Int. J. Morphol.

,
22(4):343-350, 2004.

CLONACIN, PRODUCCIN DE QUIMERAS

Y CLULAS PLURIPOTENCIALES

CLONATION, PRODUCTION OF CHIMERAS AND PLURIPOTENCIAL CELLS

*
Mariana Rojas; *Felipe Venegas; **Jean Luc Servey & **Michel Guillomot

ROJAS, M.; VENEGAS, F.; SERVEY, J. L. & GUILLOMOT, M. Clonacin, produccin de quimeras y clulas pluripotenciales.
Int. J. Morphol., 22(4):343-350, 2004.

RESUMEN: La Biologa del Desarrollo y la Biotecnologa han avanzado enormemente en los ltimos aos. Los estudios que se
estn realizando actualmente con nuevas tcnicas moleculares, nos conducen a una nueva era en el diagnstico y en el tratamiento de
muchas enfermedades congnitas. Actualmente, se ha logrado aplicar los conocimientos derivados de ella, con incipiente xito, en los
aspectos productivos y tambin en la terapia de distintas enfermedades del Hombre y de otros animales y, por ltimo, existen importantes
perspectivas en la proteccin de especies amenazadas. En este Review, se analizan algunos de los aspectos tcnicos ms interesantes de
la clonacin, produccin de quimeras y obtencin de clulas pluripotenciales, como tambin los objetivos y proyecciones en el campo
veterinario y de la salud animal y humana.

PALABRAS CLAVE: 1. Clonacin; 2. Quimeras; 3. Clulas pluripotenciales.

Los estudios que se estn realizando actualmente y pecial a la oveja Dolly. Esta tcnica de clonacin con fines
que utilizan nuevas tcnicas moleculares y equipos de alta reproductivos no debera ser utilizada en el ser humano.
sofisticacin, nos conducen a una nueva era en el diagns- Los derechos del Hombre a no ser programado genticamente
tico y en el tratamiento de muchas enfermedades congni- y a ser genticamente nico e irrepetible, constituyen una
tas. Actualmente, se ha logrado aplicar los conocimientos grave y seria objecin tica en contra de la clonacin con
derivados de ella, con incipiente xito, en los aspectos pro- fines reproductivos, por transferencia de ncleo de clula
ductivos y tambin en la terapia de distintas enfermedades somtica. En 1997, el grupo de Ian Wilmuth del Instituto
humanas y de otros animales y, por ltimo, existen impor- Roslin de Edinburgo, logr un mamfero clnico mediante
tantes perspectivas en la proteccin de especies amenaza- un trasplante de ncleo. (no hubo intervencin del sexo
das. A continuacin, analizaremos algunos aspectos que han masculino). Dolly es el primer caso de un mamfero clnico
sido noticia permanente en los ltimos aos, como la originado por una clula no sexual, y fue creada para obte-
clonacin, la produccin de quimeras, y la obtencin de ner una rplica de una oveja transgnica que no se reprodu-
clulas madres (troncales). ca. Esto se realiz de la siguiente manera:

Clonacin: Las tcnicas utilizadas para la clonacin 1) De una oveja de cabeza blanca se obtuvieron c-
pueden ser de dos tipos: 1) la practicada por transferencia de lulas de una glndula mamaria, que se mantuvieron en un
ncleos, donde se generan individuos que son copias igua- medio de cultivo. De estas clulas se extrajeron los ncleos.
les al progenitor, como la oveja Dolly y 2) la tcnica realiza-
da por gemelacin, partiendo de un vulo fecundado (a la 2) De ovejas de cabeza negra se obtuvieron vulos,
manera tradicional), se escinde, produciendo dos o ms em- a los cuales mediante micromanipulacin se les quit el n-
briones. En este caso, la constitucin gentica de las cras es cleo, quedando por lo tanto constituidos exclusivamente por
diferente a la de los padres, pero es exactamente igual entre su citoplasma y recubiertos por la zona pelcida.
ellas (Esponda, 2000).
3) Los ncleos extrados de las clulas mamarias (de
Mamferos clnicos creados por trasplante de un una oveja de cabeza blanca) fueron inyectados en el interior
ncleo. Nos referiremos a la clonacin en animales, en es- del citoplasma de los vulos (de una oveja de cabeza negra).
*
Laboratorio de Embriologa Comparada, Programa de Morfologa, Facultad de Medicina, Universidad de Chile, Chile.
**
Unit de Biologie du Dveloppement et Biotechnologie, INRA, Francia.
Trabajo financiado por el Proyecto ECOS/ CONICYT B02 C03

