Efectos Múltiples de La 4 Aminopiridina
Efectos Múltiples de La 4 Aminopiridina
Efectos Múltiples de La 4 Aminopiridina
Introduccin
materiales y mtodos
Se prepararon miocitos SAN aislados de gatos adultos (> 3 kg) y conejos (2-3 kg)
utilizando un mtodo de perfusin enzimtica [5]. Los animales se anestesiaron con
pentobarbital sdico (35 mg kg-1, i.p.) 30 minutos despus de haber recibido heparina
(1.000 u kg-1, i.p.). Los corazones fueron extirpados y montados a travs de la aorta a un
sistema de perfusin de Langendorff. Los corazones fueron perfundidos inicialmente con la
solucin de Tyrode durante 8 min y luego con una solucin nominalmente cero de calcio.
Despus de 5 minutos de perfusin, el perfusato se cambi a una solucin cero de calcio
ms colagenasa (0,33 mg / ml, Tipo I, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EE.UU.) y proteasa
(0,01 mg / ml, Tipo XIV, Sigma -Aldrich, St. Louis, MO, EE.UU.) durante 10 min. La SAN
fue diseccionada,
Se cortaron en pequeos trozos y se colocaron en un vaso de precipitados que contena
colagenasa (0,33 mg / ml Tipo I, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EE.UU.), proteasa (0,01
mg / ml Tipo XIV, Sigma- Aldrich, St. Louis, MO, USA), y elastasa (0,40 mg / ml Tipo II
A, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EE.UU.) a 35C durante perodos de 5, 10 y 15 min.
Despus de cada perodo, se aislaron las clulas mediante agitacin mecnica de las piezas
de tejido con una pipeta, en medio Kraft-Brhe (KB) de bajo contenido en cloruro, bajo
contenido en sodio y medio de potasio. Las clulas aisladas se almacenaron a 4 C en un
vaso con KB medio para experimentos electrofisiolgicos posteriores [10].
La solucin de Tyrode contena (en milimolar): 118 NaCl, 24 NaHCO3, 0,42 NaH2PO4,
5,4 KCl, 1,8 CaCl2, 1,05 MgCl2, 11 glucosa y 10 taurina; La solucin se equilibr con 95%
de O2 y 5% de CO2 (pH 7,4). La solucin de Tyrode libre de Ca ^ {2+} se prepar
omitiendo CaCl _ {2} a partir de la solucin de Tyrode. El medio KB tena la siguiente
composicin (milimolar): 80 gluta- to de potasio, 40 KCl, 20 taurina, 10 KH2PO4, 10
glucosa, 10 Hepes, 0,2 EGTA, 5 MgSO4, 0,5 creatina, y 10 cido succnico; El pH se ajust
a 7,4 con KOH. La solucin se burbuje con O2 al 100%.
Las clulas utilizadas para las grabaciones electrofisiolgicas fueron en forma de huso y
quiescentes en Ca2 + solucin que contiene. Todos los experimentos de abrazadera de
corriente y tensin se llevaron a cabo a una temperatura de 35 0,5C. Se obtuvieron
grabaciones de corriente de potencial de accin y de corriente macroscpica con los
mtodos de pinzas de corriente y voltaje de clulas enteras, utilizando un amplificador
Axopatch-200B (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, EUA). Las pipetas de vidrio tenan
resistencias de punta de 2-3 M cuando se llenaban con solucin interna. La capacitancia
de clulas enteras y la resistencia en serie se compensaron para proporcionar el transitorio
capacitivo ms rpido posible sin oscilaciones de corriente. Las corrientes se filtraron con
un filtro Bessel de cuatro polos a 1 kHz y se digitalizaron a 2 kHz. La adquisicin de datos
y los potenciales de comando fueron controlados por el software pCLAMP (versin 9.0,
Molecular Devices, Sunnyvale, CA, EUA). Para el anlisis se utilizaron el software
pCLAMP 9.0 (Molecular Devices) y Origin 7 (OriginLab Corp, Northampton, MA, EUA).
La solucin externa normal tena la siguiente composicin (en milimolar): 136 NaCl, 4,0
KCl, 1,8 CaCl2, 1 MgCl2, 10 Hepes y 11 glucosa; El pH se ajust a 7,4 con NaOH. La
solucin externa Ca ^ {2+} -Co ^ {2+} tena la siguiente composicin (en milimolar): 136
NaCl, 4 KCl, 0,1 CaCl2, 0,5 CoCl2, 1 MgCl2, 10 Hepes y 11 glucosa; PH 7,4 con NaOH.
Las soluciones externas (normales y Ca2 + -Co2 +) se equilibraron con O2 al 100%. La
solucin interna tena la siguiente composicin (en milimolar): 80 asparato de potasio, 40
KCl, 10 KH2PO4, 1 MgSO4.7H2O, 3 Na2ATP, 0,2 NaGTP, 10 Hepes y 10 EGTA; PH 7,3
con KOH.
Los conejos fueron anestesiados con pentobarbital sdico (35 mg kg-1, i.p.) 30 minutos
despus de haber recibido heparina (1.000 u / kg, i.p.). Los corazones fueron extirpados, y
el ndulo sinoauricular aislado [11]. Un grupo de conejos fue pretratado con reserpina 3 mg
/ kg i.p., 17-22 h, antes de la diseccin.
