Todas
Ausente en 25 g
Moluscos bivalvos y crustceos
104 NMP/g
Moluscos bivalvos
Ausente en 50 g
Todas
Ausente en 25 g
Vibrio vulnificus *
Listeria monocytogenes*
Clostridium botulinum*
Todas (slo en productos preenvasados al vaco)
Ausente
Staphylococcus aureus
Todas
1000 UFC/g
Enterotoxinas
estafilococcicas *
Todas
Negativo
* Bajo situaciones de emergencia sanitaria la Secretara de Salud sin perjuicio de las atribuciones de otras
Dependencias del Ejecutivo Federal, determinar los casos en los que habr de identificar la presencia del
patgeno o la toxina.
7.1.5.2.1 Esterilizados comercialmente
ESPECIFICACION
LIMITE MAXIMO
Termfilos anaerobios esporulados
Negativo
Mesfilos anaerobios esporulados
Negativo
Termfilos aerobios esporulados
Negativo
Mesfilos aerobios esporulados
Negativo
Toxina botulnica*
Ausente en todo el contenido del envase
Enterotoxina estafilocccica*
Ausente en todo el contenido del envase
* Bajo situaciones de emergencia sanitaria la Secretara de Salud, sin perjuicio de las atribuciones de otras
dependencias del Ejecutivo Federal, determinar los casos para identificar la presencia de esta toxina.
7.1.5.2.2 Pasteurizados
ESPECIFICACIONES
Salmonella spp
LIMITE MAXIMO
Ausente en 25 g
Coliformes fecales y/o E. coli
Listeria monocytogenes *
Clostridium botulinum *
Vibrio cholerae O:1 y no O:1*
Vibrio parahemolitycus*
Negativo
< 10 UFC/g
Ausente en 25 g
Ausente
Ausente en 50 g
Negativo
dependencias del Ejecutivo Federal, determinar los casos para identificar la presencia del patgeno o la
toxina.
7.1.5.2.3 Ahumados
ESPECIFICACIONES
Coliformes fecales
LIMITE MAXIMO
< 230 NMP/g
Salmonella spp
Ausente en 25 g
Enterotoxina estafilocccica *
Negativo
Listeria monocytogenes *
Ausente en 25 g
Clostridium botulinum *
Ausente
Vibrio cholerae O:1*
Ausente en 50 g
Dependencias del Ejecutivo Federal, determinar los casos para identificar la presencia del patgeno o la
toxina.
7.1.5.2.4 Salados y secos-salados
ESPECIFICACION
LIMITE MAXIMO
Negativo
Salmonella spp
Ausente en 25 g
Dependencias del Ejecutivo Federal, determinar los casos para identificar la presencia de esta toxina.
DIARIO OFICIAL
(Segunda Seccin)
7.1.5.2.5 Semipreparados
Producto
Enterotoxina
estafilocccica*
Salmonella spp
Coliformes
fecales
Vibrio cholerae O:1

y no O:1
toxignico*
Crudos o precocidos, empanizados o

rebozados (capeados), empanadas y
congelados
Negativo
Ausente en 25 g
< 230 NMP/g
Ausente en 50 g
Crudos, marinados o en salmuera
Negativo
Ausente en 25 g
< 230 NMP/g
Ausente en 50 g
Dependencias del Ejecutivo Federal, determinar los casos para identificar la presencia del patgeno o la
toxina.
7.1.5.2.6 Emulsionados
ESPECIFICACION
LIMITE MAXIMO
Enterotoxina estafilocccica *
Negativo
Salmonella spp
Ausente en 25 g
Coliformes fecales
< 230 NMP/g
Dependencias del Ejecutivo Federal, determinar los casos para identificar la presencia de la toxina.
7.1.6 Parsitos.
7.1.6.1 Durante su produccin y antes del despacho al consumo humano, los pescados deben ser
sometidos a un examen a contraluz para detectar parsitos visibles.
7.1.6.2 Los pescados no deben exceder los siguientes lmites:
ESPECIFICACION
LIMITE MAXIMO
Parsitos del gnero Gnathostoma y Paragonimus (Slo

en peces de agua dulce o salobre)
Ausente
Parsitos con cpsula >3 mm de dimetro
2/kg de unidad de muestra
Parsitos no encapsulados > 10 mm de longitud
1/kg de unidad de muestra
7.1.7 Biotoxinas marinas.

ESPECIES
LIMITE MAXIMO
Toxina amnsica de moluscos (Acido domoico)*
ESPECIFICACION
Moluscos
20 mg/kg en carne
Toxina neurotxica de moluscos (Brevitoxina)
Moluscos
20 UR /100 g
Toxina paralizante de moluscos (Saxitoxina)
Moluscos
800g/kg de carne
Moluscos
160 g/kg
Peces de zonas tropicales

y subtropicales
2,5 UR / 100g
Toxina diarreca de Moluscos (Bioensayo en ratn)*

Toxina ciguatera (Ciguatoxina )
* Bajo situaciones de emergencia sanitaria la Secretara de Salud sin perjuicio de las atribuciones de otras
Dependencias del Ejecutivo Federal, determinar los casos en los que habr de identificar la presencia de la
toxina.
7.1.8 Metales pesados.
7.1.8.1 Productos frescos, refrigerados y congelados (parte comestible)
ESPECIFICACION
ESPECIES
LIMITE MAXIMO
Arsnico total
Crustceos y Moluscos bivalvos
80 mg/kg
Cadmio (Cd)
Moluscos
2,0 mg/kg
Otras
0,5 mg/kg
Metilmercurio
Pescados como atn, marln, mero, y bonito
1,0 mgkg
Otras
0, 5 mg/kg
Plomo (Pb)
0,5 mg/kg
Moluscos
1 mg/kg
(Segunda Seccin)
DIARIO OFICIAL

ESPECIFICACION
Cadmio (Cd)
0,5
Metilmercurio
1,0 pescados como atn, marln, mero, y bonito

0,5 otras
Plomo (Pb)
1,0
Estao (Sn)*
100,0
* Unicamente para los productos enlatados.

7.1.9 Residuos de medicamentos veterinarios.
Los productos objeto de esta Norma deben cumplir con las especificaciones establecidas para
medicamentos veterinarios conforme a los ordenamientos aplicables, considerando que en los productos no
debe detectarse residuos de cloranfenicol, nitrofuranos y sulfas.
7.1.10 Aditivos para alimentos.
Unicamente se permite el empleo de los aditivos en los niveles y productos establecidos en el apndice
normativo A de esta norma.
8. Clasificacin de reas
8.1 Para efectos de esta Norma las reas se clasifican de la siguiente manera, la cual debe demostrarse
mediante estudios sanitarios:
8.1.1 Area aprobada.
8.1.1.1 Aqulla que cumple con las especificaciones siguientes:
MICROORGANISMOS
Bacterias coliformes fecales
LIMITE MAXIMO
La mediana o el promedio geomtrico del NMP del agua, no excede de
14 NMP/100 mL y no mas del 10% de las muestras excede de 43
NMP/100mL para la prueba de dilucin decimal de 5 tubos. El promedio
geomtrico deber realizarse mediante un muestreo anual de 30
muestras de cada uno de los puntos de monitoreo.
8.1.1.2 El rea aprobada no debe encontrarse bajo los casos mencionados en los incisos del 8.1.5.1.1 al
8.1.5.1.4 del numeral 8.1.5.1.
8.1.1.3 Para mantener el estatus de rea aprobada, se debe realizar un monitoreo regular anual de agua y
producto.
8.1.2 Area aprobada condicionalmente.
8.1.2.1 Aqulla que cumple con el siguiente criterio:
Las reas de produccin que estn sujetas a contaminacin microbiolgica intermitente, son las que se
pueden clasificar como aprobadas condicionalmente, esta alternativa se puede utilizar cuando existe inters
sobre un rea que est afectada por eventos de contaminacin predecibles en tiempo y la cosecha de
moluscos bivalvos sea destinada a venta directa en determinadas pocas del ao. As tambin, la calidad
sanitaria del rea puede estar afectada por poblaciones estacionales, fuentes de contaminacin no puntuales
o por el uso espordico de muelles o de puertos.
8.1.2.2 Por lo anterior, el rea debe estar sujeta a un programa de manejo que contenga los siguientes
puntos:
8.1.2.2.1 Evaluacin de fuentes potenciales de contaminacin en trminos de sus efectos en el agua y en
el rea.
8.1.2.2.2 Monitoreo rutinario de agua de mar y de producto.
8.1.2.2.3 Disponibilidad de instalaciones y condiciones de operacin para el tratamiento de aguas
residuales descargadas directa o indirectamente por el efluente en el rea.
8.1.2.2.4 Condiciones para la apertura o clausura. Esta rea est sujeta a reaperturas o clausuras, las
cuales estn determinadas por los resultados de los anlisis bacteriolgicos establecidos para un rea
aprobada y prohibida respectivamente.
8.1.3 Area restringida.
DIARIO OFICIAL
(Segunda Seccin)
8.1.3.1 Aqulla que cumple con las especificaciones siguientes:

MICROORGANISMOS
Bacterias coliformes fecales
LIMITE MAXIMO
La mediana o el promedio geomtrico del NMP del agua, no excede
de 88 NMP/100 mL y no mas del 10% de las muestras excede de
260 NMP/100mL para la prueba de dilucin decimal de 5 tubos. El
promedio geomtrico deber realizarse mediante un muestreo anual
de 30 muestras de cada uno de los puntos de monitoreo.
8.1.3.2 El rea restringida no debe encontrarse bajo los casos mencionados en los incisos del 8.1.5.1.1 al
8.1.5.1.4 del numeral 8.1.5.1.
8.1.3.3 Los moluscos cosechados en reas restringidas deben ser reinstalados o depurados o sometidos a
un tratamiento trmico u otro proceso que elimine organismos patgenos.
8.1.4 Area condicionalmente restringida.
8.1.4.1 Aquella que cumple con:
8.1.4.1.1 Las especificaciones de rea restringida cuando se encuentra en condicin abierta.
8.1.4.1.2 Las condiciones establecidas para rea prohibida cuando est en condicin cerrada.
8.1.4.2 Los moluscos bivalvos provenientes de esta rea deben reinstalarse o depurarse o ser sometidos a
un tratamiento trmico u otro proceso que elimine organismos patgenos.
8.1.5 Area prohibida.
8.1.5.1 Aquella en la cual la calidad del agua rebase los lmites mximos establecidos para el rea
restringida y en los siguientes casos:
8.1.5.1.1 Que estn contaminadas con aguas residuales, domsticas, municipales, industriales, agrcolas,
de embarcaciones, plataformas u otras instalaciones lacustres o marinas;
8.1.5.1.2 Que estn afectadas por derrames de materiales que contengan sustancias txicas como
consecuencias de contingencias;
8.1.5.1.3 Que estn afectadas con residuos de material radiactivo;
8.1.5.1.4 Que estn afectadas por marea roja o biotoxinas naturales, diferentes a las presentes en marea
roja;
8.1.5.1.5 Que estn sujetas a veda sanitaria o que estn contaminadas por otras fuentes no contempladas
en esta Norma, y
8.1.5.1.6 Que no cuente con un estudio sanitario como el sealado en el numeral 3.27.
8.2 Las reas de cosecha clasificadas como aprobadas, condicionalmente aprobadas, condicionalmente
restringidas y restringidas debern contar con un programa de monitoreo de fitoplancton y biotoxinas marinas.
A partir de los resultados de ste podr establecerse la aplicacin de la veda sanitaria.
9. Muestreo
El procedimiento de muestreo para los productos objeto de esta norma, debe sujetarse a lo que establece
la Ley General de Salud y las disposiciones jurdicas aplicables.
10. Mtodos de prueba
Para la verificacin oficial de las especificaciones sanitarias que se establecen en esta norma se deben
aplicar los mtodos de prueba sealados en el Apndice Normativo B.
11. Etiquetado
La informacin sanitaria que debe figurar en la etiqueta de los productos preenvasados objeto de esta
norma, adems de cumplir con la NOM-051-SCFI/SSA1-2010, sealada en el apartado de referencias, segn
corresponda, debe sujetarse a lo siguiente:
11.1 Cuando el producto haya sufrido alguna modificacin en su composicin nutrimental, la denominacin
debe corresponder a la establecida en la NOM-086-SSA1-1994, sealada en el apartado de referencias.
11.2 En la lista de ingredientes debe emplearse el nombre especfico de los mismos, para el caso de las
especies de los productos de la pesca empleadas, debe declararse el nombre comn y el nombre cientfico de
la especie de manera que no induzca al consumidor a engaos. Sin interferir con lo establecido en las
regulaciones de otras Dependencias excepto los incluidos en la NOM-084-SCFI-1994, sealada en el
apartado de referencias.
(Segunda Seccin)
DIARIO OFICIAL
11.3 Si la identificacin del lote corresponde a la fecha de caducidad, se debe anteponer la leyenda: Lote
y fecha de caducidad.
11.4 Los productos refrigerados deben presentar la fecha de caducidad.
11.5 Los productos congelados, deben presentar la fecha de caducidad o de consumo preferente.
11.6 En el caso de los moluscos bivalvos frescos, refrigerados o congelados, debe figurar en la etiqueta la
fecha de extraccin, rea de produccin, nmero de certificado de exportacin e importacin del producto
cuando proceda, da, mes y ao de elaboracin.
11.7 Leyendas de conservacin.
11.7.1 Los productos de la pesca refrigerados, deben incluir el texto Mantngase en refrigeracin a
mximo 4C u otra anloga.
11.7.2 Los productos congelados deben incluir el texto Consrvese en congelacin a una temperatura
mxima de - 18C y una vez descongelado, no debe volverse a congelar u otras anlogas.
11.7.3 Para los productos crudos o precocidos, la etiqueta debe contener una leyenda que refiera al
consumo del producto cocido, como: El consumo crudo o poco cocido de productos de la pesca, puede
incrementar el riesgo de adquirir una enfermedad alimentaria o leyenda anloga.
11.8 En el caso de que los productos objeto de esta norma contengan o incluyan productos preenvasados
como parte de promociones u obsequios, tales como salsas, aderezos, etc., se debe incluir en el envase del
producto de promocin u obsequio, cuando menos la siguiente informacin: lista de ingredientes, identificacin
del responsable del proceso, lote y fecha de caducidad, cuando aplique.
11.9 Especificaciones para productos a granel.
11.9.1 Los productos envasados en punto de venta, deben presentar en etiqueta adherida, cuando menos
la siguiente informacin:
11.9.1.1 Nombre o denominacin del producto.
11.9.1.2 Fecha de envasado o de caducidad.
11.9.1.3 Leyendas de conservacin.
12. Envase y embalaje
12.1 Los productos objeto de esta norma se deben envasar con materiales inocuos y resistentes a
distintas etapas del proceso, de tal manera que no alteren las caractersticas fsicas, qumicas y sensoriales
de estos ltimos.
12.2 Las superficies interiores de los envases no deben reaccionar con el contenido.
12.3 Para su embalaje se debe usar material resistente que ofrezca la proteccin adecuada a los envases
para impedir su deterioro exterior, a la vez que facilite su manipulacin, almacenamiento y distribucin.
13. Concordancia con normas internacionales
Esta norma es parcialmente equivalente con las siguientes normas internacionales:
13.1 Codex Alimentarius. ALINORM 01/18. Apndice V. Anteproyecto de Cdigo Internacional
Recomendado de Prcticas para el Pescado y los Productos Pesqueros.
13.2 Codex Alimentarius. ALINORM 01/18. Apndice III. Anteproyecto de enmienda a la norma de
sardinas y productos anlogos en conserva.
13.3 Codex Alimentarius. ALINORM 01/18. Apndice VI. Anteproyecto de norma para el arenque del
Atlntico salado y el espadn salado.
13.4 Codex Alimentarius. ALINORM 95/18. Apndice VII. Proyecto de norma revisada para barritas,
porciones y filetes de pescado empanados o rebozados congelados rpidamente.
13.5 Codex Alimentarius. ALINORM 95/18. Apndice IX. Proyecto de norma revisada para la carne de
cangrejo en conserva.
13.6 Codex Alimentarius. ALINORM 95/18. Apndice X. Proyecto de norma revisada para pescados en
conserva.
13.7 Codex Alimentarius. ALINORM 95/18. Apndice XI. Proyecto de norma revisada para el salmn en
conserva.
13.8 Codex Alimentarius. ALINORM 95/18. Apndice XII. Proyecto de norma revisada para las sardinas y
productos anlogos en conserva.
13.9 Codex Alimentarius. ALINORM 95/18. Apndice XIII. Proyecto de norma revisada para los camarones
en conserva.
DIARIO OFICIAL
(Segunda Seccin)
13.10 Codex Alimentarius. ALINORM 95/18. Apndice XIV. Proyecto de norma revisada para el atn y el
bonito en conserva.
13.11 Codex Alimentarius. ALINORM 95/18. Apndice XV. Proyecto de norma revisada para pescado
salado y pescado seco salado de la familia gadidae.
14. Bibliografa
14.1 Ley Federal sobre Metrologa y Normalizacin. Mxico, D. F.
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Roma, Italia.
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14.21 Comisin del Codex Alimentarius. Informe de la 29a. reunin del Comit del Codex sobre pescado y
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Roma, Italia.
14.22 Comisin del Codex Alimentarius. Informe de la 29a. reunin del Comit del Codex sobre pescado y
productos pesqueros. Trondheim, Noruega, 18-23 de febrero de 2008.
14.23 Directiva por la que se fijan las normas sanitarias aplicables a la produccin y a la puesta en el
mercado de los productos pesqueros. (91/493/CEE).
14.24 Directrices para emitir aseguramiento de calidad de productos de la pesca. Mxico, D.F. 1992.
14.25 Directrices del Codex para la evaluacin sensorial de pescados y los mariscos en laboratorio
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14.29 Food and Agriculture Organization. 1989. "Food Safety Regulations Applied to Fish by Major
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14.31 Food and Agriculture Organization of the Nations. 1989. Food Safety Regulations Applied to Fish by
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14.32 Gua Tcnica del Programa Mexicano de Moluscos Bivalvos. Secretara de Salud. Mxico, D.F.
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14.34 Manual de Tcnicas y Procedimientos para Anlisis Microbiolgico y Alimentos Enlatados.
Laboratorio Nacional de Salud Pblica. Mxico, D.F. 1989.
14.35 Normas y mtodos de productos de la pesca de la agencia de inspeccin de alimentos de Canad y
de Estados Unidos de Amrica como los estndares grados de frescura camarn fresco y congelado.
indicadores de evaluacin sensorial de productos de la pesca.
14.36 Programa conjunto FAO/OMS sobre normas alimentarias. Comisin del Codex Alimentarius. Informe
de la 24a. Reunin del Comit del Codex sobre Pescado y Productos Pesqueros.
14.37 Reglamento (CE) No. 178/2002 (por el que se establecen los principios y los requisitos generales de
la legislacin alimentara, se crea la Autoridad Europea de Seguridad Alimentaria y se fijan procedimientos
relativos a la seguridad alimentaria)
14.38 Reglamento (CE) No. 852/2004 del Parlamento Europeo y del Consejo de 29 de abril de 2004
relativo a la higiene de los productos alimenticios.
14.39 Reglamento (CE) No. 853/2004 del Parlamento Europeo y del Consejo de 29 de abril de 2004 por el
que se establecen normas especficas de higiene de los alimentos de origen animal.
14.40 Reglamento /CE) No 854/2004 del Parlamento Europeo y del Consejo de 29 de abril de 2004, por el
que se establecen normas especficas para la organizacin de controles oficiales de los productos de origen
animal destinados al consumo humano.
14.41 Reglamento (CE) 2406/96 del Consejo por el que se establecen normas comunes para
determinados productos pesqueros.
14.42 Servicio Nacional de Pesca (SERNAPESCA). Estndares de calidad para productos marinos.
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Regulacin y Fomento Sanitario de la Direccin General de Control Sanitario de Bienes y Servicios.
15. Observancia de la norma
La vigilancia del cumplimiento de la presente Norma corresponde a la Secretara de Salud y a los
gobiernos de las Entidades Federativas, en el mbito de sus respectivas competencias.
16. Vigencia
La presente Norma entrar en vigor a los noventa das naturales contados a partir de la fecha de su
publicacin en el Diario Oficial de la Federacin.
Transitorio
Unico.- Con la entrada en vigor de la presente Norma Oficial Mexicana cancela las siguientes normas:
Norma Oficial Mexicana NOM-027-SSA1-1993. Bienes y Servicios. Productos de la pesca. Pescados

frescos refrigerados y congelados. Especificaciones sanitarias, publicada en el Diario Oficial de la
Federacin el 3 de marzo de 1995.
Norma Oficial Mexicana NOM-028-SSA1-1993. Bienes y Servicios. Productos de la pesca. Pescados

en conserva. Especificaciones sanitarias, publicada en el Diario Oficial de la Federacin el 3 de
marzo de 1995.
Norma Oficial Mexicana NOM-029-SSA1-1993. Bienes y Servicios. Productos de la pesca.

Crustceos frescos refrigerados y congelados. Especificaciones sanitarias, publicada en el Diario
Oficial de la Federacin el 27 de febrero de 1995.
Norma Oficial Mexicana NOM-030-SSA1-1993. Bienes y Servicios. Productos de la pesca.

Crustceos en conserva. Especificaciones sanitarias, publicada en el Diario Oficial de la Federacin
el 31 de enero de 1995.
Norma Oficial Mexicana NOM-031-SSA1-1993. Bienes y Servicios. Productos de la pesca. Moluscos

bivalvos frescos refrigerados y congelados. Especificaciones sanitarias, publicada en el Diario Oficial
de la Federacin el 6 de marzo de 1995.
Norma Oficial Mexicana NOM-032-SSA1-1993. Bienes y Servicios. Productos de la pesca. Moluscos

bivalvos en conserva. Especificaciones sanitarias, publicada en el Diario Oficial de la Federacin el 6
de marzo de 1995.
Norma Oficial Mexicana NOM-129-SSA1-1995. Bienes y Servicios. Productos de la pesca: secossalados, ahumados, moluscos cefalpodos y gasterpodos, frescos-refrigerados y congelados.
Disposiciones y especificaciones sanitarias, publicada en el Diario Oficial de la Federacin el 10 de
diciembre de 1997.
Sufragio Efectivo. No Reeleccin.

Mxico, D.F., a 3 de noviembre de 2010.- El Comisionado Federal para la Proteccin contra Riesgos
Sanitarios y Presidente del Comit Consultivo Nacional de Normalizacin de Regulacin y Fomento Sanitario,
Miguel Angel Toscano Velasco.- Rbrica.
(Segunda Seccin)
DIARIO OFICIAL
APENDICE NORMATIVO A
ADITIVOS PERMITIDOS
Se podrn emplear los aditivos enlistados a continuacin en los productos y concentraciones establecidas,
segn corresponda al producto en cuestin.
A.1. Productos de la pesca frescos, refrigerados y congelados
ADITIVO
PRODUCTO
LIMITE MAXIMO
(mg/kg)
Ascorbato de potasio
1000 *
Crustceos
BPF
Crustceos
250
Pescados
5000 **
Crustceos
100
Polifosfato tetrapotsico
Pescados
5000 **
Pirofosfato tetrasdico
Pescados
5000 **
Polifosfato de sodio
Pescados
5000 **
Fosfato monopotsico
Pescados
5000 **
Fosfato monosdico
Pescados
5000 **
Crustceos
100
Trifosfato pentapotsico
Pescados
5000 **
Trifosfato pentasdico
Pescados
5000 **
Ascorbato de sodio
Acido ctrico
Etilendiamino
(EDTA)
tetracetato
disdico
Fosfato triclcico
Metabisulfito de sodio
Metabisulfito de potasio
Sulfito de sodio
Sulfito de potasio
*Expresado como cido ascrbico.

**Expresado como P2O5 solos o combinados.
A.2. Productos de la pesca procesados
ADITIVO
Acetato de almidn
Acido actico glacial
Acido algnico
Acido ctrico
Acido fosfrico
PRODUCTO
Pescados
20 g/kg solos o mezclados
Atn y bonita
Pescados
BPF
Atn y bonita
BPF
Pescados
Atn y bonita
Cangrejo
BPF
Pescados
BPF
Atn y bonita
BPF
Cangrejo
Camarones
Acido lctico
10 g/kg solos o mezclado

expresados como P2O5
850 mg/kg de producto final
Pescados
BPF
Atn y bonita
BPF

Adipato acetilado de dialmidn
Agar
Alginato de amonio
Alginato de calcio
Alginato de potasio
Alginato de sodio
Almidn hidroxipropilado
DIARIO OFICIAL
(Segunda Seccin)
Pescados
Atn y bonita
Pescados
Atn y bonita
Pescados
Atn y bonita
Pescados
Atn y bonita
Pescados
Atn y bonita
Pescados
Atn y bonita
Pescados
Atn y bonita
Almidn blanqueado
Atn y bonita
BPF
Butilhidroxitolueno
Atn y bonita
100 ppm
Pescados
2,5 g/kg
Carboximetilcelulosa sdica
Carragenina
Dialmidn glicerol
Dialmidn glicerol
hidroxipropilado
Etilendiamino tetracetato
disdico-clcico
Fosfato de dialmidn
Fosfato acetilado de dialmidn
Fosfato de hidroxipropil dialmidn
Fosfato de monoalmidn
Glicerol de dialmidn acetilado
Glutamato monosdico
Goma de algarrobo
Goma guar
Goma tragacanto
Goma xantano
Atn y bonita
2,5 g/kg
Pescados
Atn y bonita
Pescados
Atn y bonita
Pescados
Atn y bonita
Cangrejo
250 mg/kg
Camarones final
250 mg/kg de producto
Pescados
Atn y bonita
Pescados
Atn y bonita
Pescados
Atn y bonita
Pescados
Atn y bonita
Pescados
Atn y bonita
Cangrejo
500 mg/kg
Pescados
Atn y bonita
Pescados
Atn y bonita
Pescados
Atn y bonita
Pescados
Atn y bonita
(Segunda Seccin)
DIARIO OFICIAL
Embutidos, esterilizados
comercialmente;
Atn y bonita esterilizados
comercialmente y en recipientes
de cierre hermtico y sometidos
a tratamiento trmico.
Lactato de sodio
BPF
Pescados envasados en
recipientes de cierre hermtico
y sometidos a tratamiento
trmico.
Pectinas y las siguientes sales:
Pectato de amonio, de calcio, de
potasio o de sodio
Pescados Atn y bonita
Pirofosfato disdico
Cangrejo Atn y bonita
Tartrazina
Camarones
Amarillo ocaso FCF
Camarones
2,5 g/kg
10 g/kg expresados como P2O5
o mezclados
30 mg/kg de producto final, solos
o mezclados
30 mg/kg de producto final, solos
o mezclados
A.3. Productos de la pesca ahumados

ADITIVO
LIMITE MAXIMO
Bicarbonato de sodio
BPF
Butilhidroxianisol
100 ppm
Dixido de silicio amorfo
BPF
Eritorbato de sodio
BPF
Nitrito y nitrato de sodio (expresados como nitrito de sodio)

Sorbato de potasio
156 mg/kg
0,1%
A.4. Productos de la pesca salados y secos-salados

ADITIVO
PRODUCTO
LIMITE MAXIMO
Acido srbico; y las siguientes Pescado salado y pescado seco y 200 mg/kg del producto final solos
sales:
salado
o mezclados, expresados como
cido srbico.
Sorbato de sodio, potasio y calcio
A.5. Productos de la pesca semipreparados: crudos o precocidos, empanizados o rebozados y
congelados
ADITIVO
Acetato de almidn
PRODUCTO
En el rebozado o empanado
LIMITE MAXIMO
BPF
Acido ascrbico o sus sales de En filetes y carne de pescado

sodio o de potasio
picada
BPF
Acido ctrico o sus sales de sodio o Carne de pescado picada

potasio
BPF
Acido lctico
BPF
Acido L-glutmico
BPF
BPF
Alginato de calcio
En filetes y carne de pescado

picada
BPF
DIARIO OFICIAL
(Segunda Seccin)
Alginato de sodio
BPF
Almidn hidroxipropilado.
BPF
Almidn oxidado
BPF
Almidones tratados con cidos
BPF
Almidones tratados con lcalis
BPF
Embutidos,
semipreparados,
crudos
o
precocidos
empanizados o rebozados y
congelados, crudos marinados o
en salmuera, emulsionados,
modificados en su composicin,
y envasados en recipientes de
cierre hermtico y sometidos a
tratamiento trmico.
BPF
Ascorbato de calcio
Embutidos,
semipreparados,
crudos
o
precocidos
empanizados o rebozados y
congelados, crudos marinados o
en salmuera, emulsionados,
modificados en su composicin,
y envasados en recipientes de
cierre hermtico y sometidos a
tratamiento trmico.
BPF
Beta caroteno sinttico
100 mg/kg, solos o en

combinacin
Beta-apo-8-carotenal
100 mg/kg, solos o en

combinacin
Carbonato de amonio
BPF
Carbonato de potasio
BPF
Carbonato de sodio
BPF
Carbonato de amonio hidrogenado
BPF
Carbonato de potasio hidrogenado
BPF
Carbonato de sodio hidrogenado
BPF*
Carboximetilcelulosa de sodio
Carne de pescado picada
BPF
Carragenina
BPF
Color Caramelo clase I
BPF
Extracto de annato (extracto
20 mg/kg expresada como bixina
Fosfato de aluminio y sodio
1g/kg, solos o en combinacin,

Fosfato de dialmidn
BPF
De semillas de Bixa orellana)
BPF
Fosfato de dialmidn fosfatado
BPF
BPF
BPF
Fosfato de calcio dihidrogenado

(Segunda Seccin)
Fosfato de potasio dihidrogenado
Fosfato de sodio dihidrogenado
DIARIO OFICIAL
picada

picada

expresados como P2O5 (con
inclusin de los fosfatos
naturales)
(con inclusin de los fosfatos
naturales)
Fosfato de calcio hidrogenado

Glutamato monopotsico
BPF
Goma de algarrobo
BPF
Goma guar
BPF
Goma xantano
BPF
Hidroxipropil metil celulosa
BPF
Hidroxipropil celulosa
BPF
Lecitina
BPF
BPF
Metil celulosa
Metil etil celulosa
BPF
Mono y diglicridos
BPF
Palmitato de ascorbilo

1g/kg, expresados como cido
picada
ctrico, solo o en combinacin con
cido ascrbico.
Pectinas
BPF
Pirofosfato disdico

Pirofosfato tetrapotsico

picada

naturales)

picada

naturales)
Polifosfato de sodio

picada

naturales)
Trifosfato pentapotsico

picada

naturales)
Trifosfato pentasdico

picada

naturales)
DIARIO OFICIAL
(Segunda Seccin)
A.6. Productos de la pesca emulsionados

ADITIVO
LIMITE MAXIMO
Acetato de almidn
BPF
Acido algnico
BPF
Acido ascrbico y su sal de sodio
BPF
Acido ctrico
BPF
Acido eritrbico
BPF
Acido L-glutmico
BPF
Acido srbico y sus sales de sodio y potasio
1 g/kg la suma de los conservadores no podr ser

mayor a 1 g/kg
BPF
Agar
BPF
Alginato de amonio
BPF
Alginato de calcio
BPF
Alginato de potasio
BPF
Alginato de sodio
BPF
Almidn hidroxipropilado
BPF
BPF
Ascorbato de calcio
BPF
Carragenina
BPF
Dialmidn glicerol Hidroxipropilado
Etilendiamino tetracetato disdico clcico
75 mg/kg en producto final
Fosfato de dialmidn
BPF
BPF
BPF
BPF
Glicerol de dialmidn acetilado
Glutamato monosdico
BPF
Goma de algarrobo
BPF
Goma guar
BPF
Goma tragacanto
BPF
Goma xantano
BPF
Nitratos o nitritos de sodio o potasio
0,15 g/kg expresados como nitritos
Pirofosfato disdico
5 g/kg solos o mezclados expresados como P2O5
5 g/kg solos o mezclados, expresados como P2O5
Rojo allura AC y sus lacas
100 mg/kg de producto final
Mezcla de tocoferoles concentrados
0,05 g/kg
APENDICE NORMATIVO B
B.1 Precauciones generales de seguridad.

B.1.1 El analista debe consultar siempre la informacin respecto a la exposicin y manejo seguro de los
reactivos qumicos especificados en estos mtodos, para emplear el equipo de seguridad apropiado como
bata de laboratorio, guantes de ltex, anteojos de seguridad, mascarilla, etc. y trabajar cuando as se requiera
bajo campana de extraccin.
B.1.2 Para la aplicacin de los siguientes mtodos analticos se debe cumplir con las Buenas Prcticas de
Laboratorio.
(Segunda Seccin)
DIARIO OFICIAL
B.2 DETERMINACION DE MATERIA EXTRAA EN PESCADO (ENLATADO) Y PRODUCTOS DE LA

PESCA FRESCOS REFRIGERADOS Y CONGELADOS.
B.2.1 Principio del mtodo.
La materia extraa se separa por flotacin y posteriormente se filtra para su observacin al microscopio.
B.2.2 Equipo.
B.2.2.1 Balanza granataria con una precisin de 0,1 g
B.2.2 Microscopio binocular estereoscpico con objetivos que pueden ser de 3, 6, 7 y 10 X y oculares
apareados de amplio campo visual de 10, 30 y 100 X respectivamente.
B.2.2.3 Equipo de filtracin al vaco.
B.2.2.4 Lmpara para el microscopio o luz natural equivalente.
B.2.2.5 Parrilla de calentamiento con agitacin magntica.
B.2.3 Materiales.
B.2.3.1 Percolador de 2 L.
B.2.3.2 Matraz de 1,5 L
B.2.3.3 Embudo Buchner.
B.2.3.4 Vaso de precipitado de 600 mL.
B.2.3.5 Papel de filtracin rpida rayado para conteo con lneas paralelas de aproximadamente 5 mm de
separacin.
B.2.3.6 Material de uso comn en el laboratorio.
B.2.4 Reactivos.
B.2.4.1 Todos los reactivos deben ser grado analtico a menos que se indique otra especificacin y por
agua se entiende agua destilada.
B.2.4.2 Isopropanol (C3H8O)
B.2.4.3 Acido clorhdrico (HCl)
B.2.4.4 Aceite mineral. Aceite de parafina, blanco y ligero. Con un peso especfico de 0,840-0,860 (25 C)
B.2.4.5 Solucin detergente al 5%
B.2.5 Procedimiento.
B.2.5.1 Pesar 225 g de muestra y transferir a un matraz de 1,5 L. Romper los grumos con esptula. En el
caso de productos enlatados, lavar la lata completamente con pequeas cantidades de isopropanol y
adicionar estos lavados al matraz.
B.2.5.2 Aadir 50 mL de HCl y llevar a un volumen de 800 mL con agua. Agitar magnticamente y llevar a
ebullicin durante 20 minutos (si el producto forma espuma adicionar agua ocasionalmente)
B.2.5.3 Adicionar 50 mL de aceite mineral y agitar magnticamente durante 5 minutos manteniendo la
ebullicin.
B.2.5.4 Transferir al percolador el cual previamente contiene aproximadamente 250 mL de agua. Mantener
el matraz de 1,5 L para llenar el percolador con agua durante los ciclos de rellenado.
B.2.5.5 Llenar el percolador con agua caliente (55-70C) a unos 3 cm de la parte superior. Dejar en reposo
durante 3 minutos y drenar el contenido a aproximadamente 3 cm de la parte ms baja de la capa de aceite
(si existen grandes cantidades de slidos suspendidos, dejar ms tiempo en reposo para permitir la
separacin del aceite)
B.2.5.6 Repetir el drenado y las etapas de rellenado a intervalos de 3 minutos hasta que la fase acuosa
est clara. Finalmente drenar el percolador lentamente a un volumen mnimo de fase acuosa sin perder la
fase oleosa.
B.2.5.7 Drenar la fase oleosa a un matraz de 600 mL. Lavar el percolador con agua caliente, con solucin
detergente al 5%, agua e isopropanol en secuencia, usando aproximadamente 50 mL por cada lavado.
B.2.5.8 Colectar los lavados en el matraz de 600 mL. Filtrar a travs del papel y observar al microscopio.
B.2.5.9 Informe de la prueba.
B.3. BIOENSAYO PARA TOXINA PARALIZANTE EN MOLUSCOS BIVALVOS.
B.3.1 Materiales
B.3.1.1 Ratones machos albinos, sanos, cepa Webster Suiza, con un peso de 19 a 21 gramos. Los
animales que pesan de 17 a 19 y de 21 a 23 gramos tambin pueden ser utilizados en ausencia de animales
con el intervalo de peso deseado. No reutilizar ratones sobrevivientes.
DIARIO OFICIAL
(Segunda Seccin)
B.3.1.2 Reactivos
B.3.1.2.1 Solucin patrn de saxitoxina de100 g/mL.
B.3.1.2.2 Solucin de referencia de saxitoxina de1 g/mL
B.3.1.2.3 Medir 1 mL de solucin patrn en un matraz volumtrico de 100 mL, y llevar al volumen con
agua destilada acidificada con HCl (pH=3). Esta solucin es estable por varias semanas si se almacena a 3 o
4 C y el pH est entre 2,0 y 4,0.
B.3.1.2.4 Soluciones de cido clorhdrico 0,5 N y 0,18 N.
B.3.2 Procedimiento
B.3.2.1 Precaucin: Usar guantes de hule, cuando se manipulen materiales que puedan contener toxina
paralizante de los moluscos.
B.3.2.2 Acondicionamiento del bioensayo.
B.3.2.3 Diluir alcuotas de 10 mL de la solucin de referencia con 10, 15, 20, 25 y 30 mL de agua,
respectivamente. Posteriormente inyectar 1 mL de cada dilucin por va intraperitoneal a unos cuantos ratones
de prueba.
B.3.2.4 La mediana del tiempo de muerte debe estar entre 5 y 7 minutos. El pH de las diluciones debe
estar entre 2 y 4 y en ningn caso debe ser mayor a 4,5.
B.3.2.5 Probar diluciones adicionales con incrementos de 1 mL de agua destilada. Por ejemplo, si la
alcuota de 10 mL diluidos con 25 mL de agua mata a los ratones en 5 a 7 minutos, preparar soluciones 10 +
24 y 10 + 26.
B.3.2.6 Inyectar a un grupo de 10 ratones con 2 diluciones (de preferencia 3), que estn dentro del tiempo
entre 5 a 7 minutos. Aplicar dosis de 1 mL por va intraperitoneal a cada ratn.
B.3.2.7 Registrar el tiempo de inyeccin y de muerte lo ms aproximado posible a intervalos de 5
segundos. Si se registran 7 segundos, redondear a 5 segundos. Si se registran 8 segundos redondear a 10
segundos. El tiempo de muerte es el tiempo transcurrido entre el trmino de la inyeccin y el ltimo jadeo del
ratn.
B.3.2.8 Pesar y anotar el peso de los 10 ratones, aproximando hasta 0,5 gramos e inyectar cada uno con
1 mL de 2 o 3 diluciones de preferencia que provoquen la muerte en una mediana de tiempo de 5 a 7 minutos.
B.3.2.9 Anotar los tiempos de muerte. Si ms ratones de un grupo de 10 sobrevive a la inyeccin de una
dilucin en particular de la solucin de referencia, repetir la inyeccin en un nuevo grupo de 10 ratones.
B.3.2.10 Antes de proceder a realizar la prueba con el segundo grupo, investigar las variables del
procedimiento que pudieron haber provocado los resultados iniciales, tales como filtracin, derrame de la
mezcla inyectada en el ratn o el no haber inyectado el volumen completo de la solucin patrn.
B.3.2.11 Clculo del factor de correccin (FC)
B.3.2.12 Determinar la mediana del tiempo de muerte para cada grupo de 10 ratones usados con cada
dilucin. Descartar los resultados para cada grupo de 10 ratones que den una mediana de muerte menor de 5
o mayor de 7 minutos. Si cualquier grupo de 10 ratones produce una mediana de tiempo de muerte en el
intervalo de tiempo mencionado, incluir todos los grupos de 10 ratones usados para que los clculos de la
dilucin subsecuente o algunas muertes estn en el intervalo deseado.
B.3.2.13 Usar los tiempos de muerte por cada ratn y para cada grupo, en el cual la mediana de tiempo de
muerte quede entre 5 y 7 minutos. Determinar las Unidades Ratn correspondientes a partir de la tabla de
Sommer's.
B.3.2.14 Con el peso de cada ratn se determina el factor de correccin en la tabla de correcciones de
pesos de ratones. Multiplicar las Unidades Ratn por el factor de conversin del peso para determinar los
valores para las Unidades Ratn corregidas por mL de las diluciones seleccionadas. Dividir los g de
toxina/mL calculados en las diluciones seleccionadas por las URC asociadas y as obtener el factor de
conversin.
B.3.2.15 Calcular el promedio de FC individuales. El valor resultante es til para verificar los ensayos de
rutina. Este valor representa los microgramos de veneno equivalentes a una UR.
B.3.2.16 Los valores individuales del FC obtenidos en el laboratorio, pueden variar significativamente si no
existe un control absoluto de la tcnica. Por lo regular el uso de patrones de referencia o patrones
secundarios, depende del volumen de ejecucin del trabajo de ensayo.
B.3.3 Uso de patrones en el ensayo de rutina de Moluscos Bivalvos.
B.3.3.1 Verificar los valores del FC peridicamente como sigue: si los moluscos son analizados menos de
una vez a la semana, determinar el valor del FC cada da que el ensayo sea ejecutado. Para ello inocular 5
ratones con una dilucin apropiada de la solucin patrn. Si los ensayos se realizan durante varios das a la
semana, verificar solamente una vez por semana la dilucin cuya mediana de tiempo de muerte est entre 5-7
minutos. El FC as determinando debe quedar dentro de 20% el FC estndar predeterminado.
(Segunda Seccin)
DIARIO OFICIAL
B.2.3.2 Si los resultados no concuerdan, verificar el FC sobre una base de 10 ratones formado por la
adicin de 5 ratones inoculados con la misma dilucin de solucin patrn de saxitoxina e incluir los resultados
a los 5 ratones originales.
B.3.3.3 Inocular un segundo grupo de 10 ratones. El promedio de valores del FC obtenidos de los 6
grupos de 10 ratones representa un nuevo valor de FC.
B.3.3.4 Repetir la verificacin de los valores de FC de manera que los resultados sean consistentes dentro
del 20%. Si se encuentran grandes variaciones, investigar la posibilidad de controlar y reconocer otras
variables que afectan al mtodo antes de proceder con los anlisis de rutina.
B.3.4 Preparacin de la muestra
B.3.4.1 Almejas, ostiones y mejillones.
B.3.4.1.1 Lavar los moluscos bivalvos con agua potable retirando la arena y cualquier material extrao.
Desconchar la carne con cuidado, sin lesionar el cuerpo del molusco. Colectar aproximadamente 150 g de
carne sobre un tamiz del nmero 10 y dejar escurrir durante 5 minutos. Descartar las conchas, moler la carne
en una mezcladora o licuadora hasta su homogenizacin.
B.3.4.2 Escalopas.
B.3.4.2.1 Separar la porcin comestible (msculo aductor) y solamente aplicar la prueba a esta porcin.
Drenar y moler como se describi anteriormente
B.3.4.3 Extraccin de la saxitoxina.
B.3.4.3.1 Pesar 100 gramos de carne homogenizada en un vaso de precipitados tarado.
B.3.4.3.2 Agregar 100 mL de solucin de cido clorhdrico 0,18 N, agitar y verificar el pH, el cual debe
estar entre 2 y 4, y de preferencia 3.
B.3.4.3.3 Calentar la mezcla, hervir 5 minutos y dejar enfriar a temperatura ambiente. Ajustar la mezcla
enfriada a un pH 2,0-4,0 (nunca mayor a 4,5)
B.3.4.3.4 Verificar el pH con indicador universal BDH, azul de fenol, papel rojo congo o con un
potenciometro. Para bajar el pH, agregar solucin de HCl 5 N por goteo, agitando constantemente para evitar
la destruccin de la toxina.
B.3.4.3.5 Transferir la mezcla a una probeta graduada y diluir a 200 mL. Regresar la mezcla a un vaso de
precipitados, agitar para homogenizar y dejar reposar hasta que una parte del sobrenadante sea translcido y
pueda encontrarse libre de partculas slidas capaces de "tapar" una aguja hipodrmica del nmero 26.
B.3.4.3.6 Si es necesario centrifugar el sobrenadante 5 minutos a 3000 rpm o filtrar por papel. Filtrar solo
la cantidad de lquido necesario para el bioensayo.
B.3.5 Prueba de bioensayo en ratn
B.3.5.1 Pesar 3 ratones, anotando el peso para cada muestra que va a ser analizada. Inyectar por va
intraperitoneal a cada ratn l mL de extracto centrifugado. Este es el punto crtico del bioensayo. Si las
inyecciones no se hacen directamente en la cavidad peritoneal el tiempo de muerte no es reproducible.
B.3.5.2 Descartar cualquier ratn en donde se pierda o se filtre ms de una gota de extracto. Activar el
cronmetro en el momento de la inyeccin y mantener la observacin cuidadosamente, hasta el tiempo de
muerte, que se manifiesta por el ltimo jadeo del animal.
B.3.5.3 Registrar el momento de la muerte de cada ratn. Si la mediana de tiempo de muerte es de 5
minutos, diluir el extracto con HCl 0,01 N, e inyectar otro lote de ratones hasta obtener los tiempos de muerte
entre 5 y 7 minutos. Si la mediana del tiempo de muerte con el extracto no diluido es mayor a 7 minutos, el
dato puede ser utilizado para determinar la toxicidad de la muestra.
B.3.5.4 Determinar la UR/mL de extracto que corresponde a los tiempos de muerte observados de la tabla
de correccin de pesos de ratones.
B.3.5.5 Calcular las URC, multiplicando las UR correspondientes al tiempo de muerte de cada ratn por el
factor de correccin del peso obtenido en la tabla de correccin de pesos de ratones.
B.3.6 Expresin de resultados.
B.3.6.1 Clculos
g saxitoxina/100g carne de molusco = Mediana URC/mL x FC x FD x 200
En donde:
FC = Factor de conversin
FD = Factor de dilucin
DIARIO OFICIAL
(Segunda Seccin)
Tabla de correccin de pesos de ratones.

