Arch Med Vet 46, 31-38 (2014)

ARTCULO ORIGINAL

Criopreservacin de espermatozoides bovinos extrados de la cola del epiddimo

utilizando los mtodos convencional y automatizado
Cryopreservation of bovine spermatozoa from the epididymal tail using conventional
and automated methods
A Ribeiro-Peresa, L Munita-Barbosab, M Yumi-Kanazawab, MI Mello-Martinsc, F Ferreira de Souzad
Facultad de Ciencias Agrarias y Veterinarias, UNESP, Jaboticabal, Brasil

Universidad de Franca, Franca, Brasil.

Departamento de Ciencias Clnicas, Universidad de Londrina, Londrina, Brasil.

Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia, Universidad Estadual Paulista, Botucatu, Brasil

SUMMARY
Cryopreservation of sperm is important to preserve the germplasm from animals of genetic value, which can die unexpectedly. This study compares
conventional and automated methods of cryopreservation of spermatozoa obtained from the epididymis of bulls post-mortem. Twenty-two epididymides
were obtained from a commercial slaughterhouse. Spermatozoa were collected from the tail of the epididymis using the retrograde flow technique. Thus, the
samples, which were diluted in 10 ml of extender without glycerol (Botubov I, Botupharma, Botucatu, SP, Brazil), were evaluated on motility, sperm vigor,
structural and functional (swelling hypoosmotic test) membrane integrity, mitochondrial activity, sperm viability and ADN fragmentation. The samples
were divided into two aliquots and diluted in extender with glycerol (Botubov II, Botupharma, Botucatu, SP, Brazil) at a concentration of 50x106 motile
sperm/0.5 French straws. One sample was frozen by the conventional method (4 hours at 5C, in a refrigerator and 20 min in nitrogen vapor) and the other
by the automated method (Cryogen Dualflex, Neovet, Uberaba, MG, Brazil). The parameters were higher in all the tests of fresh sperm samples, with the
exception of the swelling hypoosmotic test, which showed no significant difference when the results were compared with sperm frozen by the conventional
method. The average motility of fresh spermatozoa was 74%, and conventional and automated averages were 29 and 25%, respectively. Therefore, although
cryopreservation techniques reduce sperm quality parameters, the viability of the sperm is maintained, and these methods can be used to preserve sperm.
Key words: sperm, frozen-sperm, bull, epididymis.

RESUMEN
La criopreservacin de espermatozoides es importante para la preservacin del germoplasma masculino de animales de valor zootcnico que
pueden morir inesperadamente. Este estudio compara los mtodos de criopreservacin convencional y automatizado de espermatozoides colectados
de la cola del epiddimo de toros post mortem. Fueron utilizados 22 epiddimos, colectados en una planta faenadora. Los espermatozoides fueron
colectados con la tcnica de flujo retrogrado utilizando medio diluyente sin crioprotector (BotubovI, Botupharma. Botucatu, SP, Brasil), fueron
analizados en cuanto a la motilidad, vigor, integridad estructural y funcional de la membrana plasmtica, viabilidad, actividad mitocondrial e integridad
del ADN. Los espermatozoides fueron separados en dos muestras y diluidos en medio con crioprotector (BotubovII, Botupharma. Botucatu, SP,
Brasil), fueron envasados en pajillas francesas, conteniendo 50x106 espermatozoides mviles por pajilla. Las pajillas fueron congeladas por los
mtodos convencional (4 C, durante 4 horas, en nevera domstica y 20 minutos por encima de la superficie liquida conteniendo nitrgeno lquido)
y automatizado (Cryogen,Neovet, Uberaba, MG, Brasil). Las muestras de espermatozoides frescos presentaron resultados superiores en todos los
parmetros realizados comparados con los mtodos de congelacin convencional y automatizado, con excepcin de los parmetros hipoosmticos,
donde las muestras de espermatozoides frescos no tuvieron alteraciones significativas comparadas con las muestras de espermatozoides criopreservados
por el mtodo convencional. La motilidad media de espermatozoides frescos fue de 74%, y de 29 y 25% con los mtodos convencional y automatizado
respectivamente. As, aunque las tcnicas de criopreservacin reducen los parmetros de calidad espermtica, se mantiene la viabilidad de los
espermatozoides, pudiendo ser utilizada para la preservacin espermtica.
Palabras clave: espermatozoide, congelacin, bovino, epiddimo.

INTRODUCCIN
La criopreservacin de semen es una importante biotecnologa reproductiva, que busca promover la conserAceptado: 29.08.2013.
* fafesouza@fmvz.unesp.br

vacin del germoplasma masculino por tiempo indeterminado. Esta biotecnologa, cuando se asocia a la inseminacin artificial, representa un mecanismo eficiente para
la promocin y difusin de material gentico de excelente calidad. La criopreservacin de semen proporciona
una economa para el productor, al reducir los costos de
alimentacin y transporte de los reproductores, asi como
31

