REVISIN

BIOLOGA MOLECULAR EN MICOLOGA MDICA

M. en C. Enrique Salas Tllez,*
Dr. Roberto Arenas**

M. en C. Enrique Salas Tllez, Dr. Roberto Arenas. Molecular Biology in Medical Mycology.
Biologa Molecular en Micologa Mdica. Derm.
Venez, 2001, 39: 07-10

RESUMEN ABSTRACT
Se hace una breve revisin de las tcnicas usadas en We present a brief review of the molecular techniques
biologa molecular para el estudio de los hongos en used in medical mycology. The genetic techniques used
micologa mdica. for the identification of genera and species of fungi in-
Las tcnicas genticas utilizadas en la identificacin de elude: the (RFLP) Restriction Fragment Length
especies y gneros de hongos, incluyen el Polimorfismo Polymorphism of the DNAmt, the (PCR), Polymerase
en la longitud de los fragmentos de restriccin (RFLP, Chain Reaction), The PCR-RFLP, PCR-SSCP, the
Restriction Fragment Length Polymorphism) del (RAPD) Random Amplified Polymorphic DNA. Also in
ADNmt, la Reaccin en Cadena de la Polimerasa (PCR, combination with other methods such as electrophoresis
Polymerase Chain Reaction), el anlisis del in agarose gel and the Southern and Northern Blot
polimorfismo en la longitud de los fragmentos de Techniques.
restriccin de regiones amplificadas por PCR (PCR-
RFLP), el anlisis del polimorfismo en la conformacin
de las cadenas sencillas de ADN amplificado por PCR
(PCR-SSCP), o el anlisis de polimorfismo del ADN
amplificado con cebadores arbitrarios (RAPD, Random
Amplified Polymorphic DNA). En combinacin con otros
mtodos como la electroforesis en geles de agarosa y
la transferencia a membranas de ADN (Southern Blot) o
la de ARN (Northern Blot).

Palabras clave: Biologa Molecular, Hongos, Micologa Key words: Fungi, Medical Mycology, Molecular
Mdica Biology.

INTRODUCCIN nos humanos en cultivos era frecuentemente peligroso y

se careca de las condiciones ptimas de aislamiento. Es
Por muchas dcadas la Micologa Mdica fue rea de as, que los avances tecnolgicos en micologa mdica se
limitada investigacin, debido en parte a que slo han relacionado con la ultramicroscopia, as como con
ocasionalmente hongos patgenos producen instrumentos que permitan precisar las caractersticas
enfermedades serias y de amplia distribucin en inmunolgicas y bioqumicas de los hongos.2.8
comparacin por ejemplo con bacterias, parsitos o virus. En la actualidad muchos de los inconvenientes antes
As como, el gran polimorfismo entre especies fngicas y mencionados ya han sido superados, quedando en claro
adems que el manejo de patge- que las infecciones sistmicas fungales son comunes y
no raras, y que su estudio es una necesidad imperiosa .12
El rpido incremento de las tcnicas moleculares ha
* Acadmico Acadmico Facultad de Estudios Superiores Cuautitln,
tenido influencia en el estudio de problemas de micologa
U.N.A.M. Ctedra de Inmunodiagnstico de Enfermedades Micticas mdica. Los anlisis genticos han sido de gran
y Bacterianas. provecho, y su aplicacin en microorganismos patgenos
** Jefe de la Seccin de Micologa. Departamento de Dermatologa. permite nue-
Hospital General Dr. Manuel Gea Gonzlez.
Direccin: Av. 1 de Mayo s/n, Campo 1 Colonia Atlanta, Cuautitln
Izcalli C.P. 54720.

