CONTROL DE CALIDAD DE LECHE

FUNDAMENTOS TEORICOS

El C.A.A. en su Art. 554 define "con el nombre de leche, sin agregado alguno,
se entiende el producto integral del ordeo total, ininterrumpido, y en
condiciones de higiene, de la vaca lechera en buen estado de salud y de
alimentacin"."La leche proveniente de otros animales deber expenderse
indicando el nombre de la especie productora".

La leche de vaca destinada al consumo deber responder a las siguientes

caractersticas:

1- Densidad, comprendida entre 1,028 y 1,035 a 15,5C.

2- Materia grasa: mnimo de 3,0%, propia de la leche.

3- Extracto seco no graso: mnimo 8,20%.

4- Acidez, en cido lctico: 0,13 a 0,18 g/100 ml .(13-18 Dornic).

5- Descenso crioscpico: entre 0,530 - 0,570 C, se establece una tolerancia

del 5%.

6- (Res 22, 30.01.95) "Protenas totales (N x 6,38 determinado por la

Metodologa Analtica Oficial-Mtodo 13.13-Determinacin de Protenas
Totales): mn: 2,9% P/P".1. - LECHE

1- PREPARACIN DE LA MUESTRA (AOAC 925.21, 1990)

Para el anlisis de la leche deber tomarse una cantidad suficiente y se la

conserva a 5 C. Inmediatamente antes del anlisis se lleva la muestra a una
temperatura de 20-25 C, se mezcla por inversiones repetidas cuidando de no
formar espuma. Si quedara grasa separada se debe calentar la leche a 38 C
en BM, se homogeneiza y luego se enfra a 20 C.

2- CARACTERES SENSORIALES

Aspecto: Por observacin visual directa, no debe presentar grumos, copos,

cogulos, flculos, mucosidad.

- Se introduce una varilla de vidrio en la capa de crema y se la retira

lentamente. No debe ser filante.
 Color y olor:

- Se transfiere 50-80 ml de leche a un Erlenmeyer de 150-200 ml, y se observa

el color, que no debe ser marcadamente amarillo ni rosado. Se calienta sobre
BM hasta aproximadamente 75 C, se mezcla por rotacin y se percibe el olor.
No debe ser aromtico, ptrido, agrio, rancio o acre.

Sabor:

- Se enfra la leche previamente calentada y se procede al examen gustativo.

No debe presentar gusto amargo, rancio o cido.

3-DENSIDAD DE LA LECHE (AOAC 925.22, 1990)

Medimos la densidad de la leche con lactodensmetro calibrado a 15 o 20C,

por tanto debemos multiplicar por un factor de correccin, segn la
temperatura de determinacin.

Procedimiento

- Se lleva la leche a 40 C en bao de agua.

- Se homogeneiza y se deja enfriar a aproximadamente 20 C.
- Se vierte la leche en una probeta de 250 ml evitando formar espuma y
controlar la temperatura.
- Se sumerge el lactodensmetro, lo que provocar el desborde de la leche
excedente.
- Se efecta la lectura en el borde superior del menisco.
- Convertir la lectura en el valor de la densidad mediante la siguiente frmula:

n 1,0
D (15 C) = 1000

- n = grados del lactodensmetro a 15 C.

Si la determinacin no se realiza a 15 C , efectuar la correccin, mediante el

uso de tablas.

Tabla 1. Tabla de correccin de densidad, segn temperatura de lectura.