A Ribeiro-Peres ET AL

los riesgos de transmisin de enfermedades sexualmente

transmisibles (Castelo y col 2008).
Cuando un toro muere inesperadamente, su material
gentico se pierde. Una forma de preservar el germoplasma de estos animales es la colecta de espermatozoides del
epiddimo (Martins y col 2007). Este procedimiento post
mortem es considerado una importante herramienta en la
utilizacin de espermatozoides de animales en peligro de
extincin (Lambrechts y col 1999). Los espermatozoides
colectados del epiddimo pueden ser criopreservados o
utilizados de inmediato en la fecundacin in vitro (Martins y col 2007) o en la inyeccin intracitoplasmtica en
los ocitos (James y col 2002).
Castro y col (2009) estudiaron la viabilidad de espermatozoides de toros colectados del epiddimo, refrigerados a 4 C, 24 horas despus del sacrificio y encontraron
resultados similares al de semen eyaculado. El promedio
de la motilidad y del vigor espermtico fue 60,2% y 3,1
respectivamente. El nmero promedio de espermatozoides
colectados de la cola de los epiddimos fue de 1,7 x 109,
siendo el mnimo de 0,26 x 109 y el mximo de 4,2 x 109.
En cuanto a la morfologa se obtuvo un promedio de 68,9%
de espermatozoides normales, siendo el mnimo de 31,5%
y el mximo de 89,3%, donde la mayora de los defectos
fueron gotas citoplasmticas distales. Aunque no era el objetivo del estudio, los autores congelaron los espermatozoides obtenidos de los 4 epiddimos (2 toros), siendo que
en 2 epiddimos los espermatozoides fueron colectados a
las 6 horas y los dos restantes, a las 24 horas del sacrificio.
En este anlisis, los espermatozoides congelados 6 horas
despus del sacrificio se mantuvieron viables despus de la
descongelacin (motilidad y vigor espermtico de 50% y 3
respectivamente). Sin embargo, para los espermatozoides
colectados 24 horas despus del sacrificio los resultados
fueron inferiores, con una motilidad de 10% y vigor 1.
De esta forma la utilizacin de espermatozoides congelados, provenientes del eyaculado o del epiddimo, es indispensable para un buen programa de inseminacin artificial,
ya que la manipulacin de espermatozoides frescos o congelados otorga una viabilidad corta del material. El objetivo de
congelar clulas espermticas es la produccin de un banco
de las mismas, teniendo a disposicin un material sin plazo
de vencimiento, potencializando la eficiencia de la reproduccin animal (Amirat y col 2004). Sin embargo, el proceso
de criopreservacin resulta en la disminucin de la fertilidad
cuando se compara con semen fresco (Gonzalez 2004).
Una de las cuestiones importantes relacionadas con la
eficiencia de las tcnicas de criopreservacin es la velocidad de reduccin de la temperatura durante el congelamiento. El tipo de curva utilizada durante la congelacin
tiene influencia directa en el grado de las lesiones celulares, debido a procesos de deshidratacin y formacin de
cristales de hielo intracelulares (Moore y col 2006).
Existen bsicamente dos mtodos de congelacin de
semen, el convencional y el automatizado. En el mtodo
convencional las pajillas son acomodadas en una gradilla
32

de metal y refrigeradas a 4 C, durante 4 horas, en una

nevera domstica. Luego de este periodo, la gradilla de
metal con las pajillas, es transferida para una caja de poliestireno, conteniendo nitrgeno lquido y acomodadas
6 cm por encima de la superficie liquida durante 20 minutos. Finalmente, las pajillas son inmersas en nitrgeno
lquido y, posteriormente, almacenadas en un termo de
nitrgeno. Por el mtodo automatizado, luego del envase,
las pajillas son refrigeradas y congeladas utilizando un
equipo congelador de semen automtico con un protocolo estndar segn recomendaciones del fabricante. Luego
de la congelacin las pajillas son almacenadas en el termo de nitrgeno lquido (Vasconcelos-Filho 2010).
Generalmente, los tcnicos de campo utilizan el mtodo convencional de congelacin, utilizando materiales simples como la nevera de la propiedad, para realizar la curva
de enfriamiento, y la congelacin en la caja de poliestireno
con nitrgeno lquido. Esta tcnica ha demostrado ser viable, aunque la estandarizacin de las curvas de enfriamiento y congelacin son imprecisas, toda vez que dependen
de la calidad del material utilizado, como sellamiento de
la nevera, tamao de la caja de poliestireno y el nivel de
nitrgeno. De esta manera, se han desarrollado sistemas
electrnicos automatizados porttiles, de bajo costo para el
control de las curvas de congelacin del semen (Gonzalez
2004). La estandarizacin de la curva de enfriamiento y de
congelacin parece ser una ventaja sobre la otra tcnica,
ya que durante la tcnica manual esa estandarizacin es
difcil, ya que depende de la calidad del material utilizado y existe el riesgo de una posible falla humana; adems,
la practicidad de tener todas las etapas controladas por un
aparato constituye otra ventaja (Vasconcelos-Filho 2010).
Gonzlez (2004) no observ diferencia significativa
entre las tcnicas de congelacin de semen convencional y
la automatizada para los test de motilidad, vigor e integridad de membrana plasmtica acrosomal y mitocondrial.
Entre tanto Vasconcelos-Filho (2010) obtuvo mejores resultados despus de la crioconservacin utilizando la tcnica automatizada de congelacin para motilidad y vigor.
Considerando la importancia de la criopreservacin
de espermatozoides para la reproduccin y la escasez de
trabajos que comparan las tcnicas de criopreservacin
convencional y automatizada de clulas espermticas de
bovinos se propone evaluar los efectos del mtodo de
criopreservacin (convencional versus automatizado) sobre la viabilidad de los espermatozoides colectados del
epiddimo de toros post mortem.
MATERIAL Y MTODOS
Aspectos ticos

El estudio fue realizado de acuerdo con los criterios ticos, despus de la aprobacin del Comit de tica de la Universidad de Franca en la Utilizacin de Animales (CEUA),
bajo el nmero 026/10 el 09 de septiembre de 2010.

espermatozoide, congelacin, bovino, epiddimo

Material biolgico

Se utilizaron 11 pares de epiddimos (22 epiddimos)

de toros, colectados en la planta faenadora. Los testculos fueron colectados a travs de la seccin del cordn
espermtico, tnica vaginal y tnica albugnea. Despus,
fueron colocados en bolsas plsticas, almacenados en
una caja trmica, mantenindolos a una temperatura de
37C y trasladados por 10 minutos hasta el Laboratorio
de Reproduccin Animal.
Extraccin de espermatozoides del
epiddimo