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4) Los vulos conteniendo el ncleo de la clula As naci Dolly, que posee slo la informacin
mamaria, se cultivaron por seis das, y aquellos que presen- gentica otorgada por el ncleo de la clula mamaria y
taron desarrollo embrionario (hasta estado de blastocisto) cuyo sexo no poda ser sino femenino y el color de su
fueron transferidos al tero de ovejas de cabeza negra. cabeza fue blanco (Fig. 1).

Pedro Esponda, en su entretenido libro llamado

Seres del futuro dice que se utilizaron 277 vulos que
fueron inyectados con ncleos. De ellos, 29 llegaron al
estado embrionario de blastocisto y slo naci una oveja
que fue Dolly. Por lo tanto, el xito del experimento fue
extraordinariamente bajo (0.3%).

En sntesis, se puede afirmar que son indispensa-

bles tres elementos: 1) un ncleo que contenga la infor-
macin hereditaria completa, 2) el citoplasma de un vu-
lo que debe corresponder, en principio, a la misma espe-
cie que el ncleo trasplantado y 3) una madre receptora
que anidar en su tero al embrin. Respecto al valor de
la especie que anida el embrin, se debe notar que hay
casos en que el tero de una especie puede anidar a un
ejemplar de otra especie diferente, como el caso de una
yegua que sirvi de madre husped para una cebra, o el
caso de ositos pandas que pueden desarrollarse en teros
de hembras de otras especies de osos.

Lo que parece irreemplazable es el citoplasma del

vulo, cuya composicin es muy compleja en estructu-
ras y molculas, siendo capaz de organizarlo todo para
que se produzcan las divisiones embrionarias. El citoplas-
ma del vulo muestra una capacidad indita para trans-
formar la expresin gnica de un ncleo ya programado
por la naturaleza (como el de clulas ya diferenciadas
como la glndula mamaria). Es tal el papel de este cito-
plasma ovular, que es capaz de hacer que estos ncleos
trasplantados puedan desdiferenciarse, reprogramarse y
emprender la embriog-nesis. Probablemente, el citoplas-
ma del vulo posee molculas que toman parte en este
mecanismo, pero en este momento no sabemos exacta-
mente de qu molculas se trata. El grupo francs dirigi-
do por Xavier Vignon trabaja en dilucidar cules son los
mecanismos moleculares que permiten el retorno de un
ncleo de clula ya diferenciada, a un ncleo que es
totipotente.

La clonacin ofrece importantes oportunidades para

Fig. 1. De una oveja de cabeza negra (1) se obtiene un vulo (2) al la preservacin genmica de animales en riesgo de extin-
cual mediante micromanipulacin se le extrae el ncleo (3). De cin, pero su eficiencia es reducida. Se ha considerado
una oveja de cabeza blanca (4) se extraen clulas de la glndula que uno de los factores relacionado con esta baja eficien-
mamaria (5). De estas clulas se extraen los ncleos (6). Se inyecta cia es el origen de las clulas donadoras de ncleos. Debi-
un ncleo en el interior de un vulo (7). Este vulo con el ncleo do a esto, en nuestro grupo hemos realizado un estudio
inyectado (8) se transfiere al tero de una oveja de cabeza negra
inmunohistoqumico de clulas obtenidas de biopsias de
que har las veces de madre de alquiler (9). Nace una oveja de
cabeza blanca (10) que es geneticamente idntica a la oveja que piel de bovinos adultos y neonatos, despus de ser culti-
gener el ncleo (4). vadas in vitro por perodos de una a tres semanas.