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vas ideas sobre el conocimiento biolgico de los se originan gracias a la actividad de las enzimas
mismos. Sin embargo, la importancia de la aplicacin de endonucleasas de restriccin. Cuanto menor sea el
estas tcnicas ha trascendido a otros campos del tamao de la secuencia nucleotdica, mayor ser el
conocimiento de la Micologa Mdica. nmero de fragmentos que se generen. Las
Como la mayora de los hongos patgenos son endonucleasas de restriccin se denominan con tres o
Deuteromycetes y presentan caractersticas cuatro letras que proceden del nombre de la bacteria en
ambientales cambiantes, el uso de tcnicas moleculares la que se han aislado (por ejemplo, la enzima Eco
permite estudiar caractersticas estables y no procede de Escherichia coli) y adems se le aade un
modificables por el ambiente, como ADN del gen y el nmero romano (Eco Rl, Eco Rll, Eco 47111), debido a
ARN molecular. La mejor caracterstica para discriminar que se pueden encontrar varias enzimas de restriccin
individuos, cepas, especies, gneros y familias deber diferentes, que reconocen distintas secuencias
ser en el futuro cercano, la secuencia de nucletidos de nucleotdicas, en la misma bacteria. Los fragmentos se
molculas de ADN que llevan la informacin gentica, e pueden separar mediante electroforesis en gel de
indican la distancia gentica entre las mismas. Sin agarosa, obtenindose perfiles de restriccin
embargo, aunque estas tcnicas se han desarrollado en caractersticos. Los perfiles dependern de la enzima de
un tiempo relativamente corto y en ocasiones son restriccin empleada as como del ADN utilizado (ADNn
fundamentales en el diagnstico, es dudoso que puedan o ADNmt), aunque el ms empleado es el ADN mt. La
suplir por completo los mtodos morfolgicos tradiciona- comparacin entre los perfiles permitir diferenciar
les. 4,8,13 varias especies entre s o incluso poblaciones dentro de
Las tcnicas genticas utilizadas en la identificacin una misma especie. 8,11,14
de especies y gneros de Hongos, incluyen el
Polimorfismo en la longitud de los fragmentos de Reaccin en cadena de la polimerasa (PCR). El
restriccin (RFLP, Restriction Fragment Length gran xito obtenido a mediados de los 80 por Kary
Polymorphism) del ADNmt, la Reaccin en Cadena de Mullis consisti en lograr in vitro un gran nmero de
la Polimerasa (PCR, Polymerase Chain Reaction), el copias de fragmentos especficos de ADN, basndose
anlisis del polimorfismo en la longitud de los en un principio muy sencillo: la utilizacin de
fragmentos de restriccin de regiones amplificadas por mecanismos similares a los empleados or la propia
PCR (PCR-RFLP), el anlisis del polimorfismo en la clula en la replicacin del ADN durante la ivisin
conformacin de las cadenas sencillas de ADN celular. La reaccin en cadena de la polimerasa onsiste
amplificado por PCR (PCR-SSCP), o el anlisis de en la repeticin cclica de tres etapas:
polimorfismo del ADN amplificado con cebadores 1) Desnaturalizacin del ADN bicatenario presente en
arbitrarios (RAPD, Random Amplified Polymorphic la muestra para separar las dos cadenas, mediante
DNA). En combinacin con otros mtodos como la la aplicacin de temperaturas superiores a 90C.
electroforesis en geles de agarosa y la transferencia a 2) Unin especfica de los cebadores (oligonucletidos
membranas de ADN (Southern Blot) o la de ARN sintticos) a las cadenas sencillas mediante
(Northern Blot), se ha llegado a desarrollar herramientas complementariedad de bases. La temperatura a la
de gran utilidad tanto para estudios genticos, que se realiza esta unin (Ta, Annealing
filogenticos, epidemiolgicos y diagnsticos de los temperature) es muy importante para controlar la
hongos patgenos involucrados en las infecciones especificidad de la reaccin. La Ta depende de la
micticas. composicin de bases y del tamao de los
cebadores que se unen cada uno a una cadena
Hibridacin.- Las molculas de ADN o ARN sinttico diferente delimitando la secuencia de nucletidos
son muy empleadas como "sondas" en Ingeniera que se pretende amplificar. La seleccin de dichos
gentica, para detectar, va hibridacin del cido cebadores constituye uno de los puntos ms crticos
nucleico, las secuencias especficas de ADN o ARN. El del ensayo de PCR, y
procedimiento general es marcar el cido nucleico 3) Extensin de la cadena de ADN a copiar a partir de
sonda, generalmente con fosfato radioactivo y dejar que los cebadores, utilizando los nucletidos presentes
la sonda de cadena sencilla hibride con c. nucleico en la solucin. Dicha extensin la lleva a cabo la
monocatenario derivado del ADN clonado. Por enzima ADN polimerasa, que inicia su actividad tras
apareamiento especfico de bases complementarias, reconocer la unin de los cebadores a las cadenas
dos polinucleotidos de cadena sencilla solamente se de la muestra. La polimerasa empleada
hibridarn si son totalmente complementarias.4,10,11 inicialmente, procedente de Escherichia coli, se
desnaturalizaba cuando se someta a temperaturas
Polimorfismo en la longitud de los fragmentos de superiores a 90C durante la primera etapa de cada
restriccin (RFLP).- Esta tcnica permite diferenciar ciclo y por lo tanto, habla que reponerla al inicio de
distintos microorganismos mediante el anlisis de cada fase de extensin. En la actualidad, sin
patrones de bandas, derivados de la ruptura de sus embargo, se utilizan enzimas termoestables como la
respectivos ADNs. Estos patrones, conocidos como Taq polimerasa, procedente del microorganismo
perfiles de restriccin del ADN, termfilo Thermus aquaticus. La cantidad de copias
de la secuen-