Las piezas fueron retiradas de la caja trmica, lavadas

con solucin fisiolgica y la cola del epiddimo aislada
del testculo y del tejido conectivo adyacente. Luego, la
cola del epiddimo fue secada con una gasa estril y los
espermatozoides fueron colectados con la tcnica de flujo retrgrado (Garde y col 1994, Martinez-Pastor y col
2006). Esta tcnica consiste en pasar un catter n 20 por
el ducto deferente, el cual es conectado a una jeringa de
10 mL, conteniendo medio diluyente a base de TRISyema de huevo, sin crioprotector1. Luego, se procedi al
lavado de la cola del epiddimo, hasta que todo el contenido de la jeringa extravas la parte final del mismo; finalmente la muestra fue depositada en una placa de Petri
sobre una superficie previamente calentada.
Anlisis espermtico

Despus de la colecta, los espermatozoides fueron

analizados en cuanto a motilidad, vigor, concentracin,
integridad del ADN, integridad estructural y funcional
de la membrana plasmtica (prueba hipoosmtica), viabilidad espermtica (coloracin con eosina/nigrosina) y
actividad mitocondrial.
Para la evaluacin de motilidad y vigor, una alcuota
espermtica fue depositada sobre una lmina previamente calentada, recubierta por un cubreobjetos y observada
en un microscopio de contraste de fase2, con el objetivo
de 100X. La motilidad se caracteriz por la presencia de
movimientos rectilneos y fue dada en porcentaje (0 a
100 %). El vigor espermtico fue caracterizado de acuerdo con la intensidad de los movimientos espermticos
segn una puntuacin de 0, 1, 2, 3, 4 y 5.
La concentracin espermtica fue evaluada luego de
la dilucin de 1:20 de los espermatozoides en solucin
formol-salina. Los espermatozoides diluidos fueron colocados en la cmara de Neubauer y las clulas fueron contadas en un microscopio de contraste de fase2, con objetivo de 400X. El valor obtenido fue dado en millones/mL.

La integridad del ADN fue valorada utilizndose

la coloracin con acridine orange3, segn el mtodo de
Thuwanut y col (2008). Fueron analizadas 200 clulas,
siendo consideradas con el ADN ntegro (ADN inactivo - cinta doble) las coloreadas en verde fluorescente, en
cuanto los espermatozoides con ADN anormal (ADN desnaturalizado) estaban coloreados en un espectro que vari
de amarillo-verdoso a rojo. Los resultados fueron presentados en porcentaje de espermatozoides con ADN ntegro.
La integridad estructural de la membrana fue evaluada por la coloracin con sondas fluorescentes (diacetato
de 6-carboxifluorescena4 y yoduro de propidio5), la cual
fue realizada de acuerdo con la tcnica descrita por Harrison y Vickers (1990). Fueron contadas 200 clulas, de
las cuales fueron consideradas con la membrana ntegra,
aquellas coloreadas en verde y con la membrana lesionada, las coloreadas en rojo, o rojo y verde. Los resultados
fueron presentados en porcentaje de espermatozoides
con membrana integra (de color verde).
La integridad funcional de la membrana fue evaluada
por el parmetro hipoosmtico segn la tcnica descrita por Jeyendran y col (1984), utilizando una solucin
hipoosmtica de 150 mOsmol. Fueron contadas 200 clulas espermticas, en varios campos de la lmina, escogidos aleatoriamente, siendo considerados espermatozoides con integridad funcional de la membrana aquellos
que presentaron edema, evidenciado por el enrollamiento
de la cola. Los resultados fueron presentados en porcentaje de espermatozoides con integridad funcional de la
membrana (cola enrollada en el test).
La viabilidad espermtica fue evaluada utilizando
una solucin de eosina/nigrosina preparada segn Barth
y Oko (1989). Un frotis fue preparado con una alcuota
de 5 L de la solucin y la misma cantidad espermtica.
Despus de secar al aire, la lmina fue analizada, contndose 200 clulas en microscopio ptico2 (400X), se
consideraron clulas con la membrana lesionada aquellas
coloreadas en rosa. Los resultados fueron presentados en
porcentaje de espermatozoides viables (espermatozoides
no coloreados de rosa).
La actividad mitocondrial fue evaluada por el mtodo descrito por Hrudka (1987) y Cavalcante y col (2005).
Las lminas fueron evaluadas en microscopio de contraste
de fase2, con objetivo de 1000X. Fueron contadas 200 clulas, las cuales fueron clasificadas en cuatro categoras,
siendo categora 1- la mayora de las mitocondrias estaban activas, en las cuales la envoltura mitocondrial tenia
apariencia de un cilindro compacto y prominente; categora 2- envoltura mitocondrial fragmentada, conteniendo
Acridine Orange Base, ref. 235474, Sigma-Aldrich, Munich,
Germany

6-Carboxyfluorescein diacetate, ref. C5041, Sigma-Aldrich, Munich, Germany

Propidium iodide, ref. P4170, Sigma-Aldrich, Munich, Germany

4
1

Botubov, Botupharma. Botucatu, SP, Brasil

Bioval, L1000, China

33

A Ribeiro-Peres ET AL

segmentos activos e inactivos con predominancia de los

activos; categora 3- menos de la mitad de la envoltura
mitocondrial estaba activa, con pocas mitocondrias activas dispersas; categoras 4- envoltura completamente inactiva. El ndice de actividad mitocondrial fue encontrado
luego de la multiplicacin del nmero de espermatozoides
en cada categora, por su factor de correccin, siendo la
categora 1, multiplicada por el factor de correccin 1,0;
categora 2, factor de correccin 0,5; categora 3: factor
de correccin 0,25 y categora 4: factor de correccin 0.
Congelacin y descongelacin espermtica