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Las biopsias de cuatro pabellones auriculares de bo- ticuerpo anti-citokeratina 8-18 y anti vimentina en los suce-
vinos (tres hembras adultas y un neonato), fueron desinfec- sivos pasajes.
tadas y seccionadas en cortes finos, incubadas en medio Eagle
Dulbecco modificado, a 37C. Incubadas con acutasa, por Inicialmente las clulas fueron vimentina positivas
tres minutos, lavadas con PBS, inmersas en BFS y anti- (Fig. 3) y algunas citokeratina positivas (Fig. 4). Entre los
biticos, centrifugadas dos veces a 1000 rpm por 5 minutos. pasajes 6 a 10, todas las clulas fueron vimentina positivas,
El precipitado de fibroblastos fue depositado en una placa demostrando que eran slo fibroblastos. No encontramos di-
Petri con medio de cultivo. Posteriormente, las clulas fue- ferencias significativas entre los cultivos de clulas de adul-
ron caracterizadas inmunohistoqumicamente mediante an- tos y neonatos.

Fig. 2a y b obtencin de
biopsia de la dermis del
pabelln auricular de una
vaca (Bos taurus). c y d
incubacin en medio de
cultivo.

Produccin de quimeras. Una quimera es un animal que Las primeras quimeras fueron desarrolladas en 1920,
tiene caractersticas de dos o ms especies. La quimera se en el laboratorio de Hans Spemann por fusin de embrio-
origina por la mezcla de clulas provenientes de especies nes tempranos de anfibios, pero los primeros experimentos
diferentes y posee las caractersticas de los dos individuos que desarrollaron quimeras en mamferos, se realizaron en
que genticamente lo originan. Cuando hablamos de qui- la dcada de los aos 60 y fueron logrados por Beatrice
meras, nos referimos a las logradas por mtodos experimen- Mintz, empleando mtodos de micromanipulacin de em-
tales de manipulacin embrionaria y pueden ser de diferen- briones.
tes especies o de una misma especie.
Beatrice Mintz utiliz mrulas provenientes de cru-
Para algunos autores hay dos tipos de quimeras. 1) zamientos de parejas de conejos albinos y tambin mrulas
Primarias: aquellas naturales o artificiales que desde los es- de parejas de conejos negros. Las mrulas fueron separadas
tadios embrionarios presentan dos poblaciones celulares de la zona pelcida mediante tripsina, y luego fueron fusio-
genticamente diferentes. 2) Secundarias: en las que los te- nadas. El blastocisto gigante resultante se coloc en el tero
jidos u rganos de dos fetos o adultos diferentes se combi- de una madre receptora, que haba sido hormonalmente tra-
nan. El mejor ejemplo de estas quimeras secundarias es el tada para simular una gestacin. El resultado fueron cras
caso de los trasplantes de rganos, en los que un rgano de con cuatro padres (tetraparentales), que presentan una cu-
la misma o de otra especie es introducido y se incorpora en bierta de pelos formada por manchones de pelo blanco y
el cuerpo de un animal. manchones de pelo negro (Fig. 5).