Temp. Grados de densidad
C 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34
10 24.2 25.2 26.2 27.1 28.1 29 30 31 32 32.9
11 24.3 25.3 26.3 27.2 28.2 29.2 30.2 31.2 32.2 33.1
12 24.5 25.5 26.5 27.4 28.4 29.4 30.4 31.4 32.4 33.3
13 24.6 25.6 26.6 27.6 28.6 29.6 30.6 31.6 32.6 33.5
 14 24.8 25.8 26.8 27.8 28.8 29.8 30.8 31.8 32.8 33.8
15 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34
16 25.2 26.2 27.2 28.2 29.2 30.2 31.2 32.2 33.2 34.2
17 25.4 26.4 27.4 28.4 29.4 30.4 31.4 32.4 33.4 34.4
18 25.6 26.6 27.6 28.6 29.6 30.6 31.7 32.7 33.7 34.7
19 25.8 26.9 27.9 28.9 29.9 30.9 32 33 34 35
20 26 27.1 28.2 29.2 30.2 31.2 32.3 33.3 34.3 35.3
21 26.2 27.3 28.4 29.4 30.4 31.4 32.5 33.6 34.6 35.6
22 26.4 27.5 28.6 29.6 30.6 31.6 32.7 33.8 34.9 35.9
23 26.6 27.7 28.8 29.9 30.9 31.9 33 34.1 35.2 36.2
24 26.8 27.9 29 30.1 31.2 32.2 33.3 34.4 35.5 36.5
25 27.1 28.2 29.3 30.4 31.5 32.5 33.6 34.7 35.8 36.8
26 27.3 28.4 29.5 30.6 31.7 32.7 33.8 34.9 36 37.1
27 27.5 28.6 29.7 30.8 31.9 33 34.1 35.2 36.3 37.4
28 27.7 28.9 30 31.1 32.2 33.3 34.4 35.5 36.6 37.7
29 28 29.2 30.3 31.4 32.5 33.6 34.7 35.8 36.9 38
30 28.3 29.5 30.6 31.7 32.8 33.8 35.1 36.2 37.3 38.4

4- DETERMINACIN DE LA MATERIA GRASA

El contenido en grasa es un dato fundamental dada la importancia nutritiva de

este componente, pero est sujeto a mayores oscilaciones que los otros
componentes. La valoracin en s, presenta dificultades por la naturaleza de la
sustancia grasa que est asociada con lecitinas y colesterol y ligado a las
protenas. Por tenor en materia grasa en la leche, se entiende el tenor total en
materia grasa y en sustancias lipoides, expresado en porcentaje ponderal,
obtenido por determinacin de la materia grasa de la leche lquida normal,
ejecutada segn Rose-Gottlieb.

Mtodo de Roese-Gottlieb (mtodo de referencia)

La leche es tratada con amonaco y alcohol para desagregar las protenas. La
grasa liberada es extrada con ter dietlico y ter de petrleo.
Procedimiento

- Se coloca 10,0 ml de leche en un tubo o ampolla de extraccin.

- Se agregan 1,25 ml de hidrxido de amonio o 2 ml si la leche es cida, y se
agita.
- Se agregan 10 ml de etanol y se mezcla bien.- Posteriormente se aaden 25
ml de ter dietlico, se tapa con un tapn de plstico y se agita vigorosamente
durante 1 min.
- Se enfra si es necesario y se agregan 25 ml de ter de petrleo. Se repite la
agitacin vigorosa.
- Se deja en reposo durante 2 hs., para que las capas se separen.
- Cuando la capa superior se presenta lmpida, se decanta la sol. etrea a un
vaso previamente tarado.
- Se repite la extraccin dos veces, del lquido remanente, con la mezcla de 15
ml de ter dietlico y 15 ml de ter de petrleo, agregando algunos ml de agua,
 si fuera necesario para facilitar la separacin de las dos fases (en caso de leche
desengrasada no es necesario la tercera extraccin).
- Se evapora sobre bao de agua la mayor parte de los solventes evitando
proyecciones, se deseca el recipiente que contiene la grasa, durante dos horas
en estufa a 103 2 C.
- Se repite esta operacin hasta que el peso sea constante.
- Se debe efectuar un blanco de reactivos. Si el blanco es mayor de 0,5 mg
purificar o descartar los reactivos.

Clculo
Los resultados se expresan con un decimal.