Despus del anlisis, el contenido espermtico fue separado en dos muestras, que fueron destinadas a congelacin por el mtodo convencional y el automatizado. A
partir de la concentracin espermtica de la muestra colectada, la cantidad de diluyente fue calculada en ml. El
contenido espermtico fue diluido en un medio que contena aproximadamente 4% de glicerol6 en la solucin final.
Despus de la dilucin, las muestras fueron envasadas, a
temperatura ambiente de 25 C, en pajillas francesas de 0,5
ml, conteniendo 50x106 espermatozoides mviles/pajilla.
Las pajillas fueron congeladas por los mtodos convencional y automatizado. En el mtodo convencional las
pajillas fueron acomodadas en una canastilla de metal y
refrigeradas a 4 C, durante 4 horas, en nevera domstica.
Luego de este periodo, la canastilla de metal, con las pajillas, fueron transferidas para una caja de poliestireno, conteniendo nitrgeno lquido y acomodadas 6 cm por encima
de la superficie liquida, durante 20 minutos. Finalmente,
las pajillas fueron inmersas en nitrgeno lquido y, posteriormente, almacenadas en un termo de nitrgeno lquido.
Por el mtodo automatizado, luego del envase, las pajillas fueron refrigeradas utilizando un equipo congelador
de semen automtico7 y protocolo estndar para semen
bovino, segn recomendaciones del fabricante. El protocolo de este mtodo utiliza la tasa de refrigeracin lenta
de -0,25 C/minuto, temperatura de equilibrio de 5 C,
tiempo de equilibrio de 180 minutos, tasa de congelacin
lenta de -5 C/minuto y temperatura final de congelacin
de -100 C. Luego de la congelacin las pajillas fueron
almacenadas en el termo de nitrgeno lquido.
Las pajillas de ambos grupos fueron descongeladas a
37 C en bao Mara, durante 30 segundos, para evaluacin de clulas pos-congelacin.
Anlisis estadstico

Para la descripcin de los datos fueron utilizados el

promedio y la desviacin estndar de cada grupo estudiado. Todos los datos fueron evaluados para la normalidad

Botubov,Botupharma, Botucatu, SP, Brasil

Cryogen,Neovet, Uberaba, MG, Brasil

6
7

34

por el test de Shapiro-Wilk. Las variables que no pasaron

en el test de normalidad (datos no paramtricos) fueron
evaluados por el test de ANOVA on Ranks. Las variables
que pasaron el test de normalidad (datos paramtricos)
fueron evaluadas por el test One Way ANOVA. Se verific la correlacin por el mtodo de Pearson, entre la motilidad espermtica y el ndice de actividad mitocondrial
en las muestra de espermatozoides frescos y congelados
por el mtodo tradicional y automatizado. Se utiliz el
Software SigmaStat for Windows Versin 11.0. Los datos
obtenidos de cada toro y entre los toros fueron comparados, antes e despus de la congelacin espermtica. El
nivel de significancia fue considerado P < 0,05.
RESULTADOS
Las muestras de espermatozoides frescos presentaron resultados superiores (P < 0,05) en los parmetros
evaluados de motilidad, vigor, integridad del ADN, integridad estructural de la membrana plasmtica (fluorescencia), viabilidad espermtica (coloracin con eosina/
nigrosina) y actividad mitocondrial cuando comparados
a los mtodos de congelacin convencional y automatizado. Para el parmetro de integridad estructural de la
membrana plasmtica (hiposmotica) las muestras de
espermatozoides frescos no tuvieron alteraciones significativas cuando comparadas con muestras de espermatozoides congeladas por el mtodo convencional. Por otro
lado, las muestras de espermatozoides frescos tuvieron
alteraciones significativas al compararlas con el mtodo
automatizado. En todos los parmetros realizados, las
muestras de espermatozoides congelados por el mtodo
convencional y automatizado no presentaron diferencias
significativas cuando comparadas entre s (Tabla 1).
Fue verificada una correlacin positiva (r = 0,65
P = 0,03) entre el ndice de actividad mitocondrial y la
motilidad espermtica despus del descongelamiento
solo en las muestras sometidas al mtodo de congelacin
tradicional. No fue observada ninguna correlacin para
los mismos parmetros en las muestras de espermatozoides frescos o congelados por el mtodo automatizado.
DISCUSIN
La cola del epiddimo es uno de los principales lugares de almacenamiento de los espermatozoides antes de
la eyaculacin, permitiendo que estas clulas permanezcan viables y mviles por varias semanas (Reyes-Moreno
y col 2002). La cola del epiddimo es capaz de acumular un nmero suficiente de espermatozoides para varias
eyaculaciones (Sostaric y col 2008), lo que torna a este
lugar una fuente de germoplasma, aun poco explorada
comercialmente en el toro.
En bovinos, existen pocos estudios sobre la colecta,
criopreservacin y/o inseminacin artificial utilizando
espermatozoides de la cola del epiddimo (Barker 1954,

espermatozoide, congelacin, bovino, epiddimo

Tabla 1. Parmetros de calidad espermtica (media SD) en muestras colectadas del epiddimo de 11 toros antes y despus de la
congelacin por los mtodos convencional y automatizado.

Sperm quality parameters (mean SD) in samples collected from epididymides of 11 bulls before and after freezing by conventional and
automated methods.

Parmetro
Motilidad (%)
Vigor (0 a 5)
Concentracin total (x10 )
9

Espermatozoides frescos

Congelacin
convencional

Congelacin
automatizada

74,5 5,2a

29,5 14,9b

25,5 12,1b

3,5 0,5a

2,1 0,8b

2,0 0,6b

2,1 1,7

--*

--*

93,1 6,1

92,4 13,1b

77,7 10,7a

63,1 13,6b

69,2 16,4b

Integridad funcional de la membrana (%)

69,7 9,2a

60,2 10,0ab

59,6 11,4b

Viabilidad espermtica (%)

69,4 10,7a

53,9 11,8b

52,7 9,0b

Categora 1

97,6 36,9a

24,7 23,7b

32,7 32,1b

Categora 2

60,5 32,6a

139,6 21,5b

117,8 24,9c

Categora 3

24,9 16,5a

30,2 19,0a

44,7 19,7b

Categora 4

16,9 9,4a

5,5 6,5b

4,7 7,1b

ndice actividad mitocondrial

67,1 9,3a

51,0 7,9b

51,4 10,5b

Integridad del DNA (%)

99,2 0,9

Integridad estructural de la membrana (%)

Actividad mitocondrial

Valores con diferente superndice dentro de la misma fila difieren estadsticamente (P < 0,05).
*Despus del anlisis, los espermatozoides frescos fueron envasados en pajillas con una concentracin estndar de 50x106 espermatozoides mviles por
pajilla y congelados posteriormente.