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 cia de ADN delimitado por los cebadores se obtenidos mediante RAPD pueden permitir la diferencia-
incrementa exponencialmente, debido a que las cin de los ADNs a nivel de especie, o incluso a nivel de
nuevas copias tambin sirven como patrones en los individuo .3,11,12
subsiguientes ciclos.
Las aplicaciones directas de las tcnicas de biologa
La tcnica de PCR presenta sin embargo una
molecular se pueden observar en los siguientes
limitacin: es necesario conocer parte de la secuencia
ejemplos:
que se quiere amplificar, al menos aquellas zonas en
a) Sondas de ADN se han desarrollado para
las que se van a unir los cebadores .4,11,14
Histoplasma capsulatum, Coccidiodes immitis,
Cryptococcus neoformans, Blastomyces
Anlisis del polimorfismo en la longitud de los
dermatitidis,10,12 Sacharomyces, Candida albicans,
fragmentos d restriccin de regiones amplificadas
Candida krusei, Candida lusitaniae, Pneumocystis
por PCR (PCRRFLP). La tcnica de PCR-RFLP consiste
carin, Aspergillus/Penicillium spp, Candida
en el uso combinado de la tcnica de RFLP, explicada
glabrata/Saccharomyces cereviseae
anteriormente y la tcnica de PCR. De esta manera, se
b) La tcnica de PCR se ha desarrollado en Candida12
amplifican fragmentos de ADN especficos mediante PCR
y posteriormente se tratan con enzimas de restriccin, Pneumocystis carin, especies de Aspergillus,',10
que los cortan en trozos ms pequeos. Diferencias en la Trichoderma,6 Pseudallescheria/Scedosporium,15
secuencia nucleotdica entre las especies estudiadas, Cryptococcus neoformans variedad neoformans y
darn lugar a fragmentos de diferentes tamaos que se gatt as como sus cuatro serotipos,1,10 Mucor,
examinarn mediante electroforesis. Los perfiles de ADN Sporothrix, Aspergillus nger y A. flavus.11
obtenidos tras la electroforesis son ms sencillos de c) La de RFLP se a establecido para el gnero
interpretar, puesto que hay un menor nmero de bandas Fonsecae' y para las especies de Candida (C.
y una pequea cantidad de ADN es suficiente para llevar Tropicalis, C. Parapsilopsis, C. Lusitaniae, C. Krusei
a cabo el anlisis, ya que se obtiene un gran nmero de y C. Glabrata).
copias tras su amplificacin por PCR. Esto reduce d) La tcnica de RAPD esta descrita en el gnero
significativamente la cantidad de muestra necesaria.8,11,14 Candida y Malassezia en sus diferentes especies; y
se ha descrito en varios hongos entre ellos
Anlisis del polimorfismo en la conformacin de las Aspergillus fumigatus.10,11
cadenas sencillas de ADN de regiones amplificadas
por PCR (PCR-SSCP). Esta tcnica se basa en la
relacin entre la movilidad electrofortica de una hebra BIBLIOGRAFA
de ADN monocatenario (ADNmc) y su conformacin, que
en definitiva es un reflejo de su secuencia nucleotdica. 1. Attili D, de Hoog GS and Pizzirani KA. RDNA-RFLP and ITS1 se-
En esta tcnica el ADN bicatenario (ADNbc) se quencing of species of the genus Fonsecaea, agents of
Chromoblastomycosis. Medical Mycology 1998, 36: 213-217.
desnaturaliza a ADNmc y posteriormente se separan dos
hebras mediante electroforesis en gel de poliacrilamida, 2. Beneke ES and Rogers AL. Medical Mycology and Human
bajo condiciones no desnaturalizantes. Cualquier Mycosis. California, Star Publishers. 1996: 27-45.
diferencia en la secuencia del ADN dar lugar a un
cambio de movilidad de las molculas de ADNmc, que se 3. Boekhout T, Kamp M and Guhot E. Molecular typing
ofMalassezia species with PFGE and RAPD. Medical Mycology
visualizar al final del proceso .4,11 1998,36:429432.