Materia Grasa (g /100 ml) = (a - b) x 10

Materia Grasa (g/100 g) = (a - b) x 10 / d

siendo:
- a = peso de la materia grasa aislada, en gramos
- b = peso del blanco de reactivos, en gramos
 - d = densidad de la leche

5- DETERMINACIN DEL EXTRACTO SECO (norma FIL-21:1962)

El principio consiste en la evaporacin de la humedad, a una temperatura

determinada, hasta peso constante. El extracto seco de la leche est
constituido por las distintas sustancias en solucin, suspensin y emulsin y
vara entre ciertos lmites, siendo mucho menos variable si se corrige la grasa,
ya que esta componente es el ms variable del producto por consiguiente se
acostumbra a determinar el extracto seco total y la grasa , para luego corregir
el primero de sta y obtener el extracto seco no graso. Se toman valores
mnimos normales para la leche de cada raza en cada pas.
El aguado baja el extracto seco no graso. El agregado de bicarbonato u otro
aditivo puede compensar esta disminucin.

Procedimiento

- Se colocan aproximadamente 25 g de arena en un cristalizador y se introduce

una varilla de vidrio de una longitud ligeramente mayor al dimetro del
cristalizador.
- Se seca la cpsula con arena y la varilla a 102 2 C durante 4 hs.
- Se enfra en un desecador durante 45 min. y se pesa.
- Se aaden 10 ml de muestra y se pesa al mg por diferencia.
- Se mezcla con la varilla de vidrio, y se coloca la cpsula sobre un bao de
agua hirviente durante 20-30 min., removiendo peridicamente para evitar que
se forme costra, hasta que la arena est aparentemente seca.
- Se coloca la cpsula en la estufa durante 4 hs. a 102 2 C.
- Luego se enfra en el desecador durante 45 min. y se pesa.

Clculo
Los resultados se expresan con dos decimales

(b a) x 100
Extracto Seco (g/100) = P

siendo:
- a = peso del cristalizador con arena, seco, en g.
- b = peso del cristalizador con arena y leche, seco , en g.
- P = peso de la muestra en g.
6-DETERMINACIN DE ACIDEZ (AOAC 947.05, 1990)

Procedimiento
- Se coloca en un Erlenmeyer de 100 ml, 25 ml de leche que no haya sido
previamente calentada ni diluida.
- Se agrega 1 ml de sol. de fenolftalena al 1 % p/v y se titula con sol. de
hidrxido de sodio 0,1 N agitando vigorosamente durante unos pocos
segundos, justo hasta coloracin rosada que se mantenga ms de 30 seg.
- Como blanco de color se utilizan 25 ml de leche colocada en un Erlenmeyer
similar.

Clculo
Si la solucin utilizada es NaOH 0.1 N, podemos expresar la acidez en grados
Dornic
Los resultados se expresan en grados Dornic, con un decimal.

Acidez en grados Dornic (D) = a x 4 x 0,9

Acidez en ac. lctico g/100cm3 = a x 4 x 0,009

siendo:
- a = ml de sol. de NaOH gastados en la titulacin
Una acidez superior a 19 D, se atribuye a leches de ms de 10 horas (ordeo
de la noche).

7-DETERMINACIN DE PROTENAS (mtodo Sorensen - Walker).

Fundamento terico: Para este caso utilizamos la tcnica del formol. Por cada
molcula de formol aadida las protenas liberan un protn al medio. Luego si
aadimos formol en exceso al medio nos aseguraremos que todos los protones
de las protenas sean liberados.

Procedimiento

Tomamos 10 ml. y le aadimos 20 ml de agua destilada junto con unas gotas

de fenolftaleina para posteriormente neutralizar con NaOH (procedimiento ya
realizado para la determinacin de la acidez de la leche). Ahora aadimos
formol (2-3 ml.) y neutralizamos por el mismo mtodo para dejar libres los
grupos carboxilo de los aa. Valorando posteriormente la acidez con NaOH.

Clculos

Ejemplo: Los ml de NaOH utilizados para la primera valoracin, son los mismos
que los de la determinacin de la acidez.