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do fue transferido a una oveja receptora. El ani-

mal que naci mostr una mezcla de ambas es-
pecies: lo ms destacado fue su pelaje que pre-
sentaba las caractersticas de ambas especies: y
sus cuernos que tenan la forma de los de la ca-
bra, pero que aparecan enroscados como los de
oveja. Asimismo, su sangre contena clulas de
ambas especies. Existan en este animal otras
caractersticas interesantes, como que se pare-
ca fisicamente ms a una cabra, aunque prefe-
ra la compaa de las ovejas. Tambin el anli-
sis de sus protenas mostr que posea caracte-
rsticas de ambas especies, pero que predomi-
naban las de oveja. Respecto a su comportamien-
to reproductivo, demostr ser frtil aunque era
capaz slo de copular con ovejas. Este experi-
mento es realmente nico y mostr la posibili-
dad experimental de obtener una quimera, tal
Fig. 3. Cultivos de fibroblastos marcados con tcnicas de inmunofluorescencia
como las descritas en la mitologa. (Fig. 6)
de doble marcaje: Los ncleos se observan con Hoechst y los filamentos inter-
medios con un anticuerpo antivimentina.
Los estudios realizados con quimeras son
de gran inters para analizar el proceso embrio-
lgico, ya que se pueden fabricar quimeras uti-
lizando embriones de diferentes edades. Por
ejemplo, cuando se mezcla un embrin de cua-
tro clulas con uno de ocho, esta ltima forma
el embrin, mientras el de cuatro clulas forma
el trofoblasto. Al respecto, se debe notar que el
trofoblasto es el que interacta con el tero ma-
terno, por lo tanto, esta tcnica podra ser usada
potencialmente para producir transferencias
embrionarias entre especies diferentes.

Los embriones de una especie dada, que

han sido obtenidos por clonacin, no se pueden
implantar en el tero de una hembra receptora
de especie diferente. En relacin con la implan-
tacin, slo el trofoblasto (extraembrionario)
est implicado en las interacciones con los teji-
Fig. 4. Tcnica de Inmunofluorescencia que permite el doble marcaje para los
ncleos de todas las clulas (azul) y filamentos intermedios de clulas epiteliales. dos maternos. La obtencin de conceptus qui-
(anticuerpo anticitokeratina) /rojo) mricos constitudos por el trofoblasto del
blastocisto bovino (compatibles con el receptor) y de teji-
Ms tarde, se produjeron de la misma forma qui- dos embrionarios de una especie de inters filoge-
meras en conejos y ovejas. Este mtodo se emplea habi- nticamente cercana, podra relacionarse con el xito de la
tualmente cuando se fabrican los animales knock-out, los clonacin de animales de inters gentico y en peligro de
cuales pueden ser considerados tambin como quimeras. extincin.

Pero no cabe duda de que dentro de las quimeras de En el estudio esperamos trasplantar embrioblastos
mamferos, el caso mas interesante ha sido el de la oveja- de una especie de ciervo, en el interior de vesculas
cabra creada en Cambridge (Inglaterra) por Fehilly y trofoblsticas de otra especie de ciervos, despus de la abla-
Willadsen. Estos investigadores utilizaron blastocistos de cin del embrioblasto. Los embriones quimeras as
cabra y oveja. El embrioblasto de cabra fue introducido reconstituidos, sern analizados despus de ser cultivados
dentro del blastocisto de una oveja. El embrin as forma- in vitro.

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Fig. 5. Obtencin de quimeras.

Se cruzaron parejas de conejos de

pelaje negro y tambin conejos de
manto blanco.

Se obtuvieron las mrulas resultan-

tes y se colocaron en una placa Petri.

El blastocisto se transfiere a una coneja receptora.

Nace un gazapo cuyo manto presenta manchones negros y blancos.

Las clulas madres pluripotenciales: Actualmente, son Las clulas madres obtenidas de embriones en la eta-
muchos los laboratorios en todo el mundo que trabajan para pa de blastocisto tienen la capacidad de formar todas las
obtener clulas pluripotenciales embrionarias. Estas clulas clulas del cuerpo, porque mantienen el cariotipo normal, y
son llamadas as porque tienen la potencialidad de originar una alta actividad telomerasa, adems, logran en cultivo, un
todos los tipos celulares que existen en el cuerpo y se han notable potencial de proliferacin durante un largo pero-
convertido en una esperanza teraputica para muchas enfer- do de tiempo, dando la posibilidad de una expansin ilimi-
medades tanto del Hombre como de los animales. tada.