PESO DEL RATON(G)
10
10,5
11
11,5
12
12,5
13
13,5
14
14,5
15
15,5
16
16,5
17
17,5
18
18,5
19
19,5
20
20,5
21
21,5
22
22,5
23
UNIDADES RATON
0,50
0,53
0,56
0,59
0,62
0,65
0,675
0,70
0,73
0,76
0,785
0,81
0,84
0,86
0,88
0,905
0,93
0,95
0,97
0,985
1,000
1,015
1,03
1,04
1,05
1,06
1,07
B.3.6.2 Tabla de Sommer's.

Tiempo de muerte: relacin unidades ratn para toxina paralizante de moluscos. (cida)
TIEMPO DE MUERTE*
1:00
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
2:00
05
10
15
20
25
UNIDADES RATON
100
66,2
38,3
26,4
20,7
16,5
13,9
11,9
10,4
9,33
8,42
7,67
7,04
6,52
6,06
5,66
5,32
TIEMPO DE MUERTE
5:00
05
10
15
20
30
40
45
50
6:00
15
30
45
7:00
15
30
45
UNIDADES RATON
1,92
1,89
1,86
1,83
1,80
1,74
1,69
1,67
1,64
1,60
1,54
1,48
1,43
1,39
1,35
1,31
1,28
(Segunda Seccin)
TIEMPO DE MUERTE*
30
35
40
45
50
55
3:00
05
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
4:00
05
10
15
20
25
30
35
40
45
DIARIO OFICIAL
UNIDADES RATON
5,00
4,73
4,48
4,26
4,06
4,88
3,70
3,57
3,43
3,31
3,19
3,08
2,98
2,88
2,79
2,71
2,63
2,56
2,50
2,44
2,38
2,32
2,26
2,21
2,16
2,12
2,08
2,04
1,96
TIEMPO DE MUERTE
8:00
15
30
45
9:00
30
10:00
30
11:00
30
12:00
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
30
40
60
50
55

UNIDADES RATON
1,25
1,22
1,20
1,18
1,16
1,13
1,11
1,09
1,075
1,06
1,05
1,03
1,015
1,000
0,99
0,98
0,972
0,965
1,96
0,954
0,948
0,942
0,937
0,934
0,917
0,898
0,875
2,00
2,22
*Minutos: segundos
B.3.6.3 Informe de la prueba
g saxitoxina/100g carne de molusco
B.4. DETERMINACION DE ACIDO DOMOICO POR CROMATOGRAFIA DE LIQUIDOS (HPLC)
El cido domoico es extrado del tejido homogenizado por ebullicin en HCl 0,1 N durante 5 minutos. La
mezcla es enfriada y centrifugada, una alcuota del sobrenadante es diluida, filtrada y analizada por HPLC
isocrtica y deteccin ultravioleta a 242 nm.
B.4.2 Equipo.
B.4.2.1 Sistema de cromatgrafo de lquidos:
B.4.2.1.1 Sistema de gasificador por Helio, membrana de vaco o ultrasonido.
B.4.2.1.2 Sistema de bombas capaz de desarrollar un flujo de 0.5 a 1,5 mL/min.
B.4.2.1.3 Inyector manual o automtico, compatible para inyectar 20 uL de muestra.
B.4.2.1.4 Detector de ultravioleta de longitud de onda variable a 242 nm.
B.4.2.1.5 Sistema de datos: graficador, integrador o computadora compatible con la salida de voltaje del
detector.
B.4.2.2 Centrfuga capaz de desarrollar 3000 rpm usando tubos de 100 mL.
B.4.3 Materiales.
B.4.3.1 Columna HPLC de 15 cm de longitud x 4,6 mm de dimetro interno, empacada con
octadecilsilanos (C18) de tamao de partcula de 5 m.
DIARIO OFICIAL
(Segunda Seccin)
B.4.3.2 Filtros de membrana para muestras, de 3 cm de dimetro y tamao de poro de 0,45 m.

B.4.3.3 Jeringas de vidrio o desechables de 5 mL.
B.4.3.4 Tubos para centrfuga de 100 mL.
B.4.3.5 Matraces volumtricos de 50 y 100 mL.
B.4.4 Reactivos.
B.4.4.1 Todos los reactivos deben ser grado analtico a menos que se indique otra especificacin y por
agua se entiende agua desionizada.
B.4.4.2 Agua grado HPLC (H2O)
B.4.4.3 Acetonitrilo grado HPLC (C2H3N).
B.4.4.4 Acido fosfrico ( H3PO4)
B.4.4.5 Solucin de HCl 0,1 N
B.4.5 Fase mvil.
B.4.5.1 Adicionar 2 mL de solucin acuosa de H3PO4 a 873 mL de agua desionizada. Mezclar y verificar el
pH a aproximadamente 2,5. Adicionar 125 mL de acetonitrilo, mezclar y degasificar.
B.4.5.2 Solucin patrn de cido domoico 1,09 ng/L.
B.4.5.3 Esta solucin est disponible comercialmente. Refrigerar cuando no se use. Llevar a temperatura
ambiente antes de su uso.
B.4.6.1 Preparacin de las muestras.
B.4.6.2 Limpiar completamente el exterior del molusco con agua fresca. Abrir por corte los msculos
aductores. Enjuagar el interior con agua fresca para eliminar la tierra u otro material extrao. Quitar la carne
de la concha separando los msculos aductores y la conexin del tejido en las valvas (charnela). No usar
calor o anestsicos antes de abrir la concha, y no cortar o daar el cuerpo del molusco en este estado.
B.4.6.3 Colectar aproximadamente de 100-159 g de carne en un plato de vidrio. Tan pronto como sea
posible, transferir la carne a un tamiz del No. 10 y dejar drenar por espacio de 5 minutos. Descartar los
drenados. Moler en un procesador de alimentos casero hasta obtener una mezcla homognea.
B.4.6.4 Pesar exactamente 50 g de la muestra homogenizada en un matraz de 250 mL. Adicionar 50 mL
de solucin de HCl 0,1 N y agitar completamente. Rpidamente calentar la mezcla a ebullicin (en
aproximadamente 10 minutos) y continuar el calentamiento vigoroso, con agitacin, por exactamente 5
minutos.
B.4.6.5 Transferir inmediatamente el matraz y su contenido a un bao de hielo y dejar enfriar a
temperatura ambiente (aproximadamente 10 minutos).
B.4.6.6 Llevar la mezcla enfriada a un matraz volumtrico de 100 mL y diluir al volumen con solucin de
HCl 0,1 N. Mezclar. Transferir una alcuota de 50 mL a un tubo de centrfuga. Centrifugar a 3000 rpm durante
5 minutos.
B.4.6.7 Transferir con pipeta volumtrica de 1-5 mL del sobrenadante clarificado a un matraz volumtrico
de 50 mL (el volumen transferido depende de la concentracin de cido domoico esperada). Diluir al volumen
con agua y mezclar.
B.4.6.8 Filtrar un alcuota de 1-2 mL del sobrenadante diluido a travs del filtro para muestras y colectar en
un frasco vial.
B.4.7 Acondicionamiento del equipo.
B.4.7.1 Fijar los parmetros cromatogrficos requeridos en el mtodo de acuerdo con el manual de
operacin.
B.4.7.2 Bombear fase mvil a travs del sistema del cromatgrafo hasta la obtencin de una lnea base
estable.
B.4.7.3 Realizar un anlisis preeliminar de la solucin de cido domoico y ajustar la concentracin del
acetonitrilo en la fase mvil a fin de obtener un tiempo de retencin aproximado para el cido domoico de 8
min.
B.4.8 Determinacin.
B.4.8.1 Inyectar varias rplicas 20 L de solucin patrn de cido domoico hasta que la altura o rea de
los picos de 3 inyecciones consecutivas no varen en ms del 3%.
B.4.8.2 Inyectar 20 L de las muestras.
(Segunda Seccin)
DIARIO OFICIAL

B.4.9.1 Clculos.
g Acido domoico/g = (R/R) x (W/W)

donde:
R= Area o altura promedio del pico de la muestra.
R= Area o altura promedio del pico de la solucin estndar de cido domoico.
W= Peso de la muestra inyectada (mg)
W= Peso de la solucin estndar de cido domoico inyectada (ng)
B.4.10 Informe de la prueba.
g de cido domoico/g
B.5. DETERMINACION DE HISTAMINA POR CROMATOGRAFIA EN CAPA FINA (TLC)
Se basa en la hidrlisis cida de las protenas dejando libres a los aminocidos. La histamina es extrada
con n-butanol y el extracto es analizado por cromatografa en capa fina comparando con una curva de
histamina.
B.5.2 Equipo.
B.5.2.1 Cmara cromatogrfica.
B.5.2.2 Atomizador de 50 mL para cromatografa.
B.5.3 Materiales.
B.5.3.1 Embudos de separacin de 125 mL.
B.5.3.2 Embudo de Buchner.
B.5.3.3 Matraz Kitazato de 500 mL.
B.5.3.4 Cromatofolios AL de slica gel 60 F 254 (para cromatografa en capa fina de 0,2 mm de espesor).
B.5.3.5 Microjeringa ajustable de 0-200 L.
B.5.3.6 Material comn de laboratorio.
B.5.4 Reactivos.
B.5.4.1 Todos los reactivos deben ser de grado analtico a menos que se indique otra especificacin y por
agua se entiende agua destilada.
B.5.4.2 Diclorhidrato de histamina (C5H11Cl2N3)
B.5.4.3 n-Butanol (C4H10O)
B.5.4.4 Acido clorhdrico (HCl)
B.5.4.5 Hidrxido de calcio (Ca(OH)2)
B.5.4.6 Etanol (C2H5OH)
B.5.4.7 Hidrxido de amonio (NH4OH)
B.5.4.8 Acetona (C3H6O)
B.5.4.9 Cloruro de sodio (NaCl)
B.5.4.10 Solucin de HCl 1N
B.5.4.10.1 Medir 479,8 mL de HCl y llevar a 1 L con agua.
B.5.4.11 Solucin de ninhidrina al 1% (1 mg ninhidrina/mL)
B.5.4.11.1 Pesar 1 g de ninhidrina y disolver en 100 mL de acetona
B.5.4.12 Solucin patrn de histamina de 5 g/L.
B.5.4.12.1 Mezclar 30,17 mg de diclorhidrato de histamina (equivalente a 10 mg de histamina), 20 mL de
n-butanol y 7,0 g de cloruro de sodio con 20 mL de agua destilada. Agitar durante 5 minutos. Adicionar 2,5 g
de hidrxido de calcio y agitar durante 2 minutos. Filtrar en embudo Buchner y pasar a un embudo de
separacin. Dejar reposar y separar la capa de butanol.
B.5.5.1 Preparacin de la curva patrn.
DIARIO OFICIAL
(Segunda Seccin)
B.5.5.2 A partir de la solucin patrn de histamina preparar las siguientes diluciones de acuerdo con la
tabla siguiente:
No. DE TUBO
SOLUCION PATRON DE HISTAMINA

(ML)
VOLUMEN FINAL DE
N-BUTANOL
G HISTAMINA/L.
2,20
0,0
5,0
2,52
2,8
4,5
2,88
3,6
4,0
3,29
4,7
3,5
3,35
6,7
2,5
4,00
10,0
2,0
5,61
18,7
1,5
6,66
33,3
1,0
10,00
100,0
0,5
B.5.5.3 Agitar y dejar reposar para permitir la separacin.

B.5.6 Preparacin de la muestra.
B.5.6.1 Mezclar 50 g de muestra molida en 100 ml de cido clorhdrico 1 N por 5 minutos.
B.5.6.2 Filtrar por succin a travs de un embudo Buchner con papel filtro grueso.
B.5.6.3 Tomar una alcuota de 20 mL (4 mL del extracto + 16 mL de agua). Adicionar 20 mL de n-butanol.
Agregar 7 g de NaCl y agitar durante 5 minutos.
B.5.6.4 Agregar 2,5 g de Ca(OH)2. Agitar durante 2 minutos. Filtrar por succin a travs de un embudo
Buchner con papel filtro grueso.
B.5.6.5 Separar la capa de butanol.
B.5.6.6 Determinacin.
B.5.6.7 Tomar alcuotas de 10 L de cada una de las soluciones de la curva patrn y muestras y
colocarlas en una placa de slica gel.
B.5.6.8 Desarrollo de la TLC.
B.5.6.9 Poner una mezcla de etanol: hidrxido de amonio: agua (90:6:10) en la cmara para cromatografa
y dejar saturar.
B.5.6.10 Meter la placa y dejar eluir hasta que el frente del solvente haya alcanzado los 5 cm. Sacar de la
cmara y dejar secar al aire durante 30 min. Aplicar la solucin de ninhidrina al 1% por aspersin y calentar a
100 C en estufa durante 2 minutos.
B.5.7 Estimacin del nivel de histamina.
B.5.7.1 Comparar las muestras con las soluciones patrn de histamina en el intervalo de 5-50 mg (25 a
250 mg de histamina).
B.5.7.2 La cantidad de histamina en la muestra se estima comparando visualmente el desplazamiento de
las manchas de la muestra contra el desplazamiento de los patrones de histamina.
B.5.7.3 Para determinar el contenido de histamina en la muestra es suficiente que una de las manchas de
muestra tenga un desplazamiento igual al de por lo menos uno de los patrones.
B.5.8.1 Clculos.
B.5.8.1.1 Si una de las manchas de las muestras entre 5 y 50 mg equivale al intervalo de 0,5 a 5 g de los
patrones, la cantidad de histamina para 50 g de muestra se calcula como sigue:
mg de histamina = 10 E
donde:
E = g de histamina estimados en la muestra entre 0,5 y 5 g
10= L de muestra colocados en la placa.
Si una mancha de la muestra del intervalo de 25 a 250 mg corresponde al intervalo para el patrn de 0,5 a
5 mg, la cantidad de histamina para 50 g de muestra se calcula como sigue:
mg de histamina = 50 E
donde:
E = g de histamina estimados en la muestra entre 0,5 y 5 g
50= L de muestra colocados en la placa.
(Segunda Seccin)
DIARIO OFICIAL
B.5.8.1.3 Si el valor obtenido en las muestras analizadas resulta ser mayor de 15 mg/100 g debe
analizarse nuevamente haciendo la dilucin correspondiente con butanol.
B.5.9 Informe de la prueba.
mg de histamina/kg
B.6. DETERMINACION DE SULFITOS EN ALIMENTOS. METODO OPTIMIZADO DE MONIERWILLIAMS.
El mtodo mide sulfitos libres ms porciones reproducibles de sulfitos ligados, tales como productos
carbonlicos, en alimentos. La muestra es calentada con cido clorhdrico (HCl) en reflujo para convertir el
sulfato a SO2 (sulfitos). El nitrgeno introducido a la solucin arrastra el SO2 a travs del condensador
enfriado por agua y pasa a una solucin del H2O2 al 3% donde el SO2 se oxida a cido sulfrico (H2SO4). El
contenido de sulfito es directamente relacionado al H2SO4 generado, el cual es determinado por titulacin con
hidrxido de sodio (NaOH) estandarizado. Aplicable para la determinacin de 10 ppm de sulfitos en
alimentos. Aplicable en presencia de otros compuestos voltiles de azufre, no aplicable a cebollas secas,
puerros y calabazas.
B.6.2 Equipo.
B.6.2.1 Aparato de Destilacin (nota: En este mtodo la presin dentro del aparato est limitada a la
presin propia de la solucin de H2 O2 al 3% encima del extremo del burbujeador. Mantener la presin baja
para evitar la prdida del SO2 a travs del goteo).
Usar una pelcula delgada de vaselina en las superficies que sellan en todas las juntas, excepto en la junta
entre el matraz y el embudo de separacin. Poner pinza en cada junta para asegurar que sellen
completamente. Ensamblar el aparato segn se muestra en la figura siguiente:
B.6.2.2 Bureta de 10 mL con tubo de sobrellenado y conexiones para tubo Ascarita o el equivalente para
permitir mantener una atmsfera libre de CO2 sobre el hidrxido de sodio 0,01N estandarizado.
B.6.3 Reactivos.
Todos los reactivos deben ser grado analtico a menos que se indique otra especificacin y por agua se
entiende agua desionizada.
B.6.3.1 Acido clorhdrico (HCl) acuoso 4N. Para cada anlisis, preparar 90 mL de esta solucin mezclando
30 mL de HCl y 60 mL de agua desionizada.
B.6.3.2 Indicador de rojo de metilo. Disolver 250 mg de rojo de metilo en 100 mL de etanol.
B.6.3.3 Titulante estandarizado. Hidrxido de sodio (NaOH) 0,010N Estandarizar la solucin con estndar
de ftalato cido de potasio.
B.6.3.4 Solucin de perxido de hidrgeno al 3% (H2 O2).
Para cada anlisis, diluir 3 mL de H2 O2 al 30% con 30 mL de agua desionizada. Justo antes de usarse,
agregar 3 gotas de indicador de rojo de metilo y titular con hidrxido de sodio (NaOH) 0,010N a un punto final
amarillo, si el punto final excedi, descartar la solucin.
DIARIO OFICIAL
(Segunda Seccin)
B.6.3.5 Nitrgeno de alta pureza. Usar un regulador para mantener el flujo de 200 mL/min. Para evitar
oxgeno en el nitrgeno se usa una trampa tipo cromatografa de gases.
a) Slidos. Transferir 50g de alimento o la cantidad que contenga de 500 a 1500 g de SO2, a un
procesador de alimentos o licuadora. Agregar 100 mL de etanol-agua (5+95 v/v) y mezclar. Licuar slo hasta
que el alimento pueda pasar por la junta 24/40 del matraz.
b) Lquidos. Mezclar 50g de muestra, o la cantidad que contenga de 500 a 1500 g de SO2 con 100 mL de
la mezcla etanol-agua.
Nota: Llevar a cabo la preparacin de la muestra y el anlisis tan rpido como sea posible para evitar la
prdida de formas lbiles de sulfito.
B.6.5 Preparacin del sistema.
B.6.5.1 Usando el aparato ensamblado y el matraz puesto en la manta de calentamiento, agregar 400 mL
de agua al matraz. Cerrar la llave del embudo de separacin y agregar 90 mL de HCl 4N. Empezar con el flujo
de nitrgeno. Iniciar el flujo en el refrigerante. Colocar el recipiente con 30 mL de H2O2, el cual ha sido titulado
a punto final amarillo con NaOH 0,010N. Despus de 15 min, el aparato y el agua estarn completamente
desoxigenadas y la porcin de muestras debe ser introducida al sistema.
B.6.5.2 Remover el embudo de separacin y cuantitativamente transferir la muestra al matraz. Limpiar la
junta y rpidamente aplicar grasa de silicn y regresarlo a su lugar.
B.6.5.3 El flujo de nitrgeno a travs de la solucin de H2O2 al 3% se reanuda tan pronto como se coloca
el embudo en la junta del matraz. Examinar cada junta para asegurar que est sellado. Usar un bulbo con
vlvula para aplicar presin sobre el HCl. Abrir la llave y dejar pasar el HCl al matraz. Continuar sosteniendo la
vlvula para mantener la suficiente presin sobre la solucin de cido para forzarla a pasar. Cerrar la llave
antes de que los ltimos 2-3 mL drenen para evitar que el SO2 escape hacia el embudo de separacin.
B.6.5.4 Calentar la manta al calentamiento y regular para calentar lo suficiente, obteniendo de 80 a 90
gotas/min del condensador.
B.6.5.5 Dejar 1 h 45 min y remover el vaso.
B.6.6 Determinacin.
Inmediatamente titular el contenido del vaso o probeta con hidrxido de sodio 0,010N a punto final amarillo
y que persista 20 segundos.
B.6.7.1 Clculos.
Calcular el contenido de sulfitos, como sigue:
g SO2,/g = 32,03 x VB x N x 1000

peso de muestra
donde:
32,03 = peso milequivalente del SO2
VB = Volumen (Ml) del NaOH
N = Normalidad del NaOH
1000 = Factor para convertir milequivalentes a microequivalentes
Peso de muestra: cantidad de muestra que se introdujo al matraz
B.7. DETERMINACION DE SULFITOS POR GRAVIMETRIA (OPCIONAL).
B.7.1 Despus de la titulacin, llevar el contenido del recipiente a un vaso de 400 mL agregar 4 gotas de
HCl 1N y un exceso de solucin de BaCl2 al 10% y dejar reposar toda la noche.
B.7.2 Lavar el precipitado por decantacin 3 veces con agua caliente a travs de un Gooch previamente
pesado. Lavar con 20 mL de alcohol etlico y 20 mL de ter. Secar a 105 - 110C.
B.7.3 Determinar el blanco de reactivos para la titulacin y para el mtodo gravimtrico y considerarlo en
el clculo de los resultados.
B.7.4 Preparacin del Aparato de Filtracin
B.7.4.1 Unir el receptculo con un filtro de fibra de vidrio.
B.7.4.2 Colocar lo anterior en el matraz kitasato.
B.7.4.3 Lavar el filtro con 10 mL de agua caliente, desionizada y despus con 10 mL de etanol usando
vaco.
(Segunda Seccin)
DIARIO OFICIAL
B.7.4.4 Quitar el filtro y secarlo a 110C durante 12 horas o ms. Transferir a desecador para enfriar a
temperatura ambiente. Pesar (Wb).
B.7.4.5 Colocar el filtro en el receptculo de vidrio.
B.7.5 Precipitado de BaSO4
B.7.5.1 Pasar el precipitado por el filtro. Lavar con agua para asegurar que todo ha sido filtrado.
B.7.5.2 Pasar 10 mL de etanol a travs del precipitado y filtrar con vaco.
B.7.5.3 Remover el filtro y secar en estufa a 110C durante toda la noche.
B.7.5.4 Transferir a desecador, enfriar y pesar (Wp).
B.7.6.1 Clculos.
Calcular el contenido de sulfitos como sigue:
g SO2,/g = (Wp Wb) x 274,46

g muestra
Donde:
Wp = Peso de papel filtro con el precipitado de BaSO4 a peso constante
Wb = Peso de papel filtro preparado y puesto a peso constante
B.7.7 Ensayos de Recuperacin.
B.7.7.1 Para familiarizarse y eficientizar el mtodo antes de realizar la rutina, analizar porciones de
muestra que contengan cantidades conocidas de sulfitos.
B.7.7.2 Realizar los anlisis de manera que se omita cualquier prdida de sulfitos por oxidacin o reaccin
con los componentes en el alimento.
B.7.7.3 Debido a que los sulfitos son reactivos con el aire y con algunas matrices alimenticias y dado que
carecen de estabilidad, se debe fortificar con fuentes estables de sulfitos, no sulfito de sodio o sales similares.
B.7.7.4 El hidroximetil sulfonato de sodio (HMS), el cual es estructuralmente similar a algunas formas
combinadas de sulfitos en alimentos, es til para preparar porciones de prueba fortificada.
B.7.7.5 Para el anlisis, transferir 50g de muestra de alimento libre de sulfitos al matraz. Agregar una
alcuota de solucin de la sal sdica de hidroximetil sulfonato. Analizar inmediatamente.
B.7.7.6 Recuperaciones de 80% del HMS con matrices alimenticias de 10 ppm son recomendables para
asegurar una adecuada exactitud analtica.
B.7.8 Informe de las pruebas.
g SO2,/g
B.8. DETERMINACION DE pH.
B.8.1 Fundamento.
Es la medida de la diferencia de potenciales entre un electrodo de vidrio y otro de referencia que se
genera en una muestra, medido con un potencimetro. La fuerza electromotriz producida por el sistema de
electrodos es proporcional al pH de la muestra problema.
B.8.2 Materiales y Equipo.
B.8.2.1 Balanza analtica con sensibilidad de 0,1 mg.
B.8.2.2 Molino mecnico para carnes con placa perforada con agujeros de un dimetro no mayor de 4mm.
B.8.2.3 Potencimetro graduado en unidades de pH de 0,1 o menos y que permita efectuar lecturas con
una exactitud entre 0,05 unidades y provista de un sistema de correccin de temperaturas (en caso de no
tenerlo, las lecturas deben tomarse en un rango de temperaturas de 202C).
B.8.2.4 Electrodos de referencia.
B.8.2.5 Electrodo de vidrio o sistema de electrodo combinado.
B.8.2.6 Material comn de laboratorio.
B.8.2.7 Algodn.
B.8.3 Reactivos.
Todos los reactivos deben ser de grado analtico y cuando se mencione agua debe ser destilada.
B.8.3.1 Etanol al 95% (v/v) C2H6O
B.8.3.2 Eter etlico saturado con agua C4H10O
DIARIO OFICIAL
(Segunda Seccin)
B.8.3.3 Soluciones patrn.

B.8.3.4 Para calibrar el potencimetro se pueden usar las siguientes soluciones de referencia:
B.8.3.4.1 Soluciones patrn con pH 4,0 a 20C.
B.8.3.4.2 Pesar con exactitud 10,211g de potasio hidrgeno ftalato (KHC6H4 (COO) 2) previamente secado
a 125C hasta peso constante, disolver en agua y llevar al volumen de 1000 ml.
B.8.3.4.3 El pH de esta solucin a 10C es de 4,01.
B.8.3.4.4 Solucin patrn con pH 5,45 a 20C.
B.8.3.4.5 Mezclar 500 ml de solucin 0,2N de cido ctrico (C6H8O7) en agua con 375 ml de solucin de
hidrxido de sodio (NaOH) en agua. El pH de esta solucin a 10C es de 5,42 y a 30C es de 5,48.
B.8.3.4.6 Solucin patrn con pH 6,88 a 20C.
B.8.3.4.7 Pesar con exactitud 3,402g de potasio dihidrgeno ortofostato (KH2PO4) y 3,549g de disodio
hidrgeno ortofosfato (Na2HPO4), disolver en agua y llevar al volumen a 1 l.
B.8.3.4.8 El pH de esta solucin es 6,92 a 10C y 6,85 a 30C.
B.8.3.4.9 En el caso de disponer de producto comercial seguir las indicaciones del fabricante.
B.8.4 Procedimiento:
Se describen dos procedimientos:
B.8.4.1 Para productos que pueden ser homogeneizados.
B.8.4.2 Para productos que no pueden ser homogeneizados.
B.8.4.3 Preparacin de la muestra.
B.8.4.3.1 Homogeneizar la muestra y pasarla dos veces a travs de un molino y despus mezclarla
perfectamente.
B.8.4.3.2 En el caso de muestras muy secas para poder homegeneizarlas adicionar una cantidad de agua
igual a la masa de muestra tomada para la determinacin y mezclarlas perfectamente.
B.8.4.3.3 Tomar una cantidad de muestra suficiente para que los electrodos puedan sumergirse.
B.8.4.4 Calibracin del potencimetro.
B.8.4.5 Calibrar el potencimetro y usar solucin patrn de un pH conocido exactamente y lo ms cerca
posible del pH que se va a determinar.
B.8.4.6 Si el procedimiento no tiene un sistema de correccin de temperatura, la temperatura de la
solucin patrn debe estar dentro del rango de 202C.
B.8.5 Medicin.
B.8.5.1 Introducir los electrodos en la muestra y fijar el sistema de correccin de temperatura a la
temperatura de la muestra, en caso de que no lo tenga, la temperatura de la muestra debe estar dentro del
rango de 202C.
B.8.5.2 Efectuar la medicin usando el procedimiento descrito en el manual del aparato.
B.8.5.3 Leer el pH directamente en la escala del instrumento, hasta alcanzar un valor estable.
B.8.5.4 Llevar a cabo 3 lecturas de la misma muestra.
B.8.6 Limpieza de los electrodos.
Limpiar los electrodos con trozos de algodn mojados con ter etlico y etanol sucesivamente, finalmente
lavarlos con agua y guardarlos de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
B.8.7 Expresin de los resultados.
Tomar como resultado la media aritmtica de los valores de las tres lecturas siempre y cuando la
diferencia entre los valores extremos resultantes no sea mayor de 0,15 unidades de pH.
B.8.8 Procedimiento para productos que no puedan homogeneizarse.
B.8.8.1 Tomar una porcin de muestra suficiente que permita tomar medidas de pH en varios puntos de la
misma.
B.8.8.2 Medicin.
Si la muestra tiene consistencia firme, hacer un agujero para cada determinacin de manera que el
electrodo pueda ser introducido cuidadosamente para no quebrarlo.
B.8.8.3 Efectuar las lecturas como se describi anteriormente.
Si se considera importante conocer las diferencias entre los valores del pH tomados en diferentes puntos
de la muestra, el nmero de determinaciones estar en funcin de la naturaleza y el tamao de la muestra.
(Segunda Seccin)
DIARIO OFICIAL
El lavado de los electrodos debe hacerse como se describi en el punto 11.10.6

B.8.8.4 Expresin de resultados.
Tomar como resultado la media aritmtica de los valores obtenidos en el mismo punto de la muestra
siempre y cuando la variacin no sea mayor a 0,15 unidades de pH.
Reportar que el promedio de pH para cada punto al ms cercano a 0,1 unidades de pH.
B.8.9 Precauciones.
Determinar el pH de la muestra inmediatamente cuando sea posible o almacenarla de tal manera que el
cambio de pH se restrinja al mnimo.
Durante las mediciones el aparato debe estar protegido de cambios de corriente elctrica externa.
B.9. NITROGENO AMONIACAL (NVT).
B.9.1 Fundamento.
La muestra se destila bajo condiciones establecidas en presencia de xido de magnesio recibiendo las
bases voltiles en un cido dbil de donde son tituladas.
B.9.2 Material y equipo.
B.9.2.1 Bureta de 10 ml graduada en 0,01
B.9.2.2 Matraz de Kjeldahl de 800ml
B.9.2.3 Matraz Erlenmeyer de 500ml
B.9.2.4 Probeta
B.9.2.5 Cuerpos de ebullicin
B.9.2.6 Equipo de destilacin macro Kjeldahl
B.9.2.7 Balanza analtica con sensibilidad de 0,1mg
B.9.2.8 Agua destilada
B.9.3 Reactivos.
B.9.3.1 Acido brico H3BO3 al 2% grado reactivo, pesar 20g y diluir con agua destilada a 1 litro.
B.9.3.2 Acido sulfrico o clorhdrico 0,1N valorado
B.9.3.3 Rojo de metilo
B.9.3.4 Azul de metileno
B.9.3.5 Etanol
B.9.3.6 Oxido de magnesio grado reactivo
B.9.3.7 Antiespumante preparacin de silicones o alcohol octlico.
B.9.3.8 Preparacin del reactivo de Wesslow.
B.9.3.8.1 En una mezcla 60:40 de etanol-agua, agregar rojo de metilo hasta llegar al 0,2%.
B.9.3.8.2 Preparar una dilucin de azul de metileno al 0,2% en agua destilada.
B.9.3.8.3 Mezclar dos partes de la solucin de rojo de metilo con una parte de azul de metileno.
B.9.4.1 Para prevenir la prdida de agua durante la preparacin y subsecuente manejo no se deben usar
muestras pequeas (la cantidad mnima aceptable es de 500g).
B.9.4.2 Guardar el material molido en recipientes de vidrio o similares con tapas hermticas que lo
protejan del aire y del agua.
B.9.4.3 Pasar la muestra rpidamente tres veces a travs de un molino de alimentos con placas de
aproximadamente 3mm de abertura.
B.9.4.4 Mezclar perfectamente despus de cada molienda y comenzar todas las determinaciones lo ms
rpido posible, si ocurriera cualquier demora, congelar la muestra para inhibir la descomposicin (-2 a -4C).
B.9.5.1 Pesar 10g de muestra preparada como se indica en el punto 2.4 transferirla cuantitativamente a un
matraz de Kjeldahl 800ml.
B.9.5.2 Agregar 2g de xido de magnesio, 300 ml de agua destilada y los cuerpos de ebullicin (en caso
necesario, agregar algn agente antiespumante).
B.9.5.3 Disgregar perfectamente la muestra, por medio de movimientos circulares. Recibir el destilado en
un matraz Erlenmeyer de 500ml conteniendo 25ml de cido brico y unas gotas del indicador de Wesslow (la
parte terminal del tubo debe estar dentro del cido).
DIARIO OFICIAL
(Segunda Seccin)
B.9.5.4 Conectar el matraz de Kjeldahl al equipo de destilacin y calentar de manera que hierva
exactamente durante un periodo de 10 min, mantener la temperatura exactamente durante 25 min.
B.9.5.6 Lavar el refrigerante con agua destilada y titular con cido sulfrico o clorhdrico.
B.9.5.7 Titular la solucin destilada utilizando el cido clorhdrico o sulfrico.
B.9.5.8 Simultneamente, determinar un blanco.
Nota: Antes de realizar la determinacin definir los tiempos y temperaturas con una prueba.
B.9.6 Clculos.
El resultado se expresa en mgN/100g

En donde:
v1 = ml de cido sulfrico 0,1N requeridos en la titulacin de la muestra.
v2 = ml de cido sulfrico 0,1N requeridos en la titulacin del blanco.
N = Normalidad del cido sulfrico o clorhdrico.
PM = Peso de la muestra.
14 = Miliequivalente de Nitrgeno.
B.10. METODO DE PRUEBA PARA LA DETERMINACION DE CADMIO, ARSENICO, PLOMO,
ESTAO, COBRE, FIERRO, ZINC Y MERCURIO EN ALIMENTOS, AGUA POTABLE Y AGUA
PURIFICADA POR ESPECTROMETRIA DE ABSORCION ATOMICA.
B.10.1 Fundamento
El mtodo de absorcin atmica se basa en hacer pasar un haz de luz monocromtica de una frecuencia
tal que puede ser absorbido por el analito que se encuentra presente en forma de vapor atmico. La medida
de la intensidad luminosa antes y despus de su paso por el vapor atmico permite determinar el porciento de
absorcin. La cantidad de absorcin aumenta con la concentracin de los tomos en el medio absorbente, es
decir, la medida de la absorcin aumenta con la concentracin del elemento en la muestra, ya sea que est en
su condicin original o sujeta a pretratamiento.
B.10.2 Reactivos y materiales
B.10.2.1 Reactivos
B.10.2.1.1 Soluciones estndares de referencia certificadas de cada uno de los metales.
B.10.2.1.2 Agua, debe ser destilada deionizada, con un grado mximo de conductividad de 1 mho/cm a
25C.
B.10.2.1.3 Acido ntrico (densidad especfica 1,41), grado suprapuro.
B.10.2.1.4 Acido ntrico (densidad especfica 1,41), contenido de mercurio muy bajo.
B.10.2.1.5 Acido perclrico (densidad especfica 1,67), grado suprapuro.
B.10.2.1.6 Acido clorhdrico (densidad especfica 1,19), grado suprapuro.
B.10.2.1.7 Acido sulfrico (densidad especfica 1,84), grado suprapuro.
B.10.2.1.8 Acido sulfrico 1 N a partir de la solucin grado suprapuro.
B.10.2.1.9 Acido ntrico 65% v/v grado RA.
B.10.2.1.10 Perxido de hidrgeno (densidad especfica 1,12).
B.10.2.1.11 Hidrxido de sodio granalla reactivo RA.
B.10.2.1.12 Aire comprimido seco y limpio.
B.10.2.1.13 Gases: acetileno, xido nitroso, argn y nitrgeno, grado absorcin atmica.
Solucin de Nitrato de Magnesio hexahidratado al 7% p/v. Disolver 70 g de Mg(NO3)2.6H2O en 1000 ml
de HCl 1 N.
B.10.2.1.14 Acido clorhdrico 1 N. Diluir 8,3 ml de HCl y llevar a 100 ml de agua.
B.10.2.1.15 Acido ntrico al 50% v/v. Diluir 50 ml de HNO3 al 65% v/v grado suprapuro en 50 ml de agua.
B.10.2.1.16 Acido clorhdrico 8 M. Diluir 66,0 ml de HCl y llevar a 100 ml con agua.
B.10.2.1.17 Acido clorhdrico 0,5 N. Diluir 4,15 ml de HCl y llevar a 100 ml con agua.
B.10.2.1.18 Solucin de Yoduro de Potasio al 15% p/v. Disolver 15 g de KI en 100 ml de agua (esta
solucin debe prepararse en el momento de usarse).
(Segunda Seccin)
DIARIO OFICIAL
B.10.2.1.19 Solucin de Yoduro de Potasio al 20% p/v. Disolver 20 g de KI en 100 ml de agua (esta
solucin debe prepararse en el momento de usarse).
B.10.2.1.20 Solucin de Cloruro de Potasio (10 mg/ml de K). Disolver 1,91 g de KCl en agua y diluir a 100
ml con agua.
B.10.2.1.21 Solucin de Nitrato de Magnesio al 50% p/v. Disolver 50 g de Mg(NO3)2.6H2O en 100 ml de
agua.
B.10.2.1.22 Solucin de cido clorhdrico al 1,5% p/v. Diluir 1,5 ml de HCl en 100 ml de agua destilada
deionizada.
B.10.2.1.23 Solucin de hidrxido de sodio al 1% p/v. Pesar 1 g de hidrxido de sodio y diluir a 100 ml con
agua destilada deionizada.
B.10.2.1.24 Solucin de borohidruro de sodio al 4% p/v en solucin de hidrxido de sodio al 1% p/v. Pesar
4 g de borohidruro de sodio en 100 ml de una solucin de hidrxido de sodio al 1% p/v. Filtrar al vaco.
B.10.2.1.25 Solucin reductora para mercurio. Mezclar 50 ml de cido sulfrico concentrado con
aproximadamente 300 ml de agua. Enfriar a temperatura ambiente y disolver 15 g de cloruro de sodio, 15 g de
sulfato o cloruro de hidroxilamina y 25 g de cloruro o sulfato estanoso en solucin. Diluir a 500 ml.
B.10.2.1.26 Solucin de dilucin para mercurio. En un matraz de 1 l, conteniendo de 300 a 500 ml de agua
destilada deionizada, agregar 58 ml de cido ntrico concentrado de muy baja concentracin de mercurio y 67
ml de cido sulfrico concentrado. Diluir al volumen con agua.
B.10.2.1.27 Solucin de trabajo de As de 1 g/ml. Diluir 1 ml de la solucin patrn de 1000 g/ml a 1 l con
cido sulfrico 1N preparada a partir de la solucin grado suprapuro. Preparar fresca cada da.
B.10.2.2 Materiales
B.10.2.2.1 Matraces Kjeldahl de 500 ml y 800 ml.
B.10.2.2.2 Sistema de reflujo con refrigerante.
B.10.2.2.3 Crisoles Vycor de 40 a 50 ml de capacidad.
B.10.2.2.4 Crisoles de platino de 40 a 50 ml de capacidad.
B.10.2.2.5 Matraces Erlenmeyer de diferentes capacidades.
B.10.2.2.6 Matraces volumtricos de diferentes capacidades.
B.10.2.2.7 Matraces redondos de fondo plano de 50 ml.
B.10.2.2.8 Bombas Parr.
B.10.2.2.9 Micropipetas o pipetas de Eppendorf de diferentes capacidades.
B.10.2.2.10 Puntas de plstico para micropipetas.
B.10.2.2.11 Papel filtro Whatman No. 2.
B.10.2.2.12 Perlas de ebullicin.
B.10.2.2.13 Varillas de plstico.
B.10.2.2.14 Tubos de ensayo graduados de propilen o propileno de 15 ml.
B.10.2.2.15 Recipientes de propilen o propileno.
B.10.2.2.16 Embudos de filtracin de diferentes capacidades.
B.10.2.2.17 Material comn de laboratorio.
B.10.2.2.18 Todo el material utilizado debe someterse a lavado de acuerdo con las siguientes
instrucciones:
o
El jabn que se use debe ser de preferencia neutro.
Enjuagar perfectamente con agua corriente.
Sumergir el material de vidrio o plstico en un recipiente (de preferencia plstico) que

contenga una solucin de cido ntrico grado RA al 30 %.
Dejarlo tapado y reposando por un lapso de 24 horas.
Quitar el exceso de cido ntrico con varios enjuagues (5 o 6 veces) con agua
deionizada.
Dejar escurrir y secar.
Guardar en cuanto est seco para evitar contaminacin por partculas en el aire.
DIARIO OFICIAL
(Segunda Seccin)
B.10.3 Aparatos e instrumentos