Igboeli y Foote 1968, Martins y col 2007, Castro y col

2009, Martins y col 2009, Barbosa y col 2011), teniendo
en cuenta que en algunas situaciones, esta puede ser la ltima oportunidad para la preservacin de los gametos de
un toro. Sin embargo, este es el primer estudio que describi a viabilidad de las clulas espermticas colectadas
del epiddimo y congeladas con un sistema automatizado.
Utilizando la tcnica de flujo retrogrado fueron colectados, en promedio 2,1 x 109 espermatozoides/animal, lo
que corresponde a la cantidad de clulas obtenidas en una
eyaculacin (Gonalves y col 2008). Considerando que
el epiddimo es capaz de almacenar varias eyaculaciones, la cantidad colectada podra ser superior, sin embargo los toros utilizados fueron provenientes de una planta
faenadora, donde la calidad reproductiva no es un ndice
considerado. Se opt por utilizar el promedio/animal, ya
que de acuerdo con Goovaerts y col (2006) un epiddimo
no puede ser control del otro, puesto que hay diferencias
significativas en la cantidad y calidad de las clulas colectadas de los epiddimos del mismo animal.
Las muestras de espermatozoides frescos presentaron
resultados superiores en todos los parmetros realizados
cuando comparados a los mtodos de congelacin convencional y automatizado, con excepcin del parmetro
hiposmtico. En el parmetro hiposmtico las muestras
de espermatozoides obtenidas de epiddimo, congeladas
por el mtodo convencional, se comportaron de forma

similar a las muestras de espermatozoides frescos. Sin

embargo, en la tabla 1 se observa que el valor mayor para
el parmetro de integridad funcional de membrana fue
obtenido para los espermatozoides frescos, un valor intermedio para espermatozoides congelados por el mtodo
convencional y un valor menor para los espermatozoides
congelados por el mtodo automtico. Para los dems
parmetros realizados, las muestras de espermatozoides
congelados por el mtodo convencional y automatizado
no presentaron diferencias significativas cuando comparadas entre s. Resultados contrarios fueron observados
por Terraciano y col (2008), los cuales observaron mejores resultados en el mtodo de congelacin automatizado
en equinos, especialmente en los parmetros de integridad
funcional y estructural de membrana. Gonzles (2004)
tambin evalu los mtodos de congelacin de semen
bovino y no observ diferencias significativas entre los
mtodos convencional y automatizado para las pruebas
de motilidad, vigor e integridad de membrana plasmtica
acrosomal y mitocondrial. Sin embargo, fueron utilizadas
muestras de semen de eyaculado y no espermatozoides
colectados de la cola del epiddimo, siendo as nuestro
experimento el primero en evaluar los dos mtodos de
congelacin utilizando espermatozoides bovinos colectados de la cola del epiddimo. Estos autores utilizaron una
curva de refrigeracin semejante a la utilizada en el presente estudio (-0,25 C/minuto), sin embargo con una tasa
35

A Ribeiro-Peres ET AL

de congelacin ms rpida de -15,5 C/minuto. A pesar

de las diferencias del origen de las clulas espermticas
entre los dos estudios (epiddimo y eyaculacin) y de las
diferencias en la curva de refrigeracin y congelacin, la
motilidad pos-descongelacin en los mtodos convencional y automatizado fueron semejantes (aproximadamente
30%) cuando los autores utilizaron el crioprotector glicerol, siendo el mismo utilizado en el presente estudio.
Algunos parmetros espermticos evaluados en este
estudio, para los espermatozoides de epiddimo pueden
predecir la fertilidad, como fue descrito por Correa y col
(1997), que relatan una correlacin de fertilidad in vivo
con la motilidad espermtica, resultados del parmetro
hiposmtico y morfologa. Estos parmetros explican 12
a 18% de variacin cuando evaluados separadamente y
48% cuando evaluados colectivamente (Brito y col 2003).
En el presente estudio la motilidad de los espermatozoides frescos colectados del epiddimo fue elevada,
variando entre 70 a 80% lo que puede ser considerado
dentro de los lmites normales para la especie (CBRA
1998). La motilidad espermtica es fundamental para que
los espermatozoides alcancen el ambiente uterino y el sitio de la fertilizacin, considerndose el criterio ms importante en la evaluacin de las clulas espermticas antes y despus a la criopreservacin (Siqueira y col 2007).
Martins y col (2007) observaron en su experimento que
la motilidad de los espermatozoides colectados del epiddimo (n = 3) no sufrieron alteraciones significativas en
uno de los toros despus de la criopreservacin, diferente
de los resultados del presente estudio, que independientemente del mtodo de congelacin, ocurri una cada
significativa de la motilidad espermtica.
Valores inferiores a los observados en los espermatozoides frescos, entre 10 a 45% de motilidad, fueron encontrados despus de la congelacin, tanto por el mtodo
convencional, as como por el automatizado, lo que est
de acuerdo con los resultados de Gonzlez (2004) en bovinos y Rodello y col (2005) en ovinos que no observaron
diferencia significativa entre las tcnicas de congelacin.
La colecta de los espermatozoides del epiddimo puede
ser la ltima oportunidad para garantizar la preservacin
del material gentico luego de lesin o muerte del reproductor. Algunos estudios han demostrado que estos espermatozoides pueden ser usados en la inseminacin artificial
in vitro e inyeccin intra-citoplasmtica de espermatozoides con resultados satisfactorios (Barker 1954, James y
col 2002, Martins y col 2007). En el presente estudio la
motilidad de los espermatozoides, luego de ser congelados, podra ser considerada para su uso en inseminacin
(Severo 2009), siendo mayor o igual a 30 en 55% de los
toros. Adems, fue observado que la cantidad de espermatozoides obtenidos de la cola del epiddimo resultara
en una produccin media de 104 dosis por toro, con una
variacin de 29 a 320, considerando la dosis de inseminacin de 20x106 de espermatozoides mviles por pajilla.
Es importante resaltar que los testculos fueron obtenidos
36