Las clulas madres embrionarias son las nicas ca- Las clulas madres se obtienen del embrioblasto de
paces de autorrenovarse y diferenciarse en muchas lneas un blastocisto y deben cultivarse in vitro para obtener l-
celulares. Algunos tejidos adultos de mamferos conservan neas de clulas pluripotenciales. Estas clulas madre pue-
tambin clulas madres, pero stas son capaces de generar den seguir los siguientes dos caminos, dependiendo del
slo un nmero limitado de tipos celulares. medio de cultivo que se utilice: a) mantenerse en un estado

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zado en animales, en 1988, dos laboratorios informaron

que haban obtenido clulas madres de embriones huma-
nos. En estos casos, las clulas madres fueron obtenidas a
partir de clulas germinales primordiales derivadas de fetos
abortados espontneamente. En ambos casos las clulas
embrionarias fueron pluripotentes, y capaces de proliferar
y diferenciarse en el cultivo y tambin de formar otras c-
lulas madres que producan neuronas y sangre (Geahart,
1998; Thomson et al., 1998)

Esta terapia fue probada primero en el ratn, donde

las clulas madres fueron sembradas en una placa de culti-
vo, la cul tena un medio lquido con acido retinoico, se
obtuvieron as clulas madres de la estirpe neuroniana, las
cuales al ser trasplantadas en el ratn generaron neuronas
funcionales (McDonald et al., 1999).

Cuando las mismas clulas madres eran deposita-

das sobre un piso de celulas nutricias fibroblsticas y un
medio liquido que, en vez de cido retinoico, contiene fac-
tor de crecimiento fibroblstico y factor de crecimiento
Fig. 6. Quimera: oveja-cabra derivado de plaquetas se obtuvieron, clulas madres gliales,
y cuando ellas se trasplantaron en ratones que tienen una
indiferenciado y b) diferenciarse en lneas celulares ms es- deficiencia gentica de la funcin glial se obtuvieron clu-
pecficas, por ejemplo cardacas, neurales, sanguneas, etc. las gliales funcionales y el defecto fue eliminado, por lo
que los ratones mejoraron (Fig. 3). Las clulas gliales o
Debido a que estas clulas pueden proliferan inde- neurogla son las otras clulas del sistema nervioso y cola-
finidamente en un medio de cultivo y luego diferenciarse boran con las neuronas proporcionndoles: sostn, y nutri-
en mltiples tipos celulares, las clulas humanas potencial- cin. (Brstle et al., 1999)
mente pueden proveer de un aporte ilimitado de tejidos para
trasplantes humanos. La terapia de trasplante basado en El gran problema que impide extrapolar estas tcni-
estas clulas, es una promesa de tratamiento exitoso para cas a la especie humana es que los ratones de laboratorio
una variedad de enfermedades como Parkinson, diabetes, utilizados eran consanguneos, y los seres humanos no lo
alteraciones cardacas, alteraciones degenerativas del ce- son, por lo tanto existe un problema de rechazo
rebro o lesiones de la mdula espinal, y tambin para pro- inmunolgico que no se ha podido superar con seguridad,
ducir nuevas clulas sanguneas en personas con anemia. las clulas madre deberan ser modificadas, o bien de acuer-
Sin embargo, an hay barreras que superar para un exitoso do a otros autores se debera clonar un embrin temprano a
tratamiento clnico. partir de las clulas somticas del paciente y as generar
sus propias clulas madre. (Gilbert, 2000).
Prcticamente toda la investigacin relacionada con
clulas madres embrionarias se ha desarrollado en el ratn El laboratorio Advanced Cell Technology ha estado
de laboratorio y algunos otros animales como conejos, ove- dedicado a la clonacin de un embrin humano, el objetivo
jas y vacas. En la especie humana esta investigacin est no es obtener un ser humano sino la obtencin de clulas
mucho menos desarrollada debido a los aspectos ticos y madres. La obtencin de clulas troncales obtenidas de em-
legales. En Chile, prcticamente no se desarrolla investi- briones generados por transferencia de ncleos, y no por
gacin experimental en clulas humanas, pero s en anima- va reproductiva, plantea tambin un problema tico. El
les, En nuestro laboratorio hemos observado que, a partir debate sobre esto, as como la consideracin del momento
de clulas germinales primordiales embrionarias de cone- en que comienza una vida en estos casos, de reproduccin
jo, se pueden tambin generar clulas pluripotenciales y tan distinta a lo habitual no se ha terminado. Si bin es
teratomas (Montiel et al., 2001; Rojas et al., 2001; Rojas et cierto, la vida comienza en el momento de la fecundacin,
al., 2004). es claro que en este caso no hay fecundacin, ni tampoco
hay dos gametos que se encuentren, ni la informacin
An cuando la mayora de los estudios se han reali- gentica de dos sexos que se combinan.