B.10.3.1 Aparatos
B.10.3.1.1 Lmparas de ctodo hueco o de descarga sin electrodos para determinar arsnico, cadmio,
cobre, estao, fierro, mercurio, plomo y zinc.
B.10.3.1.2 Fuente de radiofrecuencia en caso de usar lmparas de descarga.
B.10.3.1.3 Automuestreador y recirculador de agua.
B.10.3.1.4 Placa de calentamiento con regulador que alcance una temperatura de 400 a 450 C.
B.10.3.1.5 Horno de microondas.
B.10.3.1.6 Autoclave que alcance 121 5C o 15 lb de presin.
B.10.3.1.7 Centrfuga de laboratorio capaz de mantener 1600 rpm.
B.10.3.2 Instrumentos
Los instrumentos que a continuacin se indican deben estar calibrados y ajustados antes de su operacin.
B.10.3.2.1 Espectrmetro de absorcin atmica equipado con los accesorios para flama, horno de grafito,
generador de hidruros o vapor fro, dependiendo del mtodo a seguir.
B.10.3.2.2 Balanza analtica con sensibilidad de 0,1 mg.
B.10.3.2.3 Mufla capaz de mantener una temperatura de 550 10C.
B.10.3.2.4 Horno de calentamiento (estufa) con intervalo de temperatura de 120 5C.
B.10.4.1 Digestin para la determinacin de Cd, Cu, Fe, Pb y Zn.
B.10.4.1.1 Digestin por va hmeda.
B.10.4.1.1.1 Pesar con precisin de 0,1 mg, una cantidad apropiada de muestra.
Para la determinacin por el mtodo de absorcin por flama pesar como mximo 40 g de jugo o bebida,
20 g de alimentos que contengan del 50 al 75% de agua y 10 g de alimentos slidos o semislidos. Limite el
contenido de grasa o aceite a un mximo de 4 g y el total de materia orgnica a 5 g.
B.10.4.1.1.2 Aadir 10 ml de cido ntrico concentrado y dejar reposar toda la noche o iniciar directamente
la digestin.
B.10.4.1.1.3 Usar matraz de Kjeldhal o matraz conectado al sistema de refrigerantes.
B.10.4.1.1.4 Calentar suavemente.
B.10.4.1.1.5 Digerir la muestra 3 horas o ms tiempo si es necesario (algunas muestras requieren la
adicin de mayor cantidad de cido ntrico) hasta la aparicin del color traslcido, si queda mbar, adicionar
perxido de hidrgeno gota a gota con agitacin continua (reaccin exotrmica).
B.10.4.1.1.6 Enfriar.
B.10.4.1.1.7 Recuperar, filtrar y llevar a un volumen conocido en matraz volumtrico.
B.10.4.1.1.8 Correr un blanco de reactivos y muestra fortificada por cada serie de digestin.
B.10.4.1.1.9 Leer en el aparato de eleccin (espectrmetro de absorcin atmica por flama u horno de
grafito).
B.10.4.1.2 Digestin por va seca.
B.10.4.1.2.1 Pesar con precisin de 0,1 mg, una cantidad apropiada de muestra.
Para la determinacin por el mtodo de absorcin por flama pesar como mximo 40 g de jugo o bebida,
20 g de alimentos que contengan del 50 al 75% de agua y 10 g de alimentos slidos y semislidos. Limite el
contenido de grasa o aceite a un mximo de 4 g y el total de materia orgnica a 5 g.
B.10.4.1.2.2 Aadir 10 ml de cido ntrico concentrado y dejar reposar toda la noche o iniciar directamente
la digestin. En productos con alta concentracin de protenas adicionar una solucin de nitrato de magnesio
al 7,0% p/v y mezclar completamente, llevar a sequedad aproximadamente durante 6 horas en estufa a una
temperatura de 90 a 95C.
B.10.4.1.2.3 Colocar la muestra en una mufla y elevar la temperatura lentamente de 2 a 4C por minuto
hasta 350C. Mantener la temperatura hasta que cesen los humos.
B.10.4.1.2.4 Elevar gradualmente la temperatura de 500 a 550C para evitar que la muestra se incinere y
mantener esa temperatura durante 16 horas o toda la noche.
B.10.4.1.2.5 Apagar la mufla y dejar enfriar.
(Segunda Seccin)
DIARIO OFICIAL
B.10.4.1.2.6 Un segundo paso de calcinacin puede ser requerido para remover algunos residuos de
carbn, mediante el siguiente procedimiento:
Lavar las paredes del crisol con 2 ml de cido ntrico al 50%. Colocar la muestra en una placa de
calentamiento puesta a 120C para remover el exceso de cido. Colocar la muestra en una mufla fra y elevar
la temperatura gradualmente de 500 a 550C, mantenindola por el tiempo necesario. Repetir este
procedimiento cuantas veces sea necesario hasta que quede libre de carbn remanente.
B.10.4.1.2.7 Disolver las cenizas completamente en 5 ml de cido clorhdrico 1N, transferir la muestra
disuelta a un tubo de propileno o a un matraz de volumen conocido, enjuagar el crisol con dos alcuotas de 5
ml de cido clorhdrico 1 N y transferir al mismo tubo o matraz para obtener un volumen de 15 ml en el
primero y llevar al aforo en el segundo, tapar y mezclar, si existe presencia de partculas o materia insoluble,
filtrar en papel Whatman No. 2, antes de la determinacin.
B.10.4.1.2.9 Leer en el aparato de eleccin (espectrmetro de absorcin atmica: flama u horno de
grafito).
B.10.4.2 Digestin por va hmeda para la determinacin de Sn.
B.10.4.2.1 Proceder igual que en el punto B.10 .4.1.1.1.
B.10.4.2.2 No adicionar cido ntrico si no se lleva cabo la digestin total en el mismo da.
B.10.4.2.3 Adicionar 30 ml de cido ntrico concentrado al matraz y calentar suavemente por 15 minutos
en campana para iniciar la digestin, evitando una excesiva produccin de espuma.
B.10.4.2.4 Hervir suavemente hasta tener un remanente de 3 a 6 ml o hasta que la muestra empiece a
secarse en el fondo. No dejar que la muestra se calcine.
B.10.4.2.5 Retirar la muestra del calor.
B.10.4.2.6 Al mismo tiempo correr dos blancos de reactivos.
B.10.4.2.7 Adicionar 25 ml de cido clorhdrico concentrado, calentar suavemente durante
aproximadamente 15 minutos, hasta que todo el cloro sea liberado. Aumentar la temperatura gradualmente
hasta ebullicin.
B.10.4.2.8 Evaporar hasta obtener de 10 a 15 ml, usando un matraz similar con 15 ml de agua como
patrn de volumen.
B.10.4.2.9 Adicionar aproximadamente 40 ml de agua.
B.10.4.2.10 Agitar y pasar a un matraz de 100 ml y enjuagar con 10 ml de agua.
B.10.4.2.11 Cuando el cido clorhdrico est presente en la digestin, las muestras se pueden quedar toda
la noche o por ms tiempo.
B.10.4.2.12 Agregar 1 ml de solucin de cloruro de potasio en cada matraz.
B.10.4.2.13 Enfriar a temperatura ambiente.
B.10.4.2.14 Diluir con agua y agregar ms agua para compensar el volumen de grasa en el matraz.
B.10.4.2.15 Mezclar perfectamente y filtrar de 30 a 50 ml a travs de un papel filtro Whatman No. 2 y
recoger el filtrado en un recipiente de propileno, polipropileno o polietileno.
B.10.4.2.16 No filtrar los blancos. Tapar las botellas durante el anlisis. Las soluciones son estables por
varios meses.
B.10.4.2.17 Correr un blanco de reactivos y muestra fortificada por cada serie de digestin.
B.10.4.2.18 Leer en el aparato de eleccin (espectrmetro de absorcin atmica: flama u horno de grafito).
B.10.4.3 Digestin por va hmeda para la determinacin de Hg.
B.10.4.3.1 Sistema de reflujo.
B.10.4.3.1.1 Pesar con precisin de 0,1 mg, la cantidad apropiada de muestra, dependiendo el tipo de
sta, en un matraz de digestin y adicionar perlas de ebullicin.
B.10.4.3.1.2 Conectar el matraz al sistema de reflujo y agregar poco a poco la cantidad necesaria de cido
ntrico concentrado y calentar durante media hora o hasta que no se observen cambios en la digestin.
B.10.4.3.1.3 Dejar enfriar y agregar una mezcla de cido ntrico y cido sulfrico concentrados (1 + 1).
B.10.4.3.1.4 Calentar y agregar ms cido ntrico gota a gota sobre las paredes del recipiente, hasta que
el color obscuro de la solucin desaparezca.
B.10.4.3.1.5 Enfriar.
B.10.4.3.1.6 Si existe grasa o cera filtrar la solucin.
DIARIO OFICIAL
(Segunda Seccin)
B.10.4.3.1.8 Leer en el aparato de eleccin (espectrmetro de absorcin atmica de vapor fro).

B.10.4.3.2 Sistema cerrado.
B.10.4.3.2.1 Pesar con precisin de 0,1 mg, la cantidad apropiada de muestra, dependiendo el tipo de
sta, en el recipiente de digestin.
B.10.4.3.2.2 Agregar la cantidad necesaria de cido ntrico concentrado.
B.10.4.3.2.3 Tapar y sellar perfectamente el recipiente de digestin.
B.10.4.3.2.4 Si el recipiente de digestin es un matraz Erlenmeyer, colocar ste en una autoclave a 15 lb
por 30 minutos. Si se utiliza bomba Parr, calentar en parrilla controlando la temperatura a un mximo de
300C por 30 minutos.
B.10.4.3.2.5 Enfriar a temperatura ambiente.
B.10.4.3.2.6 En caso de que la digestin no sea completa adicionar perxido de hidrgeno y repetir la
digestin.
B.10.4.3.2.7 Filtrar en caso de que exista grasa o cera y analizar el contenido de Hg.
B.10.4.3.2.9 Leer en el aparato de eleccin (espectrmetro de absorcin atmica de vapor fro).
B.10.4.4 Digestin para la determinacin de As.
B.10.4.4.1 Digestin por va hmeda-seca.
B.10.4.4.1.1 Proceder como en el punto B.10.4.3.2 hasta que la digestin sea completa y posteriormente
continuar con los siguientes pasos.
B.10.4.4.1.2 Con una pipeta tomar una alcuota de la solucin de muestra digerida y colocarla en un crisol
Vycor o vaso de precipitados.
B.10.4.4.1.3 Aadir 1 ml de solucin de nitrato de magnesio al 7% p/v y calentar en una parrilla a
temperatura baja, hasta sequedad.
B.10.4.4.1.4 Incrementar el calor de la placa a un mximo de 375C.
B.10.4.4.1.5 Colocar el matraz en la mufla a 450C para oxidar cualquier residuo de carbn y
descomponer el exceso de nitrato de magnesio, por un tiempo mayor o igual a 30 minutos.
B.10.4.4.1.6 Enfriar y disolver el residuo en 2,0 ml de cido clorhdrico 8 M.
B.10.4.4.1.7 Aadir 0,1 ml de yoduro de potasio al 20% p/v para reducir el As(V) a As(III).
B.10.4.4.1.8 Dejar reposar por un tiempo mayor a 2 minutos y transferir a un matraz y llevar al aforo con
agua.
B.10.4.4.1.10 Leer en el aparato de eleccin (espectrmetro de absorcin atmica con adaptacin para
horno de grafito o generador de hidruros).
B.10.4.4.2 Digestin por va seca.
B.10.4.4.2.1 Pesar con precisin de 0,1 mg, la cantidad necesaria de muestra en un crisol Vycor o de
platino.
B.10.4.4.2.2 Aadir el volumen necesario de nitrato de magnesio al 50% p/v.
B.10.4.4.2.3 Homogeneizar con una varilla limpia de plstico extendiendo la mezcla en el crisol.
B.10.4.4.2.4 Colocar la muestra en una mufla subiendo gradualmente la temperatura hasta 300C por 2
horas. Posteriormente subir gradualmente la temperatura hasta 500C por 16 horas o durante toda la noche.
B.10.4.4.2.5 Enfriar a temperatura ambiente y humedecer las cenizas con cido ntrico al 50% v/v.
B.10.4.4.2.6 Calentar en parrilla hasta la eliminacin del cido.
B.10.4.4.2.7 Llevar los crisoles a una mufla elevando gradualmente la temperatura de 23 a 500C,
manteniendo sta 30 min hasta evaporacin total.
B.10.4.4.2.8 Transferir las cenizas del crisol a un matraz aforado usando una porcin de 10 ml de cido
clorhdrico 0,5 N.
B.10.4.4.2.9 Enjuagar los crisoles con 5 ml de agua destilada y transferir al matraz, aadir 1 ml de solucin
de yoduro de potasio al 15% y mezclar.
B.10.4.4.2.10 Dejar reposar durante 15 minutos y llevar al aforo.
B.10.4.4.2.12 Leer en el aparato de eleccin (espectrmetro de absorcin atmica con adaptacin para
horno de grafito o generador de hidruros).
(Segunda Seccin)
DIARIO OFICIAL
B.10.4.5 Digestin para la determinacin de Cd, As, Pb, Sn, Cu, Fe, Zn y Hg por horno de microondas.
Pesar con precisin de 0,1 mg, 0,500 g como mximo de muestra, aadir 6 ml de cido ntrico
concentrado y 2 ml de agua oxigenada al 30%, cerrar perfectamente el envase de reaccin y proceder segn
el manual del fabricante.
B.10.5 Procedimiento
B.10.5.1 Espectrometra de absorcin atmica por flama.
B.10.5.1.1 Calibracin. Es necesario comprobar que se tiene una calibracin inicial y peridica aceptable.
B.10.5.1.1.1 Se inicia la configuracin operacional del instrumento y en el sistema de adquisicin de datos.
Permitir un periodo no menor a 30 minutos para el calentamiento de las lmparas de descarga sin electrodos.
B.10.5.1.1.2 Se debe verificar la estabilidad del instrumento mediante el anlisis de una solucin estndar
20 veces ms concentrada que el lmite de deteccin del instrumento (LDI) para el analito, leda un mnimo de
cinco veces y calculando la desviacin estndar resultante, la cual debe ser menor al 5%.
B.10.5.1.1.3 El instrumento debe calibrarse para el analito a determinar usando el blanco de calibracin y
los estndares de calibracin preparados a 3 o 4 niveles de concentracin dentro del intervalo dinmico de
concentracin del analito.
B.10.5.1.1.4 Ajustar el instrumento a 0 con el blanco de calibracin. Introducir los estndares de
calibracin del analito de menor a mayor concentracin y registrar al menos tres rplicas de la absorbancia de
cada uno.
B.10.5.1.1.5 Elaborar una curva de calibracin graficando absorbancia en funcin de la concentracin.
Lo anterior puede llevarse a cabo en equipos que se programan directamente, en los cuales slo es
necesario introducir los estndares y marcar su concentracin terica.
B.10.5.1.2 Operacin del instrumento.
El desempeo del instrumento se verifica mediante el empleo de blancos de calibracin, estndares de
calibracin y una muestra de control de calidad (MCC).
B.10.5.1.2.1 Despus de que se ha realizado la calibracin, se debe verificar que el instrumento trabaje
adecuadamente para el analito. Para ello se analiza una muestra de control de calidad. Si las mediciones
varan en 10% o ms, al valor establecido para la MCC, el anlisis debe interrumpirse y buscar la posible
causa de error, el instrumento se debe recalibrar y verificar la nueva calibracin.
B.10.5.1.2.2 Para verificar que el instrumento no presenta deriva, por cada 10 anlisis se debe analizar el
blanco de calibracin. Si el valor verdadero del analito difiere 10% o ms, el instrumento debe recalibrarse.
Si el error persiste debe identificarse el problema y corregirse.
Si la matriz de la muestra es responsable de la deriva o afecta la respuesta del analito puede ser
necesario trabajar por adiciones estndar.
B.10.5.1.2.3 La demostracin de la operatividad inicial del instrumento se hace estableciendo los lmites
de deteccin del mtodo (LDM) para el analito y el intervalo de calibracin lineal. Para determinar el LDM se
usa un blanco de reactivos fortificado con una concentracin del analito equivalente de 2 a 5 veces el lmite de
deteccin estimado. Se hacen al menos 4 rplicas de lectura de absorbancia del blanco de reactivos
fortificado procesado a travs de todo el mtodo analtico. Los LDM se calculan de acuerdo a:
LDM= t x s
t = valor de la "T" de Student a un intervalo de confianza de 99% y una desviacin estndar estimada para
n-1 grados de libertad. t = 3,14 para 7 rplicas.
s = desviacin estndar de las rplicas del anlisis.
El intervalo lineal de calibracin se establece a partir de por lo menos 4 estndares de diferente
concentracin, uno de los cuales debe estar prximo al lmite superior del intervalo lineal.
B.10.5.1.3 Determinacin
B.10.5.1.3.1 Ajustar el instrumento de absorcin atmica en las condiciones adecuadas para la
determinacin del analito de acuerdo a las indicaciones del manual del instrumento.
B.10.5.1.3.2 Introducir el blanco de reactivos y la muestra a analizar y registrar los valores de absorbancia.
Se debe analizar al menos un blanco de reactivos con cada grupo de muestras. Los valores obtenidos ponen
de manifiesto la calidad de los reactivos usados y el grado de contaminacin del laboratorio.
B.10.5.1.3.3 En los equipos que pueden programarse, la lectura obtenida da directamente la
concentracin del elemento en las unidades de concentracin utilizadas.
B.10.5.1.3.4 Se debe analizar al menos un blanco de reactivos fortificado para cada grupo de muestras.
Se calcula la exactitud como el porciento de recuperacin (de acuerdo al apartado B.10.5.1.3.6).
DIARIO OFICIAL
(Segunda Seccin)
B.10.5.1.3.5 Se debe fortificar al menos una muestra por grupo o el 10% de ellas lo que resulte mayor. La
concentracin aadida debe ser de aproximadamente 0,1 unidades de absorbancia.
B.10.5.1.3.6 Se debe calcular el porciento de recuperacin para el analito, de acuerdo a:
CM - C
R = -------------- x 100
CA
R = % recuperacin
CM = Concentracin de la muestra fortificada
C = Concentracin de la muestra
CA = Concentracin equivalente de analito aadido a la muestra.
Si la recuperacin del analito en la muestra fortificada est fuera del intervalo previamente establecido y el
blanco de reactivos fortificado est correcto, puede existir un problema relacionado con la matriz de la
muestra. Los datos se deben verificar por el mtodo de las adiciones estndar.
B.10.5.2 Espectrometra de absorcin atmica por horno de grafito.
B.10.5.2.1 Calibracin.
B.10.5.2.1.1 Proceder de acuerdo a los puntos B.10.5.1.1.1 a B.10.5.1.1.4
B.10.5.2.1.2 Elaborar una curva de calibracin graficando rea de pico o altura mxima contra
concentracin del analito.
La calibracin mediante el uso de una computadora o una calculadora basada en el ajuste sobre los datos
de concentracin respuesta es aceptada.
Lo anterior puede llevarse a cabo en equipos que se programan directamente, en los cuales slo es
necesario introducir los estndares y marcar su concentracin terica.
B.10.5.2.2.1 Proceder de acuerdo a B.10.5.1.2.1 a B.10.5.1.2.3
B.10.5.2.3 Determinacin.
determinacin del analito, de acuerdo a las recomendaciones del manual del instrumento.
El programa de temperaturas para el horno de grafito puede variar dependiendo de la matriz de la
muestra. En el caso de existir interferencias no especficas (absorcin molecular o dispersin de la luz), se
recomienda consultar la bibliografa existente en cuanto a los mtodos disponibles para eliminarlas, as como
en el caso de interferencias de matriz.
B.10.5.3 Espectrometra de absorcin atmica por generador de hidruros.
B.10.5.3.1.2 A partir de la solucin estndar de As de 1000 mg/l, preparar una solucin de As de 1 mg/l en
cido clorhdrico de concentracin apropiada al mtodo. Trazar una curva de calibracin de absorbancia
(mximo de la altura de pico) en funcin de la concentracin del analito para un intervalo de concentracin de
0 a 10 g/l de As bajo las mismas condiciones de la matriz de la muestra.
determinacin de As: longitud de onda de 193,7 nm y lmpara de descarga sin electrodos. Colocar y ajustar la
celda de absorcin de acuerdo al manual del fabricante. Ajustar el flujo de gas (nitrgeno o argn).
B.10.5.3.3.2 Ajustar a 0 de absorbancia con el blanco de calibracin de cido clorhdrico al 1,5% siguiendo
las instrucciones del manual del fabricante.
B.10.5.3.3.3 Optimizar con un estndar de calibracin la respuesta del instrumento al analito (por lo
general, 10 ml de una solucin de 5 g/l de As da una absorbancia de 0,2), ajustando el tiempo de purga I, el
tiempo de reaccin y el tiempo de purga II.
B.10.5.3.3.4 Tomar un volumen conocido de la muestra dirigida y seguir el mismo procedimiento que con
los estndares de calibracin.
B.10.5.4 Espectrometra de absorcin atmica por vapor fro.
(Segunda Seccin)
DIARIO OFICIAL
B.10.5.4.1.1 Proceder igual que en los puntos B.10.5.1.1.1 a B.10.5.1.1.4.
B.10.5.4.1.2 A partir de la solucin de trabajo de 1 g/ml preparar estndares de calibracin que
contengan 0, 0,2, 0,4, 0,6, 0,8 y 1,0 g de Hg a frascos de reaccin. A cada frasco agregar 100 ml de la
solucin de dilucin y 20 ml de la solucin de reduccin. Trazar la curva de calibracin de absorbancia (altura
mxima de pico) en funcin de la concentracin del analito.
B.10.5.4.2.1 Proceder de acuerdo a los puntos B.10.5.1.2.1 a B.10.5.1.2.3.
determinacin de Hg: longitud de onda de 253,6 nm, slit 0,7 nm y lmpara de ctodo hueco. Colocar y ajustar
la celda de absorcin de acuerdo al manual del fabricante. Ajustar el flujo de gas (nitrgeno o argn).
B.10.5.4.3.2 Ajustar a 0 de absorbancia con el blanco de calibracin (solucin de dilucin y de reduccin)
siguiendo las instrucciones del manual del fabricante.
B.10.5.4.3.3 Optimizar con un estndar de calibracin la respuesta del instrumento al analito.
B.10.5.4.3.4 Tomar 25 ml de la muestra digerida y seguir el mismo procedimiento que con los estndares
de calibracin.
B.10.6 Expresin de resultados
B.10.6.1 Mtodo de clculo.
Interpolar los valores de absorbancia o altura de pico de la muestra analizada en la curva de calibracin y
obtener los mg/kg del elemento en la muestra y realizar los clculos empleando la siguiente frmula:
AxB
mg/ kg = -------C
en donde:
A = Concentracin en mg/kg de la muestra a interpolar en la curva de calibracin.
B = Volumen final al que se llev la muestra (ml).
C = Peso de la muestra (g) o volumen de la muestra (ml) en el caso de agua.
En los equipos que pueden programarse, la lectura obtenida da directamente la concentracin del
elemento en mg/kg o g/kg.
B.10.7 Informe de la prueba
Los resultados se informarn en mg/kg o g/kg del elemento a determinar.
B.11. PREPARACION Y DILUCION DE MUESTRAS DE ALIMENTOS PARA SU ANALISIS
MICROBIOLOGICO.
B.11.1 Fundamento
Se basa en la preparacin de diluciones primarias, para obtener una distribucin lo ms uniforme posible
de los microorganismos presentes en la porcin de muestra.
B.11.2.1 Reactivos
Los reactivos que a continuacin se mencionan deben ser grado analtico. Cuando se indique agua debe
entenderse como agua destilada.
B.11.2.1.1 Preparacin de reactivos
B.11.2.1.1.1 Solucin de hidrxido de sodio 1,0 N
FORMULA
Ingredientes
Hidrxido de sodio
Agua
Cantidades
4,0 g
100,0 ml
Preparacin: Disolver el hidrxido de sodio y llevar a 100 ml con agua.

B.11.2.1.1.2 Soluciones diluyentes
DIARIO OFICIAL
(Segunda Seccin)
B.11.2.1.1.2.1 Solucin reguladora de fosfatos (solucin concentrada).

FORMULA
Ingredientes
Cantidades
Fosfato de Sodio monobsico
34,0 g
Agua
1,0 l
Preparacin: Disolver el fosfato en 500 ml de agua y ajustar el pH a 7,2 con solucin de hidrxido de
sodio 1,0 N. Llevar a un litro con agua. Esterilizar durante 15 minutos a 121 1,0 C. Conservar en
refrigeracin (solucin concentrada). Tomar 1,25 ml de la solucin concentrada y llevar a un litro con agua
(solucin de trabajo). Distribuir en porciones de 99, 90 y 9 ml segn se requiera. Esterilizar a 121 1,0 C
durante 15 minutos. Despus de la esterilizacin, el pH y los volmenes finales de la solucin de trabajo
debern ser iguales a los iniciales.
B.11.2.1.1.2.2 Agua peptonada
FORMULA
Ingredientes
Cantidades
Peptona
1,0 g
Cloruro de sodio
8,5 g
Agua
1,0 l
Preparacin: Disolver los componentes en un litro de agua. Ajustar el pH a 7 O,1 con hidrxido de sodio
1,0 N. Distribuir en porciones de 99, 90 y 9 ml o en cualquier volumen mltiplo de nueve segn se requiera.
Esterilizar a 121 1,0 C durante 15 minutos. Despus de la esterilizacin, el pH y los volmenes finales de la
solucin de trabajo debern ser iguales a los iniciales. Si este diluyente no es usado inmediatamente,
almacenar en lugar obscuro a una temperatura entre 0 a 5C por un tiempo no mayor de un mes, en
condiciones tales que no alteren su volumen o composicin.
B.11.2.2 Materiales
B.11.2.2.1 Pipetas bacteriolgicas para distribuir 10 y 1 ml (o si es necesario de 1 ml y 2 ml), con tapn de
algodn. Las pipetas pueden ser graduadas en volmenes iguales a una dcima de su volumen total.
B.11.2.2.2 Frascos de vidrio de 250 ml con tapn de rosca.
B.11.2.2.3 Tubos de 16 x 150 mm con tapn de rosca.
B.11.2.2.4 Utensilios esterilizables para la obtencin de muestras: cuchillos, pinzas, tijeras, cucharas,
esptulas, etc.
B.11.2.2.5 Todo el material e instrumentos que tengan contacto con las muestras bajo estudio debern
esterilizarse mediante:
Horno, durante 2 h a 170 a 175C o 1 h a 180 C o Autoclave, durante 15 minutos como mnimo a 121
1,0 C.
B.11.2.2.6 El material de vidrio puede sustituirse por material desechable que cumpla con las
especificaciones deseadas. No debe usarse material de vidrio daado por esterilizacin repetida y ste debe
ser qumicamente inerte.
B.11.3.1 Horno para esterilizar que alcance una temperatura mnima de 170C.
B.11.3.2 Autoclave con termmetro y manmetro, calibrada con termmetro de mximas y mnimas.
B.11.3.3 Bao de agua con control de temperatura y circulacin mecnica, provista con termmetro
calibrado con divisiones de 0,1C y que mantenga la temperatura a 45 0,5C.
B.11.3.4 Licuadora de una o dos velocidades controladas por un restato o bien un homogeneizador
peristltico (Stomacher).
B.11.3.5 Vasos para licuadora con tapa esterilizables o bolsas estriles para homogeneizador peristltico.
B.11.3.6 Balanza granataria con sensibilidad de 0,1 g.
B.11.4.1 Preparacin de la dilucin primaria.
B.11.4.1.1 A partir de muestras lquidas:
(Segunda Seccin)
DIARIO OFICIAL
Para muestras lquidas no viscosas (agua, leche, refrescos, etc.) en las cuales la distribucin de
microorganismos es homognea o fcilmente homogeneizable por medios mecnicos (agitacin, etc.)
Para muestras congeladas de un alimento originalmente lquido o licuable, fundir por completo en bao de
agua de 40 a 45C un tiempo mximo de 15 minutos y homogeneizar agitando vigorosamente.
Para la parte lquida de una muestra heterognea la cual sea considerada suficientemente representativa
de la muestra total (Por ejemplo la fase acuosa de grasas animales y vegetales).
B.11.4.1.1.1 Agitar la muestra manualmente con 25 movimientos de arriba a abajo en un arco de 30 cm
efectuados en un tiempo de 7 segundos. Tomar 1 ml de la muestra y diluir con 9 ml del diluyente el cual debe
encontrarse a una temperatura similar a sta, evitando el contacto entre la pipeta y el diluyente.
B.11.4.1.1.2 Siempre que la cantidad de muestra lo permita, tomar alcuotas mayores, por ejemplo
volmenes de 10 u 11 ml, diludos con 90 o 99 ml, de la misma forma que se describi anteriormente
B.11.4.1.2 A partir de muestras slidas o semislidas.
Las muestras slidas y semislidas congeladas, deben descongelarse en refrigeracin de 4 a 8C durante
18 horas y no ms de 24 horas antes de proceder a su anlisis.
B.11.4.1.2.1 Pesar una cantidad de 10 u 11 g de la muestra por analizar en un recipiente o bolsa plstica
estriles de tamao adecuado.
B.11.4.1.2.2 Adicionar un volumen de 90 a 99 ml del diluyente llevado a una temperatura similar a la de la
muestra.
B.11.4.1.2.3 Operar la licuadora o el homogeneizador peristltico de 1 a 2 minutos hasta obtener una
suspensin completa y homognea segn se indique en la tcnica correspondiente para cada alimento. An
en los equipos ms lentos, este tiempo no debe exceder de 2,5 minutos.
B.11.4.1.2.4 Permitir que las partculas grandes se sedimenten, y transferir la cantidad deseada tomando
de las capas superiores de la suspensin.
Cuando la dilucin primaria es muy viscosa o pegajosa, adicionar ms diluyente, lo cual debe tomarse en
cuenta para las operaciones subsecuentes o expresin de resultados.
El homogeneizador peristltico (Stomacher) puede no ser adecuado para algunos productos (por ejemplo,
aquellos con partculas agudas o constituyentes que no se dispersen fcilmente). Debe ser utilizado slo
cuando exista evidencia (publicada o por ensayos comparativos) de que los resultados obtenidos no difieren
significativamente con aquellos obtenidos con licuadora.
B.11.4.2 Preparacin de las diluciones decimales adicionales.
B.11.4.2.1 Transferir 1 ml o un mltiplo, por ejemplo, 10 u 11 ml de la dilucin primaria 1 + 9 (10-1), en otro
recipiente conteniendo nueve veces el volumen del diluyente estril a la temperatura apropiada, evitando el
contacto entre la pipeta y el diluyente.
B.11.4.2.2 Mezclar cuidadosamente cada botella de diluyente siempre de la misma manera que se
describe en B.11.4.1.1.1.
B.11.4.2.3 La seleccin de las diluciones que se vayan a preparar y de aquellas que se van a inocular,
dependen del nmero esperado de microorganismos en la muestra, con base a los resultados de anlisis
previos y de la informacin que se obtenga del personal de inspeccin que la haya colectado. En ausencia
total de informacin, trabajar con las diluciones de la primera a la sexta.
B.11.4.2.4 Utilizar pipetas diferentes para cada dilucin inoculando simultneamente las cajas que se
hayan seleccionado. El volumen que se transfiera nunca debe ser menor al 10% de la capacidad total de la
pipeta.
B.11.4.2.5 Si la pipeta es terminal y se transfiere un volumen de lquido equivalente a su capacidad total,
escurrir aplicando la punta de la pipeta una sola vez en un rea de la caja Petri sin lquido.
B.11.4.2.6 Mientras se afora el lquido de la pipeta, la punta de sta debe apoyarse en el interior del cuello
del frasco y mantenerla en posicin vertical, para lo cual este ltimo debe inclinarse lo necesario.
En estudios donde se busca la presencia o ausencia de una determinada especie de microorganismos en
0,1 ml o 0,1 g, no es necesario preparar diluciones mayores.
El criterio para seleccionar las diluciones a preparar de acuerdo con el nmero de microorganismos
esperado es:
Para la tcnica del nmero ms probable utilizar tres tubos: donde sea posible demostrar el
microorganismo en 10 ml de la dilucin ms alta.
Para la tcnica de cuenta en placa, considerar aquellas en las que se puedan contar de 25 a 250 colonias
en un mnimo de una de tres diluciones en el mtodo de cuenta de bacterias aerobias en placa. En el caso de
otros grupos microbianos, considerar el nmero especificado de colonias en la Norma Oficial Mexicana
correspondiente.
DIARIO OFICIAL
(Segunda Seccin)
B.11.4.3 Duracin del procedimiento.

En general, las diluciones de la muestra deben ser preparadas inmediatamente antes del anlisis y stas
deben ser usadas para inocular el medio de cultivo dentro de los 20 minutos posteriores a su preparacin.
B.12. DETERMINACION DE BACTERIAS COLIFORMES. TECNICA DEL NUMERO MAS PROBABLE.
B.12.1 Fundamento
El mtodo se basa en que las bacterias coliformes, fermentan la lactosa incubadas a 35 1 C durante 24
a 48 horas, resultando una produccin de cidos y gas el cual se manifiesta en las campanas de
fermentacin.
Los reactivos que a continuacin se mencionan deben ser grado analtico. Cuando se indique agua debe
entenderse como agua destilada con pH cercano a la neutralidad.
B.12.2.1 Reactivos
B.12.2.1.1 Soluciones diluyentes
B.12.2.1.1.1 Solucin reguladora de fosfatos (solucin concentrada)
FORMULA
Ingredientes
Cantidades
Fosfato monopotsico
34,0 g
Agua
1,0 l
sodio 1N. Llevar a un litro con agua. Esterilizar durante 15 minutos a 121 1,0 C. Conservar en refrigeracin
(solucin concentrada). Tomar 1,25 ml de la solucin concentrada y llevar a un litro con agua. Distribuir en
porciones de 99, 90 y 9 ml segn se requiera. Esterilizar durante 15 minutos a 121 1 C. Despus de la
esterilizacin, el pH y los volmenes finales de la solucin de trabajo deben ser iguales a los iniciales.
B.12.2.1.1.2. Agua peptonada
FORMULA
Ingredientes
Cantidades
Peptona
1,0 g
Cloruro de sodio
8,5 g
Agua
1,0 l
Preparacin: Disolver los componentes en un litro de agua. Ajustar el pH a 7,0 con hidrxido de sodio 1
N. Distribuir en porciones de 99, 90 y 9 ml o en cualquier volumen mltiplo de nueve segn se requiera.
Esterilizar durante 15 minutos a 121 1,0 C. Despus de la esterilizacin los volmenes finales de la
solucin de trabajo deben ser iguales a los iniciales. Si este diluyente no es usado inmediatamente, almacenar
en lugar obscuro a una temperatura entre 0 a 5C por un tiempo no mayor de un mes, en condiciones tales
que no alteren su volumen o composicin.
B.12.2.1.2 Medios de cultivo.
Caldo lactosado (medio de enriquecimiento para agua potable y hielo).
Caldo lauril sulfato triptosa (medio de enriquecimiento selectivo).
Caldo lactosa bilis verde brillante (medio de confirmacin).
En el caso del anlisis de agua potable y hielo puede utilizarse caldo lactosado o caldo lauril sulfato
triptosa con prpura de bromocresol (concentracin 0,01 g/l de medio), como alternativa al uso de campanas
de fermentacin. Los tubos positivos se manifiestan por el vire del indicador a color amarillo.
B.12.2.1.2.1 Caldo lactosado
Ingrediente
Medio de concentracin
Medio de concentracin sencilla
1,5
Extracto de carne
4,5 g
3,0 g
Peptona de gelatina
7,5 g
5,0 g
Lactosa
Agua destilada
7,5 g
5,0 g
1000,0 ml
1000,0 ml
(Segunda Seccin)
DIARIO OFICIAL
Disolver los ingredientes en 1 l de agua, calentando si es necesario o el medio completo deshidratado,

siguiendo las instrucciones del fabricante. Ajustar el pH final de tal manera que despus de la esterilizacin
ste sea de 6,9 0,2 a 25C. Distribuir en volmenes de 10 ml en tubos con dimensiones de 16 x 160 mm el
medio de concentracin sencilla y de 20 ml en tubos de 20 x 200 mm el medio de concentracin 1,5, cada
tubo debe tener campana de fermentacin. Esterilizar en autoclave por 15 minutos a 121 1,0 C. Enfriar
rpidamente para evitar una exposicin excesiva al calor. El aspecto del caldo es claro y de color beige. Se
puede utilizar una concentracin doble del medio de cultivo, en cuyo caso se emplearn 10 ml del caldo
preparado, cuando se agreguen 10 ml de la muestra.
B.12.2.1.2.2 Caldo lauril sulfato triptosa.
Ingrediente
Medio de concentracin 1,5
Medio de concentracin
sencilla
Triptosa
30,0 g
20,0 g
Lactosa
7,5 g
5,0 g
Fosfato dipotsico
4,125 g
2,75 g
Fosfato monopotsico
4,125 g
2,75 g
Cloruro de sodio
7,50 g
5,0 g
Lauril sulfato de sodio
0,15 g
0,1 g
1000,0 ml
1000,0 ml
Agua destilada
Disolver los componentes en 1 l de agua, calentando si es necesario o el medio de cultivo completo

deshidratado, siguiendo las instrucciones del fabricante. Ajustar el pH de tal manera que despus de la
esterilizacin ste sea de 6,8 0,2 a 25C. Distribuir en volmenes de 10 ml en tubos con dimensiones de 16
x 160 mm el medio de concentracin sencilla y de 20 ml en tubos de 20 x 200 mm el medio de concentracin
1,5, cada tubo debe tener campana de fermentacin. Esterilizar en autoclave por 15 minutos a 121 1,0C.
Se recomienda almacenar el medio una vez preparado. Las campanas de fermentacin no deben de contener
burbujas de aire despus de la esterilizacin. Se puede utilizar una concentracin doble del medio de cultivo,
en cuyo caso se emplearn 10 ml de caldo preparado, cuando se agreguen 10 ml de muestra.
B.12.2.1.2.3 Lactosa bilis verde brillante
FORMULA
Ingredientes
Cantidades
Peptona
10,0 g
Lactosa
10,0 g
Sales biliares
20,0 g
Verde brillante
0,0133 g
Agua
1,0 l
Disolver los componentes o el medio completo deshidratado en agua, calentar si es necesario. Ajustar el
pH, de tal manera que despus de la esterilizacin ste sea de 7,2 a 25C. Distribuir el medio en cantidades
de 10 ml en tubos de 16 X 160 mm conteniendo campana de fermentacin. Esterilizar en autoclave por 15
minutos a 121 1,0C. Las campanas de fermentacin no deben contener burbujas de aire despus de la
esterilizacin.
B.12.2.2 Materiales
Pipetas bacteriolgicas para distribuir 10 y 1 ml (o si es necesario de 11 y 2 ml), con tapn de

Frascos de vidrio de 250 ml con tapn de rosca.
Utensilios esterilizables para la obtencin de muestras: cuchillos, pinzas, tijeras, cucharas, esptulas,
etc.
Tubos de cultivo 20 x 200 mm y de 16 x 160 mm con tapones metlicos o de rosca.
Campanas de fermentacin (tubos de Durham).

Pipetas bacteriolgicas graduadas de 10 y 1 ml
Gradillas.
Asa de platino o nicromel de aproximadamente 3 mm de dimetro
DIARIO OFICIAL
(Segunda Seccin)
Todo el material que tenga contacto con las muestras bajo estudio debe esterilizarse mediante:
Horno, durante 2 horas a 170 a 175C o 1 h a 180C o autoclave, durante 15 minutos como mnimo a
121 1,0C.
El material de vidrio puede sustituirse por material desechable que cumpla con las especificaciones
deseadas. No debe usarse material de vidrio daado por las esterilizaciones repetidas y ste debe
Horno para esterilizar que alcance una temperatura mnima de 170 C.
Incubadora con termostato que evite variaciones mayores de 1,0C, provista con termmetro
calibrado.
Termmetro de mximas y mnimas.
Autoclave que alcance una temperatura mnima de 121 1,0C.
Potencimetro con una escala mnima de 0,1 unidades de pH a 25C.