V NaOH= 2.5 ml. de NaOH 0.1 N

Para la segunda valoracin los ml de NaOH utilizados para neutralizar los
cidos libres de la leche fueron:

V NaOH = 1.5 ml.

Los ml gastados en la segunda valoracin se multiplican por el factor 2.24 para

expresar el resultado como porcentaje de protenas:

1.5 ml. x 2.24 = 3.32%

Luego se aplica una regla de tres y obtenemos que:

100% ------------------78.5% casenas

3.32%------------------ x=

R.: 2.6 % de casenas

8- ENSAYO DE COAGULACIN

a) - Se coloca 10 ml de leche en un tubo de ensayo.

- Se calienta a ebullicin, y se observa si coagula.

b) - Se colocan 2 ml de leche en un tubo de ensayo y se agrega igual vol. de

etanol al 68% v/v.
- Se agita y se observa si coagula.

9- ENSAYO DEL TIEMPO DE REDUCCION DEL AZUL DE METILENO

Consiste en agregar a cierta cantidad de leche una sol. standard de azul de

metileno. Se mantiene luego a temperatura constante. La leche se decolora por
el efecto de las reductasas, al cabo de un perodo de tiempo que depende del
nmero y cantidad de las bacterias que contiene. Verifica en forma indirecta el
grado de desarrollo microbiano en la leche.

Reactivo
Azul de metileno al 0,005%. Se pesan 0,20 g de azul de metileno y se
disuelve en 200 ml de agua destilada hervida o esterilizada. Se toman 5 ml
de esta sol. y se lleva a 100 ml.
Se debe guardar en envases de vidrio color caramelo.

Procedimiento
- Se colocan 10 ml de la muestra en un tubo, y se agrega 1 ml de la sol. de azul
de metileno al 0.005 %.
- Se tapa el tubo, se lo invierte hasta homogeneizacin de la mezcla.
- Posteriormente se lo coloca en un bao de agua o estufa a 37 C.
- Se observa cada 30 min., previa homogeneizacin.
- Se anota el tiempo transcurrido hasta la decoloracin. Un anillo azul en la
superficie y en el fondo carece de significado (la coloracin en la superficie es
debida al O2 del aire, debe trabajarse con material esterilizado).

Interpretacin del resultado

- < 30 min............ ...leche mala
- 30 min. a 2 hs...... leche regular
- 2 -7 hs................. leche buena
- ms de 4 hs......... leche muy buena
- ms de 7 hs..........leche con el agregado de conservadores

En resumen:

El valor obtenido en la densitometra es un indicativo de genuidad y

tambin til para evidenciar adulteracin.

El contenido en graos Dornic , indica la conservacin y la frescura.

Las tres determinaciones extracto seco, protenas y grasa, son tiles

para la caracterizacin del tipo de leche segn su contenido.

Las determinaciones: Actividad Peroxidasa, Prueba de la Fosfatasa

alcalina, Prueba de la Reductasimetra, Prueba del Alcohol, son
indicadores de calidad o de algn tipo de adulteracin en la leche.

CONTROL DE FRAUDES Y/O ADULTERACIONES CON LECHES DE OTRA

ESPECIE ANIMAL

DETERMINACION DE LECHE DE VACA EN LECHE DE OVEJA O DE CABRA

El objetivo de la prctica es la deteccin de leche de vaca, como agente
adulterante, en leches de oveja y cabra utilizadas para la elaboracin de
derivados con denominaciones de origen mediante la diferenciacin de las
protenas de suero por electroforesis.
La fraccin srica de la muestra se extrae por adicin de solucin tampn a pH
4,6 y posterior centrifugacin. Las protenas de suero son separadas por
electroforesis en gel de poliacrilamida a pH 8,3. Las b-lactoglobulinas de leche
de vaca presentan una mayor movilidad electrofortica que las a-
lactoalbminas y las b-lactoglobulinas de la leche de oveja y de la leche de
cabra. El mtodo es aplicable a la leche cruda o pasterizada a una temperatura
mxima de 90C, durante treinta segundos, fresca o conservada mediante
congelacin o adicin de dicromato potsico.
Reactivos

Reactivos para la obtencin de la fraccin srica:

- Solucin de cido actico al 10%

- Acetato sdico 1M

Reactivos para la electroforesis.