de una planta faenadora comercial, de animales sin valor

reproductivo, demostrando as la viabilidad de la tcnica
en la utilizacin de toros con fertilidad comprobada que
puedan morir inesperadamente. Resultados semejantes
fueron obtenidos por Castro y col (2009) que estudiaron
la viabilidad de espermatozoides colectados del epiddimo
refrigerado de 15 toros y calcularon que podran ser congeladas un total de 114 dosis/toro, considerando en este
caso 30x106 espermatozoides mviles por pajilla.
Aunque una evaluacin de la fragmentacin de ADN
pueda parecer poco importante, puede haber una relacin
entre la integridad del ADN y otras funciones espermticas, como la motilidad espermtica, ya que apenas una
pequea fraccin de las protenas mitocondriales son codificadas por el ADN mitocondrial, siendo que la mayora
de los genes para estas protenas estn localizados en el
ncleo. De esta forma, las alteraciones en el ncleo son
reflejadas en la funcin mitocondrial y en el rendimiento
celular (Bereiter-Hahn y Jendrach 2010), lo que hace necesario una evaluacin completa de la clula espermtica.
El desarrollo embrionario inicial depende de la integridad
del ADN espermtico (Rodrigues-Martinez 2005), siendo
que la evaluacin de la estabilidad del material gentico
de los espermatozoides pueden proporcionar informaciones adicionales sobre la calidad de las muestras seminales. El anlisis estructural de la cromatina espermtica es
realizado para verificar la susceptibilidad del ADN a la
desnaturalizacin (Freitas-Dellaqua y col 2009). La integridad del ADN fue inferior en las muestras de espermatozoides congelados, independientemente de la tcnica
de congelacin, lo que comprueba los efectos negativos
encontrados por Baumber y col (2003) en equinos. Con
esto, los valores de la integridad del ADN, en el presente
estudio, se encuentra dentro del rango considerado normal en los bovinos para el semen eyaculado, que est en
torno de 2 a 5% de fragmentacin (Garner y col 1994).
La integridad de la membrana de las clulas espermticas es un requisito fundamental en el proceso de fertilizacin. Luego de la congelacin, los espermatozoides
obtenidos del epiddimo de toros, independiente del mtodo de congelacin, sufrieron lesiones en la membrana
espermtica, comprobadas por el test de fluorescencia
con la carboxifluorescena y yoduro de propidio. A pesar
de esto, la congelacin por el mtodo convencional fue ligeramente superior en el parmetro hipoosmtico, comparado al mtodo automatizado. La reduccin de la fertilidad del espermatozoide luego de la criopreservacin
es atribuida en gran parte a la alteracin de la funcin y
de la estructura de su membrana (Parks y Graham 1992,
Medeiros y col 2002). A pesar de esto, tales alteraciones
no son exclusivas de los espermatozoides del epiddimo y
pueden ser observadas en la misma intensidad del semen
eyaculado (Correa y Zavos 1994).
Los resultados del presente estudio indicaron que no
hubo interferencia del mtodo de criopreservacin sobre
la viabilidad espermtica, manteniendo ms del 60% de

espermatozoide, congelacin, bovino, epiddimo

clulas viables. A pesar de esto, los resultados de viabilidad fueron el doble de la mortalidad espermtica, lo que
indica que los espermatozoides del epiddimo, despus
del descongelamiento, se comportan de la misma manera
que los eyaculados (Celeghini y col 2008), en el cual los
espermatozoides inmviles aun pueden ser viables.
La reduccin de la motilidad espermtica puede estar asociada a la lesin mitocondrial, pues es necesaria
energa tanto para la motilidad como para la fertilizacin.
La mitocondria es la principal fuente de energa para el
espermatozoide por su produccin de ATP, localizndose
en torno de la pieza intermediaria para ofrecer energa y
facilitar los movimientos propulsivos del espermatozoide
(Connell y col 2002), lo que debera estar relacionado a
la motilidad espermtica.
A pesar de eso, Barbosa y Esper (1997) y Barbosa y
col (2011) no constataron correlacin entre motilidad y
actividad citoqumica mitocondrial en el semen eyaculado y en los espermatozoides del epiddimo, respectivamente. Por el contrario, Gloria y col (2011) determinaron
una correlacin positiva entre la actividad mitocondrial y
la motilidad total y progresiva del semen eyaculado, sin
embargo, ninguna correlacin fue verificada en los espermatozoides colectados del epiddimo. En este estudio, la
categora 1 predomin en las muestras de espermatozoides frescos, con modificacin para categora 2 luego de
la criopreservacin; estos hallazgos concuerdan con los
de Cavalcante y col (2005) en caprinos, as como el ndice de actividad mitocondrial, que aunque disminuy, se
mantuvo encima de 50. Tal resultado indica una disminucin de los niveles de ATP despus de la descongelacin,
la cual se correlaciona con el nmero de espermatozoides
mviles y a la viabilidad espermtica (Lindemann y Kanous 1989, Tesarik y col 1993, Januskauskas y Zilinskas
2002). Adems, no fueron observadas diferencias significativas para la actividad mitocondrial entre los mtodos
convencional y automatizado de congelacin de espermatozoides, lo que est de acuerdo con los resultados de
Gonzlez (2004) que encontr resultados semejantes en
la evaluacin de las clulas espermticas obtenidas por
eyaculacin.
A pesar de no haber sido probada la fertilidad in vivo,
la posibilidad de utilizar los espermatozoides de epiddimo es real y promisoria, ya que Barker (1954) encontr 63% de fertilidad luego de realizar una inseminacin
artificial con espermatozoides congelados obtenidos del
epiddimo de toros. Amann y Griel Jr (1974) encontraron
una tasa de fertilizacin similar entre las muestras obtenidas de la cola del epiddimo y de la eyaculacin (84%
contra 94% respectivamente).
Basado en los resultados, se concluy que aunque las
tcnicas de criopreservacin, convencional y automtica,
de espermatozoides obtenidos de la cola del epiddimo reducen significativamente todos los parmetros de calidad
espermtica evaluados, logran mantener la viabilidad de
las clulas espermticas, pudiendo ser utilizadas con gran