Las muestras deben prepararse y diluirse, siempre que sea posible, de acuerdo al Mtodo de Preparacin
y Dilucin de Muestras de Alimentos para su Anlisis Microbiolgico.
B.12.5.1 Para alimentos.
Preparar suficiente nmero de diluciones para asegurar que todos los tubos correspondientes a la ltima
dilucin rindan un resultado negativo.
B.12.5.1.1 Prueba presuntiva
B.12.5.1.1.1 Inoculacin. Tomar tres tubos de medio de enriquecimiento de mayor concentracin. Usar
una pipeta estril para transferir a cada tubo 10 ml de la muestra si es lquida o 10 ml de la dilucin primaria
inicial, en el caso de otros productos.
B.12.5.1.1.1.1 Tomar tres tubos de concentracin sencilla del medio selectivo de enriquecimiento. Usar
una pipeta estril para transferir a cada uno de estos tubos 1 ml de la muestra si es lquida o 1 ml de la
dilucin primaria en el caso de otros productos.
B.12.5.1.1.1.2 Para las diluciones subsecuentes, continuar como se indica en el prrafo anterior, usando
una pipeta diferente para cada dilucin. Mezclar suavemente el inculo con el medio.
B.12.5.2.1.2 Incubacin. Incubar los tubos a 35 0,5 C por 24 2 horas y observar si hay formacin de
gas, en caso contrario prolongar la incubacin hasta 48 2 horas
B.12.5.1.2 Prueba confirmativa
De cada tubo que muestre formacin de gas, tomar una asada y sembrar en un nmero igual de tubos con
medio de confirmacin. Incubar a 35 0,5 C por 24 2 horas o si la formacin de gas no se observa en este
tiempo, prolongar la incubacin por 48 2 horas.
En esta Norma Oficial Mexicana se considera una combinacin de tres tubos por cada dilucin de la serie.
Para algunos productos y siempre que se requiera una mayor precisin en los resultados, ser necesario
inocular una serie de cinco o diez tubos.
B.12.6 EXPRESION DE LOS RESULTADOS.
Tomar la serie de tubos de la prueba confirmativa que d formacin de gas despus del perodo de
incubacin requerido y buscar el NMP en los cuadros correspondientes.
El cuadro 3 muestra algunos ejemplos que se pueden presentar.
Ejemplos:
Ejemplo 1. Cuando slo una dilucin muestra tres tubos positivos, elegir sta y las diluciones mayores
posteriores.
Ejemplo 2. Cuando ms de una dilucin muestra tres tubos positivos y la ltima da menos de tres, elegir
esta ltima y las dos diluciones anteriores ms bajas.
Ejemplo 3. Cuando en ninguna dilucin hay tres tubos positivos y stos se encuentran en ms de tres
diluciones, seleccionar las dos diluciones mayores positivas y la siguiente.
Ejemplos 4 y 5. Cuando los tubos positivos slo se encuentran en la muestra sin diluir (10 ml o 1 g) y en la
primera dilucin (1 ml o 10-1), seleccionar las tres primeras diluciones para el clculo del nmero ms
probable.
(Segunda Seccin)
DIARIO OFICIAL
En cada caso se obtiene un nmero de tres cifras, lo cual es representado en los cuadros 4 al 7, segn
corresponda. En la columna que indica el nmero de tubos positivos se busca el ndice del NMP.
La tcnica de NMP puede admitir gran cantidad de variaciones. Los resultados obtenidos con esta tcnica
deben ser utilizados con precaucin. Los lmites de confianza estn representados en los cuadros 4 al 7. Por
ejemplo, para una muestra slida con un NMP de 70 coliformes por gramo, los lmites de confianza en el 95%
de los casos variarn de 10 a 230 coliformes por gramo (ejemplo 3 del cuadro 3) y en un producto con 24 de
NMP de coliformes por gramo, los lmites de confianza son de 3,6 a 130 coliformes por gramo (ejemplo 2
cuadro 3).
CUADRO 4. Indice del NMP y lmites de confianza 95% para varias combinaciones de resultados
positivos cuando son usados varios nmeros de tubos. (Diluciones 10, 1,0 y 0,1g)
3 TUBOS POR DILUCION
95% Lmites de confianza
bajo
alto
<0,005
<0,09
<0,005
<0,09
Combinacin
de positivos
Indice del NMP

por g
0-0-0
0-0-1
< 0,03
0,03
0-1-0
0-2-0
1-0-0
1-0-1
1-1-0
1-1-1
0,03
--0,04
0,07
0,07
0,11
<0,005
--<0,005
0,01
0,01
0,03
1-2-0
2-0-0
2-0-1
2-1-0
2-1-1
2-2-0
2-2-1
2-3-0
3-0-0
3-0-1
3-0-2
3-1-0
3-1-1
0,11
0,09
0,14
0,15
0,20
0,21
0,28
--0,23
0,39
0,64
0,43
0,75
0,03
0,01
0,03
0,03
0,07
0,04
0,10
--0,04
0,07
0,15
0,07
0,14

Indice del NMP
por g
bajo
alto
<0,02
0,02
<0,005
<0,005
<0,07
0,07
0,13
--0,20
0,21
0,23
0,36
0,02
0,04
0,02
0,04
0,04
0,06
<0,005
<0,005
<0,005
<0,005
<0,005
<0,005
0,07
0,11
0,07
0,11
0,11
0,15
0,36
0,36
0,37
0,44
0,89
0,47
1,50
--1,20
1,3
3,80
2,1
2,3
0,06
0,05
0,07
0,07
0,09
0,09
---0,12
0,08
0,11
--0,11
0,14
<0,005
<0,005
0,01
0,01
0,02
0,02
--0,03
0,01
0,02
--0,02
0,04
0,15
0,13
0,17
0,17
0,21
0,21
--0,28
0,19
0,25
--0,25
0,34
DIARIO OFICIAL
(Segunda Seccin)
3-1-2
3-2-0
3-2-1
3-2-2
3-3-0
3-3-1
3-3-2
3-3-3
4-0-0
4-0-1
4-1-0
4-1-1
4-1-2
4-2-0
1,20
0,93
1,50
2,10
2,40
4,60
11,0
>11.0
-------
0,30
0,15
0,30
0,35
0,36
0,71
1,50
>1,50
----------
3,8
3,80
4,40
4,70
13,0
24,0
48,0
>48.0
-------------
--0,14
0,17
-----0,13
0,17
0,17
0,21
0,26
0,22
--0,04
0,05
-----0,03
0,05
0,05
0,07
0,09
0,07
--0,34
0,46
-----0,31
0,46
0,46
0,63
0,78
0,67
4-2-1
4-3-0
4-3-1
4-4-0
5-0-0
5-0-1
-------
-------------
-------------
0,26
0,27
0,33
0,34
0,23
0,31
0,09
0,09
0,11
0,12
0,07
0,11
0,78
0,80
0,93
0,93
0,70
0,89
5-0-2
5-1-0
5-1-1
5-1-2
5-2-0
5-2-1
5-2-2
--------
---------------
----------------
0,43
0,33
0,46
0,63
0,49
0,70
0,94
0,15
0,11
0,16
0,21
0,17
0,23
0,28
1,14
0,93
1,2
1,5
1,3
1,70
2,2
5-3-0
5-3-1
5-3-2
5-3-3
5-4-0
5-4-1
-------
-------------
-------------
0,79
1,10
1,4
1,80
1,30
1,70
0,25
0,31
0,37
0,44
0,35
0,43
1,9
2,5
3,4
5,0
3,0
4,9
5-4-2
5-4-3
5-4-4
5-5-0
5-5-1
5-5-2
5-5-3
5-5-4
5-5-5
------------------
-------------------
-------------------
2,20
2,80
3,50
2,40
3,50
5,40
9,20
16,09
---
0,57
0,90
1,20
0,68
1,60
1,80
3,0
6,40
---
7,0
8,5
10,0
7,5
10,0
14,0
32,0
58,0
---
positivos cuando son usados varios nmeros de tubos. (Diluciones 1,0, 0,1 y 0,01g)
Combinacin de
positivos
Indice del
NMP por g
0-0-0
0-0-1
0-1-0
0-2-0
1-0-0
1-0-1
1-1-0
1-1-1
<0,3
0,3
0,3
--0,4
0,7
0,7
1,1

bajo
alto
<0,05
<0,9
<0,05
<0,9
<0,05
1,3
----<0,05
2,0
0,1
2,0
0,1
2,3
0,3
3,6

Indice del NMP
por g
bajo
alto
<0,2
0,2
0,2
0,4
0,2
0,4
0,4
0,6
<0,05
<0,05
<0,05
<0,05
<0,05
<0,05
<0,05
<0,05
<0,7
0,7
0,7
0,11
0,7
1,1
1,1
1,5
(Segunda Seccin)
DIARIO OFICIAL
1-2-0
2-0-0
2-0-1
2-1-0
2-1-1
2-2-0
2-2-1
2-3-0
3-0-0
3-0-1
3-0-2
3-1-0
3-1-1
3-1-2
1,1
0,9
1,4
1,5
2,0
2,1
2,8
--2,3
3,9
6,4
4,3
7,5
12,0
0,3
0,1
0,3
0,3
0,7
0,4
1,0
--0,4
0,7
1,5
0,7
1,4
3,0
3,6
3,6
3,7
4,4
8,9
4,7
15,0
--12,0
13,0
38,0
21,0
23,0
38,0
0,6
0,5
0,7
0,7
0,9
0,9
--1,2
0,8
1,1
-1,1
1,4
--
<0,05
<0,05
0,1
0,1
0,2
0,2
--0,3
0,1
0,2
-0,2
0,4
--
1,5
1,3
1,7
1,7
2,1
2,1
--2,8
1,9
2,5
-2,5
3,4
--
3-2-0
3-2-1
3-2-2
3-3-0
3-3-1
3-3-2
9,3
15,0
21,0
24,0
46,0
110,0
1,5
3,0
3,5
3,6
7,1
15,0
38,0
44,0
47,0
130,0
240,0
480,0
1,4
1,7
-----
0,4
0,5
-----
3,4
4,6
-----
3-3-3
4-0-0
4-0-1
4-1-0
4-1-1
4-1-2
4-2-0
>110,0
-------
>15,0
-------------
>480,0
-------------
-1,3
1,7
1,7
2,1
2,6
2,2
-0,3
0,5
0,5
0,7
0,9
0,7
-3,1
4,6
4,6
6,3
7,8
6,7
4-2-1
4-3-0
4-3-1
4-4-0
5-0-0
5-0-1
-------
-------------
-------------
2,6
2,7
3,3
3,4
2,3
3,1
0,9
0,9
1,1
1,2
0,7
1,1
7,8
8,0
9,3
3,
7,0
8,9
5-0-2
5-1-0
5-1-1
5-1-2
5-2-0
5-2-1
5-2-2
5-3-0
5-3-1
5-3-2
5-3-3
5-4-0
5-4-1
5-4-2
5-4-3
5-4-4
5-5-0
5-5-1
5-5-2
5-5-3
5-5-4
5-5-5
-----------------------
---------------------------------------------
---------------------------------------------
4,3
3,3
4,6
6,3
4,9
7,0
9,4
7,9
11,0
14,0
18,0
13,0
17,0
22,0
28,0
35,0
24,0
35,0
54,0
92,0
161,0
>161,0
1,5
1,1
1,6
2,1
1,7
2,3
2,8
2,5
3,1
3,7
4,4
3,5
4,3
5,7
9,0
12,0
6,8
12,0
18,0
30,0
64,0
>64,0
11,4
9,3
12,0
15,0
13,0
17,0
22,0
19,0
25,0
34,0
50,0
30,0
49,0
70,0
85,0
100,0
75,0
100,0
140,0
320,0
580,0
>580,0
DIARIO OFICIAL
(Segunda Seccin)
positivos cuando son usados varios nmeros de tubos. (Diluciones 0,1, 0,001 y 0,0001 g)
bajo
Alto
<0,5
<9
<0,5
<9
<0,5
13
----<0,5
20
1
21
1
23
3
36
3
36
1
36
3
37
3
44
7
89
4
47
10
150
----4
120
7
13,0
15
380
7
210
14
230
30
380
15
380
30
440
35
470
36
130,0
71
240,0
150
480,0
>150
>480,0
Combinacin
de positivos
Indice del
NMP por g
0-0-0
0-0-1
0-1-0
0-2-0
1-0-0
1-0-1
1-1-0
1-1-1
1-2-0
2-0-0
2-0-1
2-1-0
2-1-1
2-2-0
2-2-1
2-3-0
3-0-0
3-0-1
3-0-2
3-1-0
3-1-1
3-1-2
3-2-0
3-2-1
3-2-2
3-3-0
3-3-1
3-3-2
3-3-3
<3
3
3
--4
7
7
11
11
9
14
15
20
21
28
--23
39
64
43
75
120
93
150
210
240
460
1100
>1100
4-0-0
4-0-1
4-1-0
4-1-1
4-1-2
4-2-0
4-2-1
4-3-0
4-3-1
4-4-0
5-0-0
5-0-1
5-0-2
--------------
---------------------------
5-1-0
5-1-1
5-1-2
5-2-0
5-2-1
5-2-2
-------
5-3-0
5-3-1
---

Indice del NMP
por g
bajo
alto
<2
2
2
4
2
4
4
6
6
5
7
7
9
9
--12
8
11
-11
14
-14
17
------
<0,5
<0,5
<0,5
<0,5
<0,5
<0,5
<0,5
<0,5
<0,5
<0,5
1,0
1,0
2
2
--3
1
2
-2
4
-4
5
------
<7
7
7
11
7
11
11
15
15
13
17
17
21
21
--28
19
25
-25
34
-34
46
------
---------------------------
13
17
17
21
26
22
26
27
33
34
23
31
43
3
5
5
7
9
7
9
9
11
12
7
11
15
31
46
46
63
78
67
78
80
93
93
7
89
114
-------------
-------------
33
46
63
49
70
94
11
16
21
17
23
28
93
120
150
130
170
220
-----
-----
79
110
25
31
190
250
(Segunda Seccin)
5-3-2
5-3-3
5-4-0
5-4-1
5-4-2
5-4-3
5-4-4
5-5-0
5-5-1
5-5-2
5-5-3
5-5-4
5-5-5
--------------
DIARIO OFICIAL
---------------------------
---------------------------

140
180
130
170
220
280
350
240
350
540
920
1600
>1600
37
44
35
43
57
90
120
68
120
180
300
640
>640
340
500
300
490
700
850
1000
750
1000
1400
3200
5800
>5800
positivos cuando son usados varios nmeros de tubos. (Diluciones 0,01, 0,001 y 0,0001 g)
Combinacin
de positivos
Indice del
NMP por g
0-0-0
0-0-1
0-1-0
0-2-0
1-0-0
<30
30
30
--40
1-0-1
1-1-0
1-1-1
1-2-0
2-0-0
2-0-1
2-1-0
2-1-1
2-2-0
2-2-1
2-3-0
3-0-0
3-0-1
3-0-2
3-1-0
3-1-1
3-1-2
3-2-0
3-2-1
3-2-2
3-3-0
3-3-1
3-3-2
3-3-3
4-0-0
4-0-1
4-1-0
4-1-1
4-1-2
4-2-0
4-2-1
70
70
110
110
90
140
150
200
210
280
--230
390
640
430
750
1200
930
1500
2100
2400
4600
11000
>11000
--------

bajo
Alto
<5
<90
<5
<90
<5
130
----<5
200
10
10
30
30
10
30
30
70
40
100
--40
70
150
70
140
300
150
300
350
360
710
1500
>1500
---------------
210
230
360
360
360
370
440
890
470
1500
--1200
1300
3800
2100
2300
3800
3800
4400
4700
13000
24000
48000
>48000
---------------

Indice del NMP
por g
bajo
alto
<20
20
20
40
20
<5
<5
<5
<5
<5
<70
70
70
110
70
40
40
60
60
50
70
70
90
90
--120
80
110
-110
140
-140
170
-----130
170
170
210
260
220
260
<5
<5
<5
<5
<5
10
10
20
20
--30
10
20
-20
40
-40
50
-----30
50
50
70
90
70
90
110
110
150
150
130
170
170
210
210
--280
190
250
-250
340
-340
460
-----310
460
460
630
780
670
780
DIARIO OFICIAL
(Segunda Seccin)
4-3-0
4-3-1
4-4-0
5-0-0
5-0-1
5-0-2
5-1-0
5-1-1
5-1-2
5-2-0
5-2-1
5-2-2
5-3-0
5-3-1
---------------
-----------------------------
-----------------------------
270
330
340
230
310
430
330
460
630
490
700
940
790
1100
90
110
120
70
110
150
110
160
210
170
230
280
250
310
800
930
930
700
890
1140
930
1200
1500
1300
1700
2200
1900
2500
5-3-2
5-3-3
5-4-0
5-4-1
5-4-2
5-4-3
-------
-------------
-------------
1400
1800
1300
1700
2200
2800
370
440
350
430
570
900
3400
5000
3000
4900
7000
8500
5-4-4
5-5-0
5-5-1
5-5-2
5-5-3
5-5-4
5-5-5
--------
---------------
---------------
3500
2400
3500
5400
9200
16000
>16000
1200
680
1200
1800
3000
6400
>6400
10000
7500
10000
14000
32000
58000
>58000

Informar "Nmero ms probable (NMP) de coliformes por gramo o mililitro de muestra".
En caso de muestras de agua informar NMP/100 ml.
B.13. METODO PARA LA CUENTA DE MICROORGANISMOS COLIFORMES TOTALES EN PLACA.
B.13.1 Fundamento
El mtodo permite determinar el nmero de microorganismos coliformes presentes en una muestra,
utilizando un medio selectivo (agar rojo violeta bilis) en el que se desarrollan bacterias a 35C en
aproximadamente 24 h, dando como resultado la produccin de gas y cidos orgnicos, los cuales viran el
indicador de pH y precipitan las sales biliares.
B.13.2.1 Reactivos
Los reactivos que a continuacin se mencionan, deben ser grado analtico y cuando se indique agua debe
entenderse como agua destilada.
B.13.2.1.1.1 Solucin reguladora de fosfatos (solucin concentrada)
FORMULA
Ingredientes
Fosfato monopotsico
Agua
Cantidades
34,0 g
1,0 l
sodio 1,0 N. Llevar con agua a un litro. Esterilizar a 121 1,0C durante 15 minutos. Conservar en
refrigeracin (solucin concentrada). Tomar 1,25 ml de la solucin concentrada y llevar a un litro con agua
(solucin de trabajo). Distribuir en porciones de 99, 90 y 9 ml segn se requiera. Esterilizar durante 15 minutos
a 121 1,0C. Despus de la esterilizacin, el pH y los volmenes finales de la solucin de trabajo deben ser
iguales a los iniciales.
(Segunda Seccin)
DIARIO OFICIAL
B.13.2.1.1.2 Agua Peptonada

FORMULA
Ingredientes
Cantidades
Peptona
1,0 g
NaCl
8,5 g
Agua
1,0 l
Preparacin: Disolver los componentes en un litro de agua. Ajustar el pH a 7,0 con hidrxido de sodio 1,0
N. Distribuir en porciones de 99, 90 y 9 ml o en cualquier volumen mltiplo de nueve segn se requiera.
Esterilizar durante 15 minutos a 121 1,0C. Despus de la esterilizacin, los volmenes finales de la
solucin de trabajo deben ser iguales a los iniciales. Si este diluyente no es usado inmediatamente, almacenar
en lugar obscuro a una temperatura entre 0 a 5C por un tiempo no mayor de un mes, en condiciones tales
que no alteren su volumen o composicin.
B.13.2.1.2 Medio de Cultivo
Agar-rojo- violeta-bilis-lactosa (RVBA)
FORMULA
Ingredientes
Peptona
Cantidades
7,0 g
Extracto de levadura
3,0 g
Lactosa
10,0 g
Sales biliares
1,5 g
Cloruro de sodio
5,0 g
Rojo neutro
0,03 g
Cristal violeta
0,002 g
Agar
15,0 g
Agua
1,0 l
Preparacin: Mezclar los componentes en el agua y dejar reposar durante algunos minutos. Mezclar
perfectamente y ajustar el pH a 7,4 con cido clorhdrico 0,1N o con hidrxido de sodio 0,1N a 25C, de forma
que despus del calentamiento se mantenga en este valor. Calentar con agitacin constante y hervir durante 2
minutos. Enfriar inmediatamente el medio en un bao de agua hasta que llegue a 45C. Evitar el
sobrecalentamiento del medio. No debe esterilizarse en autoclave. Usar el medio dentro de las tres primeras
horas despus de su preparacin. En el caso de utilizar medio de cultivo deshidratado, seguir las
instrucciones del fabricante.
B.13.2.2 Materiales
Pipetas bacteriolgicas para distribuir 10 y 1 ml (o si es necesario de 11 y 2 ml), con tapn de

Frascos de vidrio de 250 ml con tapn de rosca.
Tubos de 16 X 150 mm con tapn de rosca.
Utensilios esterilizables para la obtencin de muestras: cuchillos, pinzas, tijeras, cucharas,

esptulas, etc.
Cajas Petri.
Todo el material e instrumentos que tengan contacto con las muestras bajo estudio debe esterilizarse
mediante:
Horno, durante 2 h a 170 - 175C, o 1 h a 180C; o en autoclave, durante 15 minutos como mnimo a
121 1,0C.
El material de vidrio puede sustituirse por material desechable que cumpla con las especificaciones
deseadas. No debe usarse material de vidrio daado por las esterilizaciones repetidas y ste debe
Horno para esterilizar que alcance una temperatura mnima
de 170C.
DIARIO OFICIAL
(Segunda Seccin)
Autoclave con termmetro y manmetro, calibrada con termmetro de mximas y mnimas.
Bao de agua con control de temperatura y circulacin mecnica, provista con termmetro calibrado
con divisiones de 0,1 C y que mantenga la temperatura a 45 1,0C.
Vasos para licuadora con tapa esterilizables o bolsas estriles para homogeneizador peristltico.
Incubadora con termostato que evite variaciones mayores de 1,0 C, provista con termmetro
calibrado.
Contador de colonias de campo oscuro, con luz adecuada, placa de cristal cuadriculada y lente
amplificador.
Registrador mecnico o electrnico.
Microscopio ptico.
Potencimetro con una escala mnima de 0,1 unidades de pH a 25 C.

La preparacin de la muestra debe ser de acuerdo a lo establecido en el mtodo de Preparacin y Dilucin
de Muestras de Alimentos para su Anlisis Microbiolgico.
B.13.5.1 Colocar en cajas Petri por duplicado 1 ml de la muestra lquida directa o de la dilucin primaria,
utilizando para tal propsito una pipeta estril.
B.13.5.2 Repetir el procedimiento tantas veces como diluciones decimales se requiera sembrar, utilizando
una pipeta estril diferente para cada dilucin.
B.13.5.3 Verter de 15 a 20 ml del medio RVBA fundido y mantenido a 45 1,0C en bao de agua. En el
caso de utilizar cajas de Petri de plstico se vierte de 10 a 15 ml del medio. El tiempo transcurrido entre la
preparacin de la dilucin primaria y el momento en que se vierte el medio de cultivo, no debe exceder de 20
minutos.
B.13.5.4 Mezclar cuidadosamente el inculo con el medio con seis movimientos de derecha a izquierda,
seis movimientos en el sentido de las manecillas del reloj, seis movimientos en el sentido contrario al de las
manecillas del reloj y seis de atrs para adelante, sobre una superficie lisa y nivelada. Permitir que la mezcla
solidifique dejando las cajas Petri reposar sobre una superficie horizontal fra.
B.13.5.5 Preparar una caja control con 15 ml de medio para verificar la esterilidad.
B.13.5.6 Despus de que est el medio completamente solidificado en la caja, verter aproximadamente 4
ml del medio RVBA a 45 1,0C en la superficie del medio inoculado. Dejar que solidifique.
B.13.5.7 Invertir las placas y colocarlas en la incubadora a 35C, durante 24 2 horas.
B.13.5.8 Despus del perodo especificado para la incubacin, contar las colonias con el contador de
colonias.
B.13.5.9 Seleccionar las placas que contengan entre 15 y 150 colonias. Las colonias tpicas son de color
rojo oscuro, generalmente se encuentran rodeadas de un halo de precipitacin debido a las sales biliares, el
cual es de color rojo claro o rosa, la morfologa colonial es semejante a lentes biconvexos con un dimetro de
0,5 a 2,0 mm.
B.13.6 Expresin de los resultados
B.13.6.1 Clculo del Mtodo
B.13.6.1.1 Placas que contienen entre 15 y 150 colonias caractersticas.
Separar las placas que contienen el nmero antes mencionado de colonias caractersticas en dos
diluciones consecutivas. Contar las colonias presentes. Calcular el nmero de coliformes por mililitro o por
gramo de producto, multiplicando el nmero de colonias por el inverso de la dilucin correspondiente,
tomando los criterios del mtodo para la Cuenta de Bacterias Aerobias en Placa.
B.13.6.1.2 Placas que contienen menos de 15 colonias caractersticas.
Si cada una de las placas tiene menos de 15 colonias caractersticas, reportar el nmero obtenido seguido
de la dilucin correspondiente.
B.13.6.1.3 Placas con colonias no caractersticas.
Si en las placas no hay colonias caractersticas, reportar el resultado como: menos de un coliforme por 1/d
por gramo, en donde d es el factor de dilucin.
Informar: UFC/g o ml en placa de agar rojo violeta bilis, incubados a 35C durante 24 2 h.
(Segunda Seccin)
DIARIO OFICIAL
En caso de emplear diluciones y no observar crecimiento, informar utilizando como referencia la dilucin
ms baja utilizada, por ejemplo dilucin 10-1.
En caso de no observar crecimiento en la muestra sin diluir se informa: "no desarrollo de coliformes por
ml".
B.14. METODO PARA LA DETERMINACION DE Salmonella EN ALIMENTOS.
B.14.1 Fundamento
La presente tcnica para la deteccin de Salmonella en alimentos, describe un esquema general que
consiste de 5 pasos bsicos:
B.14.1.1 Preenriquecimiento, es el paso donde la muestra es enriquecida en un medio nutritivo no
selectivo, que permite restaurar las clulas de Salmonella daadas a una condicin fisiolgica estable.
B.14.1.2 Enriquecimiento selectivo, empleado con el propsito de incrementar las poblaciones de
Salmonella e inhibir otros organismos presentes en la muestra.
B.14.1.3 Seleccin en medios slidos, en este paso se utilizan medios selectivos que restringen el
crecimiento de otros gneros diferentes a Salmonella y permite el reconocimiento visual de colonias
sospechosas.
B.14.1.4 Identificacin bioqumica, este paso permite la identificacin gnerica de los cultivos de
Salmonella y la eliminacin de cultivos sospechosos falsos.
B.14.1.5 Serotipificacin, es una tcnica serolgica que permite la identificacin especfica de un cultivo.
En caso de disponerse de frmulas comerciales deshidratadas, se deben seguir las instrucciones
impresas en la etiqueta respectiva para su preparacin.
Las sustancias qumicas usadas para preparar los medios de cultivo y los reactivos deben ser grado
analtico.
B.14.2.1 Reactivos
B.14.2.1.1 Medios de pre-enriquecimiento
B.14.2.1.1.1 Agua de peptona tamponada
FORMULA
Ingredientes
Cantidades
Peptona
10,0 g
Cloruro sdico
5,0 g
Fosfato sdico dibsico
3,5 g
Fosfato potsico monobsico
1,5 g
Agua
1,0 l
Preparacin: Disolver los componentes en agua, calentando si es necesario. Ajustar el pH, si es

necesario, despus de la esterilizacin a 7,0. Distribuir en recipientes de vidrio esterilizables con la capacidad
necesaria para obtener las porciones necesarias para la prueba. Esterilizar por 20 min a 121 1C
B.14.2.1.1.2 Caldo lactosado
FORMULA
Ingredientes
Cantidades
Extracto de carne
3,0 g
Peptona
5,0 g
Lactosa
5,0 g
Agua destilada
1,0 l
pH final: 6,9 0,2

Preparacin: Disolver los ingredientes en agua, calentando a 65C. Distribuir en porciones de 225 ml, en
frascos de 500 ml.. Esterilizar durante 15 min a 121C 1C
DIARIO OFICIAL
(Segunda Seccin)
B.14.2.1.2 Caldo de enriquecimiento

B.14.2.1.2.1 Caldo selenito-cistina
FORMULA
Ingredientes
Cantidades
Triptona o polipeptona
5,00 g
Lactosa
4,00 g
Fosfato disdico
10,00 g
Selenito cido de sodio
4,00 g
L-cistina
0,01 g
Agua destilada
1,00 l
pH final: 7,0 0,2 a 25C

Preparacin: Disolver los ingredientes en un litro de agua destilada estril y distribuir en volmenes de 10
y 225 ml en recipientes estriles, segn se requiera. El caldo as preparado es transparente. De preferencia
usarlo el mismo da de su preparacin. Si se desea conservar el medio por varios das, puede exponerse al
calor en autoclave por 5 min a 110C 1C, tomando entonces un color salmn.
B.14.2.1.2.2 Caldo tetrationato
FORMULA
Ingredientes
Cantidades
Proteosa peptona o tristona
5,0 g
Sales biliares
1,0 g
Carbonato de calcio
10,0 g
Tiosulfato de sodio pentahidratado
30,0 g
Agua destilada
1,0 l
pH final: 7,0 0,1

Preparacin: Disolver los ingredientes en un litro de agua destilada estril. Distribuir, agitando
constantemente, en porciones de 10 y 225 ml, en recipientes estriles. Guardar en refrigeracin. Antes de
usar el medio, agregar 2 ml de una solucin yodo-yoduro y 1 ml de solucin de verde brillante al 0,1% por
cada 100 ml de caldo. El medio una vez adicionado de yodo no debe calentarse y debe usarse el mismo da
de su preparacin.
B.14.2.1.2.3 Vassiliadis-Rappaport
Solucin A
FORMULA
Ingredientes
Cantidades
Tristona
5,0 g
Cloruro de sodio
8,0 g
Fosfato de potasio dihidrogenado
1,6 g
Agua destilada
1,0 l
Disolver los componentes en agua por calentamiento cercano a 70C

Solucin B
FORMULA
Ingredientes
Cloruro
de
hexahidratado
Agua destilada
Cantidades
magnesio
400,0 g
1,0 l
Disolver el cloruro de magnesio en agua. Como esta sal es muy higroscpica es conveniente disolver el
contenido entero de cloruro de magnesio desde un recipiente recientemente abierto de tal modo que la
concentracin de la solucin sea de 0,4 g/ml. Conservar en frasco mbar a temperatura ambiente.
(Segunda Seccin)
DIARIO OFICIAL
Solucin C
Ingredientes
Cantidades
Oxalato de verde de malaquita

Agua destilada
0,4g
100,0 ml
Disolver el oxalato de verde de malaquita en agua. Conservar en frasco mbar a temperatura ambiente.
Medio completo
Ingredientes
Cantidades
solucin A
1 000 ml
solucin B
100 ml
solucin C
10 ml
Preparacin: Adicionar 1 000 ml de la solucin A, 100 ml de la solucin B y 10 ml de la solucin C. Ajustar

el pH si es necesario, de tal manera que despus de la esterilizacin sea de 5,2. Distribuir antes de usar
dentro de tubos en cantidades de 10 ml. Almacenar en refrigeracin.
B.14.2.1.2.4 Caldo de Soya Tripticasa
FORMULA
Ingredientes
Cantidades
Tripticasa o triptosa
17,0 g
Fitona
3,0 g
Glucosa
2,5 g
Cloruro de sodio
2,5 g
Agua destilada
1,0 l
pH final: 7,3 0,2

Preparacin: Disolver los ingredientes en 1 litro de agua destilada, calentando lentamente hasta su
disolucin completa. Distribuir porciones de 225 ml dentro de matraces de 500 ml y esterilizar en autoclave
durante 15 min a 121C 1C.
B.14.2.1.2.5 Leche descremada reconstituida
Suspender 100 g de leche descremada en polvo en un litro de agua destilada. Agitar circularmente hasta
disolucin. Distribuir en volmenes de 225 ml en matraces Erlenmeyer de 500 ml. Esterilizar a 121 C 1C
por 15 min. El volumen final debe corregirse para mantener 225 ml.
B.14.2.1.2.6 Caldo soya tripticasa estril adicionado con sulfito de potasio.
Adicionar al caldo soya tripticasa 5 g de sulfito de potasio por cada 1000 ml de medio, quedando una
concentracin final de sulfito de potasio del 0,5%. Adicionar el sulfito de potasio antes de esterilizar en
autoclave en la forma habitual.
B.14.2.1.3 Medios de Aislamiento
B.14.2.1.3.1 Agar verde brillante (VB)
FORMULA
Ingredientes
Cantidades
3,0000g
Polipeptona (Proteosa peptona No. 3)
10,0000g
Cloruro de sodio
5,0000g
Lactosa
10,0000g
Sacarosa
10,0000g
Rojo de fenol
0,0800g
Agar
20,0000g
Verde brillante
0,0125g
Agua destilada
1,0000l
pH final: 6,9 0,2
DIARIO OFICIAL
(Segunda Seccin)
Preparacin: Suspender los ingredientes en un litro de agua destilada y calentar a ebullicin, hasta
disolucin completa. Ajustar el pH. Esterilizar en autoclave por 15 min a 121C 1C. El sobrecalentamiento
del medio disminuye su selectividad. Enfriar el medio a 50C y distribuirlo en cajas de petri estriles. El
aspecto del medio es obscuro, de color marrn.
B.14.2.1.3.2 Agar con sulfito de bismuto
FORMULA
Ingredientes
Cantidades
Extracto de carne de res
5,000g
Mezcla de peptonas
10,000g
Glucosa
5,000g
Fosfato disdico (anhidro)
5,000g
Sulfato ferroso (anhidro)
0,300g
Sulfito de bismuto
8,000g
Verde brillante
0,025g
Agar
20,000g
Agua destilada
1,000l
pH final: 7,6 0,2

Preparacin: Suspender los ingredientes en un litro de agua. Calentar hasta su disolucin completa,
agitando frecuentemente. Ajustar el pH. Enfriar a 45C y verter en cajas de petri estriles, distribuyendo de
manera homognea el precipitado propio del medio. El aspecto de las placas es opaco, de color verde plido
y deben usarse el mismo da de su preparacin. Si la coloracin es parda, no deben utilizarse. El medio no
debe esterilizarse en autoclave; el sobrecalentamiento afecta su selectividad.
B.14.2.1.3.3 Agar xilosa lisina desoxicolato (XLD)
FORMULA
Ingredientes
Xilosa
Cantidades
3,75g
L-lisina
5,00g
Lactosa
7,50g
Sacarosa
7,50g
Cloruro de sodio
5,00g
3,00g
Rojo de fenol
0,08g
Agar
15,00g
Desoxicolato de sodio
2,50g
Citrato frrico-amnico
0,80g
Tiosulfato de sodio
6,80g
Agua destilada
1,00l
pH final: 6,9 0,2

Preparacin: Suspender los ingredientes en un litro de agua destilada, y calentar en bao de agua a
55C, agitando frecuentemente, hasta disolucin completa. Ajustar el pH. Enfriar a 50C y verter en cajas de
petri estriles. No se esterilice. El sobrecalentamiento produce una precipitacin; la reactividad del medio
puede ser satisfactoria, pero las colonias suelen ser muy pequeas. El aspecto del medio es claro y de color
rojo brillante.
B.14.2.1.3.4 Agar para Salmonella y Shigella (SS)
FORMULA
Ingredientes
Extracto de carne
Cantidades
5,000g
Polipeptona *
5,000g
Lactosa
10,000g
Sales biliares
8,500g
Citrato de sodio dihidratado
8,500g
(Segunda Seccin)
DIARIO OFICIAL
Tiosulfato de sodio pentahidratado

Citrato frrico
8,500g
1,000g
Agar
13,500g
Rojo neutro
0,025g
Verde brillante
0,330mg
Agua destilada
1,000l
pH final: 7,0 0,2

* La polipeptona se puede sustituir por 2,5 g de peptona de casena y 2,5 g de peptona de carne.
Preparacin: Suspender los ingredientes en un litro de agua destilada estril y calentar a ebullicin hasta
disolucin completa. Ajustar el pH. No esterilizar en autoclave. Enfriar a 50C y distribuir en cajas de petri
estriles en condiciones aspticas. El aspecto del medio fundido es claro y de color rosado.
B.14.2.1.3.5 Agar entrico Hektoen
FORMULA
Ingredientes
Cantidades
Proteosa peptona
12,000g
3,000g
Lactosa
12,000g
Sacarosa
12,000g
Salicina
2,000g
Sales biliares
9,000g
Cloruro de sodio
5,000g
Tiosulfato de sodio
5,000g
Citrato amnico frrico
1,500g
Azul de bromotimol
0,064g
Fuscina cida
0,100g
Agar
13,500g
Agua
1,000l
pH final: 7,5 0,2

Preparacin: Suspender los ingredientes en agua destilada, hervir con agitacin hasta completa
disolucin del agar. No sobrecalentar. Dejar enfriar a 55 - 60 C y distribuir en cajas de petri estriles en
condiciones aspticas.
B.14.2.1.4 Medios para pruebas bioqumicas
B.14.2.1.4.1 Agar de tres azcares y hierro (TSI)
FORMULA
Ingredientes
Cantidades
Peptona de carne *
1,0g
Peptona de casena *
1,0g
Cloruro de sodio
0,5g
Lactosa
1,0g
Sacarosa
1,0g
Glucosa
0,1g
Agar
1,3g
Rojo de fenol
2,5mg
Sulfato ferroso amnico-Pentahidratado
20,0mg
Tiosulfato de sodio
20,0mg
Agua destilada
100,0ml
pH final: 7,3 0,2

* Estas peptonas se pueden sustituir por 2 g de polipeptona.
DIARIO OFICIAL
(Segunda Seccin)
Preparacin: Suspender los ingredientes en 100 ml de agua destilada. Calentar a ebullicin, agitando
ocasionalmente, hasta disolucin completa. Enfriar a 60C y ajustar el pH. Distribuir en volmenes de 3 ml en
tubos de 13 x 100 mm y esterilizar a 121C 1C durante 15 min. Inclinar los tubos de manera que el medio
de cultivo en el fondo alcance una altura de 3 cm y una profundidad de 4 cm. El medio es de color rojo.
B.14.2.1.4.2 Agar de hierro y lisina (LIA)
FORMULA
Ingredientes
Cantidades
Peptona de gelatina
0,5g
0,3g
Glucosa
0,1g
L-lisina
1,0g
Citrato frrico-amnico
50,0mg
Tiosulfato de sodio anhidro
4,0mg
Prpura de bromocresol
2,0mg
Agar
1,5g
Agua destilada
100,0ml
pH final: 6,7 0,2

Preparacin: Suspender los ingredientes en el agua destilada y mezclar bien, calentar hasta ebullicin
con agitacin frecuente hasta conseguir la disolucin completa. Ajustar el pH. Distribuir en volmenes de 3 ml
en tubos de 13 x 100 mm, con tapn de rosca. Esterilizar en autoclave a 121C 1C durante 12 min. Dejar
que los tubos se enfren en posicin inclinada, de tal modo que se obtengan columnas de medio de 4 cm y
una superficie inclinada de 2 cm.
El medio ya preparado es de color prpura.
B.14.2.1.4.3 Agar nutritivo
FORMULA
Ingredientes
Cantidades
Extracto de carne
3,0g
Peptona
5,0g
Agar
15,0g
Agua destilada
1,0l
pH final: 6,8 0,2

Preparacin: Suspender los ingredientes en agua. Dejar reposar de 5 a 10 min. Calentar a ebullicin
hasta disolucin completa. Distribuir en tubos de 13 x 100 mm, en cantidades de 1/3 de su volumen.
Esterilizar a 121C 1C por 15 min. Inclinar los tubos antes que el agar solidifique.
B.14.2.1.4.4 Medio de SIM (para Sulfuro, Indol y Movilidad)
FORMULA
Ingredientes
Cantidades
Extracto de carne
3,000g
Peptona
30,000g
Hierro peatonizado
0,200g
Tiosulfato de sodio
0,025g
Agua destilada
1,000l
pH final: 7,3 0,2

Preparacin: Suspender los ingredientes en el agua destilada, calentar a ebullicin agitando
frecuentemente hasta lograr una disolucin completa. Enfriar a 50C y ajustar el pH. Distribuir el medio en
volmenes de 3 ml en tubos de 13 x 100 mm y esterilizar en autoclave a 121C 1C durante 15 min. Se
dejan enfriar los tubos en posicin vertical.
(Segunda Seccin)
DIARIO OFICIAL
B.14.2.1.4.5 Agar citrato de Simmons

FORMULA
Ingredientes
Cantidades
Fosfato de amonio
1,00g
Fosfato dipotsico
1,00g
Cloruro de sodio
5,00g
Citrato de sodio
2,00g
Sulfato de magnesio
0,20g
Azul de bromotimol
0,08g
Agar
15,00g
Agua destilada
1,00l
pH final: 6,8 0,2

frecuentemente hasta lograr una disolucin completa. Ajustar el pH. Distribuir el medio en volmenes de 3 ml
en tubos de 13 x 100 mm y esterilizar en autoclave a 121C 1C durante 15 min. Dejar enfriar los tubos en
posicin inclinada.
B.14.2.1.4.6 Caldo MR-VP (Rojo de metilo-Voges Proskauer)
FORMULA
Ingredientes
Peptona
Cantidades
7,0g
Dextrosa
5,0g
Difosfato de potasio
5,0g
Agua destilada
1,0l
pH final: 6,9 0,2

frecuentemente hasta lograr una disolucin completa. Ajustar el pH. Distribuir el medio en volmenes de 3 ml
en tubos de 13 x 100 mm y esterilizar en autoclave a 121C 1C durante 15 min.
B.14.2.1.4.7 Caldo manitol
FORMULA
Ingredientes
Cantidades
Extracto de carne
1,000g
Proteosa peptona
10,000g
Cloruro de sodio
5,000g
Rojo de fenol
0,018g
Manitol
10,000g
Agua
1,000 l
pH final: 7,4 0,2

Preparacin: Suspender 26 g del medio deshidratado en un litro de agua, mezclar y ajustar el pH.
Distribuir en volmenes de 2 a 3 ml en tubos de 13 x 100 mm. Esterilizar a 121C 1C durante 15 min
B.14.2.1.4.8 Caldo malonato
FORMULA
Ingredientes
Cantidades
1,000g
Sulfato de amonio
2,000g
Fosfato dipotsico
0,600g
Fosfato monopotsico
0,400g
Cloruro de sodio
2,000g
Malonato
3,000g
Glucosa
0,250g
DIARIO OFICIAL
Azul de bromotimol
0,025g
Agua
1,000l
(Segunda Seccin)
pH final: 6,7 0,2

Preparacin: Suspender los ingredientes en agua, mezclar y ajustar el pH. Distribuir en tubos de 13 x
100 mm en cantidades de 3 ml. Esterilizar en autoclave a 121C 1C durante 15 min.
B.14.2.1.4.9 Caldo Urea
FORMULA
Ingredientes
Cantidades
Urea
20,00g
0,10g
Fosfato monopotsico
9,10g
Fosfato disdico
9,50g
Rojo de fenol
0,01g
Agua
1,00l
pH final: 6,8 0,2
Preparacin: Disolver los ingredientes en agua destilada. NO CALENTAR. Esterilizar por filtracin a
travs de membrana 0,45 m o en autoclave de 5 a 8 lb de presin durante 15 min. Distribuir aspticamente
de 1,5 a 3 ml en tubos estriles de 13 x 100 mm.
B.14.2.1.4.10 Caldo de urea rpido
FORMULA
Ingredientes
Cantidades
Urea
20,000g
0,100g
Fosfato monopotsico
0,091g
Fosfato disdico
0,095g
Rojo de fenol
0,010g
Agua
1,000l
pH final: 6,8 0,2

Preparacin: Disolver los ingredientes en agua destilada. NO CALENTAR. Esterilizar por filtracin a
travs de membrana 0,45 m. Distribuir aspticamente de 1,5 a 3 ml en tubos estriles de 13 x 100 mm.
B.14.2.1.4.11 Caldo infusin cerebro corazn
FORMULA
Ingredientes
Cantidades
Infusin cerebro corazn
200,0g
Infusin de corazn de res
250,0g
Proteosa peptona
10,0g
Cloruro de sodio
5,0g
Fosfato disdico dodecahidratado
2,5g
Dextrosa
2,0g
Agua destilada
1,0l
pH final: 7,4 0,2
Preparacin: Disolver los ingredientes en agua destilada, calentar suavemente. Distribuir y esterilizar a
121C 1C durante 15 min.
B.14.2.1.5 Soluciones
B.14.2.1.5.1 Solucin verde brillante al 0,1% (1:1000)
FORMULA
Ingredientes
Cantidades
Verde brillante
0,1g
Agua destilada estril
100,0 ml
Disolver 0,1 g de verde brillante en agua destilada estril hasta completar 100 ml.
(Segunda Seccin)
DIARIO OFICIAL
B.14.2.1.5.2 Solucin de yodo-yoduro

FORMULA
Ingredientes
Cristales de yodo
Yoduro de potasio
Agua destilada
Cantidades
6,0g
6,0g
100,0 ml
Disolver los cristales y el yoduro de potasio en agua destilada hasta completar 100 ml.
Conservar en frasco mbar
B.14.2.1.5.3 Solucin salina al 0,85%
FORMULA
Ingredientes
Cloruro de sodio
Agua destilada
Cantidades
0,85g
100,00ml
Disolver el cloruro de sodio en el agua y esterilizar a 121C 1 C durante 15 min.

B.14.2.1.5.4 Solucin salina formalizada
FORMULA
Ingredientes
Cantidades
Solucin de formaldehdo (36-38%)
6,0ml
Cloruro de sodio
8,5g
Agua destilada
1,0l
Disolver 8,5 g de cloruro de sodio en 1 litro de agua destilada. Esterilizar a 121C 1C durante 15 min.
Enfriar a temperatura ambiente. Adicionar 6 ml de la solucin de formaldehdo. No esterilizar despus de la
adicin de formaldehdo.
B.14.2.1.5.5 Reactivo de Kovac
FORMULA
Ingredientes
p-dimetil-aminobenzaldehido
Cantidades
5,0g
Alcohol amlico
75,0ml
Acido clorhdrico concentrado
25,0ml
Disolver el p-dimetil-aminobenzaldehdo en el alcohol amlico y despus agregar el cido clorhdrico

lentamente. Conservar en frasco mbar en refrigeracin.
B.14.2.1.5.6 Solucin de alfa-naftol al 5%
FORMULA
Ingredientes
Alfa-naftol
Alcohol
Cantidades
5,0g
100,0 ml
Disolver 5 g de alfa-naftol en alcohol hasta completar 100 ml.

B.14.2.1.5.7 Solucin de rojo de metilo
FORMULA
Ingredientes
Cantidades
Rojo de metilo
0,10g
Alcohol etlico
300,00ml
agua destilada c.b.p
500,00ml
Disolver el rojo de metilo en el alcohol etlico y adicionar agua hasta completar 500 ml.
DIARIO OFICIAL
(Segunda Seccin)
B.14.2.1.5.8 Solucin de hidrxido de potasio al 40%

FORMULA
Ingredientes
Cantidades
Hidrxido de potasio
Agua destilada
40,0g
100,0 ml
Disolver 40 g de hidrxido de potasio en agua hasta completar 100 ml.

B.14.2.1.5.9 Solucin de gelatinasa al 5%
FORMULA
Ingredientes
Cantidades
Gelatinasa
Agua
5,0g
100,0 ml
Disolver 5 g de gelatinasa en 100 ml de agua destilada. NO CALENTAR.