Despus de aislar el ndulo sinoauricular, se cortaron cuatro hilos de tejido (0,3-0,4 mm de
ancho y 3-4 mm de longitud) en una direccin perpendicular a la cresta terminal. Las
hebras se ataron en una serie de pequeas bolas (tpicamente cinco) con dimetros de 0,3-
0,4 mm. Una vez completado el procedimiento de diseccin, se fij una hebra de bolas
(superficie endocrdica hacia arriba) en el bao de tejidos. Utilizamos bolas de las regiones
central y superior (craneal) de la SAN.
El bao de tejidos fue superfused con la solucin de Tyrode modificada a 35 C. La
solucin fluy bajo la accin de la gravedad a una velocidad de 5-10 ml / min a travs de
un intercambiador de calor en la cmara. La temperatura del bao se control usando un
termistor en miniatura para asegurar que la temperatura permaneciese a 35 C.
Se registraron los potenciales de accin intracelular de las pequeas bolas de tejido SAN
usando microelectrodos de vidrio convencionales (resistencia, 30-40 Mohms, solucin de
relleno, KCl 3M). La solucin de Tyrode contena (en milimolar) 118 NaCl, 5,4 KCl, 1,05
MgCl2, 0,42 NaH2PO4, 1,8 CaCl2, 24 NaHCO3 y 11 glucosa. La solucin se equilibr con
95% de O _ {2} - 5% de CO2 para dar un pH de 7,4. 4-AP para dar la concentracin
requerida (pH ajustado a 7,4 usando HCl).
Drogas
Se disolvieron CsCl y 4-AP (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EE.UU.) en las soluciones
externas hasta las concentraciones finales deseadas. Despus de disolver el 4-AP, se ajust
el pH a 7,4 con HCl. Se prepararon soluciones madre de diez milimolar de E-4031 (Eisai
Pharmaceutical Co, Tokio, Japn), atropina y propranolol (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO,
EE.UU.) en agua y se mantuvieron a -20C. Se diluyeron alcuotas de las soluciones madre
a diversas concentraciones en las soluciones de registro externas. Las soluciones que
contenan Chromanol 293B (Sigma - Aldrich, St. Louis, MO, EE.UU.) se prepararon
recientemente a partir de una solucin madre de dimetilsulfxido 40 mM; Tertiapina Q
(Tocris Bioscience, Ellisville, MO, EE.UU.) se disolvi en agua a 300 M y se almacen a
-20 C hasta su uso.
anlisis estadstico
Los datos se presentan como media error estndar de la media (SE) para el nmero
indicado de preparaciones. Se utiliz la prueba t de Student (pareada o no apareada segn
corresponda), un anlisis de varianza unidireccional y anlisis ad hoc para comparaciones
mltiples (correccin de Bonferroni, segn proceda) para probar las diferencias para los
datos distribuidos normalmente. Se consider significativa una diferencia si p <0,05.
Resultados
Efecto de 4-AP en IKr e IKs
La Figura 1 muestra trazas actuales obtenidas por pulsos despolarizantes de 2 s a -40, -20, 0
y +20 mV y tras repolarizacin a -50 mV, obtenidos a partir de una clula SAN de conejo.
Para estos experimentos, los IK se bloquearon con cromanol 293B (50 M) y los receptores
muscarnicos se bloquearon con atropina (1 M). 4-AP (5 mM) inhibi las corrientes
rectificadoras retardadas activadas por la despolarizacin de la membrana y la corriente de
cola inducida por la repolarizacin a -50 mV. En la Fig. 1b, se muestran los efectos
inhibidores de 4-AP (1 y 5 mM) sobre la corriente de cola IKr en diferentes potenciales. 4-
AP disminuy las corrientes de cola IKr en las clulas SAN de conejo despus de un pulso
despolarizante a +30 mV por 28 5% (1 mM) y 47 8% (5 mM; n = 5; p <0,05). En
experimentos separados (no mostrados), se encontr que el rectificador retardado y las
corrientes de cola registradas bajo estas condiciones experimentales estaban completamente
bloqueadas por el bloqueador IKr E-4031 (1 M).
La Figura 2a muestra rastros actuales obtenidos de una clula SAN cat, bajo condiciones de
control (en presencia de 1 M de E- 4031 y 1 M de atropina) y despus de la adicin de 4-
AP (5 mM). A partir de un potencial de retencin (HP) de -50 mV, se aplicaron impulsos de
ensayo de 5 s a -40, -20, 0, +20 y +40 mV; Las corrientes de cola se registraron tras la
repolarizacin a -50 mV. 4- AP produjo una inhibicin de la corriente retardada del
rectificador activada por la despolarizacin y la corriente de cola inducida por la
repolarizacin a -50 mV. En la Fig. 2b, se muestran los efectos inhibidores de 4-AP (1 y 5
mM) sobre IKs activados a diferentes potenciales (n = 5 clulas). En experimentos
separados (no mostrados), se encontr que el rectificador retardado y las corrientes de cola
registradas bajo estas condiciones experimentales estaban completamente bloqueadas por el
bloqueador IKs cromanol 293 (50 M).
Efectos de la 4-AP sobre los miocitos SAN despus del bloqueo
De IKr, IKs y Si