potencial para la preservacin de las clulas espermticas

obtenidas del epiddimo en programas de reproduccin
asistida. Adems, la criopreservacin automatizada puede
sustituir a la convencional sin producir daos a las clulas espermticas obtenidas del epiddimo, aunque se deba
considerar el mayor costo de los equipos y consumo de
nitrgeno lquido cuando esta tcnica es utilizada.
REFERENCIAS
Amann RP, LC Griel Jr. 1974. Fertility of bovine spermatozoa from rete testis, cauda epididymidis, and ejaculated
sperm. J Dairy Sci 57, 212-219.
Amirat L, D Tainturier, LT Jeanneau, C Thotin, O Grard, JL
Courtens, M Anton. 2004. Bull semen in vitro fertility
after cryopreservation using egg yok LDL: a comparison
with Optidyl a commercial egg yolk extender. Theriogenology 61, 895-907.
Barbosa RT, CR Esper. 1997. Avaliao e demonstrao da atividade citocromo C oxidase em espermatozoides bovinos.
Ars Vet 13, 218-223.
Barbosa LM, MY Kanazawa, A Peres, FF Souza. 2011. Viabilidade do smen congelado obtido do epiddimo de touros
post-mortem. Rev Bras Ci Vet 19, 190-194.
Barker CAV. 1954. Low temperature preservation of bovine
epididymal spermatozoa. Can J Comp Med 13, 390-393.
Barth AD, RJ Oko. 1989. Abnormal morphology of bovine
spermatozoa. Iowa State University Press, Ames, USA.
Baumber J, BA Ball, JJ Linfor, SA Meyers. 2003. Reactive
oxygen species and cryopreservation promote DNA fragmentation in equine spermatozoa. J Androl 24, 621-628.
Bereiter-Hahn J, M Jendrach. 2010. Mitochondrial dynamics.
Intern Rev Cell Mol Biol 284, 1-65.
Brito LFC, AD Barth, S Bilodeau-Goeseels, PL Panich, JP
Kastelic. 2003. Comparison of methods to evaluate the
plasmalemma of bovine sperm and their relationship with
in vitro fertilization rate. Theriogenology 60, 1539-1551.
Castelo TS, TR Frota, AR Silva. 2008. Consideraes sobre a criopreservao do smen de caprinos. Acta Vet Bras 2, 67-75.
Castro JB, VF Casas, FF Souza. 2009. Viabilidade dos espermatozides colhidos do epiddimo de touros 24 horas
post-mortem. Resmenes del Congresso Brasileiro de Reproduo Animal, Belo Horizonte, Brasil, Pp 379.
Cavalcante TV, CR Esper, JL Ferreira, FEF Dias, HC Azevedo,
MF Cordeiro, JAT Souza. 2005. Avaliao da atividade
mitocondrial em espermatozides ps-colheita e ps-descongelao de caprinos das raas Boer e Alpina no outono
e primavera. Arch Vet Sc 10, 89-93.
CBRA. 1998. Manual prtico para exame androlgico e avaliao de smen animal. Editora do Colgio Brasileiro de
Reproduo Animal, Belo Horizonte, Brasil, Pp 2-49.
Celeghini ECC, RP Arruda, AFC Andrade, J Nascimento, CF
Raphaela, PHM Rodrigues. 2008. Effects that bovine
sperm cryopreservation using two different extenders has
on sperm membranes and chromatin. Anim Reprod Sc
104, 119-131.
Connell MO, N Mcclure, SEM Lewis. 2002. The effects of cryopreservation on sperm morphology, motility and mitochondrial function. Hum Reprod 17, 704-709.
Correa JR, PM Zavos. 1994. The hypoosmotic swelling test: Its