B. 14.2.1.6 Antisueros
Antisuero polivalente somtico (O)
Antisuero polivalente flagelar (H)
Antisuero Vi
B.14.2.2 Material
Matraces Erlenmeyer de 500 ml
Recipientes de boca ancha, de capacidad apropiada para contener las muestras simples y
compuestas
Angulos de vidrio
Cucharas, bistures, cuchillos y pinzas
Tubos de ensaye de 16 x 150 mm y de 20 x 100 mm
Tubos para serologa de 10 x 75 mm o de 13 x 100 mm
Pipetas bacteriolgicas de 10,0 y 5,0 ml, graduadas en 0,1 ml y protegidas con tapn de algodn.
Pipetas de 1 ml, con graduaciones de 0,01 ml
Cajas de Petri estriles de vidrio o desechables
Rejillas para tubos de ensaye
Asa de platino o nicromel de aproximadamente 3 mm de dimetro
Papel pH (intervalo de 6-8) con graduaciones mximas de 0,4 unidades de pH para cambios de color
Todo el material que tenga contacto con las muestras bajo estudio debe esterilizarse mediante:
Horno, durante 2 horas a 170-175C o autoclave, durante 15 min como mnimo a 121C 1C
B.14.3 Equipo
Horno para esterilizar que alcance los 180 C
Incubadora con termostato para evitar variaciones mayores de 0,1C y termmetro.
Autoclave con termmetro o manmetro, probado con termmetro de mximas.
Bao mara con termostato y termmetro.
Balanza granataria con sensibilidad de 0,1 g
Licuadora de una o dos velocidades controladas por un restato, con vasos esterilizables (vidrio o
aluminio).
Mecheros Bunsen o Fisher
Potencimetro
B.14.4.1 Preparacin de los alimentos para el aislamiento de Salmonella
Los siguientes mtodos se basan en el anlisis de 25 g de la muestra analtica en una proporcin de 1:9
de muestra/ caldo. Esta cantidad puede variarse siempre que se mantenga la misma proporcin. Se
recomienda una muestra de 25 g o ms.
(Segunda Seccin)
DIARIO OFICIAL
B.14.4.1.1 Procedimiento general para la preparacin de muestras

Pesar aspticamente 25 g de la muestra en un vaso estril de licuadora o en bolsa estril para trabajar en
homogeneizador peristltico (stomacher). Adicionar 225 ml del medio de preenriquecimiento estril
(generalmente caldo lactosado, a menos que se indique otro) y licuar si es necesario durante un min.
Transferir aspticamente la mezcla homogeneizada a un recipiente estril de boca ancha con tapn de rosca
y dejar reposar por 60 min a temperatura ambiente con la tapa bien enroscada. Mezclar bien y determinar el
pH aproximado con papel pH. Ajustar, si es necesario, a un pH 6,8 0,2 con hidrxido de sodio 1N o cido
clorhdrico 1N estriles. Mezclar y cubrir el recipiente enroscando suavemente la tapa.
Incubar 24 2 h a 35 C. Continuar como se indica en B.14.4.2.1
B.14.4.1.2 Procedimiento especfico para la preparacin
B.14.4.1.2.1 Productos que contienen huevo en su formulacin (pastas para sopa, rollos chinos, etc.);
ensaladas preparadas (jamn, huevos, pollo, atn, pavo); frutas frescas, congeladas o secas; crustceos
(camarones, cangrejos, jaibas, langostinos, langostas) y pescado.
Preferentemente no descongelar la muestra antes de su anlisis, si esto es necesario, utilizar caldo
lactosado como medio de preenriquecimiento, licuar dos min. Continuar despus de la incubacin como en
B.14.4.2.1
B.14.4.1.2.2 Carnes, sustitutos de carnes, derivados crnicos, sustancias de origen animal, productos
glandulares y harinas (pescado, carne y hueso).
B.14.4.1.2.2.1 Productos procesados trmicamente y productos secos. Se sigue el procedimiento
sealado en A.13.4.1.1 hasta la homogenizacin. Si la muestra es en polvo o molida, el licuado puede
omitirse. Despus de reposar, mezclar bien y ajustar el pH como se indica en el procedimiento general. Para
emulsionar las grasas, agregar los detergentes en las mismas proporciones y con las mismas
recomendaciones que para el coco. La cantidad de los mismos depender en gran medida de la composicin
del alimento. Los detergentes no sern necesarios en los productos glandulares en polvo. Incubar las
muestras como se indica en B.14.4.1.1.
B.14.4.1.2.2.2 Productos crudos o altamente contaminados. Pesar porciones de 25 g de producto en dos
vasos para licuadora. Si la muestra es en polvo o molida, el licuado puede omitirse y el producto puede
pesarse directamente en matraces Erlenmeyer estriles de 500 ml. Adicionar 225 ml de caldo selenito cistina
o 225 ml de caldo tetrationato (sin verde brillante) a cada muestra analtica. Licuar por dos min y pasar
aspticamente a matraces Erlenmeyer de 500 ml. Dejar reposar y ajustar el pH como se indica en B.14.4.1.1
Adicionar 2,25 ml de solucin de verde brillante 0,1% y 4,5 ml de solucin yodo-yoduro a la muestra que
se enriquecer con caldo tetrationato. Homogenizar e incubar. Continuar como se indica en B.13.4.2.1
B.14.4.2 Aislamiento de Salmonella
B.14.4.2.1 Cerrar firmemente el tapn de rosca de los matraces con los cultivos de preenriquecimiento y
agitar suavemente, transferir respectivamente 1 ml de la mezcla a un tubo que contenga 10 ml de caldo
tetrationato y a otro con 10 ml de caldo selenito cistina. Como alternativa, en sustitucin del caldo tetrationato
puede emplearse el medio Vassiliadis-Rappaport.
B.14.4.2.2 Incubar de 18 a 24 h a 35C o, para alimentos fuertemente contaminados a 42C por el mismo
perodo. Estriar los productos que fueron directamente enriquecidos en medios selectivos.
B.14.4.2.3 Mezclar el tubo con caldo selenito cistina y estriar en agar xilosa lisina desoxicolato (XLD), agar
verde brillante (VB) y una tercera caja con cualquiera de los medios selectivos adicionales (agar entrico
Hektoen, agar Sulfito de Bismuto o Agar SS).
Efectuar el mismo procedimiento para el caldo tetrationato.
Incubar las placas 24 2 h a 35C.
B.14.4.2.4 Examinar las placas para investigar la presencia de colonias tpicas de Salmonella, de acuerdo
con las siguientes caractersticas:
Agar XLD: colonias rosas o rojas que pueden ser transparentes con o sin centro negro. En algunos casos
las colonias pueden aparecer completamente negras.
Agar VB: colonias rojas o rosas que pueden ser transparentes rodeadas por medio enrojecido; las
bacterias fermentadoras de la lactosa dan colonias amarillas.
Agar entrico Hektoen: colonias verdes o azulverdes con o sin centro negro. En algunos casos las
colonias pueden aparecer completamente negras.
Agar Sulfito de Bismuto: las colonias tpicas de Salmonella pueden ser cafs, grises o negras; con o sin
brillo metlico. Generalmente el medio circundante (halo) es caf, tornndose posteriormente negro. Algunas
cepas producen colonias verdes sin la formacin del halo oscuro. Si las placas no muestran colonias tpicas o
no se observa crecimiento, incubar 24 h adicionales.
Agar SS: colonias translcidas, ocasionalmente opacas. Algunas colonias dan centro negro. Las colonias
fermentadoras de la lactosa son rojas.
DIARIO OFICIAL
(Segunda Seccin)
B.14.4.3 Identificacin bioqumica

B.14.4.3.1 Seleccionar al menos dos colonias tpicas de cada medio selectivo, que se encuentren bien
aisladas.
Tocar levemente el centro de cada colonia e inocular dos tubos, uno con agar triple azcar hierro (TSI) y
otro con agar hierro lisina (LIA), por estra en la superficie inclinada y por puncin en el fondo.
Incubar por 24 2 h a 35C.
Almacenar en refrigeracin de 5 a 8 C las placas con medios selectivos por s es necesario retomar ms
colonias.
B.14.4.3.2 Observar el crecimiento en los tubos y considerar presuntivamente positivas para Salmonella
las colonias que den las siguientes reacciones:
B.14.4.3.2.1 Agar TSI, en el fondo del tubo se observa vire del indicador debido a la fermentacin de la
glucosa; en la superficie del medio se observa un color rojo ms intenso que el medio original debido a la no
fermentacin de la lactosa ni de la sacarosa. En la mayora de los casos se observa coloracin negra a lo
largo de la puncin debido a la produccin de cido sulfihdrico.
B.14.4.3.2.2 Agar LIA, se observa intensificacin del color prpura en todo el tubo por la descarboxilacin
de la lisina. Considerar negativos aquellos cultivos que produzcan claramente color amarillo en el fondo del
agar. La mayora de las cepas de Salmonella producen cido sulfihdrico en este medio con ennegrecimiento
a lo largo de la puncin.
B.14.4.3.2.3 Retener todos los cultivos que muestren las reacciones caractersticas de Salmonella en los
medios TSI y LIA para las pruebas adicionales, indicadas en B.14.4.3.3
B.14.4.3.3 Los cultivos con TSI que no parecen de Salmonella pero que presentan reacciones en LIA
tpicos, deben trabajarse como cultivos presuntivos positivos, ya que en estos casos, el medio LIA permitir
detectar S. arizonae y cepas atpicas de Salmonella que utilicen lactosa o sacarosa. Descartar solamente los
cultivos que muestren reacciones atpicas en ambos medios.
B.14.4.3.4 Continuar el anlisis a partir de los tubos de TSI con reacciones tpicas. Si el cultivo presenta
reacciones atpicas en este medio, tomar colonias adicionales de las placas de donde se obtuvo el cultivo
atpico anterior y sembrar las pruebas bioqumicas nuevamente.
B.14.4.3.5 Continuar la identificacin bioqumica y serolgica a partir de los cultivos recuperados de TSI.
Se recomienda trabajar seis cultivos por cada 25 g de unidad analtica seleccionando colonias procedentes de
ambos medios de enriquecimiento.
B.14.4.3.6 Prueba de ureasa
B.14.4.3.6.1 Prueba de ureasa (convencional). Con una asa estril, tomar crecimiento del cultivo
presumiblemente positivo de cada tubo de medio TSI e inocular tubos de caldo urea. Utilizar un control de
medio para comparar el vire prpura de las reacciones positivas con el color del medio original. Incubar 24
2 h a 35 C.
B.14.4.3.6.2 Prueba de ureasa (rpida). Tomar dos asadas de crecimiento del cultivo presumiblemente
positivo de cada tubo de medio TSI e inocular tubos de caldo urea (rpida). Incubar 2 h a 37 0,5C en bao
de agua.
Descartar todos los cultivos que den ureasa positiva. Retener los cultivos que den la prueba negativa (sin
cambio de color del medio).
B.14.4.4 Identificacin serolgica
B.14.4.4.1 Ensayo de los antgenos somticos de Salmonella (Antisuero polivalente O).
B.14.4.4.1.1 Colocar con una asa dos gotas separadas de solucin salina estril sobre un portaobjetos o
en dos secciones de una placa para aglutinacin. Suspender en cada una de las gotas, una porcin del cultivo
desarrollado en TSI.
B.14.4.4.1.2 Agregar a una de ellas una gota del antisuero polivalente somtico (O) y mezclar con el canto
del asa o empleando aplicadores de madera.
B.14.4.4.1.3 Agitar inclinando la lmina hacia atrs y hacia adelante durante aproximadamente un min.
Observar bajo buena iluminacin sobre un fondo oscuro.
B.14.4.4.1.4 Considerar cualquier grado de aglutinacin como positiva.
La prueba positiva resulta cuando se presenta aglutinacin en la gota con el cultivo y el antisuero y no
aglutinacin en la gota que contiene el cultivo y la solucin salina.
Si se observa aglutinacin en ambas gotas, la prueba no es definitiva y se debe continuar con las pruebas
bioqumicas complementarias.
(Segunda Seccin)
DIARIO OFICIAL
B.14.4.4.2 Cuando la aglutinacin es positiva con el suero polivalente O, puede determinarse el subgrupo
empleando antisueros para los diferentes subgrupos (los grupos B, C, D y E, suelen ser los ms frecuentes).
B.14.4.4.2.1 Si la aglutinacin con el antisuero O es negativa, utilizar antisuero Vi y efectuar la prueba. Si
hay aglutinacin con Vi calentar el cultivo a ebullicin y repetir la aglutinacin con el antisuero polivalente O.
B.14.4.4.2.2 Si no se cuenta con los sueros grupoespecficos, solicitar la tipificacin de la cepa al
Laboratorio de Enterobacterias del Centro Nacional de Diagnstico y Referencia de la Secretara de Salud o al
Laboratorio Nacional de Salud Pblica.
B.14.4.4.3 Si se requiere, practicar el ensayo de los antgenos flagelares de Salmonella (Antisuero
polivalente H).
B.14.4.4.3.1 Inocular el crecimiento del tubo de TSI en agar infusin de cerebro corazn e incubar de 4 a
6 h a 35 C hasta que se observe crecimiento (para ensayo en el mismo da), o bien, en caldo soya
tripticaseina e incubar por 24 2 h a 35C (para ensayo al da siguiente). Adicionar 2,5 ml de solucin salina
formalizada a 5 ml del cultivo en caldo o al cultivo en agar cerebro corazn (BHI).
B.14.4.4.3.2 Colocar 0,5 ml del antisuero polivalente flagelar (H) preparado en un tubo para serologa (13 x
100 mm aproximadamente). Adicionar 0,5 ml del cultivo formalizado. Preparar un control de solucin salina
mezclando 0,5 ml de solucin salina formalizada con 0,5 ml del antgeno formalizado. Incubar las mezclas en
bao de agua a 48- 50C. Observar a intervalos de 15 min por espacio de una h. Una prueba positiva es
cuando se observa aglutinacin en la mezcla de prueba pero no en el control. Debe interpretarse como
negativa una prueba en la que ninguna de las mezclas muestre aglutinacin. Cuando ambas mezclas se
aglutinan, se considera la prueba inespecfica.
B.14.4.5 Pruebas bioqumicas complementarias
Cuando las pruebas serolgicas o bioqumicas iniciales, dan resultados atpicos o no concluyentes,
realizar las pruebas que se describen a continuacin:
B.14.4.5.1 Inocular los cultivos positivos provenientes de TSI y LIA en: medio SIM, agar citrato de
Simmons, caldo manitol y caldo RM-VP. Usar caldo malonato para confirmar la presencia de la especie S.
arizonae.
B.14.4.5.2 Interpretar los cambios en los medios inoculados conforme lo siguiente:
B.14.4.5.2.1 Agar citrato Simmons
Inocular por estra el tubo
Incubar 96 2 h a 35 2C
Prueba positiva: crecimiento acompaado de un cambio de color de verde a azul.
Prueba negativa: ausencia de crecimiento y sin cambio de color.
B.14.4.5.2.2 Medio SIM
Inocular por puncin
Incubar 24 h a 35 2C
Movilidad
Prueba positiva: crecimiento a lo largo de la puncin y en el seno del medio de cultivo.
Prueba negativa: crecimiento a lo largo de la puncin exclusivamente.
Produccin de cido sulfihdrico
Prueba positiva: desarrollo de un color negro a lo largo de la puncin que puede extenderse a todo el
medio.
Prueba negativa: ausencia de color negro.
Produccin de indol
Adicionar al tubo con medio SIM que presente crecimiento, de 0,2 a 0,3 ml de reactivo de Kovac.
Prueba positiva: desarrollo de un anillo de color rojo.
Prueba negativa: sin cambio de color.
B.14.4.5.2.3 Caldo RM-VP
Inocular un tubo con el medio
Incubar 48 2 h a 35 2C para la prueba de VP y 96 h para la prueba RM
B.14.4.5.2.3.1 Prueba de Voges-Proskauer (VP)
Transferir a un tubo un ml del cultivo de 48 h
Adicionar 0,6 ml de solucin de alfa naftol
Adicionar 0,2 ml de solucin de hidrxido de potasio 40%
Adicionar algunos cristales de creatinina (opcional)
Interpretar los resultados despus de incubar 2 h a 35 2C o 4 h a temperatura ambiente
DIARIO OFICIAL
(Segunda Seccin)
Prueba positiva: desarrollo de color rojo ladrillo

Prueba negativa: sin cambio de color
Reincubar el resto del medio RM-VP 48 h ms a 35 2C
B.14.4.5.2.3.2 Prueba de rojo de metilo (RM)
Adicionar al medio de cultivo de 96 h de incubacin de dos a tres gotas de solucin de rojo de metilo
Interpretar los resultados inmediatamente
Prueba positiva: desarrollo de color rojo
Prueba negativa: desarrollo de color amarillo
B.14.4.5.2.4 Caldo malonato
Inocular un tubo conteniendo el medio
Prueba positiva: desarrollo de color azul
B.14.4.5.2.5 Caldo manitol
Inocular un tubo conteniendo el medio
Prueba positiva: desarrollo de color amarillo
B.14.4.5.3 Consultar los resultados obtenidos en el cuadro 2 para la identificacin de los gneros de las
bacterias investigadas.
Nota: Los sistemas bioqumicos comerciales validados pueden ser usados como alternativa para las
pruebas bioqumicas convencionales.
B.14.5 Clculo y expresin de resultados
B.14.5.1 Interpretacin de reacciones bioqumicas y serolgicas.
CUADRO 1
REACCIONES
BIOQUIMICAS
Tpica
Tpica
Tpica
Reacciones
atpicas
Reacciones
atpicas
REACCIONES SEROLOGICAS
INTERPRETACION
Antgeno O, Vi o H positivo
Todas las reacciones negativas
No probada
Antgeno O, Vi o H positivo
Cepas consideradas como Salmonella
Todas las reacciones negativas
No debe ser considerada Salmonella
Puede ser Salmonella
B.14.5.2 Reacciones bioqumicas y serolgicas de Salmonella

CUADRO 2
PRUEBA O SUSTRATO
POSITIVO
NEGATIVO
amarillo
prpura
negro
rojo
amarillo
no negro
Ureasa
Caldo de lisina descarboxilasa
Caldo dulcitol rojo de fenol
rojo-prpura
prpura
amarillo o gas
no hay cambio de color

amarillo
no hay cambio de color, ni gas
Caldo KCN
Caldo malonato
Prueba de indol
Prueba del antgeno flagelar
Prueba del antgeno somtico
Caldo lactosa rojo fenol
crecimiento
azul
superficie color violeta
aglutinacin
aglutinacin
amarillo o gas
no hay crecimiento
superficie color amarillo
no hay aglutinacin
no hay aglutinacin
Glucosa (TSI)
Lisina descarboxilasa(LIA)
H2S (TSI y LIA)
REACCIO
N
+
+
+
+
+b
+
+
-
(Segunda Seccin)
Caldo sacarosa rojo fenol
Prueba Voges- Proskauer
Prueba rojo de metilo
Citrato de Simmons
DIARIO OFICIAL
amarillo o gas
de rosa a rojo
rojo difuso
crecimiento color azul

amarillo difuso
no hay crecimiento no hay
cambio de color
a +, 90 % o ms positivos en 1 o 2 das; -, 90 % o ms negativas en 1 o 2 das; v, variable.
b La mayora de los cultivos S. arizonae son negativos.
c La mayora de los cultivos S. arizonae son positivos.
+
v
B.14.5.3 Informe de Resultados

Informar: presencia o ausencia de Salmonella en ___________ g o _______________ ml de muestra.
B.15. METODO PARA LA DETERMINACION DE Staphylococcus aureus EN ALIMENTOS.
B.15.1 Fundamento
Este mtodo permite hacer una estimacin del contenido de Staphylococcus aureus en alimentos, se
efecta directamente en placas de medio de cultivo selectivo y diferencial, con la confirmacin mediante las
pruebas de coagulasa y termonucleasa. Este mtodo es adecuado para el anlisis de alimentos en los cuales
se esperen ms de 100 clulas de Staphylococcus aureus por g.
En caso de disponerse de frmulas comerciales deshidratadas, para su preparacin se deben seguir las
instrucciones impresas en la etiqueta respectiva.
Cuando se mencione agua debe entenderse que se trata de "agua destilada".
Los reactivos a emplear en el mtodo objeto de esta norma deben ser grado analtico.
B.15.2.1 Reactivos
B.15.2.1.1.1 Solucin reguladora de fosfatos (Solucin concentrada)
FORMULA
Ingredientes
Fosfato monopotsico
Agua
Cantidad
34,0 g
1,0 l
sodio 1 N, aforar con agua a 1 l. Esterilizar durante 15 min a 121C 1, conservar en refrigeracin (solucin
concentrada). Tomar 1,25 ml de la solucin concentrada y llevar a 1 l con agua (solucin de trabajo). Distribuir
en porciones de 99, 90 y 9 ml segn se requiera. Esterilizar a 121C 1 durante 15 min. Despus de la
esterilizacin, los volmenes finales y el pH de la solucin de trabajo deben ser iguales a los iniciales.
B.15.2.1.1.2 Agua peptonada
FORMULA
Ingredientes
Cantidad
Peptona
1,0 g
Cloruro de sodio
8,5 g
Agua
1,0 l
Preparacin: Disolver los componentes en un litro de agua. Ajustar el pH a 7,0 con solucin de hidrxido
de sodio 1N. Distribuir en porciones de 99, 90 y 9 ml segn se requiera. Esterilizar a 121C 1 durante 15 min.
Despus de la esterilizacin los volmenes finales y el pH de la solucin de trabajo deben ser iguales a los
iniciales.
B.15.2.1.2 Medios de cultivo
B.15.2.1.2.1 Medio de Baird-Parker
FORMULA
Ingredientes
Cantidad
Medio base (6.1.2.1.1)
95,0 ml
Solucin de telurito de potasio (6.1.2.1.2)
1,0 ml
Emulsin de yema de huevo (6.1.2.1.3)
5,0 ml
Preparacin: Cuando el medio base est a 45C, agregar los dems ingredientes y mezclar. Colocar de
15 a 20 ml del medio completo, enfriar y dejar solidificar. Las placas pueden almacenarse por 48 h a
temperatura de 0 a 5C.
DIARIO OFICIAL
(Segunda Seccin)
B.15.2.1.2.1.1. Medio base de Baird-Parker

FORMULA
Ingredientes
Cantidad
Triptona
10,0 g
1,0 g
Extracto de carne
5,0 g
Glicina
12,0 g
Cloruro de litio
5,0 g
Piruvato de sodio
10,0 g
Agar
20,0 g
Agua
1,0 l
Preparacin: Disolver los ingredientes o el agar base en agua y calentar con agitacin constante y hervir
durante 1 min. Esterilizar a 121C 1 durante 15 min. Enfriar y mantener el medio a 45C.
B.15.2.1.2.1.2 Solucin de telurito
FORMULA
Ingredientes
Telurito de potasio
Agua
Cantidad
1,0 g
100,0 ml
Preparacin: Disolver el telurito de potasio en agua y esterilizar. La solucin puede ser almacenada por
varios meses a temperatura de 0 a 5C.
B.15.2.1.2.1.3 Emulsin de yema de huevo
Preparacin. Lavar con agua y jabn los huevos frescos que sean necesarios y limpiarlos con una
solucin de tintura de yodo (solucin alcohlica al 2%) o sumergirlos en solucin de cloruro mercrico
(1:1000). Enjuagar con agua estril y secar con gasa estril. En campana de flujo laminar o en condiciones
aspticas, abrir los huevos y vaciarlos en un separador de claras estril. Transferir las yemas a una probeta
hasta un volumen de 60 ml y completar a 90 ml con solucin salina isotnica. Verter la emulsin a un matraz
Erlenmeyer con perlas de vidrio estril y agitar fuertemente para formar la emulsin. Filtrar a travs de gasa.
Las placas deben utilizarse dentro de las 48 h siguientes a su preparacin.
B.15.2.1.2.1.4 Solucin salina isotnica
FORMULA
Ingredientes
Cloruro de sodio
Agua
Cantidad
0,85 g
100,0 ml
Preparacin: Disolver el ingrediente en agua y esterilizar a 121C 1 durante 15 min.

B.15.2.1.2.2 Caldo de infusin cerebro-corazn (BHI)
FORMULA
Ingredientes
Cantidad
Infusin de cerebro de ternera
200,0 ml
Infusin de corazn de res
250,0 ml
Peptona de gelatina
10,0 g
Cloruro de sodio
5,0 g
Fosfato disdico dodecahidratado
2,5 g
Glucosa
2,0 g
Agua
1,0 l
Preparacin: Disolver los ingredientes en agua y calentar ligeramente si es necesario. Distribuir y

esterilizar durante 15 min a 121C 1.
(Segunda Seccin)
DIARIO OFICIAL
B.15.2.1.2.3 Acido desoxirribonucleico helicoidal de timo de ternera.

FORMULA
Ingredientes
Acido desoxirribonucleico helicoi-dal de timo de ternera o equivalente
Agar
Cloruro de calcio anhidro (Solucin 0,01 M) (A.7.1.2.3.1)
Cloruro de sodio
Azul de toluidina (Solucin 0,1 M) (6.1.2.3.2)
Tris-(hidroximetil-aminometano) (Tris solucin 0,05 M, pH 9)
(A.7.1.2.3.3)
Cantidad
0,03 g
1,00 g
0,10 ml
1,00 g
0,30 ml
100,00 ml
Preparacin: Disolver los ingredientes, excepto el azul de toluidina agitando hasta completar la disolucin
del cido desoxirribonucleico y calentar a ebullicin. Agregar el azul de toluidina. Distribuir en frascos
pequeos con tapn de hule. No es necesario esterilizar. Este medio es estable a temperatura ambiente hasta
4 meses y funciona perfectamente aun despus de fundirlo varias veces. Tomar un porta objetos limpio y
agregar 3 ml del medio fundido esparcindolo por la superficie. Cuando el agar solidifique, hacer orificios con
la punta de una pipeta Pasteur. Conservar en refrigeracin para evitar la deshidratacin.
B.15.2.1.2.3.1 Solucin de cloruro de calcio anhidro 0,01 M
Cloruro de calcio PM = 110,99
Disolver 0,1199 g de cloruro de calcio en 100 ml de agua.
B.15.2.1.2.3.2 Solucin de azul de toluidina 0,1 M
Disolver 3,05 g de azul de toluidina en 100 ml de agua.
B.15.2.1.2.3.3 Solucin amortiguadora 0,05 M Tris-(hidroximetilaminometano)
(Tris pH 9) PM = 121,1
Disolver 6,055 g de Tris en 100 ml de agua.
B.15.2.1.3 Reactivo biolgico:
Plasma de conejo
Emplear plasma de conejo deshidratado o rehidratado siguiendo las instrucciones del fabricante y agregar
cido etilendiaminotetractico (EDTA) en solucin al 0,1% en plasma rehidratado. Si se utiliza plasma
deshidratado diluir con agua estril en proporcin de 1:3. Puede emplearse plasma de conejo liofilizado
adicionado de EDTA. No debe emplearse sangre citratada.
B.15.2.2 Materiales
Todos los instrumentos que se utilicen para trabajar la muestra deben esterilizarse mediante horno,
durante 2 h de 170-175C o como alternativa en autoclave durante 15 min como mnimo a 121C 1.
Cuchillos, pinzas, tijeras, cucharas, esptulas y separador de huevo.
Tubos de cultivo de 16 mm x 150 mm o frascos de 125 a 250 ml de capacidad.
Tubos de cultivo de 10 mm x 75 mm.
Cajas Petri de 90 a 100 mm de dimetro.
Pipetas bacteriolgicas de 1 ml y 10 ml de capacidad graduadas en 0,1 ml y 1 ml respectivamente y

dimetro de 2 a 3 mm.
Pipetas Pasteur.
Probetas.
Varillas de vidrio de 3,5 mm de dimetro aproximadamente y 20 cm de largo dobladas en ngulo

recto.
Matraz Erlenmeyer con perlas de vidrio
Cmara hmeda: consiste en una caja Petri en la cual se coloca una varilla de vidrio en forma de "V"
rodeada de algodn humedecido con agua.
B.15.3 Aparatos
Horno para esterilizar que alcance 180C.
Autoclave con termmetro.
Bao de agua con regulador de temperatura de 35 0,5C.
Bao de agua con regulador de temperatura de 45 0,5C.
Balanza con capacidad no mayor de 2,500 g y sensibilidad de 0,1 g.
Incubadora a 35 1C.
DIARIO OFICIAL
(Segunda Seccin)

La preparacin de la muestra se debe realizar de acuerdo a lo establecido en el mtodo Preparacin y
Dilucin de Muestras de Alimentos para su Anlisis Microbiolgico.
B.15.5.1 Utilizando diferentes pipetas de 1 ml para cada dilucin, depositar 0,1 ml sobre la superficie de
las placas de agar Baird-Parker.
B.15.5.2 Distribuir el inculo sobre la superficie del agar con varillas estriles de vidrio en ngulo recto,
utilizando una para cada dilucin.
B.15.5.3 Mantener las placas en su posicin hasta que el inculo sea absorbido por el agar.
B.15.5.4 Invertir las placas e incubar de 45 a 48 h a 35C.
B.15.5.5 Seleccionar las placas que tengan entre 15 y 150 colonias tpicas de Staphylococcus aureus; si
no es posible, seleccionar las placas de las diluciones ms altas no obstante tengan ms de 150 colonias.
B.15.5.6 Cuando las placas tengan menos de 15 colonias tpicas tambin pueden ser utilizadas y al
informe se debe agregar la nota de "valor estimado".
B.15.5.7 Las colonias tpicas son negras, circulares, brillantes, convexas, lisas, de dimetro de 1 a 2 mm y
muestran una zona opaca y un halo claro alrededor de la colonia.
B.15.5.8 Seleccionar las colonias de acuerdo con el siguiente cuadro para realizar las pruebas de
coagulasa y termonucleasa:
NUMERO DE COLONIAS
NUMERO DE COLONIAS
SOSPECHOSAS EN PLACA
POR PROBAR
Menos de 50
51 a 100
101 a 150 o ms
B.15.5.9 Seleccionar el nmero de colonias y sembrar cada una en tubos con 0,5 ml de caldo de infusin
cerebro-corazn.
B.15.5.10 Incubar a 35C durante 24 h.
B.15.5.11 Inocular en la misma forma cepas conocidas de Staphylococcus aureus y Staphylococcus
epidermidis como testigos positivo y negativo.
B.15.5.12 Despus del periodo de incubacin pasar con una pipeta de 1 ml, 0,3 ml de cada cultivo a otro
tubo de 10 mm x 75 mm y conservarlo para la prueba de termonucleasa. El resto del cultivo se usa para la
prueba de coagulasa.
B.15.5.13 Prueba de coagulasa
B.15.5.13.1 Agregar a los 0,2 ml del cultivo anterior, 0,2 ml de plasma de conejo diluido volumen a
volumen con solucin salina estril.
B.15.5.13.2 Incubar en bao de agua de 35 a 37C y observar durante 6 h a intervalos de 1 h; si no hay
formacin de cogulo, observar a las 24 h. Considerar positiva la prueba si hay formacin de cogulo.
Para comprobar la coagulabilidad del plasma de conejo se aade una gota de cloruro de calcio al 5% a
0,5 ml de plasma reconstituido empleado, formndose un cogulo en 10-15 seg.
B.15.5.14 Prueba de termonucleasa
B.15.5.14.1 Calentar durante 15 min, 0,3 ml de cultivo en caldo de infusin cerebro-corazn en bao de
agua hirviendo.
B.15.5.14.2 Pasar una gota de cada cultivo por medio de una pipeta Pasteur a un orificio del medio,
incluye testigo.
B.15.5.14.3 Incubar a 35C en cmara hmeda de 4 a 24 h.
B.15.5.14.4 La aparicin de un halo color rosa extendido de por lo menos 1 mm alrededor de la
perforacin se califica como positiva.
B.15.6 Clculo y expresin de resultados
B.15.6.1 Clculo
Hacer el clculo del contenido de microorganismos en el producto tomando en cuenta el nmero de
colonias totales, el nmero de colonias confirmadas, la dilucin y el volumen inoculado (0,1 ml).
(Segunda Seccin)
DIARIO OFICIAL
Ejemplo 1:
Si la caja tiene 80 colonias en la dilucin 1:1000
Se toman 5 colonias para la prueba, de stas dan 4 positivas, el clculo es:
80 x 4 = 64 x 1000 x 10 = 640 000
5
Ejemplo 2:
Si la caja tiene 14 colonias en la dilucin 1:10
Se toman 3 colonias para la prueba, de stas dan 2 positivas, el clculo es:
14 x 2 = 9,3 x 10 x 10 = 930
3
B.15.6.2 Expresin de los resultados:
Segn ejemplo 1:
Informar como Staphylococcus aureus 640 000 UFC/g
Segn ejemplo 2:
Informar como Staphylococcus aureus 930 UFC/g valor estimado
Si las pruebas confirmativas resultan negativas en todas las colonias probadas, informar como:
0 UFC/g en muestras directas
-10 UFC/g en muestras de dilucin 1:10
-100 UFC/g en muestras de dilucin 1:100
En la prctica los resultados pueden variar, esto depender del tcnico que trabaje el mtodo y el grado de
confiabilidad del mismo, que en el 95% de los casos es de 16% a 52%.
B.16. METODO DE PRUEBA MICROBIOLOGICO PARA ALIMENTOS. DETERMINACION DE L.
monocytogenes.
B.16.1 Fundamento
El mtodo para detectar la presencia de Listeria monocytogenes se basa en el aislamiento y la
diferenciacin de especies de Listeria spp., principalmente por la fermentacin de carbohidratos y la actividad
hemoltica de los miembros de este gnero.
B.16.2 Reactivos
Los reactivos que a continuacin se mencionan deben ser grado analtico.
Cuando se indica agua, debe entenderse que se trata de agua destilada.
Acido actico 5 N
Acido clorhdrico 1 M
Acido sulfanlico (cristales)
Alfa-naftilamina
Alfa-naftol 5% en etanol absoluto
Etanol absoluto
Granalla de zinc
Hidrxido de sodio 1 M
Lactamato de glicil-glicina (anhdrido de glicina)
Regulador de fosfatos glicerinado con pH 9,0 0,2
Sangre de carnero desfibrinada
Solucin al 3% de perxido de hidrgeno
Solucin salina fisiolgica 0,85% estril
Sueros comerciales para tipificacin de Listeria spp
Sulfato de cadmio al 20%
Zinc pulverizado
B.16.2.1 Reactivos para Tincin de Gram
B.16.2.1.1 Alcohol-acetona
Ingredientes
Cantidad
Etanol (95%)
700,0 ml
Acetona
300,0 ml
Mezclar ambos lquidos.
DIARIO OFICIAL
(Segunda Seccin)
B.16.2.1.2 Cristal violeta

Solucin A
Ingredientes
Cantidad
Cristal violeta
2,0 g
Etanol (95%)
20,0 ml
Disolver el cristal violeta en el etanol.

Solucin B
Ingredientes
Cantidad
Oxalato de amonio
0,8 g
Agua
80,0 ml
Disolver el oxalato de amonio en el agua. Despus de preparar las soluciones A y B, verter una en la otra
y agitar hasta que se mezclen perfectamente.
B.16.2.1.3 Solucin de Yodo
Ingredientes
Cantidad
Yodo
1,0 g
Yoduro de potasio
2,0 g
Agua
300,0 ml
Triturar finamente el yodo y el yoduro de potasio en un mortero, de ser posible en una campana de
extraccin. Aadir una pequea cantidad de agua para lavar el material, agregar el resto del agua y agitar.
Nota: Evitar el contacto de los reactivos con la piel!
B.16.2.1.4 Solucin de Safranina
Ingredientes
Cantidad
Safranina
0,25 g
Etanol (95%)
10,00 ml
Agua
100,00 ml
Disolver la safranina en el etanol, mezclar, agregar el agua y volver a agitar. Filtrar la solucin con papel
filtro.
B.16.2.2 Reactivos para la determinacin de nitritos
B.16.2.2.1 Reactivo A
Ingredientes
Cantidad
Alfa-naftilamina
0,5 g
Acido actico 5N
100,0 ml
B.16.2.2.2 Reactivo B
Ingredientes
Cantidad
Acido sulfanlico
1,0 g
Acido actico 5N
125,0 ml
B.16.2.2.3 Reactivo C
Ingredientes
Alfa-naftol
Acido actico 5N
Cantidad
1,0 g
200,0 ml
B.16.2.2.4 Solucin de sulfato de cadmio al 20%

Colocar granallas de zinc en solucin de sulfato de cadmio al 20% de 4 a 6 h. Disolver el precipitado de
cadmio, adicionando cido clorhdrico 1N.
(Segunda Seccin)
DIARIO OFICIAL
B.16.3 Medios de cultivo

A continuacin se presentan las frmulas y los procedimientos para preparar los medios empleados en
este anlisis microbiolgico. En caso de disponer de frmulas comerciales deshidratadas se deben seguir las
instrucciones del fabricante para su preparacin.
B.16.3.1 Caldo soya tripticasena con 0,6 % de extracto de levadura (CSTEL)
Ingredientes
Cantidad
Caldo soya tripticasena
30,0 g
6,0 g
Agua
1000,0 ml
Agitar hasta disolver los ingredientes. Esterilizar a 121 1C durante 15 min. El pH final de la solucin
debe ser 7,3 0,2.
B.16.3.2 Caldo de enriquecimiento (EB) pH 7,3
Un litro de caldo soya tripticasena con extracto de levadura (CSTEL) debe contener los siguientes
suplementos:
Suplementos
Cantidad
Clorhidrato de acriflavina
15,0 mg
Acido nalidxico (sal sdica)
40,0 mg
Cicloheximida
50,0 mg
Acido pirvico (sal sdica) Solucin

al 10 % (p/v) *
11,1 ml
Preparar los suplementos de acriflavina y nalidxico a partir de una solucin al 0,5 % (p/v) con agua.
El suplemento de cicloheximida prepararlo como una solucin al 1,0 % (p/v) en una solucin al 40 % (v/v)
de etanol en agua. Esterilizar por filtracin los suplementos. Agregar en condiciones aspticas los
suplementos al medio CSTEL previamente esterilizado, justo antes de su uso. Para la preparacin de un litro
del medio CSTEL se debe partir de las soluciones anteriores, agregando las siguientes cantidades: 3,0 ml de
acriflavina, 8,0 ml de cido nalidxico y 5,0 ml de solucin de cicloheximida. Precaucin: La cicloheximida es
una sustancia qumica altamente txica, durante su manejo deben emplearse guantes, lentes de proteccin y
lavarse las manos inmediatamente despus de usarla!
B.16.3.3 Medio de cloruro de litio feniletanol-moxolactam (LMP)
Ingredientes
Cantidad
Agar fenil etanol
35,5 g
Glicina anhdra
10,0 g
Cloruro de litio
5,0 g
Solucin de moxolactam al 1 % en amortiguador de fosfatos pH 6,0
2,0 ml
Agua
1000,0 ml
Esterilizar el medio (sin moxolactam) en autoclave a 121 1C durante 15 min. Enfriar de 48 a 50C y
agregar la solucin de moxolactam previamente esterilizada por filtracin. Distribuir volmenes de 12 a 15 ml
del medio en cajas de Petri estriles. Las placas delgadas facilitan la observacin de las colonias.
B.16.3.4 Medio Oxford
B.16.3.4.1 Medio base Oxford (OXA)
Ingredientes
Cantidad
Base de agar Columbia
39,0 g
Esculina
1,0 g
Citrato frrico amnico
0,5 g
Cloruro de litio
Agua
15,0 g
1000,0 ml
DIARIO OFICIAL
(Segunda Seccin)
Agregar los ingredientes a un litro de agua y llevar a ebullicin hasta disolucin completa. Esterilizar en
autoclave a 121 1C durante 15 min. Enfriar a 50C el medio base y en condiciones aspticas agregar los
suplementos. Un litro de medio Oxford debe contener los siguientes suplementos:
Suplementos
Cantidad
Cicloheximida
400 mg
Sulfato de colistina
20 mg
Acriflavina
5 mg
Cefotetn
2 mg
Fosfomicina
10 mg
Disolver la cicloheximida, el sulfato de colestina, acriflavina, cefotetn y la fosfomicina en 10 ml de una

mezcla 1:1 de etanol: agua. Esterilizar por filtracin antes de agregar al medio base. Mezclar y vaciar en cajas
Petri estriles. Las placas del medio Oxford se pueden almacenar como mximo dos semanas.
B.16.3.5 Agar soya tripticasena con 0,6% de extracto de levadura (ASTEL)
Ingredientes
Cantidad
Agar soya tripticasena
40,0 g
Agua
6,0 g
1000,0 ml
Agitar y calentar a ebullicin hasta disolver el agar. Esterilizar a 121 1C durante 15 min. pH final 7,3
0,2.
B.16.3.6 Agar sangre de carnero
Ingredientes
Cantidad
Base de agar sangre
95,0 ml
5,0 ml
Preparar el agar base de acuerdo a las instrucciones del fabricante. Enfriar a 45 2C y agregar
aspticamente la sangre de carnero, la cual previamente se debe encontrar a temperatura ambiente (20 25C). Homogeneizar el medio y verter en las cajas Petri estriles de 12 a 15 ml para la prueba de CAMP y de
15 a 20 ml para la prueba de hemlisis.
B.16.3.7 Caldo nitratos
Ingredientes
Cantidad
Nitrato de potasio
1,0 g
Cloruro de sodio
0,5 g
Peptona
2,0 g
Agua
1000,0 ml
Agregar los ingredientes a un litro de agua, agitar hasta disolucin completa. Verter en tubos de 13 x 100
mm con tapn de rosca. Esterilizar en autoclave a 121 1C durante 15 min.
B.16.3.8 Medios para la prueba de movilidad
B.16.3.8.1 Medio de SIM
Ingredientes
Cantidad
Peptona de casena
20,0 g
Peptona de carne
6,1 g
Sulfato de fierro y amonio
0,2 g
Tiosulfato de sodio
0,2 g
Agar
3,5 g
Agua
1000,0 ml
Agitar y calentar a ebullicin hasta disolver el agar. Envasar en porciones de 4 ml en tubos de 13 x 100
mm. Esterilizar en autoclave a 121 1C durante 15 min. pH final 7,3 0,2.
(Segunda Seccin)
DIARIO OFICIAL
B.16.3.8.2 Medio MTM

Ingredientes
Extracto de carne
Peptona
Cloruro de sodio (NaCl)
Agar
Agua
Cantidad
3,0 g
10,0 g
5,0 g
4,0 g
1000,0 ml
Agitar y calentar a ebullicin hasta disolver el agar. Envasar en porciones de 4 ml en tubos de 13 x 100
mm. Esterilizar en autoclave a 121 1C durante 15 min. pH final 7,4 0,2.
B.16.3.9 Caldo prpura para fermentacin de carbohidratos
Ingredientes
Proteosa peptona No. 3
Cloruro de sodio
Extracto de carne
Agua
Cantidad
10,00 g
5,00 g
1,00 g
0,02 g
1000,00 ml
Calentar si es necesario para disolver los ingredientes. Esterilizar en autoclave durante 15 min. a 121
1C pH final 6,8 0,2. Agregar la solucin del carbohidrato, previamente esterilizada, por filtracin en cantidad
suficiente para obtener una concentracin final de 0,5 %.
Nota: Los sistemas bioqumicos comerciales validados pueden usarse como alternativa para las pruebas
bioqumicas convencionales.
B.16.4 Materiales
Aceite de inmersin
Asas bacteriolgicas
Cajas Petri
Cubreobjetos
Matraces Erlenmeyer de 500 ml
Lmpara de luz blanca
Lpiz graso o marcador
Lupa de bajo aumento
Pipetas volumtricas de 25, 10 y 1,0 ml
Portaobjetos escabado
Portaasas
Tubos de 16 x 125 mm
Tubos de 13 x 100 mm u otros con tapn de rosca
Sistema de filtracin con membranas con un tamao de poro de 0,45 m

Se requiere adems de lo mencionado en el mtodo de Preparacin y Dilucin de Muestras de Alimentos
para su Anlisis Microbiolgico, lo siguiente:
Incubadoras con termostato que evite variaciones mayores de 1,0C, provista con termmetro
calibrado.
Microscopio de contraste de fases con objetivo de inmersin en aceite (100 X) o microscopio de

campo oscuro.
Para la preparacin de la muestra seguir lo mencionado en el mtodo Preparacin y Dilucin de muestras
de Alimentos para su Anlisis Microbiolgico.
Este mtodo debe realizarlo un microbilogo experimentado, en un ambiente controlado, aislado de reas
de produccin de alimentos. Se debe tener especial cuidado en la disposicin de aquellos materiales y equipo
que hayan estado en contacto con alimentos sospechosos, antes de desecharlos o volver a utilizarlos. Esta
tcnica por ningn motivo debe aplicarla personal inmunocomprometido ya sea por enfermedad o por el uso
de medicamentos, mujeres embarazadas o personas de edad avanzada.
DIARIO OFICIAL
(Segunda Seccin)
B.16.7.1 Procedimiento de enriquecimiento

Tomar una muestra representativa del alimento, tanto de la superficie externa como del interior. Colocar
25 ml o 25 g de la muestra en un recipiente conteniendo 225 ml de medio de enriquecimiento (EB),
homogeneizar e incubar por 48 h a 30C. En el caso de muestras en donde se sospecha que tienen clulas de
Listeria spp daadas, se recomienda la incubacin en un caldo de enriquecimiento que contenga piruvato de
sodio al 0,1 % (p/v) incubado a 30C por 6 h sin suplementos. Despus de las 6 h de incubacin los
suplementos deben agregarse y continuar la incubacin a 30C hasta un total de 48 h.
B.16.7.1.1 Aislamiento
Despus de 24 y 48 h de incubacin en el medio EB, resembrar en los medios LMP y OXA. Incubar las
placas del medio LMP a 30C por 24 a 48 h y las de medio OXA a 35C por el mismo periodo. Observar el
crecimiento en las placas del medio LMP con luz blanca en un ngulo de 45 (iluminacin de Henry), a simple
vista o con la ayuda de una lupa. En este medio generalmente aparecen las colonias de color blanco o azul
iridiscentes. Ver la figura 1. En el medio OXA las colonias de Listeria son negras, con halo negro. Algunas
colonias pueden aparecer con un tono caf oscuro que se define mejor a los siete das de incubacin.
Seleccionar cinco o ms colonias tpicas del medio de OXA o LMP y pasar a placas de medio ASTEL. Este
paso es importante debido a que las colonias aparentemente aisladas en los medios OXA y LMP pueden estar
contaminadas con flora competitiva parcialmente inhibida, invisible a simple vista.
Debido a que puede estar presente ms de una especie de Listeria en la muestra, deben identificarse
como mnimo cinco colonias.
B.16.7.2 Identificacin
Se deben utilizar cepas de referencia positivas y negativas para cada una de las pruebas. Seleccionar
colonias tpicas y sembrar en medio ASTEL. Incubar a 35C por 24 h. Estos cultivos pueden mantenerse a
4C y utilizarse como inculo para realizar las pruebas de identificacin.
B.16.7.2.1 Prueba de movilidad en fresco
Hacer preparaciones en fresco (en gota suspendida o entre porta y cubreobjetos) utilizando solucin salina
al 0,85%. La suspensin debe ser densa y emulsificarse completamente, y observar con objetivo de inmersin
en un microscopio de contraste de fase o microscopio de campo oscuro. Las clulas de Listeria spp son
bacilos cortos con movilidad rotatoria o como si brincaran. Los bacilos con movimientos rpidos no son
Listeria spp.
B.16.7.2.2 Prueba de catalasa
Emulsificar un cultivo puro, con una gota de solucin de perxido al 3%. La formacin inmediata de
burbujas indica que la prueba es positiva. Las especies de Listeria son catalasa positivo.
Precauciones, la emulsin debe realizarse con una asa de plstico o palillo de madera estril evitando el
contacto del metal con el reactivo. Si las colonias provienen de agar base con sangre. Cualquier
contaminacin de eritrocitos puede dar pruebas falsas positivas!
B.16.7.2.3 Tincin de Gram
Hacer una tincin de Gram de cultivos de 16 a 24 h. Todas las especies de Listeria son bacilos cortos
Grampositivo; sin embargo en cultivos viejos pueden presentarse como formas cocoides. En extensiones
delgadas se observan de color plido y pueden confundirse con Bacteroides spp.
(Segunda Seccin)
DIARIO OFICIAL
B.16.7.2.4 Prueba de hemlisis