- Tampn de los geles pH 8,9: Tris (Hidroximetil) Aminometano y cido

clorhdrico 35%

- Acrilamida-Bisacrilamida disuelta en el tampn anterior

- Tampn de electrodos pH 8,3: Tris (Hidroximetil) Aminometano y Glicina

- Persulfato amnico al 10% en agua

- N,N,N',N'- Tetrametilendiamina (TEMED)

- Solucin de Azul de Bromofenol

- Solucin de Glicerina al 40% en agua

Reactivos para la tincin con Azul Coomassie R-250

- Solucin fijadora: Acido 5-Sulfosaliclico 2-hidrato, Acido Tricloroactico, Agua

- Solucin decolorante: Etanol 96% v/v, Acido Actico glacial, Agua

- Solucin de tincin: Azul Coomassie Brillante R-250 disuelto en solucin

decolorante

Procedimiento

Obtencin de la fraccin soluble a pH 4,6 de la leche cruda

- Aadir a 10 ml de leche 5 ml de solucin de cido actico al 10% y 5 ml de
solucin de acetato sdico 1M en un tubo de 50 ml y agitar en vortex.
Comprobar con pH-metro que el pH de la mezcla este entre 4.2-4.6.

- Centrifugar a 3.000 r.p.m., 5C durante 10 minutos y filtrar el sobrenadante a

travs de un papel de filtro colocando un embudo sobre un vial.

Preparacin de las muestras para la electroforesis

En tubos eppendorf se aaden las siguientes fracciones:

- 250 l de la fraccin soluble obtenida segn el apartado 3.1.de cada una de

las muestras

- 250 l de la solucin de Glicerina 40%

- 125 l de la solucin Azul de bromofenol

Estas muestras se preparan y se dejan en un gradilla en la nevera hasta el da

siguiente

3.3. Preparacin del Gel de Poliacrilamida

Preparar el montaje del equipo de electroforesis

- Tomar en un Erlemmeyer 50 ml de la solucin de acrilamida-bisacrilamida

(guantes)

- Aadir 500 l de solucin de persulfato amnico al 10%

- Ponerlo 1 minuto en un bao de ultrasonidos y tapar rpido con papel

parafilm

- Justo antes de aadirlo en el equipo de electroforesis aadir como agente

polimerizante 50 l de TEMED y pasarlo a una probeta

- Echarlo entre los cristales del equipo de electroforesis y poner el peine antes
de que polimerice la mezcla.

Electroforesis

- Colocar el gel en el aparato de electroforesis y llenar las cmaras de los

electrodos con el tampn de electrodos de pH 8,3.
- Aplicar con microjeringa en cada uno de los pocillos del gel un volumen de 20
l de las muestras

- La electroforesis se realiza a 60 mA (220 V) dejando correr el frente hasta que

la lnea del azul de bromofenol est a 0,5 mm del extremo inferior del gel. La
duracin es aproximadamente de tres horas.

Tincin con Azul Coomassie R-250.

Una vez completada la electroforesis, introducir el gel sucesivamente en:

1 La solucin fijadora: Una hora.

2 La solucin de tincin: Doce horas (hasta el da siguiente)

3 La solucin decolorante, diez minutos, cambiando la solucin decolorante

cuando sea necesario hasta que quede el fondo transparente y las bandas
azules.

Interpretacin de los resultados

En el diagrama se observa el orden de las bandas de las protenas de suero de
las tres especies de leche con diferente movilidad electrofortica.

Figura 1. Distribucin de las bandas de las protenas de suero de leche de

cabra, oveja y vaca con diferente movilidad electrofortica