37

A Ribeiro-Peres ET AL

employment as an assay to evaluate the functional integrity of the frozen-thawed bovine sperm membrane. Theriogenology 42, 351-360.
Correa JR, MM Pace, PM Zavos. 1997. Relationships among
frozen-thawed sperm characteristics accessed via the routine semen analysis, sperm functional tests and fertility of
bulls in an artificial insemination program. Theriogenology 48, 721-731.
Freitas-Dellaqua CPF, AM Crespilho, FO Papa, JA Dellaaqua
Jr. 2009. Metodologia de avaliao laboratorial do smen
congelado bovino. Rev Bras Reprod Anim 33, 213-222.
Garde J, M Aguado, S Prez, D Garrido, M Prez-Guzmn, V Montoro. 1994. Physiological characteristics of epididymal spermatozoa from post-mortem rams. Theriogenology 41, 203.
Garner DL, LA Johnson, ST Yue, BL Roth, RP Haungland.
1994. Dual DNA staining assessment of bovine sperm
viability using SYBR-14 and propidium iodide. J Androl
15, 620-629.
Gloria A, A Contri, I de Amicis, D Robbe, A Carluccio. 2011.
Differences between epididymal and ejaculated sperm
characteristics in donkey. Anim Reprod Sci 128, 117-122.
Gonalves PBD, JR Figueiredo, VJ Freitas. 2008. Biotcnicas
aplicadas reproduo animal. 2nd ed. Editora Roca, So
Paulo, Brasil.
Gonzalez RA. 2004. Efeito da criopreservao usando diferentes tcnicas de congelao e crioprotetores sobre parmetros espermticos e a integridade de membrana dos espermatozoides bovino. Tesis doctoral, Faculdade de Medicina Veterinria e Zootecnia, Universidade de So Paulo,
Pirassununga, Brasil.
Goovaerts IGF, GG Hoflack, A Van Soom, J Dewulf, M Nichi,
A de Kruif, PEJ Bols. 2006. Evaluation of epididymal semen quality using the Hamilton-Thorne analyser indicates variation between the two caudae epididymides of the
same bull. Theriogenology 66, 323-330.
Harrison RAP, SE Vickers. 1990. Use of fluorescent probes to
assess membrane integrity in mammalian spermatozoa. J
Reprod Fert 88, 343-352.
Hrudka F. 1987. Cytochemical and ultracytochemical demonstratation of cytochrome c oxidase in spermatozoa and dynamics of its changes accompanying ageing or induced by
stress. Int J Androl 19, 809-828.
Igboeli G, RH Foote. 1968. Maturation changes in bull epididymal spermatozoa. J Dairy Sci 51, 1703-1705.
James AN, H Green, S Hoffman, AM Landry, D Paccamonti,
RA Godke. 2002. Preservation of equine sperm stores in
the epididymis at 4C for 24, 28, 72 and 96 hours. Theriogenology 58, 401-404.
Januskauskas A, H Zilinskas. 2002. Bull semen evaluation
post-thaw and relation of semen characteristics to bulls
fertility. Vet Zootec 17, 1-8.
Jeyendran RS, HH Vanderven, M Perez-Pelaez, BG Crabo, LJD
Zaneveld. 1984. Development of an assay to assess the
functional integrity of the human sperm membrane and
its relationship to other semen characteristics. J Reprod
Fertil 47, 219-228.
Lambrechts H, F Van Niekerk, W Coetzer, S Cloete, HG Vander.
1999. The effect of cryopreservation on the survivability,
viability and motility of epididymal African buffalo (Synceruscaffer) spermatozoa. Theriogenology 52, 1241-1249.
Lindemann CB, KS Kanous. 1989. Regulation of mammalian

38

sperm motility. Arch Andrology 23, 1-22.

Martinez-Pastor F, V Garcia-Macias, M Alvarez, C Chamorro,
P Herraez, P Paz, L Anel. 2006. Comparison of methods
for obtaining spermatozoa from the cauda epididymis of
Iberian red deer. Theriogenology 65, 471-485.
Martins CF, R Rumpf, DC Pereira, MN Dode. 2007. Cryopreservation of epididymal bovine spermatozoa from dead
animals and its uses in vitro embryo production. Anim
Reprod Sci 101, 326-331.
Martins CF, K Driessen, P Melo Costa, JO Carvalho-Neto, RV
de Sousa, R Rumpf, MN Dode. 2009. Recovery, cryopreservation and fertilization potential of bovine spermatozoa obtained from epididymides stored at 5 C by different periods of time. Anim Reprod Sci 116, 50-57.
Medeiros CMO, C Forell, ATD Oliveira, JL Rodrigues. 2002.
Current status of sperm cryopreservation: why isnt it better? Theriogenology 57, 327-344.
Moore AI, EL Squires, JE Bruemmer, JK Graham. 2006. Effect
of cooling rate and cryoprotectant on the cryosurvival of
equine spermatozoa. J Equine Vet Sc 26, 215-218.
Parks JE, JK Grahan. 1992. Effects of cryopreservation procedures on sperm membranes. Theriogenology 8, 299-312.
Reyes-Moreno C, M Boilard, R Sullivan, M Sirar. 2002. Characterization and identification of epididymal factors that
protect ejaculated bovine sperm during in vitro storage.
Biol Reprod 66, 159-166.
Rodello L, HC Azevedo, SD Bicudo, MS Maia, DB Sousa, CC
Sicherle. 2005. Comparao entre sistemas automatizado
e geladeira/vapor de nitrognio lquido na criopreservao
de smen ovino. Resmenes del Congresso Brasileiro de
Reproduo Animal, Goinia, Brasil.
Rodriguez-Martinez H. 2005. Methods for semen evaluation
and their relationship to fertility. Resmenes del Congresso Brasileiro de Reproduo Animal, Goinia, Brasil.
Severo NC. 2009. Influncia da qualidade do smen bovino
congelado sobre a fertilidade. A Hora Veterinria 28, 167.
Siqueira JB, JD Guimares, EP Costa, M Henry, CAA Torres,
MVGB Silva. 2007. Relao da taxa de gestao com smen bovino congelado e testes de avaliao espermtica
in vivo. Rev Bras Zootec 36, 387-395.
Sostaric E, M Alberts, BM Gadella, TAE Stout. 2008. The roles of the epididymis and prostasomes in the attainment
of fertilizing capacity by stallion sperm. Anim Reprod Sci
107, 237-248.
Terraciano PB, IC Bustamante-Filho, LV Miquelito, TR Arlas,
FCRC Mattos, EP Passos, ER Oberst, EOC Lima. 2008.
Criopreservao de espermatozides eqinos comparando
duas curvas de congelamento combinadas com diluentes
comerciais: uma anlise laboratorial. Cinc Rural 38,
1972-1977.
Tesarik J, C Mendoza, A Carreras. 1993. Fast acrosome reaction
measure a highly sensitive method for evaluating stimulus-induced acrosome reaction. Fertil Steril 53, 424-430.
Thuwanut P, K Chatdarong, M Techakumphu, E Axner. 2008.
The effect of antioxidants on motility, viability, acrosome
integrity and DNA integrity of frozen-thawed epididymal
cat spermatozoa. Theriogenology 70, 233-240.
Vasconcelos-Filho WF. 2010. Eficincia da congelao automatizada na viabilidade de smen bovino. 2010. Tesis
mster, Instituto de Zootecnia, Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro, Seropdica, Brasil.