Dibujar una cuadrcula de 20 a 25 espacios en el fondo de la placa de agar sangre de carnero al 5%.
Inocular por picadura un cuadro por cada cultivo. Incubar por 48 h a 35C. Al inocular, observar la reaccin
hemoltica en las placas. L. monocytogenes y L. seeligeri producen una zona ligeramente clara alrededor del
punto de picadura. Confirmar las reacciones dudosas con la prueba de CAMP.
B.16.7.2.5 Prueba de reduccin de nitratos
Inocular los tubos conteniendo caldo nitratos, incubar a 35C por 5 das. Para la lectura se debe agregar
0,2 ml del reactivo A y 0,2 ml del reactivo B, un color rojo indica una prueba positiva (presencia de nitritos). Si
esta coloracin no se observa, adicionar zinc en polvo. El desarrollo de color rojo despus de una hora
confirma una prueba negativa (presencia de nitratos). En forma alternativa adicionar al cultivo en caldo nitratos
0,2 ml del reactivo B y 0,2 ml del reactivo C. Un color naranja indica una prueba positiva (presencia de
nitritos). Si esta coloracin no se observa, adicionar 0,2 ml del reactivo de cadmio, el desarrollo de un color
naranja confirma una prueba negativa (presencia de nitratos). Este procedimiento alternativo elimina el uso del
alfa-naftilamina, que es carcinognica.
B.16.7.2.6 Prueba de movilidad en agar
Inocular el medio SIM o MTM, incubar por 7 das a temperatura ambiente (20-25C), observar diariamente.
Las especies de Listeria son mviles, dando un crecimiento tpico en forma de paraguas.
B.16.7.2.7 Prueba de utilizacin de carbohidratos
Inocular tubos de caldo prpura para fermentacin de carbohidratos al 0,5 %: dextrosa, esculina, maltosa,
ramnosa, manitol y xilosa. Incubar 7 das a 35C. Una coloracin amarilla indica una prueba positiva. Todas
las especies de Listeria dan positivas las pruebas para dextrosa, esculina y maltosa. Consultar el cuadro 1
para reacciones con ramnosa, xilosa y manitol. Si la pigmentacin prematura del aislamiento en el medio OXA
no deja lugar a duda, el ensayo de esculina puede omitirse.
B.16.7.2.8 Prueba de Cristie-Atkins-Munch-Peterson (CAMP)
Para la prueba de CAMP se emplean las siguientes cepas de coleccin de S. aureus y R. equi:
Staphylococcus aureus
Rhodococcus equi
ATCC 49444
ATCC 6339
NCTC 7428
NCTC 1621
ATCC 25923
CIP 5710
Las cepas empleadas en la prueba de CAMP pueden obtenerse de diversas colecciones nacionales e
internacionales.
En una placa de agar sangre de carnero sembrar una estra de la cepa de S. aureus y, paralelamente una
de R. equi, separadas lo suficiente para que entre stas se puedan estriar perpendicularmente las cepas
sospechosas de Listeria, sin que lleguen a tocarse (aproximadamente 5 mm de separacin). Despus de 24 y
48 h de incubacin a 35C observar el sinergismo entre las hemolisinas de S. aureus, R. equi y Listeria que se
manifiesta como una zona hemoltica ms intensa.
La figura 2 muestra la disposicin de las estras de los cultivos en una placa para la prueba de CAMP. La
hemlisis de L. monocytogenes y L. seeligeri se incrementa cerca de la estra de S. aureus, y la hemlisis de
L. ivanovii se aumenta cerca de la estra de R. equi. Las especies restantes no son hemolticas en esta
prueba.
Prueba de CAMP para Listeria monocytogenes:

Diseo de la inoculacin en placas de agar sangre de carnero. Las lneas horizontales representan las
estras de la inoculacin de cinco cepas. Las lneas verticales representan las estras de inoculacin de S.
aureus (S) y R. equi (R). Las lneas sombreadas indican el incremento de hemlisis en esas regiones.
DIARIO OFICIAL
(Segunda Seccin)
Cuadro 1. Diferenciacin de las Especies de Listeria

ESPECIES
L. monocytogenes
L. ivanovii
L. innocua
L. welshimeri
L. seeligeri
L. grayic
HEMOLITICO(BETA)A
REDUCCION
NITRATOS
+
+
+
-
b
V
PRODUCCION DE
ACIDOS
M
R
X
+
+
b
V
b
V
+
+
b
+
V
-
CAMPO
S.a
R.e
+
+1
-
+
-
a
bV
Variable
L. grayi incluye ahora las cepas de la especie L. murrayi reductoras de nitratos y ramnosa variable
M Manitol
R
Ramnosa
X
Xilosa
S.a Staphylococcus aureus
R.e Rhodococcus equi
B.16.7.3 Serologa
La determinacin de los tipos serolgicos de Listeria se aplica cuando las consideraciones
epidemiolgicas sean cruciales. Inocular en caldo de triptosa por 24 h a 35C. Transferir a dos tubos de agar
inclinado de triptosa e incubar 24 h a 35C. Para realizar la prueba se pueden utilizar sueros comerciales,
siguiendo las instrucciones del fabricante.
Cuadro 2. Serologa de las especies de Listeria
ESPECIES
L. monocytogenes
L. ivanovii
L. innocua
L. welshimeri
L. seeligeri
SEROTIPO
1/2A, 1/2B, 1/2C
3A, 3B, 3C
4A, 4AB, 4B
4C, 4D, 4E, "7"
5
4AB, 6A, 6B, Un a
6A, 6B
1/2B, 4C, 4D, 6B, Un a

Comparar los resultados obtenidos con el cuadro 1 y determinar el gnero y especie de las cepas
aisladas. La correspondencia de resultados con el cuadro anterior indica la presencia del gnero Listeria.
El nico miembro del gnero Listeria de importancia para esta norma es Listeria monocytogenes.
Cuando los resultados sean positivos para L. monocytogenes informar la presencia en 25 g o 25 ml de
muestra. Y si los resultados son negativos informar ausencia en 25 g o 25 ml de muestra.
B.17. DE LA ESTIMACION DE LA DENSIDAD MICROBIANA POR LA TECNICA DEL NUMERO MAS
PROBABLE. DETERMINACION DE BACTERIAS COLIFORMES, COLIFORMES FECALES Y Escherichia
coli POR LA TECNICA DE DILUCIONES EN TUBO MULTIPLE.
Este mtodo es aplicable a cualquier grupo bacteriano de inters sanitario, especialmente en productos
que se encuentran en bajas concentraciones de microorganismos (10 por gramo o ml). Ejemplo: Leche, agua,
alimentos; que por su consistencia pueden interferir con la exactitud de la cuenta de Unidades Formadoras de
Colonias (U.F.C.).
B.17.1 Fundamento.
Se basa en la dilucin de la muestra en tubos mltiples, de tal forma que todos los tubos de la menor
dilucin sean positivos y todos los tubos de la dilucin ms alta sean negativos. El resultado positivo se
demuestra por la presencia de gas o crecimiento microbiano.
Para obtener el Nmero Ms Probable (NMP) en los resultados se aplica la teora de la probabilidad, lo
cual tiene como condicin lo siguiente:
(Segunda Seccin)
DIARIO OFICIAL
- Una distribucin aleatoria de las bacterias que existen en la muestra.

- Las bacterias se encuentran como entidades no agrupadas.
- Los microorganismos presentes en la muestra crecern en el medio, cuando son incubados y se
mantengan en las condiciones adecuadas para su desarrollo.
Si se espera una cuenta microbiana alta, la muestra deber diluirse para dar cumplimiento a las
condiciones. La forma ms comn de realizar esta prueba es mediante diluciones decimales y usando un
inculo en series de 3, 5 o 10 tubos en serie. A medida que el nmero de tubos inoculados para cada dilucin
aumentan se reducen los lmites de confianza.
B.17.2 Equipo, materiales y reactivos.
No aplica.
B.17.3 Procedimientos.
B.17.3.1 Uso de tablas de NMP con 95% de lmite de confianza.
Las tablas 1-3 presentan la estimacin estadstica de los valores del NMP que corresponden al 95% de
lmite de confianza cuando se utilizan 3, 5 y 10 tubos. Otras combinaciones de resultados positivos y
negativos no encontrados en estas tablas, tienen muy baja probabilidad de que se presenten. Si los resultados
no estn incluidos en las tablas, se deber repetir la prueba a partir de la muestra original. Si no es posible,
el NMP se puede obtener (para las combinaciones de 3 y 5 tubos) de las tablas 4 y 5; tambin se puede
aplicar una ecuacin (vase punto B.2) para obtener el NMP aproximado.
El intervalo del 95% de confianza se interpreta como sigue: si el analista supone que el nmero real de
microorganismos cae dentro de los lmites, entonces se asume que ser correcto el 95% de las veces. El valor
del NMP tabulado representa un intervalo y no un valor absoluto.
Cuando se preparan ms de 3 diluciones de una muestra, el NMP deber determinarse a partir de tres
diluciones consecutivas (usando tablas 1-3). Primero, para todas las diluciones que tengan todos los tubos
positivos, seleccionar la dilucin mayor. Despus usar las 2 siguientes diluciones mayores (A y B en las tablas
6 y 7). Cuando en ninguna de las diluciones probadas hubiera crecimiento en todos los tubos, seleccionar (si
es posible) las primeras tres diluciones consecutivas (volumen de muestra) para que la dilucin media
contenga resultados positivos (C de tablas 6 y 7).
Con frecuencia es necesario el NMP desde el inicio con volmenes diferentes de los enlistados en las
tablas 1-5. Si el volumen de muestra es mayor que 0,01 g multiplicar el NMP enlistado en la tabla por 10. El
resultado de una determinacin de 5 tubos que d 3 tubos positivos en 0,01 g; 2 tubos positivos en 0,001 g y 1
tubo positivo en 0,0001 g (3-2-1) leer en la tabla No. 2 como 17 y multiplicar por 10 para as obtener 170 como
el NMP actual por gramo de muestra. De igual forma si la cantidad ms grande utilizada para la tabla de
referencia es 1 g en lugar de 0,1 g, dividir el NMP derivado de la tabla entre 10. Por ejemplo el resultado de la
determinacin del NMP en 3 tubos para Salmonella spp que d 3 tubos positivos en 1 g; 1 tubo positivo en
0,1 g y ningn positivo en 0,01 g (3-1-0) leer en la tabla No. 1 como 43 y dividir entre 10, lo que da 4,3 como el
NMP presuntivo por gramo de muestra.
Un mtodo alternativo para obtener el nmero ms probable es usando la siguiente frmula:
(NMP/g de la tabla - 100) X factor de dilucin del tubo de enmedio = NMP/g
Para calcular el NMP/100 g multiplicar por 100.
B.17.3.2 Clculo aproximado del NMP y 95% de lmite de confianza.
Debido a la inherente complejidad para calcular los lmites de confianza del NMP lo ms comn es el uso
de tablas. Generalmente estas tablas estn limitadas al uso de 3, 5 y 10 tubos por dilucin, incluso usando un
mtodo aceptado, pueden presentarse datos irregulares o accidentes de laboratorio que causan prdida de 1
o ms tubos de dilucin. En este caso una serie de diluciones de por ejemplo: 5,4,4 puede dar una lectura de
5-2-0. Para estos casos se puede aplicar una frmula sencilla, la cual no corresponde exactamente con los
resultados obtenidos tericamente; sin embargo, las desviaciones generalmente son pequeas, esta frmula
no debe ser aplicada para fines de regulacin. La frmula no restringe el nmero de tubos o las diluciones y
puede aplicarse para todo tipo de pruebas. El clculo aproximado est dado por la siguiente ecuacin: NMP/g
= P/(N T)1/2
Donde: P es el nmero de tubos positivos, N es la cantidad total de muestra (g) en todos los tubos
negativos y T es la cantidad total de muestra (g) en todos los tubos.
Por ejemplo, considerando que se tuvieran serie de diluciones al doble:
MUESTRA (G)
8
4
2
1
0,5
0,25
NO. DE TUBOS
5
5
5
5
5
5
NO. DE TUBOS POSITIVOS

5
4
2
0
1
0
DIARIO OFICIAL
(Segunda Seccin)
El nmero de tubos positivos es: P = (5 + 4 + 2 + 1) = 12; N = (8x0) + (4x1) + (2x3) + (1x5) + (0,5x4) +
(0,25x5) = 18,25; y T = 5 (8+4+2+1+0,5+0,25) = 78,75
NPM/g = 12/(18,25 x 78,75)
1/2
= 0,32/g o 32/100 g
Los lmites de confianza del 95% estimados, pueden obtenerse del antilogaritmo de base 10 con la
siguiente ecuacin:
log (NMP/g) 1,08 (log a)/n) 1/2
Donde: a es el radio de dilucin y n es el nmero de tubos por dilucin. Esta expresin asume que el radio
de dilucin es diferente de 1:10 (por ejemplo 1:2). Para diluciones de 1:10, la cantidad por restar o sumar
deber ser de 1,14(n) para la mejor estimacin. Si el nmero de tubos por dilucin (ni) es desigual (por
ejemplo: un accidente de laboratorio) para la dilucin k reemplazar n por la expresin nH (media armnica) por
el nmero de tubos por dilucin (ni).
La media armnica se define como:
nH = k / (1/ ni )
k es el nmero de diluciones. Por ejemplo: Suponiendo que el resultado de 3 diluciones en ni fuera 5-4-4.
Por lo tanto nH = 3/ (1/5) + (1/4) + (1/4) = 3/0,70 = 4,3i
Para el ejemplo anterior el NMP con n = 5 y un lmite de confianza aproximado de 95% ser el siguiente:
log 0,32 (1,08) (log 2)/5)
-0,495 0,265
Entonces el lmite inferior es el antilogaritmo (-0-76) = 0.17/g o 17/100 g y el lmite inferior es el
antilogaritmo (-0,23) = 0,59/g o 59/100 g. Cuando se compara con las tablas el NMP podra ser 0,31/g con
lmites de confianza de 0,16/g y 0,57/g.
Tabla No. 1 Seleccin del NMP con un lmite de confianza de 95% para la prueba de fermentacin
utilizando 3 tubos: con porciones de 0,1, 0,01 y 0,001 g (ml) de muestra.
0,1
0
0
1
1
1
1
2
2
2
2
2
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
No. de tubos positivos

0,01
0
0
1
0
0
0
0
1
1
0
2
0
0
0
0
1
1
0
1
1
2
0
0
0
0
1
1
0
1
1
2
0
2
1
2
2
3
0
3
1
3
2
3
3
0,001
NMP/g (ml)b
3
3+
4
7+
7
11+
9
14+
15
20+
21
23
39
43
75
93
150
210+
240
460
1100
1100
95% de lmite de confianza

Inferior
Superior
1
17
1
21
2
27
2
28
4
35
2
38
5
48
5
50
7
60
8
62
9
130
10
180
10
210
20
280
30
380
50
500
80
640
90
1400
100
2400
300
4800
-
Los resultados normales, obtenidos en un 95% de las pruebas no estn seguidos por un smbolo ms (+). Menos del
4% de los resultados de las pruebas obtenidos estn marcados por un smbolo ms (+). Combinaciones de tubos positivos
no encontrados en esta tabla se presentan en menos del 1% de las pruebas y si se presentaran con mayor frecuencia
indican un error de tcnica o que el valor del nmero ms probable se encuentra en el lmite. El NMP de combinaciones que
no aparecen en la tabla, se puede obtener por extrapolacin a la combinacin cercana ms elevada.
b
Multiplicar todos los valores de NMP/g (ml) por 100 para expresarlos como NMP/100 g (ml).
(Segunda Seccin)
DIARIO OFICIAL
a
utilizando 5 tubos: con porciones de 0,1, 0,01 y 0,001 g (ml) de muestra .
0,1
0,01
0,001
NMP/g (ml)b
Inferior
Superior
0
0
0
1
1
1
1
2
2
2
2
2
3
3
3
3
3
3
3
4
4
4
4
4
4
4
4
4
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
0
0
1
0
0
1
2
0
0
1
1
2
0
0
1
1
2
2
3
0
0
1
1
2
2
3
3
4
0
0
1
1
1
2
2
2
3
3
3
4
4
4
4
4
5
5
5
5
5
5
0
1
0
0
1
0
0
0
1
0
1
0
0
1
0
1
0
1
0
0
1
0
1
0
1
0
1
0
0
1
0
1
2
0
1
2
0
1
2
0
1
2
3
4
0
1
2
3
4
5
2
2+
2
2
4+
4
6+
4
7+
7
9+
9
8
11
11
14+
14
17+
17+
13
17
17
21
22
26+
27
33+
34+
23
31
33
46
63+
49
70
94+
79
110
140
130
170
220
280+
350+
240
350
540
920
1600
1600
1
1
1
1
1
2
1
2
2
3
3
3
4
4
6
6
7
7
5
7
7
9
9
12
12
15
16
9
13
14
20
22
21
30
40
30
40
60
50
70
100
120
160
100
100
220
300
600
-
10
10
11
15
15
18
17
20
21
25
25
24
29
30
35
35
40
41
38
45
46
55
56
65
67
77
80
68
110
120
150
180
170
210
250
250
300
360
390
480
580
690
820
940
1300
2000
2900
5300
-
Los resultados normales, obtenidos en un 95% de las pruebas, no estn seguidos por un smbolo ms(+). Menos del
4% de los resultados de las pruebas obtenidos estn marcados por un smbolo ms (+). Combinaciones de tubos positivos
no aparecen en la tabla, se pueden obtener por extrapolacin a la combinacin cercana ms elevada.
b
DIARIO OFICIAL
(Segunda Seccin)
utilizando 10 tubos: con porciones de 0,1, 0,01 y 0,001 g (ml) de muestraa.
0,1
0
0
0
0
1
1
1
1
2
2
2
2
2
2
3
3
3
3
3
3
3
4
4
4
4
4
4
4
4
5
5
5
5
5
5
5
5
5
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
7
7
7

0,01
0
0
0
1
1
0
2
0
0
0
0
1
1
0
2
0
0
0
0
1
1
0
1
1
2
0
3
0
0
0
0
1
1
0
1
1
2
0
2
1
3
0
0
0
0
1
1
0
1
1
2
0
2
1
3
0
4
0
0
0
0
1
1
0
1
1
2
0
2
1
3
0
3
1
4
0
0
0
0
1
1
0
1
1
2
0
2
1
3
0
3
1
4
0
5
0
0
0
0
1
0
2
0,001
NMP/g (ml)b
1
1+
1
2+
1
2+
2
3+
2
3+
3
4+
4
5+
3
4
4
5+
5
6+
6+
4
6
6
7
7
8
8
9+
6
7
7
9
9
10+
10
11+
11+
8
9
9
11
11
12
12
14+
14+
15+
10
12
13+
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
2
2
1
2
2
2
2
3
3
2
2
2
3
3
4
4
5
2
3
3
4
4
5
5
6
6
3
4
4
5
5
6
6
7
7
8
5
6
7

Inferior
Superior
5
5
7
5
7
7
8
7
9
9
10
10
12
9
11
11
13
13
14
14
12
13
14
15
15
17
17
19
15
16
17
18
18
20
20
22
22
18
20
20
22
22
24
25
27
27
29
22
24
27
(Segunda Seccin)
7
7
7
7
7
7
7
7
7
7
7
8
8
8
8
8
8
8
8
8
8
8
8
8
8
8
8
8
9
9
9
9
9
9
9
9
9
9
9
9
9
9
9
9
9
9
9
9
9
10
10
10
10
10
10
1
1
1
2
2
2
3
3
4
4
5
0
0
0
1
1
1
2
2
2
3
3
3
4
4
5
5
6
0
0
0
1
1
1
2
2
2
3
3
3
4
4
4
5
5
5
6
6
7
0
0
0
1
1
1
DIARIO OFICIAL
0
1
2
0
1
2
0
1
0
1
0
0
1
2
0
1
2
0
1
2
0
1
2
0
1
0
1
0
0
1
2
0
1
2
0
1
2
0
1
2
0
1
2
0
1
2
0
1
0
0
1
2
0
1
2
12
13
15+
13
15
17+
15
17
17
19+
19+
13
15
17+
15
17
19+
17
19
21+
19
21
24+
22
24
24
27+
27+
17
19
22+
19
22
25+
22
25
28+
25
29
32+
29
33
37+
33
37
42+
38
43+
44+
23
27
31+
27
32
38

6
7
8
7
8
9
8
9
9
10
10
6
7
8
7
9
10
9
10
12
10
12
13
12
13
13
15
15
8
10
11
10
11
13
12
13
15
13
15
18
16
18
20
18
20
23
21
24
24
12
14
16
14
17
20
25
27
30
27
30
32
30
33
33
36
36
28
31
34
31
34
37
35
38
42
39
42
46
43
46
47
51
52
37
41
46
42
47
52
47
53
58
54
60
66
61
67
74
69
76
83
77
85
87
58
67
77
69
79
92

10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
2
2
2
2
3
3
3
3
4
4
4
4
5
5
5
5
6
6
6
6
6
7
7
7
7
7
8
8
8
8
8
8
9
9
9
9
9
9
9
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
DIARIO OFICIAL
0
1
2
3
0
1
2
3
0
1
2
3
0
1
2
3
0
1
2
3
4
0
1
2
3
4
0
1
2
3
4
5
0
1
2
3
4
5
6
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
33
39
50
50+
40
50
60+
70+
50
60
70
80+
60
70
90
100
80
90
110
120
140+
100
120
140
150
170+
130
150
170
200
220
250+
170
200
230
260
300
350
400+
240
290
350
400
500
700
900
1120
1160
2300
2300
(Segunda Seccin)
17
20
20
30
20
20
30
30
30
30
30
40
30
40
40
50
40
50
50
60
70
50
60
70
80
90
60
80
90
100
120
140
90
100
120
140
160
180
210
120
150
170
200
300
300
400
600
800
1100
-
83
96
110
120
100
120
130
150
120
140
160
170
150
170
190
210
180
200
230
250
270
220
250
280
310
340
280
320
360
400
440
480
380
430
490
560
640
720
820
610
750
910
1100
1400
1700
2100
2700
3700
6000
-
Los resultados normales, obtenidos en un 95% de las pruebas, no estn seguidos por un smbolo ms (+). Menos del
4% de los resultados de las pruebas obtenidos estn marcados por un smbolo ms(+). Combinaciones de tubos positivos
no aparecen en la tabla, se pueden obtener por extrapolacin a la combinacin cercana ms elevada.
b
(Segunda Seccin)
DIARIO OFICIAL
Tabla No. 4 Nmero ms probable (NMP) para 1g de muestra cuando se usan 3 tubos con porciones
de 0,1, 0,01 y 0,001g.
Tubos Positivos
0,1 0,01 0,001 NMP
Tubos Positivos
0,1 0,01 0,001 NMP
0,1
Tubos Positivos
0,01 0,001 NMP
0,1
Tubos Positivos
0,01 0,001 NMP
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
1
1
0
1
2
3
0
1
3
3
6
9
3
6,1
1
1
1
1
1
1
0
0
0
0
1
1
0
1
2
3
0
1
3,6
7,2
11
15
7,3
11
2
2
2
2
2
2
0
0
0
0
1
1
0
1
2
3
0
1
9,1
14
20
26
15
20
3
3
3
3
3
3
0
0
0
0
1
1
0
1
2
3
0
1
23
39
64
95
43
75
0
0
0
0
0
0
0
1
1
2
2
2
2
3
2
3
0
1
2
3
0
9,2
12
6,2
9,3
12
16
9,4
1
1
1
1
1
1
1
1
1
2
2
2
2
3
2
3
0
1
2
3
0
15
19
11
15
20
24
16
2
2
2
2
2
2
2
1
1
2
2
2
2
3
2
3
0
1
2
3
0
27
34
21
28
35
42
29
3
3
3
3
3
3
3
1
1
2
2
2
2
3
2
3
0
1
2
3
0
120
160
93
150
210
290
240
0
0
0
3
3
3
1
2
3
13
16
19
1
1
1
3
3
3
1
2
3
20
24
29
2
2
2
3
3
3
1
2
3
36
44
53
3
3
3
3
3
3
1
2
3
460
1100
1100
Tabla No. 5 Nmero ms probable (NMP) para 100 ml de muestra cuando se usan 5 porciones en
cada una de 3 diluciones con series geomtricas.
No. de
Positivos
Tubos No. de
Positivos
10
0,1
ml ml
ml
0
0
N
M
P
10
Tubos No. de
Positivos
0,1
10
Tubos No. de
Positivos
Tubos No. de
Positivos
Tubos No.
de
Positivos
0,1
0,1
0,1
10
10
10
0,1
ml
N
M
P
ml
ml
ml
N
M
P
1,8 1
3,6 1
5,4 1
7,2 1
10
9,0 1
1,8 1
3,6 1
5,5 1
7,3 1
9,1 1
12
17
23
35
110
11
14
19
27
42
130
3,7 1
6,1 2
9,3 3
14
22
49
5,5 1
8,2 2
12
17
26
70
7,4 1
10
14
20
32
95
9,2 1
12
17
24
38
120
11
15
19
27
44
150
13
17
22
31
50
180
5,6 1
8,3 2
12
17
27
79
7,4 1
10
14
21
33
110
9,3 1
13
17
24
39
140
11
15
20
28
45
180
ml
ml
N
M
P
4,5 3
6,8 3
9,1 3
12
14
12
16
6,1 2
9,2 3
8,1 2
12
17
26
64
10
14
20
31
84
ml
ml ml
m
l
Tubos
ml
ml
N
M
P
ml ml
ml
N M
P
7,8 4
13
23
11
17
31
13
21
43
16
25
58
20
30
76
23
36
95
6,8 3
11
17
33
14
21
46
DIARIO OFICIAL
(Segunda Seccin)
13
17
22
31
52
210
15
19
25
35
59
250
7,5 1
11
15
21
34
130
9,4 1
13
17
24
40
170
11
15
20
28
47
220
13
17
23
32
54
280
15
19
25
36
62
350
17
22
28
40
69
430
9,4 1
13
17
25
41
240
11
15
20
29
48
350
13
17
23
32
56
540
15
19
26
37
64
920
17
22
29
41
72
1600
19
24
32
45
81
Tabla No. 6 Ejemplos para determinar el NMP estimado en series de tres tubos con 1g (ml) de muestra
por tubo.
Cantidad de muestra (g o ml)a
Ejemplo
A
B
C
D
E
0,10
3/3
3/3
0/3
3/3
3/3
,001
3/3
3/3
0/3
3/3
3/3
0,001
2/3
3/3
1/3
2/3
3/3
Valores positivos NMP estimado/g o mlb

reportados
0,0001
0/3
2/3
0/3
1/3
3/3
0,00001
0/3
0/3
0/3
1/3
3/3
3-2-0
3-2-0
0-1-0
3-2-2
3-3-3
930
9300
30
2100
110000
a Numerador/denominador = nmero de tubos positivos/nmero de tubos inoculados.

b Multiplicar todos los valores de NMP/g (ml) por 100 para expresarlos como NMP/100 g (ml).
Tabla No. 7 Ejemplos para determinar el NMP estimado en series de 5 tubos con 1 g (ml) de muestra
por tubo.
Ejemplo
A
B
Cantidad de muestra (g o ml)a

0,1,
0,01
0,001
0,0001
5/5
5/5
2/5
0/5
5/5
5/5
5/5
2/5
C
D
E
0/5
5/5
5/5
0/5
5/5
5/5
1/5
3/5
5/5
0/5
1/5
5/5
Valores positivos
NMP estimado/g o mlb
0,00001
0/5
0/5
reportados
5-2-0
5-2-0
490
4900
0/5
1/5
5/5
0-1-0
5-2-2
5-5-5
20
1400
160000
a Numerador/denominador = nmero de tubos positivos/nmero de tubos inoculados.

b Multiplicar todos los valores de NMP/g (ml) por 100 para expresarlos como NMP/100 g (ml).
B.17.3.3 Determinacin de bacterias coliformes, coliformes fecales y Escherichia coli por la tcnica
de diluciones en tubo mltiple.
B.17.3.3.1 Fundamento
Este mtodo se basa en la propiedad de los microorganismos coliformes para producir gas a partir de
glucosa y fermentacin de lactosa dentro de las 48 horas de incubacin a 35 0,5C (coliformes) y 44,50,2C
(coliformes fecales y E. coli).
B.17.3.3.2 Equipo y materiales
Adems de los mencionados en el mtodo Preparacin y dilucin de muestras de alimentos para

anlisis microbiolgico, lo siguiente:
Bao de agua con agitacin continua cubierto y con termostato que evite variaciones mayores a
0,1C.
(Segunda Seccin)
DIARIO OFICIAL
Termmetro calibrado y verificado 1/10
Tubos de cultivo de 20x200 y de 16x160 mm con tapn de rosca
Campanas de fermentacin (tubos de Durham)
Gradillas
Asas bacteriolgicas de 3 mm de dimetro
Lmpara de luz ultravioleta de longitud amplia 4 watts.
Lentes protectores.
Medios de cultivo
Caldo lauril
Ingredientes:
Bacto triptosa
20,0 g
Bacto lactosa
5,0 g
Fosfato potsico, dibsico
2,75 g
Fosfato potsico, monobsico
2,75 g
Cloruro de sodio
5,0 g
Lauril sulfato de sodio

Agua destilada
0,1 g
1000,0 ml
pH final: 6,8 0,2 a 25C.

Preparacin: Disolver los ingredientes en un litro de agua destilada. Ajustar el pH. Distribuir en tubos de
ensaye con campanas de Durham. Adicionar 10 ml de medio para cada tubo. Esterilizar en autoclave durante
15 minutos a 121C. Antes de abrir el autoclave, dejar bajar la temperatura a 75C para que no queden burbujas
en las campanas de Durham.
Preparacin de caldo lauril triptosa
INOCULO (ml)
1
10
10
20
100
100
100
CANTIDAD DE MEDIO
POR TUBO (ml)
10 o ms
10
20
10
50
35
20
VOLUMEN DE MEDIO
MAS INOCULO (ml)
11 o ms
20
30
30
150
135
120
CALDO LAURIL TRIPTOSA

REQUERIDO g/L
35,6
71,2
53,4
106,8
106,8
137,1
213,6
Caldo EC (E. coli.)

Ingredientes:
Bacto triptosa
20,0 g
Bacto lactosa
5,0 g
Bacto sales biliares No. 3
1,5 g
Fosfato dipotsico
4,0 g
Fosfato monopotsico
1,5 g
Cloruro de sodio
5,0 g
Agua destilada
1000,0 ml
pH final: 6,9 0,2 a 25C.

Preparacin: Disolver los ingredientes en un litro de agua destilada y calentar ligeramente para que se
disuelva por completo. Ajustar el pH. Distribuir en tubos de ensaye con campanas de Durham. Adicionar 10 ml
de medio para cada tubo. Esterilizar en autoclave durante 15 minutos a 121C. Antes de abrir el autoclave,
dejar bajar la temperatura a 75C para evitar que queden burbujas en las campanas de Durham.
DIARIO OFICIAL
(Segunda Seccin)
Agar McConkey
Ingredientes:
Proteasa peptona o polipeptona
Peptona o gelizante
Lactosa
Sales biliares No. 3
Cloruro de sodio
Rojo neutro
Cristal violeta
Agar
Agua destilada
pH final: 7,1 0,2 a 25C
3,0 g
17,0 g
10,0 g
1,5 g
5,0 g
0,03 g
0,001 g
13,5 g
1000,0 ml
Preparacin: Disolver los ingredientes en un litro de agua destilada. Calentar hasta ebullicin para
disolver por completo. Ajustar el pH. Esterilizar a 121C durante 15 minutos. Enfriar a 50-60C y vaciar en
cajas Petri.
Agar eosina azul de metileno de Levin (EMB-L)
Ingredientes:
Peptona
10,0 g
Lactosa
10,0 g
K2HPO4
2,0 g
Eosina Y
0,4 g
Azul de metileno
0,065 g
Agua destilada
1000 ml
pH final: 7,1 0,2

Preparacin: Disolver la peptona, el fosfato y el agar en un litro de agua. Calentar hasta ebullicin para la
disolucin completa. Distribuir en porciones de 100 o 200 ml y esterilizar a no ms de 121C por 15 minutos.
Fundir antes de su uso y adicionar a cada porcin de 100 ml.
a) 5 ml de solucin de lactosa al 20%
b) 2 ml de solucin acuosa de eosina al 2%
c) 4,3 ml de solucin acuosa de azul de metileno al 0,15%.
Cuando se use el producto deshidratado, disolver todos los ingredientes de acuerdo con las instrucciones
del fabricante.
Caldo triptona al 1% (triptofano)
Ingredientes:
Triptona o tripticasa
10 g
Agua destilada
1000 ml
pH final: 6,9 0,2

Preparacin: Disolver los ingredientes. Distribuir en porciones de 5 ml en tubos de ensaye de 16 x 125 o
16 x 150 mm. Esterilizar a 121C por 15 minutos.
Caldo MR-VP
Medio 1
Ingredientes:
Peptona tamponada
7g
Glucosa
5g
K2HPO4
5g
Agua destilada
1000 ml
pH final: 6,9 0,2

Preparacin: Disolver los ingredientes con calentamiento suave si es necesario. Distribuir en volmenes
de 10 ml en tubos de ensaye de 16x150 mm. Esterilizar a 121C por 15 minutos.
(Segunda Seccin)
DIARIO OFICIAL
Caldo citrato de Koser

Ingredientes:
NaNH4HPO4 4H2O
1,5 g
KH2PO4 (monobsico)
1,0 g
MgSO4 7H2O
0,2 g
Citrato de sodio 2H2O
3,0 g
Agua destilada
1000 ml
pH final: 6,7 0,2.

Preparacin: Distribuir preferentemente en tubos de ensaye con tapa de rosca. Esterilizar a 121C por 15
minutos. Esta formulacin se recomienda en los Mtodos de Anlisis Oficial de AOAC y en los Mtodos
Estndares para el Anlisis de Agua y Aguas de Desecho (APHA). Este difiere de la composicin del medio
deshidratado disponible comercialmente y es recomendable su uso.
Reactivos
Reactivo de Kovacs
Ingredientes:
p-imetilaminobenzaldehdo
5g
Alcohol amlico (normal)
75 ml
HCI concentrado
25 ml
Preparacin: Disolver el p-Dimetilaminobenzaldehdo en alcohol amlico normal. Adicionar lentamente el

HCl. Almacenar a 4C.
Para la prueba de indol
1. Adicionar 0,2-0,3 ml del reactivo a 5 ml del cultivo de bacteria en caldo triptona.
Se considera una prueba positiva cuando desarrolla un color rojo en la superficie del tubo.
Reactivo de Voges-Proskauer (VP)
Solucin 1
Ingredientes:
alfa-naftol
5g
Alcohol absoluto
100 g
Solucin 2
Ingredientes:
Hidrxido de potasio
40 g
Agua destilada
para llevar a 100 ml
Prueba de Voges-Proskauer (VP).

1. Transferir 1 ml del cultivo a probar con 48 horas de incubacin a un tubo de ensaye.
2. Adicionar 0,6 ml de la solucin 1 y 0,2 ml de la solucin 2.
3. Agitar despus de la adicin de cada solucin.
4. Para intensificar y acelerar la reaccin adicionar unos cuantos cristales de creatina y mezclar.
5. Dejar a temperatura ambiente.
6. Leer resultados despus de 4 horas de adicionar los reactivos.
El desarrollo de una coloracin rosa es una prueba positiva.
DIARIO OFICIAL
(Segunda Seccin)
Reactivos para la coloracin de Gram

Cristal violeta
Solucin A
Cristal violeta (colorante 90%)
2g
Etanol 95%
20 ml
Solucin B
Oxalato de amonio
0,8 g
Agua destilada
80 ml
Indicador rojo de metilo (R44)

1. Mezclar la solucin A y B. Almacenar por 24 horas
2. Filtrar a travs de un papel filtro spero.
lodo de Gram
Ingredientes:
lodo
1g
Ioduro de potasio (Kl)
2g
Agua destilada
300 ml
1. Colocar el Kl en un mortero.
2. Adicionar el yodo.
3. Triturar con el pistilo por 5-10 segundos.
4. Adicionar 1 ml de agua y triturar
7. Vaciar esta solucin en una botella de reactivo.
8. Enjuagar el mortero y el pistilo con la cantidad de agua necesaria para completar 300 ml.
Colorante de contraste (solucin concentrada)
Ingredientes:
Safranina O
2,5 g
Etanol al 95%
100 ml
Solucin de trabajo: Adicionar 10 ml de la solucin concentrada a 90 ml de agua destilada.

Procedimiento para la tincin de Gram
1. Fijar con calor moderado los frotis de la muestra a teir.
2. Adicionar la solucin de cristal violeta al frotis.
3. Dejar actuar por un minuto.
4. Lavar con agua corriente y escurrir.
5. Aplicar la solucin de yodo por un minuto.
6. Lavar con agua corriente y escurrir.
7. Decolorar con etanol al 95% hasta que la coloracin azul deje de fluir (aproximadamente 30 segundos).
8. Inmediatamente despus enjuagar con agua corriente
9. Escurrir.
(Segunda Seccin)
DIARIO OFICIAL
10. Aplicar el colorante de contraste (safranina) por 30 segundos.

11. Enjuagar, escurrir y secar al aire. Examinar al microscopio.
Medio EC-MUG
Preparar el caldo EC y adicionar 50 mg de 4-metilumbelliferyl-beta-D-glucurnido (MUG) por litro antes de
esterilizar (121C por 15 minutos). El caldo EC-MUG est comercialmente disponible.
B.17.3.3.3 Procedimiento
B.17.3.3.3.1 Alimentos
B.17.3.3.3.1.1 Prueba presuntiva.
B.17.3.3.3.1.1.1 Preparar la muestra como se indica en el mtodo Preparacin y dilucin de muestras de
alimentos para anlisis microbiolgico; y de acuerdo con el tipo de producto, utilizar las diluciones apropiadas,
segn se indica en el procedimiento de la densidad microbiana por la tcnica del nmero ms probable.
Utilizar como medio de enriquecimiento caldo lauril triptosa y continuar como en el punto B.17.3.3.3.1.1.2
B.17.3.3.3.1.2 Prueba confirmativa. Continuar como en el punto B.17.3.3.3.1.2
B.17.3.3.3.3Prueba confirmatoria.
Confirmar la presencia de Escherichia coli en por lo menos el 10% de las pruebas con resultados positivos
a coliformes fecales por cultivo en placas de agar McConkey a partir de los tubos que demostraron la
presencia de gas en la prueba confirmativa. Incubar las placas a 350,5C durante 242 horas, observar las
colonias tpicas fermentadoras de color rojo rodeadas de un halo opaco de precipitacin de sales biliares.
Seleccionar 1 o ms colonias aisladas y pasar a tubos de fermentacin con caldo lauril triptosa, continuar
como se indica en el punto B.16.3.3.3.1.1 Hacer tincin de Gram para observacin de la morfologa de las
colonias.
B.17.3.3.3.3.1 Interpretacin de resultados.
La formacin de gas en el tubo de fermentacin secundario dentro de las 483 horas y la demostracin de
bacilos Gram (-) no esporulados confirma un resultado positivo de la prueba demostrndose la presencia del
grupo coliforme.
B.17.3.3.3.4 Clculos
Calcular la densidad microbiana en nmero ms probable conforme al procedimiento sealado
anteriormente, para estimar la poblacin de bacterias coliformes y bacterias coliformes fecales de acuerdo con
las diluciones empleadas y expresar en NMP/g o ml para alimentos y NMP/100 ml para agua. En el caso de
usar volmenes de 20 ml de muestras de agua en 5 tubos o 10 ml de muestras de agua en 10 tubos, utilizar
las siguientes tablas:
TABLA 1. Indice del NMP con 95% de lmite de confianza para varias combinaciones de resultados
positivos y negativos cuando se usan 5 tubos con 20 ml de muestra de agua o hielo.
NO. DE TUBOS
Positivos
NMP/100 ml
95% DE LIMITE DE CONFIANZA (APROXIMADO)

Inferior
Superior
1,1
3,0
1,1
0,05
6,3
2,6
0,3
9,6
4,6
0,8
14,7
8,0
1,7
26,4
8,0
4,0
Infinito
DIARIO OFICIAL
(Segunda Seccin)
TABLA 2. Indice del NMP con 95% de lmite de confianza para varias combinaciones de resultados
positivos y negativos cuando se usan 10 tubos con 10 ml de muestra de agua o hielo.
NMP/100 ml
No. de Tubos
Positivos
95% de Lmite de Confianza (aproximado)

Inferior
Superior
1,1
0,0
3,0
1,1
0,03
5,9
2,2
0,26
8,1
3,6
0,69
10,6
5,1
1,3
13,4
6,9
2,1
16,8
9,2
3,1
21,1
12,0
4,3
27,1
16,1
5,9
36,8
23,0
8,1
59,5
10
23,0
13,5
Infinito
B.18. PREPARACION DE LA MUESTRA PARA LA DETERMINACION DE VIBRIO CHOLERAE.