Anlisis del polimorfismo del ADN amplificado con 4. Brock TI) and Madigan MT. Microbiologia. Sexta edicin, Mxico
cebadores arbitrarios (RAPD). La tcnica de RAPD Prentice may- Hispanoamericana 1993: 142-191; 298-326.
denominada tambin por otros autores AP-PCR
5. Hanana R, Fensterle J, Nussei P, et al. PCR Based quantification
(Arbitrarily Primed PCR) o DAF (DNA Amplification of Pneumocystis carin in in vitro system. Microbes Infect., 2000,2:
Fingerprinting) se basa en la amplificacin simultnea de 737-743.
mltiples fragmentos de ADN nuclear mediante PCR,
utilizando para ello un nico cebador, normalmente de 6. Kuhls K, Lieckfeldt E, Bornk T et al. Molecular reidentification of
human pathogenic Trichoderma isolates as Trichoderma
915 bases, cuya secuencia se elige al azar. Las longibrachiatum and Trichoderma citrinoviricle. Medical Mycology,
temperaturas de unin (Ta) empleadas (35-39 C) son 1999, 37: 25-33.
mucho ms bajas en comparacin al PCR tradicional, lo
cual favorece la inespecificidad de la reaccin. Los 7. Kwon-Chung KJ, Pfeiffer T, Chang YC, et al. Molecular biology of
fragmentos se analizan mediante electroforesis. El Cryptococcus neoformans and theropy of cryptococcosis. Journal
of Medical and Veterinary Mycology, 1994 32 Supplement 1: 407-
nmero y tamao de los fragmentos amplificados a partir 415.
de un determinado ADN mediante RAPD, se mantiene
constante siempre que se utilice el mismo cebador y se 8. Maresca C and Kobayoshi GS. Molecular Biology of Pathogenic
haga el estudio en las mismas condiciones. De este Fungi. 2nd. Ed. New York, Telos Press. 1994: 59, 85, 241, 293,
375, 461.
modo los perfiles
9. Martin C, Roberts D, Van Der Weide M, et al. Development of a
PCRbased line probe assay for identification of fungal pathogens.
J. Clin. Microbiol. 2000, 38: 3735-3742.

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10. Mitchell TG, Sandin RI, Bowman BH, et al. Molecular 13. Smith J and Wood R. Biologa Molecular y Biotecnologa.
mycology: DNA probes and applications of PCR Technology. Mxico, Adison Wesley Longman. 1998: 22-38
Journal of Medical and Veterinary Mycology 1994, 32
Supplement 1: 351-366. 14. Turner PC, McLennan AG, Bates AD et al. Instant Notes in
Molecular Biology. New York, Bios Scientific Publishers,
11. Reiss E, Tanaka K, Bruker G, et al. Molecular. Diagnosis and 1998: 47-59; 99104; 150-154.
epidemiology of fungal infections. J. Med. Mycol, 1998, 36
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