Las submuestras de pescado ahumado en filete deben analizarse individualmente.
B.18.1 Incubacin de las muestras a 35-37C.
De cada submuestra tomar 25 g, cortar en piezas pequeas e introducirlas en un vaso de licuadora de
500 ml de capacidad que contenga 225 ml de agua peptonada alcalina (APW) y homogeneizar por 2 min a la
mxima velocidad. Esta es la dilucin 1:10. De esta dilucin preparar la dilucin 1:100 y 1:1000, en 9 o 90 ml
de agua peptonada alcalina.
Incubar las tres diluciones de 35 a 37C.
B.18.2 Incubacin de las muestras de 35-37C y 42C.
Si se van a incubar los enriquecimientos a dos temperaturas para una muestra, homogeneizar una porcin
de 50 g de cada submuestra en 450 ml de agua peptonada alcalina (APW). Esto hace la dilucin 1:10. Verter
250 ml (g) de la dilucin 1:10 a un segundo recipiente estril. Prepare dos series de diluciones de 1:100 y
1:1000. Por lo tanto tenemos dos series de 3 diluciones. Incubar una serie de 35 a 37C y la otra a 42C.
Proseguir con el paso de resiembra marcado en la NOM-031-SSA1-1993. Productos de la pesca. Moluscos
bivalvos frescos-refrigerados y congelados. Especificaciones sanitarias.
B.19. TECNICAS Y PROCEDIMIENTOS PARA LA INVESTIGACION DE VIBRIO CHOLERAE
B.19.1 Material y equipo
Licuadora y vasos de licuadora estriles.
Frascos de vidrio de boca ancha tipo tarro de 500 ml de capacidad con tapa de rosca.
Varilla de vidrio de 3 mm de dimetro y 20 cm de largo, con un doblez terminal en ngulo recto de 4

cm.
Balanza granataria de 2000 g de capacidad y 0,2 g de sensibilidad.
Balanza analtica de 120 g de capacidad y 5 mg de sensibilidad.
Incubadoras de 39-40C.
Bao de agua de 42 0,2C y 35-37C.
Cucharas estriles u otros instrumentos apropiados para transferir muestras de alimentos.
Cajas Petri estriles de 15 x 100 mm de plstico.
Pipetas estriles de 1 ml con graduacin de 0,01 ml, de 5 y 10 ml con graduacin de 0,1 ml.
Asas bacteriolgicas de 3 mm de dimetro de nicromel o platino.
Tubos de cultivo o de ensayo de 16 x 150 mm y 20 x 150 mm.
Tubos para bioqumicas o ensaye de 10 x 75 mm o 13 x 100 mm.
(Segunda Seccin)
DIARIO OFICIAL
Tijeras y pinzas estriles.
Lmpara (para observar reacciones serolgicas).
Mecheros.
Papel pH (rango 1-14) con un mximo de graduacin de 0,4 unidades de pH por cambio de color.
Potencimetro.
Bolsas de polietileno de 28 x 37 cm con tapa resellable.
Aparato de filtracin y membranas de 0,45 micras.
B.19.1.1 Medios de cultivo

Agua Peptonada Alcalina (APW)
FORMULA
Peptona.
10 g
Cloruro de Sodio
10 g
Agua destilada
1 000 ml
Disolver los ingredientes. Ajustar el pH de tal forma que despus de esterilizar ste sea de 8,5 0,2.
Esterilizar en autoclave 10 minutos a 121C.
Agar Tiosulfato, Citrato, Sales Biliares y Sacarosa (TCBS)
FORMULA
5g
Proteosa peptona
10 g
Sacarosa
20 g
Tiosulfato de sodio.5H2O
10 g
Citrato de sodio.2H2O
10 g
Sales biliares
3g
Bilis de buey
5g
Cloruro de sodio
10 g
Citrato frrico
1g
Azul de bromotimol
40 mg
Azul de timol
40 mg
Agar
15 g
Agua destilada
1 000 ml
Preparar en un matraz por lo menos tres veces ms grande que el volumen requerido de medio. Adicionar
los ingredientes en agua destilada tibia y calentar con agitacin constante hasta ebullicin e inmediatamente
retirar del calor. No esterilizar. Enfriar a 50C y colocar en cajas de Petri. Dejar secar las placas de 37-45C
antes de usar.
Agar modificado con Celobiosa, Polimixina B y Colistina (mCPC)
SOLUCION 1 FORMULA
Peptona
10 g
Extracto de carne
5g
Cloruro de sodio
20 g
Solucin Stock de colorante 1 000
1 ml
Agar
15 g
Agua destilada
900 ml
Ajustar el pH a 7,6. Hierva hasta que se disuelva el Agar. Esterilizar por autoclave 15 minutos a 121C.
Enfre de 48-55C.
DIARIO OFICIAL
(Segunda Seccin)
SOLUCION STOCK DE COLORANTES 1 000 X :

FORMULA
Azul de Bromotimol
Rojo de cresol
Etanol al 95%
4g
4g
100 ml
Para obtener un color firme del medio usar una solucin colorante stock en lugar de estar pesando
repetidamente los colores en polvo. Disuelva el colorante en etanol hasta obtener una solucin al 4%
(peso/volumen). Agregue 1 ml de esta solucin a cada litro de agar mCPC, la cual tendr al final 40 mg de
Azul de Bromotimol y 40 mg de Rojo Cresol por litro.
SOLUCION 2: FORMULA
Celobiosa
Colistina
Polimixina B
Agua destilada
10 g
400 000 Ul
100 000 UI
100 ml
Disuelva la celobiosa por calentamiento en agua destilada. Enfre y agregue los antibiticos. Esterilice por
filtracin, agregue la solucin 2 a la solucin 1 mezcle y distribuya en cajas Petri.
Agar T1N1 (Agar Triptona y Sal)
FORMULA
Triptona o tripticasa
Cloruro de sodio
Agar
Agua destilada
10 g
10 g
20 g
1 000 ml
Suspenda los ingredientes y hierva hasta disolucin del agar, si lo desea inclinado, distribuya en tubos.
Esterilice en autoclave 15 minutos a 121C. Deje solidificar los tubos inclinados, para placas enfre el medio
de 45-50C y distribuya en cajas Petri estriles.
Agar Gelatina (GA)
FORMULA
Peptona
Gelatina
Agar
Agua destilada
4g
1g
15 g
15 g
1 000 ml
Suspenda los ingredientes y hierva hasta disolucin de la gelatina y el agar, ajuste el pH a 7,2 0.2.
Esterilice en autoclave 15 minutos a 121C. Enfre de 45-50C y distribuya en cajas Petri estriles.
Agar Gelatina con Sal (GS)
Preparar agar gelatina (GA), pero adicionando 30 g de Cloruro de Sodio por cada litro. Suspenda los
ingredientes y hierva hasta disolver la gelatina y el agar. Ajuste el pH de 7,2 0,2. Esterilice en autoclave 15
minutos a 121C. Enfre de 45-50C, coloque en cajas Petri. Si es necesario para inhibir la diseminacin de
Vibrio spp tal como V. alginolyticus, use de 25-30 g de agar por litro.
Caldo Glucosa de Hugh-Leifson
FORMULA
Peptona
Cloruro de Sodio
Dextrosa
Prpura de Bromocresol
Agar
Agua destilada
2g
0,5 g
20 g
10 g
0,015 g
3g
1 000 ml
Suspenda los ingredientes y hierva hasta disolver el agar. Ajuste el pH a 7,4 0,2. Coloque en tubos y
esterilice en autoclave 15 minutos a 121C.
(Segunda Seccin)
DIARIO OFICIAL
Medio Base de Descarboxilasa (Arginina, Lisina y Ornitina)

FORMULA BASE
Peptona
5g
3g
Dextrosa (D-glucosa)
1g
0.02 g
Agua destilada
1 000 ml
Para caldo de Arginina, Lisina y Ornitina, adicione 5 g de L-aminocido a 1 litro de base. Como control,
use base sin suplemento (aminocido). Para Vibrio spp haloflicos, adicionar 15 g de Cloruro de Sodio por
litro. Ajuste el pH de tal manera que despus de la esterilizacin sea de 6,5 0,2. Distribuya en tubos y
esterilice en autoclave 10 minutos a 121C.
Caldo Triptona y Caldos Triptona Sal T1N0,T1N1,T1N3 y T1N6,T1N8 y T1N10
FORMULA
Triptona o Tripticasa
10 g
Cloruro de Sodio
0,10,30,60,80, o 100 g
Agua destilada
1 000 ml
Disuelva los ingredientes en agua destilada, para T1N0 no agregue Cloruro de sodio, para T1N1 use 10 g
de Cloruro desodio (1% w/v concentracin de cloruro de sodio); as respectivamente. Para T1N3 usar 30 g de
NaCl por litro (3% w/v concentracin de cloruro de sodio) Distribuya en tubos de tapn de rosca de 16 x 150
mm, tape los tubos. Esterilice en autoclave durante 15 minutos a 121C. Ajuste el pH a 7,2 0,2.
Caldo Soya Tripticasa (TSB)
FORMULA
Peptona de Tripticasa (Triptona)
17 g
Peptona de fitona (Soytona)
3g
Cloruro de Sodio
5g
Fosfato dipotsico
2,5 g
Dextrosa
2,5 g
Agua destilada
1 000 ml
Suspenda los ingredientes en agua destilada y caliente hasta disolucin. Distribuya 225 ml en matraces de
500 ml o tubos. Esterilice en autoclave durante 15 minutos a 121C. El pH final debe ser de 7,2 0,2.
Agar Soya Tripticasa (TSA)
FORMULA
Peptona tripticasa (Triptona)
15 g
Peptona de fitona (Soytona)
5g
Cloruro de Sodio
5g
Agar
15 g
Agua destilada
1 000 ml
Suspenda los ingredientes en agua destilada y hierva durante un minuto hasta disolucin del agar. Para
Vibrio spp haloflicos, agregar 15 g de Cloruro de Sodio. Distribuya dentro de tubos o matraces. Esterilice en
autoclave durante 15 minutos a 121C. Deje solidificar los tubos inclinados o deje enfrar de 45-50C y
distribuya en cajas Petri. El pH final debe ser de 7,3 0,2.
DIARIO OFICIAL
(Segunda Seccin)
Agar de Hierro Kligler (KIA)

FORMULA
Peptona polipeptona
20 g
Lactosa
20 g
Dextrosa
1g
Cloruro de Sodio
5g
Citrato frrico amoniacal
0,5 g
Tiosulfato de sodio
0,5 g
Rojo de fenol
0,025 g
Agar
15,0 g
Agua destilada
1 000 ml
Suspender los ingredientes y hervir hasta disolucin del agar. Distribuir en tubos de tapn de rosca.
Esterilizar en autoclave durante 15 minutos a 121C. Dejar solidificar los tubos inclinados. Ajustar el pH de 7,4
0,2.
Agar Arginina Glucosa Inclinado (AGS)
FORMULA
Peptona
5g
3g
Tristona
10 g
Cloruro de Sodio
20 g
Glucosa
1g
L-Arginina. (hidrocloruro)
5g
0,5 g
Tiosulfato de Sodio
0,3 g
0,2 g
Agar
13,5 g
Agua destilada
1 000 ml
Suspender los ingredientes en agua destilada, hervir hasta disolucin del agar, y distribuir en cantidades
de 5 ml a tubos de 13 x 100 mm. Ajustar el pH de 6,8 a 7,0. Esterilizar en autoclave de 10 a 12 minutos a
121C. Deje solidificar el medio inclinado.
Agar Triple Azcar y Hierro (TSI)
FORMULA
Polipeptona
20 g
Cloruro de Sodio
5g
Lactosa
10 g
Sacarosa
10 g
Glucosa
1g
Sulfato ferroso amnico
0,2 g
Tiosulfato de Sodio
0,2 g
Rojo de fenol
0,025 g
Agar
13 g
Agua destilada
1 000 ml
Disolver los ingredientes en agua destilada. Mezclar bien y calentar a ebullicin, agitando ocasionalmente
hasta completa disolucin. Enfrar a 60C y ajuste el pH de 7,3 0,1.
(Segunda Seccin)
DIARIO OFICIAL
Agar de Hierro y Lisina (LIA)

FORMULA
Peptona o gelisato
5,0 g
3,0 g
Glucosa
1,0 g
L-Lisina
10,0 g
0,5 g
Tiosulfato de sodio
0,04 g
0,02 g
Agar
15,0 g
Agua destilada
1 000 g
Disolver los ingredientes en el agua destilada y mezclar bien; calentar hasta ebullicin con agitacin
frecuente hasta conseguir la disolucin completa. Esterilizar en autoclave 12 minutos a 121C. Enfrar de 5060C y ajustar el pH de 6,7 0,1. Distribuir en volmenes de 3 ml en tubos de 13 x 100 mm. Los tubos se
enfran en posicin inclinada, de tal modo que se obtengan columnas de medio de 3 cm y una parte inclinada
de 2 cm.
Caldo Rojo de Metilo y Vogues Proskauer(RM-VP)
FORMULA
Peptona
7g
Glucosa
5g
Fosfato dipotsico
5g
Agua destilada
1 000 ml
Disolver los ingredientes en 800 ml de agua tibia. Para Vibrio spp haloflicos, agregar 15 g ms de Cloruro
de Sodio (para una concentracin final del 2%). Filtrar, enfrar a 20C y diluir a 1 litro. Distribuya en tubos.
Esterilizar en autoclaves durante 12 - 15 minutos a 121C. Ajustar el pH de 6,9 0,2.
Medio para prueba de movilidad (Semislida)
FORMULA
Peptona
10 g
Extracto de carne
3g
Cloruro de Sodio
5g
Agar
4g
Agua destilada
1 000 ml
Calentar con agitacin y hervir de 1 a 2 minutos hasta disolucin del agar. Para Vibrio spp haloflicos
agregar 15 g ms de Cloruro de Sodio (para una concentracin final del 2%). Distribuir en tubos con tapn de
rosca. Esterilizar en autoclave 15 minutos a 121C. Ajustar el pH de 7,4 0,2.
B.19.1.2 Soluciones y reactivos
Prueba de Rojo de Metilo.
Reactivo. Frmula
Rojo de metilo
0,1 g
Alcohol etlico
300 ml
Agua destilada
200 ml
Disolver el Rojo de Metilo en el alcohol y diluir con el agua destilada, para llevar a cabo la prueba, aadir 5
gotas de la solucin a 5 ml del cultivo problema.
DIARIO OFICIAL
(Segunda Seccin)
Resultados: Un color rojo demuestra un pH menor a 4,5 y la prueba es Positiva. Un color amarillo se
reporta como prueba Negativa.
Prueba de Vogues-Proskauer.
Esta prueba es para comprobar la presencia del Diacetilo.
Reactivo. Frmula
Alfa Naftol
5g
Alcohol Etlico absoluto
100 ml
Aadir 0,6 ml de la solucin de Alfa Naftol y 0,2 ml de una solucin acuosa al 40% de KOH a 1 ml de
cultivo.
Resultados: El desarrollo de una coloracin roja en 15 minutos constituye una reaccin POSITIVA.
Prueba de Oxidasa.
Reactivo
FORMULA
N,N,N,N-Tetrametil-p-Fenilendiamino
0,5 g
Agua destilada
100 ml
Conservar en frasco oscuro a 5-10C. El reactivo se conserva durante 14 das. Sembrar en un tubo de
base de gelosa para sangre. Incubar 18 horas a 35C. Agregar 0,3 ml de reactivo.
Resultado: La reaccin positiva se observa por la produccin de un color azul en un minuto.
Reaccin de Indol.
REACTIVO DE KOVAC
FORMULA
p-dimetilaminobenzaldehdo
5.0 g
Alcohol amlico.o alcohol isoamlico
750 ml
Acido clorhdrico concentrado
25 ml
Disolver el p-dimetilaminobenzaldehdo en el alcohol amlico y agregar el cido clorhdrico lentamente,

gota a gota y agitando. Debe conservarse en frasco mbar con tapn esmerilado; el color del reactivo va del
amarillo al caf claro. Se debe conservar a 4C.
B.19.1.3 Procedimiento:
Sembrar un tubo con 5 ml de caldo triptona. Incubar 48 horas a 35C. Agregar de 0,2 a 0,3 ml del reactivo.
El desarrollo de un color intenso, constituye una prueba Positiva para indol.
B.19.1.4 Toma de muestra
La toma de muestra para anlisis microbiolgicos, se deber hacer en condiciones aspticas y en
recipientes estriles.
B.19.1.4.1 Preparacin de la muestra
Las muestras de moluscos bivalvos debern analizarse en su composicin bsica de lquido y carne. Para
moluscos bivalvos desconchar de 10 a 12 piezas grandes, incluir el lquido. Verter 50 g en 450 ml de agua
peptonada alcalina (APW), lice para homogeneizar durante 2 minutos a alta velocidad. Esta es la dilucin
1:10. Colocar 250 g de esta dilucin en un segundo recipiente estril. Preparar dos series de diluciones 1:100
y 1:1000. En este momento deber tener dos series de tres diluciones. Incubar una serie a 35-37C y la otra a
42C.
B.19.1.4.1.1 Resembrar
Despus de la incubacin, y sin agitar, transferir el inculo de la pelcula (crecimiento superficial) con un
asa de 3-5 mm de dimetro a una placa por lo menos, de cada uno de los medios de cultivo selectivos: Agar
con tiosulfato, citrato, sales biliares y sacarosa (TCBS) o al agar modificado con celobiosa, polimixina B y
colistina (mCPC), la polimixina inhibe al biotipo Clsico de V. cholerae. Incubar el agar TCBS durante 18 a 24
horas de 35-37C y el agar mCPC durante 18 a 24 horas de 39-40C.
(Segunda Seccin)
DIARIO OFICIAL
B.19.1.4.2 Morfologa colonial.

Examinar las placas a fin de determinar si se presentan las caractersticas coloniales que a continuacin
se describen, seleccionar por lo menos 3 colonias sospechosas de cada placa y aplicarlas con estria cruzada
para aislar en agar T1N1 o en agar soya tripticasa con sal (al 2% de concentracin de NaCl) e incubar durante
12-18 horas a 35-37C. Es necesario hacer un cultivo en un medio no selectivo a fin de garantizar la pureza
de las colonias, antes de las pruebas bioqumicas, se puede inocular a los agares gelatina (GA) y gelatina sal
(GS) en el segundo da. Los resultados sern confiables si las placas de aislamiento muestran colonias puras.
a.- Agar TCBS. Las colonias de V. cholerae (El Tor y Clsico) son grandes, lisas, amarillas (positivas para
la fermentacin de la sacarosa) y ligeramente achatadas, con el centro opaco y los bordes translcidos.
Nota: Las especies de Vibrio no producen colonias pequeas de color crema en agar TCBS. Las colonias
de V. mimicus, que estn estrechamente relacionadas con la especie anterior, son verdes (sacarosa
negativas). La mayora de las dems especies de Vibrio crecen en agar TCBS y producen colonias amarillas y
verdes.
b.- Agar mCPC. Las colonias de V. cholerae El Tor son prpuras (negativas para la fermentacin de la
celobiosa). El V. vulnificus produce colonias amarillas achatadas, con el centro opaco y los bordes
translcidos. La mayora de las dems especies de Vibrio no crecen fcilmente en agar mCPC.
B.19.1.4.3 Diferenciacin.
Diferenciacin de los vibrios sospechosos de los microorganismos que no son vibrios.
a.- TSI, KIA y agar inclinado de Arginina y Glucosa (AGS). Inocular las colonias individuales en medios de
cultivo TSI (Agar de Triple Azcar y Hierro), KIA (Agar de Hierro Kliger) y AGS, picar y estriar en el agar
inclinado. Incubar los tubos inoculados, con el tapn no muy apretado, durante 18 a 24 horas de 35-37C. Se
recomiendan estos medios porque las reacciones permiten efectuar una diferenciacin presuntiva entre la
mayora de las especies de Vibrio, Aeromonas, Plesiomonas, Shigella y otras bacterias.
b.- Caldo triptona al 3% de NaCl (T1N3). Inocular las colonias en los caldos T1N0 y T1N3 e incubar durante
18 a 24 horas de 35-37C. El V. cholerae y el V. mimicus crecern en T1N0 y T1N3. Algunas especies de
bacterias que no son vibrios y que presentan reacciones similares a las de V. cholerae en medios de TSI y LIA
no crecen en T1N3. La mayora de las especies Vibrio spp, incluyen algunos V. cholerae No. 01, crecern en
T1N3 unicamente de la familia Vibrionaceae crece solamente en T1N3.
Una alternativa consiste en usar agar gelatina (GA) y agar gelatina con 3% de NaCl (GS) para determinar
la tolerancia de los cultivos puros a la sal. Dividir las placas en ocho sectores, inocular una lnea recta en el
centro de un sector de las placas, tanto de GA como de GS con cada cultivo puro. Incubar durante 18 a 24
horas de 35-37C. El V. cholerae y el V. mimicus crecern. El Vibrio spp haloflico crecer en ambas placas,
porque ellos no requieren de sal. Slo en la placa con GS. Para leer la reaccin de la gelatinasa sostener la
placa sobre una superficie negra, observar un halo opaco alrededor de la colonia de los microorganismos
gelatinasa positivos.
c.- Caldo glucosa de Hugh-Leifson.
Inocular colonias individuales en tubos duplicados con caldo de glucosa de Hugh-Leifson. Recubrir un tubo
con una capa de aceite mineral estril o vapor lquido (50% de petrolato y 50% de parafina) unos dos
centmetros de grueso. Incubar ambos tubos durante 18 a 24 horas de 35-37C. Las especies de Vibrio spp
utilizan la glucosa tanto para la oxidacin como para la fermentacin. Las especies de Pseudomonas, que
comnmente se aslan del pescado y los mariscos con mtodos de enriquecimiento que se usan para las
especies de Vibrio, utilizan la glucosa slo para la oxidacin.
d.- Prueba de oxidasa.
Realizar la prueba de oxidasa con cultivos puros de agar soya tripticasa (2% de NaCl) u otro medio que no
contenga carbohidratos fermentables. Un mtodo fcil consiste en colocar un crculo de papel filtro en una
caja de Petri y humedecerlo con algunas gotas de reactivo de oxidasa. Con un palito aplicador de madera, un
mondadientes o una asa de platino estril, sacar un poco de cultivo de la placa y tocar el papel humedecido, si
hay microorganismos oxidasa positivos, el papel se tornar prpura oscura o azul en pocos segundos. Las
especies patgenas de Vibrio son oxidasa positivas (excepto el V. metschnnikovii).
B.19.2 Identificacin y Confirmacin de V. cholerae 01, V.cholerae NO 01 y V. mimicus.
a.- Leer los resultados de las prueba bioqumicas de TSI, KIA, AGS, T1N0 y T1N3 o GA y GS, y caldo
glucosa de Hugh-Leifson.
b.- Hacer una tincin de Gram a un cultivo de 18 a 24 horas en caldo o agar.
DIARIO OFICIAL
(Segunda Seccin)
Nota: Los cultivos puros que se sometern a las dems pruebas serolgicas y bioqumicas para el V.
cholerae son sacarosa positivos (amarillo) en agar TCBS y sacarosa negativos (verdes) en el caso de V.
mimicus o son celobiosa negativos (verde-prpura) en agar mCPC, crecen en caldo T1N0 o en placas con GA;
presentan reacciones caractersticas en TSI, KIA y AGS. Son gelatina y oxidasa positivos, son bacilos curvos
gram negativos y producen cido a partir de la glucosa, tanto en la oxidacin como en la fermentacin, en el
caldo de cultivo de Hugh-Leifson.
c.- Pruebas bioqumicas.
Las reacciones bioqumicas para identificacin de V. cholerae y otras especies bacterianas afines figuran
en el cuadro anexo. La frmula para todos los medios bioqumicos deber contener por lo menos un 2% de
NaCl. En vez de medios convencionales se pueden usar tiras AP120E, con 2% de NaC1 como diluyente. Para
el V. cholerae se puede usar solucin salina fisiolgica (0,85% de NaC1) como diluyente.
d.- Prueba serolgica de aglutinacin.
Usar antisuero de diagnstico del grupo 01 y del subgrupo Inaba (factores AC) y Ogawa (Factores AB)
para el antgeno del serotipo 01. Usar cultivos de 16 a 24 horas producidos en TSA. Incluir cultivos positivos y
negativos, y los controles salinos para cada antisuero usado. Seguir las instrucciones del antisuero. Como es
posible que los antgenos de los antisueros estn relacionados entre s, hay que realizar pruebas bioqumicas
para confirmar que el cultivo puro sea de V. cholerae 01 o No. 01.
Nota: Anticuerpos monoclonales estn disponibles, pero el anti-B y anti-C reaccionan opuestamente con
bacterias de otras especies. Uso de anticuerpos policlonales y/o monoclonales ser para el antgeno del
complejo 01
1.- Los cultivos que aglutinan con el antisuero del grupo 01, pero no en solucin salina fisiolgica simple,
son de V. cholerae del grupo 01 si las reacciones bioqumicas confirman que el cultivo puro es de V. cholerae.
Los cultivos que se aglutinan con este antisuero para grupos especficos pueden ser clasificados segn el
subtipo con anticuerpos Inaba y Ogawa.
Los cultivos que aglutinan con el suero polivalente (grupo 01) y con los antisueros Inaba y Ogawa,
tienen los 3 factores (A, B y C) y son del serotipo Hikojima.
Los cultivos que aglutinan con el antisuero polivalente pero no aglutinan con antisueros Inaba y
Ogawa, no se pueden tipificar con estos antisueros.
2.- Los cultivos de V. cholerae cuya identidad se haya confirmado con mtodos bioqumicos y que no
aglutinen con el antisuero del grupo 01 son V. cholerae 0:1. El suero para la clasificacin de V. cholerae No
0:1 segn el tipo se puede obtener de R.J. Siebeling.
3.- Los cultivos que se aglutinan en el antisuero del grupo 01 y en solucin salina, no se pueden clasificar
segn el tipo. Sin embargo, si se usa un medio ms rico, como en TSA o agar infusin cerebro corazn (BHI),
se puede eliminar esta autoaglutinacin.
e. Caractersticas mnimas para la identificacin de V. cholerae.
Las caractersticas que permiten suponer la presencia de V. cholerae como mnimo son las siguientes:
1.- Morfologa.
Bacilo o bacilo encorvado, esporognico y gram negativo.
2.- Aspecto en TSI.
Estria cido, picadura cido, gas negativo y H2S negativo.
3.- Prueba de Hugh-Leifson.
Fermentacin de la glucosa y oxidacin positiva.
4.- Citocromo-oxidasa positivo.
5.- Prueba de la Dihidrolasa arginina: negativo.
6.- Prueba de la Lisinadescarboxilasa: positivo.
7.- Prueba de VP: Positivo El Tor, negativo Clsico y V. mimicus.
8.- Crecimiento a 42C: positivo.
9.- Prueba de halofilia con NaCl. 0% : positivo, 3% : positivo, 6%: usualmente negativo. Algunas cepas de
V. cholerae NO 01 se desarrollan a 0% de NaCl.
10.- Fermentacin de la sacarosa: positivo para V. cholerae (negativo para V. mimicus).
11.- Prueba de ONPG: positivo.
12.- Fermentacin de la arabinosa: negativo.
13.- 0/129 sensitiva: sensible para 10 y 150 g 0/129
(Segunda Seccin)
DIARIO OFICIAL
REACCIONES DE ALGUNOS Vibrio EN AGAR KIA, TSI Y AGS.

MICROORGANISMOS
KIA
TSI
AGS
ESTRIA PICADURA
ESTRIA PICADURA
ESTRIA PICADURA
V. cholerae
A(K)*
V. mimicus
K(A)*
V .parahemolyticus
V. alginolyticus
V. vulnificus
KoA
K(A)*
V. hidrophyla
KoA
KoA
V. shigelloides
KoA
KoA
* = Raramente
K = Alcalino
A = Acido
a = Ligeramente cido
N = Neutro
Ninguna de las especies de Vibrio enumeradas produce sulfuro de hidrgeno en medios KIA, TSI o AGS,
ni una cantidad perceptible de gas a partir de glucosa en medios KIA, TSI o AGS. Algunas especies de
Aeromonas pueden producir gas a partir de glucosa en estos medios.
B.20. DETERMINACION DE CLOSTRIDIUM BOTULINUM Y SUS TOXINAS EN ALIMENTOS Y
MUESTRAS CLINICAS
B.20.1 Fundamento
Demostrar la presencia de toxina botulnica por inyeccin a ratones con extractos de alimentos o muestras
clnicas y observar el efecto letal. Comprobar con el antisuero especfico la neutralizacin de la toxina. La
determinacin de C botulinum se basa en el cultivo de muestras de alimentos y clnicas en condiciones de
anaerobiosis en medios especficos y la subsecuente demostracin de la toxina.
B.20.2 Toma y manejo de muestras
B.20.2.1 Alimentos
Las muestras pueden tomarse de sobrantes de los alimentos sospechosos o de recipientes cerrados.
Cuando estn involucrados alimentos comerciales, es importante observar la etiqueta, nmero de lote del
fabricante, o cualquier dato relevante que pueda identificar el origen de la muestra.
B.20.2.2 Clnicas
Las muestras clnicas para el anlisis incluyen: materia fecal, aproximadamente 10 g, contenido gstrico
(ajustar aproximadamente a pH 6 con hidrxido de sodio 0,1) y suero (colectado de 20 ml de sangre ANTES
DE ADMINISTRAR LA ANTITOXINA). Cuando se sospecha de botulismo infantil es importante analizar las
heces. Si fuera necesario, las manchas o partes slidas de los paales.
B.20.3 Envo de muestras
B.20.3.1 Para un envo seguro, el interior de los empaques deben contener:
(I) Un primer recipiente impermeable al agua.
(II) Un segundo recipiente impermeable al agua.
(III) Material absorbente (por ejemplo unicel) entre los dos contenedores, suficiente para
absorber el contenido entero del primer recipiente.
B.20.3.2 De preferencia enviar el material en refrigeracin en paquetes que contengan recipientes con gel
congelado. Para una mxima preservacin de la toxina el recipiente secundario debe empacarse en una caja
de unicel con recipientes de gel congelado. Sin embargo, si se sospecha retraso en el envo, el material debe
congelarse y empacarse con hielo seco.
B.20.4 Material y equipo
0,1 N NaOH o NaHCO3 saturado para limpiar posibles derrames.
Flujo laminar
Propipeta o bulbo
DIARIO OFICIAL
Lentes de seguridad
Guantes de cirujano
Tubos de centrfuga de 40 ml de capacidad
Centrfuga refrigerada con capacidad de 15 000 x g
Jeringas desechables de 19 x 15.
Filtros desechables de 0,45 m.
Vortex
Licuadora
Solucin de tetraciclina al 0,2%
Potencimetro
Incubadora 30, 35C
Balanza
Equipo para tincin de Gram
Tubos de ensayo de 13 x 100 mm
Antisuero monovalente A, B, E y F
Antisuero trivalente ABE
Jeringas para tuberculina
Ratones de preferencia hembras de 20 a 30 g cepa CFI o NIH
Solucin reguladora de fosfatos con gelatina
Tripsina al 1% p/v
Tripsina al 1,4%
Medio carne cocida (CMM)
Caldo tripticasa peptona glucosa extracto de levadura (TPGY).
Caldo tripticasa peptona glucosa extracto de levadura (TPGYT) con tripsina
Agar aislamiento Clostridium botulinum (CBI)
Agar hgado de ternera yema de huevo
Agar esporulacin de Eklund
Bao de agua (75-100C)
Etanol al 50% o absoluto
Jarras y sistema de anaerobiosis
(Segunda Seccin)
B.20.5 Preparacin de medios de cultivo

B.20.5.1 Medio de la carne cocida (CMM).
FORMULA
Corazn de res
454 g
Proteosa peptona
20 g
Bactodextrosa
2g
Cloruro de sodio
5g
Extracto de corazn de res
1000 ml
Picar el corazn de res, sumergir en agua y calentar hasta ebullicin durante 1 h. Enfriar, ajustar el pH a
7,0, y hervir 10 minutos. Filtrar a travs de muselina y presionar para drenar el exceso de lquido de la carne.
Guardar la carne cocida. Agregar los ingredientes al filtrado y ajustar a pH 7,0, agregar agua hasta hacer
1000 ml. Filtrar a travs de papel filtro poroso. Se puede conservar el caldo y la carne en congelacin por
separado. Agregar el corazn cocido y picado a tubos de ensaye de 18 x 150 mm o 20 x 150 mm a una altura
de 1,2 a 2,5 cm del tubo y adicionar de 10 a 12 ml del caldo. Esterilizar en autoclave 15 minutos a 121C. Si
este medio se almacena por ms de 12 h despus de su preparacin, debe calentarse a ebullicin por 10
minutos y enfriar antes de su uso.
(Segunda Seccin)
DIARIO OFICIAL
B.20.5.2 Caldo tripticasa peptona glucosa extracto de levadura (TPGY).

FORMULA
Tripticasa
50 g
Peptona
5g
Glucosa
4g
20 g
Tioglicolato de sodio
1g
Agua destilada
1000 ml
Disolver los ingredientes en agua caliente, enfriar y ajustar a pH 7,2. Distribuir en volmenes de 2 ml en
tubos de 20 x 150 mm con tapn de rosca. Esterilizar por vapor fluente, enfriar a la temperatura y almacenar a
4C hasta 6 semanas. Si se almacena ms de 12 h tratarlos con calor como se indica en 4.5.1. Agregar 1,5 ml
de solucin de tripsina al 1,4% por cada tubo con 21 ml del medio TPGY. Mezclar muy suavemente. Este
medio no se puede almacenar.
B.20.5.3 Caldo tripticasa peptona glucosa extracto de levadura adicionado con tripsina (TPGYT).
FORMULA
Tripticasa
50 g
Peptona
5g
Glucosa
4g
20 g
Tioglicolato de sodio
1g
Agua destilada
1000 ml
Disolver los ingredientes en agua caliente, enfriar y ajustar a pH 7,2. Distribuir en volmenes de 2 ml en
tubos de 20 x 150 mm con tapn de rosca. Esterilizar por vapor fluente, enfriar a la temperatura y almacenar a
4C hasta 6 semanas. Si se almacena ms de 12 h tratarlos con calor como se indica en B.5.5.1. Agregar 1,5
ml de solucin de tripsina al 1,4% por cada tubo con 21 ml del medio TPGY. Mezclar muy suavemente. Este
medio no se puede almacenar.
B.20.5.4 Agar hgado de ternera yema de huevo.
a) Agar hgado de ternera.
FORMULA
Infusin de hgado
50 g
Infusin de ternera
500 g
Proteosa peptona
20 g
Neopeptona
1,3 g
Triptona
1,3 g
Dextrosa
5,0 g
Almidn soluble
10,0 g
Casena isoelctrica
2,0 g
Cloruro de sodio
5,0 g
Nitrato de sodio
2,0 g
Gelatina
20,0 g
Agar
15,0 g
Agua destilada
1000 ml
Calentar con agitacin constante hasta dilucin completa. Esterilizar en autoclave por 15 minutos a 121C,
pH final 7,3 + 0,2. Agregar por cada 500 ml del medio base fundido 40 ml de la suspensin salina de yema de
huevo. Mezclar y vaciar a cajas de Petri estriles de 15 x 100 mm (aproximadamente 15 - 20 ml). Secar las
placas a temperatura del laboratorio por 2 das o a 35C por 24 horas. Verificar esterilidad de las placas.
Almacenar en refrigeracin.
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(Segunda Seccin)
b) Emulsin al 50% de yema de huevo.

Lavar los huevos con un cepillo suave y dejar escurrir. Sumergirlos por 1 hora en solucin de cloruro
mercrico al 0,1%, escurrir. Sumergir en una solucin de etanol al 70% y dejar durante 30 minutos, escurrir.
Abrir los huevos en condiciones aspticas y descartar las claras. Colocar las yemas en un recipiente estril y
mezclar con igual volumen de solucin salina fisiolgica (0,85%) estril. Guardar en refrigeracin hasta su
uso.
B.20.5.5 Agar para asilamiento de C. botulinum (CBI).
El agar CBI es una modificacin del medio agar McClung Toabe para el aislamiento selectivo y diferencial
de C. botulinum, el cual puede aislarse de los cultivos toxignicos de CMM, provenientes de muestras de
heces, lquido gstrico o alimentos. El medio de agar CBI contiene: Cicloserina 250 g/ml, sulfametoxazol 76
g/ml y trimetroprim 4 g/ml en la base del medio agar McClung Toabe yema de huevo.
Agar McClung Toabe
FORMULA
Proteosa peptona
40 g
Bacto dextrosa
2g
Fosfato de sodio dibsico
1g
Fosfato de potasio monobsico
1g
Cloruro de sodio
2g
Sufato de magnesio
0,1 g
Agar
25 g
Agua destilada
1000 ml
pH final
7,6 0,2 a 25C
5g
Suspensin de yema de huevo
100 ml
SOLUCION DE ANTIBIOTICOS
Cicloserina 250 mg o 25 ml de una solucin al 0,1%
Sufametoxasol 76 mg o 4 ml de una solucin al 1,9%. Disolver el sulfametoxazol en solucin 2 N de

NaOH.
Lactato deTrimetroprim 4 mg o 4 ml de una solucin al 0,1% por cada 100 ml de medio base.
Esterilizar por filtracin.
Preparacin: Agregar el extracto de levadura y los ingredientes del agar McClug Toabe a un matraz de 2
L con 900 ml de agua destilada, mezclar y calentar hasta disolucin. Ajustar a pH 7,5. Esterilizar 15 minutos a
121C en autoclave. Enfriar a 55C en bao de agua y en condiciones aspticas agregar 100 ml de la
suspensin al 50% de yema de huevo. Agregar los volmenes necesarios para conservar la concentracin de
antibiticos por litro de medio base. Mezclar y distribuir en cajas de Petri estriles de 15 x 100 mm
aproximadamente 15-20 ml por placa. Dejar solidificar y colocar en bolsas de plstico. Guardar en
refrigeracin hasta su uso. Estas placas pueden almacenarse hasta 1 mes aproximadamente.
B.20.5.6 Agar para esporulacin de Eklund.
FORMULA
Tripticasa
4g
Peptona
1g
Glucosa
0,1 g
1g
Agar
4g
Agua destilada
200 ml
Disolver los ingredientes en agua caliente, excepto el agar, ajustar a pH 7,8, agregar el agar. Esterilizar
por vapor y enfriar a 50C. Agregar 2 ml de solucin al 10% de clorhidrato de cistena, esterilizada por
filtracin; 12 ml de emulsin de yema de huevo y 2 ml de sangre citratada de bovino o borrego. Preparar las
placas. Este medio es particularmente adecuado para la esporulacin de C. botulinum del grupo II.
(Segunda Seccin)
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B.20.6 Diluyentes y reactivos

B.20.6.1 Solucin amortiguadora de fosfatos con gelatina
FORMULA
Gelatina
2g
Na2HPO4
4g
Agua destilada
1000 ml
Ajustar a pH 6,2 con solucin de cido clorhdrico 4N. Distribuir en frascos con tapn de rosca, esterilizar
por vapor, enfriar a la temperatura ambiente y almacenar a 4C.
B.20.6.2 Solucin de tetraciclina al 0,2%.
Disolver 50 mg en 25 ml del diluyente fosfato de gelatina, mantener a 4C hasta 4 das. Si se requiere
almacenar por ms tiempo, congelar en pequeas porciones. Evitar la recongelacin.
B.20.6.3 Solucin de tripsina (1:250).
a) Solucin al 1%
Disolver 200 mg en 20 ml de agua destilada. No almacenar.
b) Solucin al 1,4%.
Disolver 280 mg en 20 ml del diluyente fosfato de gelatina, filtrar a travs de membrana de 0,45 m. Usar
vaco para obtener efecto parcial de deareacin del filtrado.
B.20.6.4 Antisueros
A, B, E; A, B; A, B, E, C*, D*, F.
Investigacin de sospecha de botulismo en animales.
B.20.7.1 Examen microscpico de los alimentos sospechosos
Este examen no es esencial para la deteccin de C. botulinum, pero facilita la seleccin de los alimentos
sospechosos para el anlisis. Preparar frotis directos y hacer tincin de Gram. Si el alimento contiene exceso
de grasa, sumergir los portaobjetos fijados al calor por 1-2 minutos en xilol antes de teir.
B.20.7.2 Preparacin del material para el anlisis de las toxinas.
B.20.7.2.1 Alimentos lquidos
Centrifugar aproximadamente 20 ml a 15000 x g durante 20 minutos. Decantar cuidadosamente el
sobrenadante o extraer con una jeringa desechable de 19 x 25 mm. Cubrir el tubo y conservar a 4C para
hacer el cultivo del sedimento posteriormente. Repetir la centrifugacin, si el sobrenadante an no est claro.
Esterilizar el sobrenadante por filtracin a travs de la membrana de 0,45
m adaptada a una jeringa
desechable. Ocasionalmente puede requerirse una prefiltracin durante el proceso de filtracin. El propsito
de la esterilizacin es prevenir una infeccin y a su vez una muerte inespecfica de los ratones inoculados.
B.20.7.2.2 Alimentos semilquidos
Colocar 10-15 g en tubos de centrfuga de 40 ml, agregar igual volumen de solucin reguladora de fosfatos
con gelatina y homogenizar en vortex.
Centrifugar y proceder como en B.20.7.2.1.
B.20.7.2.3 Alimentos slidos
Colocar 10-20 g en un vaso de licuadora o mortero. Agregar suficiente solucin reguladora de fosfatos con
gelatina para obtener cuando menos 10 ml de sobrenadante despus de la centrifugacin. La dilucin del
alimento deber estar entre 1:1 a 1:3. Licuar a velocidad alta por 1-2 minutos. Los vasos de licuadora debern
cerrarse hermticamente para prevenir la formacin de aerosoles. Centrifugar y proceder como en B.20.7.2.1,
B.20.7.2.2 y B.20.7.2.3.
B.20.7.2.4 Alimentos enlatados
Lavar y secar la superficie de la lata. Cubrir la tapa con etanol al 96%, dejar por 2 minutos; decantar y
flamear el alcohol residual. Colocar la lata en una bolsa de plstico para prevenir la dispersin de aerosoles y
abrir con un abrelatas estril. Proceder como en B.20.7.2.1, B.20.7.2.2 y B.20.7.2.3.
B.20.7.2.5 Suero
Idealmente debe obtenerse 10 ml de suero. El suero usado sirve slo antes del tratamiento con el
antisuero. Si est turbio, centrifugar a 15,000 x g durante 20 minutos, decantar el sobrenadante.
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(Segunda Seccin)
B.20.7.2.6 Heces
Colocar 10 g en un tubo de centrfuga de 40 ml de capacidad, agregar suficiente cantidad de solucin
reguladora de fosfatos con gelatina para obtener al menos 10 ml de sobrenadante despus de la
centrifugacin. Mezclar en vortex durante 2-3 minutos. Conservar la mezcla a 4C por 2 h. Homogeneizar en
vortex. Centrifugar y proceder como en 19.7.2.1. Las muestras lquidas, enemas y el contenido intestinal se
pueden centrifugar directamente con poco o sin la adicin de la solucin reguladora de fosfatos con gelatina.
Ocasionalmente, los sobrenadantes de muestras clnicas no se pueden filtrar, en estos casos, agregar 1 ml de
una solucin al 0,2% de tetraciclina por cada 9 ml del sobrenadante.
B.20.7.2.7 Contenido gstrico
Medir el pH y ajustar, si es necesario, a 5,5-6,5 con una solucin 1N de NaOH. Evitar que el valor de pH
sea mayor a 7,0. Centrifugar y proceder como en B.19.7.2.1.
B.20.7.2.8 Otras muestras clnicas.
Tratar las muestras semilquidas y slidas como en B.20.7.2.2 y B.20.7.2.3
B.20.8 Anlisis de las toxinas
B.20.8.1 Procedimiento general (se aplica cuando no se sospecha de alguna toxina en particular).
B.20.8.1.1 Si se dispone de suficiente material, distribuir el filtrado en volmenes de 1,2 ml dentro de 6
tubos de ensaye de 13 x 100 mm, marcados del 1-6. A los tubos marcados 2-5, agregar 0,12 ml de los
siguientes antisueros: monovalente A, B o E y trivalente ABE. Mezclar en vortex y dejar reposar a temperatura
ambiente por 45 minutos.
B.20.8.1.2 Al tubo 6, agregar 0,12 ml de una solucin de tripsina al 1%. Incubar a 35C por 60 minutos. El
tubo 1 no se adiciona. Ver tabla No. 2.
B.20.8.1.3 Si el volumen de material es insuficiente para completar la prueba, se puede omitir el tubo No.
6.
B.20.8.1.4 Inyectar dos ratones (20-30 g) intraperitonealmente por tubo, con los volmenes siguientes: 0,5
ml del tubo 1,0 y 0,55 ml de los tubos 2-6. Observar a los ratones por 72 h. Los sntomas tpicos de botulismo
son: pelo erizado, estrechamiento de cintura, dificultad para respirar, parlisis de los miembros posteriores y
parlisis general antes de la muerte. Si estos sntomas se presentan despus de 72 h, observar a los
animales por otras 24 h hasta completar un total de 4 das.
B.20.8.1.5 Si mueren 1 o 2 ratones repetir la inyeccin. Una muestra se considera positiva para la toxina si
2/2 o ? o = 2/4 ratones mueren, si se presenta la muerte de los animales dentro de las 2 primeras horas se
pueden considerar que son debidas a otras causas diferentes a toxina botulnica.
B.20.8.1.6 Si solamente mueren los ratones inoculados con las muestras tratadas con tripsina, indica la
presencia de toxina de grupo II y continuar como se indica en el punto B.19.8.3.
B.20.8.1.7 Si no se neutralizara la toxina con los antisueros A, B y E, indica
a) la presencia de toxinas no relacionadas en especial cuando se presentan sntomas atpicos;
b) Cantidad insuficiente de antisuero en presencia de altos niveles de toxina (difcil en caso de muestras
clnicas y en la mayora de los alimentos txicos; o
c) incluido un serotipo no comn. Si la muestra probada produce sntomas tpicos de botulismo y sin
embargo no es neutralizada con los antisueros, proceder de la forma siguiente:
I) En casos de muy alta toxicidad, diluir la muestra 1:10 con solucin amortiguadora de fosfatos
gelatina y repetir la prueba de neutralizacin.
II) Incluir el antisuero F en la prueba de neutralizacin.
B.20.8.2 Muestras sospechosas de contener toxina grupo V (A o B).
Proceder como se indica en 4.8.1 omitiendo el tubo No. 6.
B.20.8.3 Muestras sospechosas de contener toxina grupo II (B o E).
Distribuir en cada uno de los tubos marcados del 1 al 4, 1,2 ml del filtrado. A cada tubo agregar 0,12 ml de
una solucin de tripsina al 1%, incubar a 35C por 60 minutos. A los tubos marcados del 2 al 4 agregar 0,12 ml
de uno de los siguientes antisueros monovalente B o E y trivalente A, B y E. Mezclar y continuar como se
indica en 4.8.1 Inyectar 0,5 ml del tubo No. 1 y 0,6 ml de los tubos 2 al 4.
Si no hubiese material disponible suficiente, omitir los tubos con los antisueros monovalentes B y E.
B.20.8.4 Determinacin de la dosis letal en ratn (DLR)
Si se quiere titular la toxina, hacer diluciones decimales de los sobrenadantes tratados, y no tratados con
tripsina, generalmente se hacen hasta 1:1000 dependiendo del nivel de toxina esperado, pero nunca
excediendo 1:10000. Inyectar 2 ratones por dilucin. La recproca de la dilucin ms alta que causa la muerte
multiplicada por 2, es la DLR. Ejemplo: si la muerte ocurre a una dilucin de 1:100 pero no de 1:1000, el nivel
de toxina es de 200 a 2000 DLR por ml.
(Segunda Seccin)
DIARIO OFICIAL
B.20.9 Identificacin de Clostridium botulinum.

B.20.9.1 Quitar el exceso de aire disuelto en los tubos preparados con medio caldo carne cocida (CMM) y
caldo glucosa peptona tripticasa extracto de levadura (TPGY), mediante calentamiento en bao de agua a
ebullicin por 10 minutos y enfriar antes de usarlos. Asegurarse de que las tapas de los tubos estn flojas al
hacer este proceso.
B.20.9.2 Agregar a los tubos de TPGY 1,5 ml de una solucin de tripsina al 1,4% y mezclar suavemente y
marcar con una T (TPGYT). A los tubos de CMM marcarlos con 1 y 2; y 3 y 4 a los tubos con TPGYT. Ver
tabla No. 3.
B.20.9.3 Cualquier tipo de muestra incluyendo los sedimentos, pueden servir como inculo; stos adems
tienen la ventaja de que no contienen inhibidores potenciales, los cuales se han eliminado junto con el
sobrenadante, de aqu que los sedimentos pueden contener grandes cantidades de microorganismos por
unidad de volumen.
B.20.9.4 Colocar aproximadamente 1 g de inculo a cada uno de los tubos 1 a 3, calentar el tubo No. 2 en
bao de agua a 75C por 20 minutos para seleccionar esporas resistentes al calor.
B.20.9.5 Para seleccionar esporas sensibles o resistentes al calor, suspender aproximadamente 1 g del
inculo en un volumen de 10 a 20 ml de solucin de etanol al 50%, o mezclar el inculo, cuando la muestra es
lquida 1:1 con etanol absoluto o de 96%. Mantener las suspensiones o mezclas a temperatura ambiente por
60 minutos, centrifugar a 14000 x g durante 15 minutos, y pasar el sedimento al tubo No. 4.
B.20.9.6 Incubar los tubos a 35C por 24 horas y a 30C por 4 das. Centrifugar aproximadamente 10 ml
de cultivo a 15000 x g durante 20 minutos. Esterilizar el sobrenadante por filtracin a travs de membranas de
0,45 m, con ayuda de una jeringa desechable. Diluir el filtrado 1:5 con solucin amortiguadora de fosfatos
con gelatina. Continuar como se indica en B.17.6.1 para el ensayo de toxina pero omitiendo el tubo No. 6.
B.20.9.7 Si fuera necesario neutralizar con antisuero tipo F, el cual es relativamente dbil, determinar la
toxicidad y diluir con solucin amortiguadora de fosfatos de gelatina el sobrenadante a aproximadamente 10
DLR/ml. Mezclar volmenes de 1,25 ml con 0,25 ml de antisuero F. Inyectar 0,5 ml sin antisuero y 0,6 ml con
antisuero.
B.20.10 Aislamiento de Clostridium botulinum a partir de cultivos toxignicos.
B.20.10.1 El aislamiento de cepas productoras de botulismo, se facilita si se dan todas las condiciones
para la produccin de toxina. Si los cultivos de los tubos Nos. 2 o 4 son toxignicos, uno de stos debe
seleccionarse. Sembrar directamente en agar hgado de ternera yema de huevo o en agar para el aislamiento
de Clostridium botulinum (CBI), en estos medios no se ha observado un enmascaramiento por microflora
atpica. En el caso de que predominara flora atpica combinada con la presencia de algunas esporas de C.
botulinum, el inculo debe hacerse previo tratamiento con etanol. En el caso de ausencia de esporas,
reincubar los tubos de enriquecimiento o pasar al medio de esporulacin (Eklund).
B.20.10.2 Aislamiento de C. botulinum de cultivos con presencia moderada de microorganismos atpicos.
B.20.10.2.1 Hacer una tincin de Gram de los cultivos txicos. Si los cultivos 2 y 4 son txicos, pueden
excluirse los tubos 1 y 3. Seleccionar los cultivos sobre las siguientes bases:
i) Bacilos gram positivos atpicos.
ii) Nmero de bacilos gram positivos con esporas. Si en la tincin se observa un mnimo de 10% de
bacilos gram positivos, inocular una asada en agar hgado de ternera-yema de huevo y en agar CBI. Incubar
en anaerobiosis a 30C por 48 horas.
Nota: Es importante tomar en cuenta que cultivos viejos de C. botulinum pueden aparecer como Gram
negativos.
B.20.10.2.2 Seleccionar 5 colonias bien aisladas sobre el agar hgado de ternera yema de huevo que
presenten un halo opaco indicativo de lipolisis y pasarlas a caldo TPGY. Seleccionar otras 5 colonias del
medio agar para el aislamiento de C. botulinum rodeadas de un halo opaco con brillo aperlado y pasar a caldo
TPGY. Incubar a 30C durante 5 das. Hacer pruebas para determinar las toxinas como se indica en 4.6,
inocular por duplicado los cultivos toxignicos en agar hgado de ternera yema de huevo, incubar una placa en
anaerobiosis y otra en aerobiosis para asegurar pureza. Nota: Es necesario inocular un gran nmero de
colonias, debido a que C. botulinum puede enmascararse por otros clostridia que presentan caractersticas
coloniales similares.
B.20.10.3 Aislamiento de C. botulinum de cultivos con grandes cantidades de microorganismos atpicos.
B.20.10.3.1 Si en la tincin de Gram se observan bacilos gram positivos con esporas, mezclar 2 ml del
cultivo, con 2 ml de etanol al 96%, y dejar a temperatura ambiente por 60 minutos. Inocular una asada en agar
hgado de ternera yema de huevo y en agar aislamiento de C. botulinum, y continuar como se indica en
B.6.10.1.
DIARIO OFICIAL
(Segunda Seccin)
B.20.10.3.2 Si no se presenta esporulacin en el medio de enriquecimiento, reincubar por otra semana a

30C o extender 0,1 ml del cultivo en agar de esporulacin de Eklund, e incubar las placas en anaerobiosis a
30C hasta que las esporas estn presentes en cantidades significativas (generalmente se requieren de 5 a 10
das). Suspender una asada del cultivo en aproximadamente 2 ml de etanol al 50%, dejar a temperatura
ambiente por 60 minutos, e inocular en agar hgado de ternera yema de huevo y en agar CBI. Continuar como
se indica en B.20.10.1.
TABLA No. 1 ALGUNAS CARACTERISTICAS DE C. BOTULINUM GRUPOS I Y II
GRUPO CRECIMIENTO TEMPERATURA PARA CRECIMIENTO
POR ABAJO DE 10C
Y PRODUCCION DE TOXINA
I
A, B, Fb
30 - 37C
II
Bc, E, F b
26 - 30C
* Algunas cepas de los tipos A y B pueden presentar subtipos A-B, A-F. B-A. B-F, cada una produce una
toxina en mayor cantidad (representada por la primera letra del subtipo).
b No comn
c No comn en Norteamrica
TABLA No. 2 PRUEBA DE NEUTRALIZACION Y TOXICIDAD EN RATON
TUBO
NO.
VOLUMEN DE
MUESTRA (ML)
ANTISUERO
VOLUMEN DEL
ANTISUERO (ML)
VOLUMEN IUNOCULADO
(ML)
1,2
0,5
1,2
AntiA
0,12
0,55
1,2
AntiB
0,12
0,55
1,2
AntiE
0,12
0,55
1,2
Anti A, B, E
0,12
0,55
1,2
Tripsina
0,12
0,55
TABLA No 3 ENRIQUECIMIENTO
TUBO NO.
MEDIO
TRATAMIENTO
CMM
NINGUNO
CMM
CALOR
TPGYT
NINGUNO
TPGYT
ALCOHOL
B.21. DE LAS RECOMENDACIONES PARA EL TRATAMIENTO DE CONGELACION

B.21.1 Para los productos de la pesca con sospecha de contener parsitos y que se destine para ahumar
en fro debe ser sometido a un tratamiento previo, conforme a los tiempos y temperaturas que se recomiendan
a continuacin:
TEMPERATURA
TIEMPO
-20C
7 das
-35C
15 h
B.22. METODO DE PRUEBA PARA EL ANALISIS MICROBIOLOGICO DE ALIMENTOS ENVASADOS

HERMETICAMENTE. ESTERILIZADOS COMERCIALMENTE
B.22.1 Fundamento
B.22.1.1 Examen microbiolgico de latas no alteradas
Este examen tiene por objeto determinar la presencia de microorganismos viables latentes, que resistieron
el tratamiento trmico debidamente aplicado y que en determinadas circunstancias pudieran desarrollarse,
produciendo alteraciones en el alimento y representando un riesgo para el consumidor.
(Segunda Seccin)
DIARIO OFICIAL
Los envasados, aun los bien procesados, pueden contener esporas de bacilos termoflicos, las cuales son
muy resistentes al calor, pero no se desarrollan en las condiciones normales de almacenamiento y no
producen problemas de descomposicin del producto ni representan un peligro para el consumidor.
La prueba de esterilidad comercial, puede efectuarse por la observacin y anlisis del contenido del
producto, su apariencia, color, olor, pH y examen microscpico.
Estas observaciones se hacen despus de la incubacin de las latas y siempre comparndolas con otras
no incubadas.
Si es necesario efectuar el cultivo o si el producto despus de incubarse presenta cualquier cambio, ya
sea en apariencia, olor, color, pH, o bien presencia de gas o espuma, proceder como se indica en 5.1 o 5.2,
dependiendo del pH del alimento.
B.22.1.2 Examen microbiolgico de latas alteradas
Este anlisis tiene por objeto determinar el origen de la alteracin, la cual puede ser causada por
microorganismos que sobreviven al tratamiento trmico o por la introduccin de stos despus del
tratamiento, por defectos de las cerraduras o por golpes que lesionen el envase. Conociendo la naturaleza del
alimento y su tratamiento, es posible predecir el tipo de organismo responsable de la alteracin.
Numerosas investigaciones han demostrado que el tipo de alteraciones guarda relacin con el grado de
acidez del alimento procesado, por lo que stos se dividen en dos grandes grupos:
B.22.1.2.1 Alimentos de baja acidez, con pH > 4,6, entre los que se encuentran productos crnicos,
lcteos, marinos, algunos vegetales, guisados, sopas, etctera.
B.22.1.2.2 Alimentos cidos, con pH < 4, 6, entre los que se encuentran tomates, frutas, jugos de ctricos,
encurtidos, entre otros.
A continuacin se presentan las frmulas y los procedimientos para preparar los medios y reactivos
empleados en el anlisis microbiolgico de los productos envasados hermticamente y sometidos a
esterilizacin comercial. En caso de disponerse de frmulas comerciales deshidratadas equivalentes, se
deben seguir las instrucciones del fabricante.
B.22.2.1 Medios de cultivo y soluciones
B.2.2.1.1 Caldo glucosa prpura de bromocresol (CGPB)
FORMULA
Glucosa
100 g
Extracto de carne
30 g
Peptona (P. Ej. casena)
50 g
20 ml
(1
6% en etanol)
Agua destilada
1 0000 ml
pH final = 7,0 0,2

Disolver los ingredientes en el agua, ajustar el pH y envasar en tubos de 22 x 175 mm, en volmenes de
12 a 15 ml. Esterilizar en autoclave a 121 1C por 15 min.
B.21.2.1.2 Caldo de hgado picado o caldo carne cocida (CH o CCC)
FORMULA
Hgado o carne magra de res
500,0 g
Agua destilada
800,0 ml
Peptona
10,0 g
Fosfato dipotsico
1,0 g
Almidn soluble
1,0 g
pH final = 7,0 0,2

Poner el hgado o la carne picada en agua, calentar a ebullicin y dejar a fuego lento durante una hora.
Enfriar, retirar la capa de grasa, ajustar el pH y hervir otros 10 min. Filtrar a travs de gasa o manta de cielo,
presionando para quitar el exceso de lquido. Enfriar y agregar al caldo la peptona, el fosfato y el almidn
soluble. Ajustar el pH y llevar el volumen del caldo a 1 000 ml con agua destilada. Filtrar a travs de papel
filtro grueso; en este paso el caldo y la carne pueden guardarse en refrigeracin, si el medio no puede
terminarse el mismo da. Envasar en tubos de 22 x 175 mm volmenes de 10 a 12 ml de caldo y depositar
suficiente hgado o carne picada para que ocupe una altura de 1,25 cm del fondo del tubo. Esterilizar a 121
1C por 15 min.
DIARIO OFICIAL
(Segunda Seccin)
B.22.2.1.3 Caldo extracto de malta

FORMULA
Extracto de malta
6,0 g
Maltosa
1,5 g
Glucosa
6,0 g
1,0 g
Agua destilada
1 000,0 ml
pH final = 4,7 0,2

Disolver los ingredientes con agitacin constante. Ajustar el pH a 4,7 0,2, envasar en tubos de 22 x 175
mm en volmenes de 12-15 ml. Esterilizar en autoclave a 121 1C por 15 min. Exponer al calor el menor
tiempo posible.
B.22.2.1.4 Caldo cido
FORMULA
Proteosa peptona
5,0 g
5,0 g
Glucosa
5,0 g
Fosfato dipotsico
4,0 g
Agua destilada
1 000,0 ml
pH final = 5,0 0,2

Disolver los ingredientes en 1 l de agua y envasar en tubos de 22 x 175 mm en volmenes de 12 a 15 ml.
Esterilizar en autoclave a 121 1C por 15 min.
B.22.2.1.5 Agar papa dextrosa o dextrosa Sabouraud
B.22.2.1.5.1 Agar papa dextrosa
FORMULA
Infusin de papa
200,0 ml
Glucosa
20,0 g
Agar
15,0 g
Agua destilada
1 000,0 ml
pH final = 3,5
Lavar, pelar y rebanar papas de tamao mediano (250 g). Hervir durante 30 min en 290 ml de agua
destilada. Filtrar varias veces a travs de gasa y algodn. En esta infusin, disolver los dems ingredientes.
Aadir agua destilada hasta completar el volumen (1000 ml). Calentar a ebullicin, hasta la disolucin total de
los ingredientes. Ajustar el pH a 5,6 0,2. Distribuir en volmenes de 100 ml y esterilizar en autoclave a 121
1C. Enfriar a 45 - 48C y acidificar a pH 3,5 con solucin estril de cido tartrico al 10% (aproximadamente
1,4 ml de cido por cada 100 ml de medio). Una vez que se ha agregado el cido tartrico, no se vuelve a
calentar el medio.
B.22.2.1.5.2 Agar dextrosa Sabouraud
FORMULA
Polipeptona o neopeptona
10,0 g
Dextrosa
40,0 g
Agar
15,0 g
Agua destilada
1 000,0 ml
pH final = 5,6 0,2

Calentar hasta disolucin completa. Esterilizar en autoclave a 118 - 121C por 15 min, no exceder de 121
1C.
(Segunda Seccin)
DIARIO OFICIAL
B.22.2.1.6 Agar hgado de ternera

FORMULA
Infusin de hgado
50,0 g
Infusin de ternera
500,0 g
Proteosa peptona
20,0 g
Neopeptona
1,3 g
Triptona
1,3 g
Glucosa
5,0 g
Almidn soluble
10,0 g
Casena isoelctrica
5,0 g
Cloruro de sodio
5,0 g
Nitrato de sodio
2,0 g
Grenetina
20,0 g
Agar
15,0 g
Agua destilada
1 000,0 ml
pH final = 7,3 0,2

Mezclar los ingredientes con agua destilada y calentar a ebullicin hasta su disolucin total. Ajustar el pH y
esterilizar a 121 1C por 15 min.
B.22.2.1.7 Agar nutritivo
FORMULA
Extracto de carne
3,0 g
Peptona
5,0 g
Agar
15,0 g
Agua destilada
1 000,0 ml
pH final = 7,3 0,2

Suspender los ingredientes en agua destilada y disolverlos por ebullicin. Ajustar el pH. Distribuirlo en
volmenes adecuados en matraces o botellas y esterilizar a 121 1C por 15 min.
B.22.2.1.8 Solucin estril de cido tartrico al 10%
Disolver 10,0 g de Acido tartrico y llevar a 100 ml con agua destilada. Esterilizar en autoclave a 121
1C.
B.22.2.1.9 Colorante de azul de metileno
Solucin A Azul de metileno (pureza no < 90%) 0,3 g Etanol (95%) 90,0 ml
Solucin B Solucin 0,01% de hidrxido de 100,0 ml potasio
Mezclar A y B
B.22.2.1.10 Colorante de cristal violeta
Cristal violeta (pureza no < 90%) 2,0 g
Etanol (95%) 20,0 ml
Agua destilada 80,0 ml
B.22.2.1.11 Colorante de Gram
Solucin A Cristal violeta (pureza no < 90%) 2,0 g Etanol (95%) 20,0 ml
Solucin B Oxalato de amonio 0,8 g Agua destilada 80,0 ml
Mezclar solucin A y B dejar reposar 24 h al abrigo de la luz, filtrar por papel filtro grueso.
Solucin de yodo para Gram
Yodo (cristales) 1,0 g
Yoduro de potasio 2,0 g
Agua destilada 300,0 ml
DIARIO OFICIAL
(Segunda Seccin)
Mezclar el Yodo y el Yoduro de potasio en un mortero y triturar hasta fino polvo. Agregar 1 ml de agua y
mezclar, agregar 5 ml de agua y mezclar, agregar 10 ml de agua y mezclar. Vaciar esta solucin a un frasco
reactivo, lavar el mortero y el pistilo con suficiente agua hasta completar los 300 ml.
B.22.2.2 Materiales
Mecheros de Bunsen o Fischer.
Abrelatas sanitarios.
Pinzas, esptulas y cucharas.
Charolas.
Pipetas serolgicas de 10 ml con tapn de algodn.
Pipetas despuntadas o tubos de 8 mm de dimetro con tapn de algodn.
Propipeta o bulbo para pipeta.
Tubos de cultivo de 18 x 150 o de 22 x 175 mm.
Embudos grandes de tallo corto.
Portaobjetos.
Cajas de Petri estriles.
Punzn para latas.
Asa de platino o nicromel en porta-asas.
Cepillo para lavar las latas.
Toallas o gasas estriles.
Solucin de yodo al 4% (en etanol al 70%).
Sistema de anaerobiosis.
Varillas de vidrio de 20 cm de longitud y 3 mm de grueso, dobladas en ngulo recto de 5 cm en uno

de sus extremos.
Azul de metileno, cristal violeta o equipo para tincin de Gram.
Autoclave con termmetro o manmetro.
Horno para esterilizar a 180C.
Incubadoras con termmetro y termostato que evite variaciones > de 0,1C.
Potencimetro de escala expandida.
Microscopio compuesto.
B.22.4 Preparacin de las muestras

B.22.4.1 Llevar un registro en el laboratorio en donde se anoten:
B.22.4.1.1 El nmero de lote (o sealar si ste no existe o est incompleto)
B.22.4.1.2 Todos los datos importantes para la identificacin del producto que aparezcan en la etiqueta;
identificar la muestra en forma indeleble, antes de remover la etiqueta. Conservar el envase y la etiqueta.
B.22.4.1.3 Los defectos fsicos que se observen en el envase como abolladuras, golpes que lo deformen,
oxidacin, derrames, defectos aparentes de las cerraduras, abombamiento, etctera.
Segn su apariencia externa clasificarlas como sigue:
B.22.4.2 Latas
B.22.4.2.1 Latas planas o normales.
B.22.4.2.2 Abombamiento ligero (Flipper), Grado I. Unicamente uno de los extremos de la lata se
encuentra ligeramente abombado, pero puede comprimirse fcilmente.
B.22.4.2.3 Abombamiento elstico (Springer), Grado II. Uno de los extremos se encuentra abombado; al
presionarle el extremo opuesto se abulta.
B.22.4.2.4 Hinchazn (Soft swell), Grado III. Ambos extremos se encuentran abombados, pero pueden
comprimirse o ceden ligeramente a la presin.
B.22.4.2.5 Hinchazn (Hard swell), Grado IV. Ambos extremos se encuentran abombados y no pueden
comprimirse: la lata puede reventar.
(Segunda Seccin)
DIARIO OFICIAL
B.22.4.3 Frascos de vidrio

B.22.4.3.1 Tapa normal
B.22.4.3.2 Tapa abombada
B.22.4.4 Incubacin de los envases
B.22.4.4.1 Incubacin de productos en envases de apariencia normal.
La prueba ms confiable para determinar la esterilidad comercial es la incubacin del producto a
temperaturas apropiadas y por un tiempo suficiente para que cualquier microorganismo que se encuentre
pueda desarrollarse bajo las condiciones del producto envasado, dando origen a manifestaciones ya sea en el
envase o en el producto. Incubar de 30 a 35C por 10 a 14 das.
Observar diariamente los envases. La manifestacin de crecimiento es la hinchazn en diferentes grados y
en los envases de vidrio se pueden observar los cambios en el alimento o la formacin de burbujas. En
cuanto se detecte hinchazn en el producto o cualquier otra desviacin suspender la incubacin.
Al final del periodo de incubacin, abrir las latas para descubrir descomposicin cida (flat sour), por
cambios en el color, olor, consistencia y pH del alimento. Preparar extensiones, teirlas con azul de metileno o
tincin de Gram y observarlas microscpicamente. El hallazgo de cualquier anormalidad indica que el
producto no est comercialmente estril y se debe proceder como para los envases alterados.
B.22.4.4.2 Incubacin de envases sospechosos o alterados
Analizar de inmediato una o varias unidades de la muestra e incubar el resto de las latas que no presenten
alteracin evidente o con abombamiento de grado I de 30 a 35C por 10 a 14 das.
Los envases con abombamiento muy evidente no deben incubarse. Aquellas que se clasifiquen como
grado III o IV de no analizarse en el momento, debern refrigerarse.
B.22.4.5 Apertura de las latas o envases
B.22.4.5.1 Area de trabajo
Se debe trabajar preferentemente en un gabinete de flujo laminar que proporcione un ambiente ultralimpio, clase 100*
La desinfeccin de la superficie de trabajo se puede hacer con alcohol o sales cuaternarias de amonio a la
concentracin recomendada por el fabricante. Posteriormente se debe poner a trabajar el flujo, 30 min antes
de efectuar el trabajo.
Para controlar la eficacia del flujo, se deben poner como testigos cajas con medio de cultivo abiertas, a los
lados y al centro del rea de trabajo, durante todo el tiempo que dure la operacin.
Si no se tiene el equipo necesario, se puede utilizar un cuarto o cubculo perfectamente limpio, lavado con
agua y jabn, desinfectndolo con un agente bactericida apropiado. En este caso se trabajar entre dos
mecheros Bunsen.
B.22.4.5.2 Personal
El personal debe trabajar con bata limpia. Si tiene el pelo largo, debe usar turbante. El uso de mascarillas
quirrgicas es opcional. El personal enfermo con gripe o cualquier otro problema infeccioso no debe intervenir
en el anlisis.
B.22.4.6 Preparacin de latas o envases normales
Lavar el envase con un cepillo, usando agua caliente y jabn; enjuagar y dejar secar.
Remojar con un sanitizante durante 10 a 15 min, la tapa contraria a donde est grabado el lote. Escurrir el
lquido y secar con la flama de un mechero.
Destapar con un abridor de latas sanitario estril.
En las latas de cierre de anillo o dispositivos abre fcil, abrir por la cara opuesta.
* El equipo debe proveer un ambiente libre de partculas de 0,3 micras con una eficiencia del 99,99% en
un flujo de 100 pies3/min.
B.22.4.6.1 Frascos de vidrio
Lavar la tapa del frasco y sumergirlo durante 15 min en una solucin sanitizante, de manera que quede
cubierta la tapa; esta solucin puede ser cloro 100 mg/kg. Colocar un algodn estril en torno a la tapa y con
un punzn estril hacer un orificio en el centro, a fin de que se pierda el vaco y pueda abrirse con facilidad.
Abrir el frasco sin contaminar los bordes del mismo.
B.22.4.7 Preparacin de latas o envases alterados
Lavar el envase con un cepillo, con agua caliente y jabn; enjuagar y secar. Si la lata est muy inflada,
mantener en el refrigerador antes de abrirla. Limpiar y sanitizar la tapa con una solucin de cloro 100 mg/kg o
yodo al 2% en alcohol al 70%; limpiar con una gasa estril.
DIARIO OFICIAL
(Segunda Seccin)
En latas muy infladas de pH muy cido, es necesario hacer una prueba para hidrgeno, con objeto de
conocer si el gas se debe a la accin del cido sobre el metal.
Para ello, practicar una pequea puntura en el centro de la tapa y recibir el gas en un tubo de ensayo
invertido; inmediatamente ponerlo sobre la flama. Una pequea explosin indica la presencia de hidrgeno.
No debe flamearse directamente el orificio de la lata.
Para abrir latas infladas, colocar un embudo invertido con un algodn estril sobre la tapa y picar con un
picahielo estril, hasta desalojar el gas antes de abrir la lata.
Abrir la lata entre dos mecheros Bunsen o en el gabinete de flujo laminar vertical. Tomar porciones tanto
del contenido slido como del lquido; si es posible, homogeneizar. Utilizando utensilios adecuados a la
naturaleza del producto (esptulas, pinzas, tubos de vidrio, pipetas, etctera) transferir aproximadamente 2 g
o 2 ml del producto a los tubos con el medio que se va a utilizar, dependiendo del pH del alimento.
Conservar una muestra en un frasco estril, para cualquier aclaracin o para efectuar pruebas biolgicas.
Hacer una extensin en un portaobjetos del contenido de la lata, ya que muchas veces los grmenes
causantes del deterioro mueren durante el almacenamiento y slo el examen microscpico puede dar una
idea de los microorganismos involucrados en la descomposicin. Preparar las extensiones mediante una asa
de platino. Si el alimento es slido o muy espeso, agregar una pequea cantidad de agua estril. Si es muy
grasoso, depositar sobre la extensin una pequea cantidad de xilol con posterioridad a su fijacin por calor.
Una vez tomada la muestra, anotar el estado del alimento: su olor, cambios en su color, consistencia,
etctera. No debe probarse. Determinar el pH y vaciar el contenido de la lata. Observar su interior, anotando
el estado del barniz, la presencia de manchas, defectos del frasco o de la tapa, etctera.
B.22.5.1 Examen de alimentos envasados de baja acidez (pH > a 4,6)
Inocular aproximadamente 2 g o 2 ml, en cada uno de 4 tubos con caldo hgado, previamente calentado a
100C para expulsar el oxgeno disuelto, y enfriar rpidamente.
Inocular asimismo, 4 tubos de caldo prpura de bromocresol.
Incubar segn el siguiente esquema:
MEDIO DE CULTIVO
TUBOS
TEMPERATURA
TIEMPO
INVESTIGACION
Caldo hgado o CCC
35C
96 h/120 h
Mesoflicos anaerobios
Caldo hgado o CCC
55C
24 h/72 h
Termoflicos anaerobios
Caldo prpura de bromocresol
35C
96 h/120 h
Mesoflicos aerobios
Caldo prpura de bromocresol
55C
24 h/48 h
Termoflicos aerobios
Transferir los alimentos lquidos por medio de una pipeta, utilizando un bulbo o propipeta. Precaucin!
Tener ciudado al manipular el producto, incluso cuando provenga de envases aparentemente normales. La
Toxina botulnica puede estar presente! Observar los tubos diariamente, hasta el trmino del tiempo de
incubacin si no hay crecimiento en todos los tubos, descartar e informar como NEGATIVO.
Cuadro 1 DIAGRAMA DEL PROCEDIMIENTO DE CULTIVO PARA ALIMENTOS ENLATADOS DE
BAJA ACIDEZ (> 4,6).
CULTIVO ORIGINAL
CH o CCC
y
CGPB
TEMPERATURA
35C
96/120 h
SUBCULTIVO
AN o AHT
Aerbico
Crecimiento
Crecimiento
Frotis
CH o CCC
AN o AHT
Anaerbico
CH o CCC
y
CGPB
55C
24/72 h
CULTIVO PURO
Frotis
CH o CCC
AN o AHT
Aerbico
Crecimiento
Frotis
CH o CCC
IDENTIFICACION
Tincin de Gram
Anaerbico
AN o AHT
Tincin de Gram
Aerbico
AN o AHT
Tincin de Gram
Anaerbico
Crecimiento
AN o AHT
Anaerbico
CH = Caldo Hgado de Ternera AN = Agar Nutritivo

CCC = Caldo Carne Cocida AHT = Agar Hgado de Ternera
CGPB = Caldo Prpura de Bromocresol
Frotis
CH o CCC
Tincin de Gram
Aerbico
AN o AHT
(Segunda Seccin)
DIARIO OFICIAL
DIAGRAMA DEL PROCEDIMIENTO DE CULTIVO PARA ALIMENTOS ENLATADOS ACIDOS (4,6).

CULTIVO ORIGINAL
TEMPERATURA
SUBCULTIVO
AN, ADS o ADP
CA, CEM
30C
Crecimiento
Aerbico
96/120 h
CULTIVO PURO
IDENTIFICACION
Frotis
Tincin de Gram
CA, CEM
Anaerbico
Crecimiento
AN, ADS o ADP
AN, ADS o ADP
Frotis
Tincin de Gram
Anaerbico
CA, CEM
Aerbico
AN, ADS o ADP
CA
AN
55C
Crecimiento
Aerbico
24/72 h
Frotis
Tincin de Gram
CA
Anaerbico
Crecimiento
AN
AN
Frotis
Tincin de Gram
Anaerbico
CA
Aerbico
AN
CA = Caldo Acido AN = Agar Nutritivo

CEM = Caldo Extracto de Malta ADS = Agar Dextrosa Sabouraud
ADP = Agar Papa Dextrosa
Si hay crecimiento, hacer frotis y teir-resembrar a placas de agar hgado de ternera (sin yema de huevo)
o agar nutritivo. Incubar a 35C y 55C una placa en aerobiosis y anaerbico (ver cuadro 1) continuar la
incubacin a 35C de caldo de hgado (CH) o caldo carne cocida (CCC) hasta un mximo de 5 das y guardar
para determinacin de toxina (cuando proceda).
Observar los agares y seleccionar un nmero representativo de los diferentes tipos de colonias y
resembrar a CH y CCC a la temperatura y las condiciones segn se especifica en el cuadro 1 (a 35C por
96/120h y 55C por 24/72h).
Expulsar el oxgeno inmediatamente antes de utilizar el CH que se va a incubar en anaerobiosis. Mantener
viables los cultivos puros aislados. Hacer tincin de Gram.
B.22.5.1.1 Cuando se presente crecimiento microbiano durante las pruebas para esterilidad comercial en
un enlatado y no haya evidencia de descomposicin del alimento, efectuar la confirmacin de la siguiente
forma:
B.22.5.1.1.1 Obtener cultivos puros de la cepa o cepas encontradas.
B.22.5.1.1.2 Seleccionar otro envase del mismo producto y el mismo lote que el anterior.
B.22.5.1.1.3 En condiciones aspticas, practicar una pequea perforacin en el extremo de la lata o cerca
del cierre.
A.22.5.1.1.4 Inocular el producto con la cepa por abajo de la superficie.
B.22.5.1.1.5 Flamear el orificio para crear vaco y sellar aspticamente con soldadura o un material similar.
B.22.5.1.1.6 Despus de inocular, incubar a 30-35C durante 10 das.
B.22.5.1.1.7 Abrir el enlatado y examinar el producto.
El aspecto del producto debe ser igual al que se observ en el envase de donde se obtuvo el cultivo. Si en
el primer enlatado el producto fue de apariencia normal, pero se obtuvo crecimiento y en el segundo,
inoculado con la flora microbiana aislada del primero, se encuentra el producto alterado (gas, consistencia
diferente, olor, etctera), debe considerarse que el primer enlatado era comercialmente estril y que el
crecimiento fue el resultado de un procedimiento deficiente por el laboratorio. Si se encuentra flora mixta
nicamente en el CGPB, hacer informe de los tipos morfolgicos. Si hay flora mixta en CH/CCC entre la cual
se incluyan bacilos, hacer prueba toxina. Si se observan nicamente bacilos Gram positivo o Gram variable
tpicos del gnero Bacillus o Clostridium investigar presencia de esporas. En algunos casos las clulas
vegetativas envejecidas pueden dar la apariencia de Gram negativo y debe considerarse como si fuera Gram
positivo. Determinar la presencia de toxina. Esta prueba la podr realizar un laboratorio oficialmente
acreditado por las autoridades correspondientes.
DIARIO OFICIAL
(Segunda Seccin)
B.22.5.2 Examen microbiolgico de alimentos envasados de acidez alta (pH < 4,6)
Inocular 2 g o 2 ml de alimento en 4 tubos de caldo cido y 2 tubos de caldo extracto de malta.
Incubar segn el esquema:
MEDIO DE CULTIVO
TUBOS
TEMPERATURA
TIEMPO
INVESTIGACION
Caldo cido
30C
96 h
Lactobacilos, hongos y levaduras
Caldo cido
55C
48 h
Termoflicos de descomposicin cida
Caldo extracto de malta
30C
96 h
Lactobacilos, hongos y levaduras

B.22.6.1 Envases normales
Conviene extremar los cuidados al efectuar los ensayos, seleccionar las muestras e interpretar los
resultados de las pruebas para demostrar la esterilidad comercial, ya que cualquier error basado en fallas de
manipulacin o interpretacin, puede originar la destruccin de un lote comercialmente estril, como
contaminado. Al incubar el enlatado o al recibirse la lata, la presencia de hinchazn, principalmente cuando es
muy acentuada, indica contaminacin microbiana. Estas condiciones deben ser confirmadas demostrando la
presencia de un gran nmero de microorganismos en las extensiones preparadas directamente a partir del
alimento, descubriendo cambios en el aspecto del producto (consistencia, olor, coloracin anormal) o
variaciones en el pH, en comparacin siempre con un producto normal. Los cultivos se practican por
duplicado, cuando hay contaminacin, en ambos tubos se debe hallar una flora similar a la encontrada en las
extensiones de la muestra original. Encontrar slo uno de los tubos de cultivo positivo y otro negativo, puede
indicar una contaminacin por manipulacin en el laboratorio, a menos que se compruebe que existe el mismo
tipo de flora que en la extensin de la muestra original.
A veces existe alguna dificultad en diferenciar partculas del alimento de microorganismos. Otras veces las
levaduras o lactobacilos participan en la produccin del alimento, como sucede en algunos productos
obtenidos por fermentacin. En estos casos, aunque ya no sean viables, los microorganismos pueden
aparecer en la extensin, y slo la experiencia y el conocimiento de los procesos permite interpretar
correctamente los resultados.
B.A.22.6.2 Envases alterados, con pH > de 4,6
B.22.6.2.1 Presencia de mesoflicos aerobios
La flora presente en este caso, puede estar constituida por bacilos o ser mixta.
B.22.6.2.1.1 Presencia de bacilos esporulados
Generalmente consiste en esporas termorresistentes de diferentes especies de bacilos. Regularmente el
alimento no presenta alteraciones, ya que las esporas no pueden desarrollarse en condiciones de
anaerobiosis; sin embargo, se han encontrado alteraciones producidas por bacilos con esporas resistentes
(Bacillus mesentericus y Bacillus subtilis), en alimentos de acidez media, con tratamiento trmico adecuado,
pero con vaco incompleto. Tambin se ha encontrado Bacillus nigrificans, en conservas de betabeles con
ennegrecimiento del producto.
B.22.6.2.1.2 Presencia de flora mixta
La presencia de flora mixta se debe generalmente a la penetracin de grmenes, con posterioridad al
proceso trmico, actuando como vehculo el agua de enfriamiento. La flora que se observa puede ser muy
variada.
La penetracin de los grmenes se debe a defectos en las cerraduras, que permiten el paso de los
microorganismos. Las latas generalmente se encuentran infladas y pueden mostrar defectos o derrames.
El pH y el aspecto del producto varan.
B.22.6.2.2 Presencia de mesoflicos anaerobios
Consiste de anaerobios del gnero Clostridium, entre los que se encuentran C. sporogenes, C. putrificans,
C. hystoliticum, C. bifermentans, C. perfringens y C. botulinum; este ltimo es el de mayor importancia
sanitaria, por producir una toxina muy potente. Las latas pueden estar parcialmente infladas y el producto
parcialmente digerido; el olor es ptrido. El pH aumenta. En este caso, es necesario practicar la prueba en
animales, tanto del producto como del filtrado del cultivo, para investigar la presencia de la toxina. Esta prueba
la podr realizar un laboratorio oficialmente acreditado por las autoridades correspondientes.
(Segunda Seccin)
DIARIO OFICIAL
B.22.6.2.3 Presencia de termoflicos aerobios

Consta de bacilos termoflicos estrictos o facultativos, que poseen esporas muy resistentes al calor
(especie tipo B. stearothermophilus, causante de la descomposicin cida flat sour). Las latas son planas, sin
alteracin y con marcado aumento de la acidez del producto; puede haber olor anormal o enturbiamiento del
lquido.
B.22.6.2.4 Termoflicos anaerobios
Pertenecen tambin al gnero Clostridium, con esporas muy resistentes al calor.
La especie tipo C. thermosaccharolyticum, es un anaerobio estricto no productor de sulfhdrico; las latas se
encuentran infladas.
Otro tipo de descomposicin poco comn, puede ser causada por C. nigrificans, que produce sulfhdrico
con ennegrecimiento del producto.
B.22.6.3 Interpretacin de resultados en alimentos de acidez alta
B.22.6.3.1 Presencia de mesoflicos aerobios
B.22.6.3.1.1 Presencia de Lactobacillus. La descomposicin por bacterias acidricas no formadoras de
esporas, puede deberse a varias especies del gnero Lactobacillus. Se han aislado L. lycoperci, L.
pentoaceticus, L. menitipolum y L. pleofructi.
B.22.6.3.1.2 Presencia de levaduras. El hallazgo de levaduras indica falta de procesamiento. Las latas
contaminadas generalmente se presentan muy hinchadas y el olor del producto es caracterstico de levadura
(olor cido). Entre las levaduras se han aislado esporas del gnero Torula.
B.22.6.3.1.3 Presencia de hongos. Otro tipo de descomposicin puede ser causada por hongos como
Byssochlamys fulva, que forma esporas muy resistentes al calor. Se han encontrado tambin algunas cepas
de Penicillium; en estos casos generalmente las latas se encuentran planas, sin alteracin y el hongo crece en
la superficie del producto.
B.22.6.3.2 Mesoflicos anaerobios
Clostridium pasteurianum causa una descomposicin poco frecuente, en que las latas se encuentran
infladas y con olor butrico. Si se sospecha este tipo de contaminacin, sembrar un tubo con medio o caldo
cido en anaerobiosis a 35C.
B.22.6.3.3 Termoflicos aerobios
La descomposicin por termoflicos aerobios produce el tipo flat-sour, o sea la descomposicin cida. Las
latas se encuentran planas y se observan cambios en el vaco; entre los grmenes causantes est B.
coagulans, que es el responsable de la descomposicin de productos derivados del jitomate y de la
produccin de grumos de leche evaporada.
B.22.6.3.4 Termoflicos anaerobios
La descomposicin por termoflicos anaerobios es poco frecuente en productos cidos. La producen
anaerobios butricos.
En productos de acidez muy alta, con pH inferior a 3, 7, como col agria, encurtidos, etctera, la
descomposicin puede deberse a las bacterias ya sealadas, pero generalmente la acidez inhibe el desarrollo
de grmenes. En muchos casos, la hinchazn de la lata se debe a causas qumicas, por formacin de
hidrgeno.
B.22.6.4 Observaciones generales
Algunas veces se pueden encontrar cultivos negativos, procedentes de latas anormales, o de latas
normales con productos descompuestos. Esto puede deberse a que la alteracin ocurri antes del
procesamiento trmico del enlatado y han muerto los microorganismos que la originaron, o bien a que en un
producto contaminado, los grmenes murieron al agotarse el oxgeno o los nutrientes.
En estos casos, un examen microscpico del producto puede ayudar al diagnstico.
B.23. PROCEDIMIENTO AL TRASLUZ PARA LA DETECCION DE PARASITOS.
B.23.1 Para detectar los parsitos se coloca una muestra sobre una lmina acrlica de 5 mm de espesor,
de 45% de traslcidez y una fuente luminosa de 1500 lux a una distancia de 30 cm por encima de la lmina.
B.23.2 La infestacin parastica podr detectarse mediante este procedimiento al trasluz, por examen
visual.
____________________

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buenas prcticas de fabricacin

siglas en ingls de cromatografa de lquidos de alta resolucin

partes por milln

primeras entradas-primeras salidas

unidades formadoras de colonias

mayor o igual que

Jueves 10 de febrero de 2011

4.2 Cuando en la presente norma se mencione:

debe entenderse que se trata de la Ley General de Salud.

Jueves 10 de febrero de 2011

Control del Sistema PEPS.

Temperatura del rea.

Condiciones de transporte y comercializacin.

Hojas tcnicas de las sustancias.

Control de destino del producto por lotes que garantice su rastreabilidad.

Tipo de mantenimiento (preventivo o correctivo).

Lo anterior de conformidad con el trmite SSA-04-015. Conservacin de informacin sobre el proceso de

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6.15.2.1.9 Se deben llevar controles grficos de la temperatura de conservacin durante la refrigeracin de

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Jueves 10 de febrero de 2011

Pescados (en msculo)

100 mg/kg como SO2

Peces de las familias: Clupeidae, Scombridae,

7.1.3.2 Productos de la pesca procesados

LIMITE MAXIMO (mg/kg)

* Para especies de las familias Scombridae, Clupeidae, Coryphenidae, Scombresocidae y Pomatomidae.

LIMITE MAXIMO (mg/kg)

Coliformes fecales y/o E.

Vibrio cholerae O:1 y

230 NMP/100 g de carne

Moluscos cefalpodos y gasterpodos

230 NMP/100 g de carne

Dems productos de la pesca*

Jueves 10 de febrero de 2011

Moluscos bivalvos y crustceos

Todas (slo en productos preenvasados al vaco)

Termfilos anaerobios esporulados

Mesfilos anaerobios esporulados

Termfilos aerobios esporulados

Mesfilos aerobios esporulados

Ausente en todo el contenido del envase

Ausente en todo el contenido del envase

Vibrio cholerae O:1*

Jueves 10 de febrero de 2011

Vibrio cholerae O:1

Crudos o precocidos, empanizados o

< 230 NMP/g

Crudos, marinados o en salmuera