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Clulas madres que no provienen de embriones umbilical de sus hijos y mantener all esas clulas hasta el
tempranos. momento en que ellos pudieran necesitar algn trasplante
de stas. Existen tambin otras clulas madres pero que no
1.- Las clulas de la mdula sea son progenitoras de son pluripotentes, sino que son monopotentes, por ejemplo
tejidos, tales como cartlago, hueso, clulas hematopoyticas las clulas de la capa basal de la piel, que slo originaran
y adiposas. Actualmente, se realizan trasplantes locales de piel.
las clulas de la mdula sea, las cuales permiten la eficien-
te reconstruccin de defectos seos y se podrn utilizar en Para concluir, sealamos que son las clulas
un futuro prximo para solucionar problemas ortopdicos. embrionarias del blastocisto, las que tienen capacidad de
generar todas las clulas del organismo, las otras clulas
2.- Otra fuente de clulas madres es la sangre que madres, como las del cordn umbilical y la mdula sea del
fluye por el cordn umbilical. En 1 ml de sangre del cordn adulto, tienen un potencial ms restringido.
umbilical, hay aproximadamente 8000 progenitores de
eritrocitos, entre 13 y 24 mil progenitores mieloides, y entre Probablemente, ninguna de estas tcnicas resulte con-
1000 y 10.000 clulas madres pluripotenciales. Esta forma vincente para ser utilizadas en la especie humana, sin em-
de obtencin de clulas madres estara mucho ms de acuer- bargo, parece ser que los estudios iniciados, con relacin a
do con diversas regulaciones ticas. En los ltimos aos se la bsqueda y obtencin de clulas madres, no se detendrn,
han utilizado clulas madres provenientes de sangre del cor- De acuerdo, a lo escrito por Daniel Perry en la revista Stem
dn umbilical, para trasplantes, en lugar de clulas de la cell, la voz de los pacientes se ha convertido en un sonido
mdula sea. Ms de 500 de estos trasplantes han sido reali- muy poderoso en el debate de las clulas madres, existiendo
zados en todo el mundo, principalmente en nios con enfer- millones de pacientes afectados por enfermedades, quienes
medades sanguneas incluidas las leucemias linfoide y pueden ser ayudados por estas investigaciones en clulas
mieloide, diversos tipos de anemia, con muy buenos resul- pluripotenciales.
tados. Actualmente, se estn formando varios bancos de c-
lulas provenientes de cordones umbilicales y muchos pa- Al parecer, las investigaciones sobre estos temas re-
dres estn considerando congelar un segmento de cordn cin comienzan.

ROJAS, M.; VENEGAS, F.; SERVEY, J. L. & GUILLOMOT, M. Clonation, chimeras and production pluripotential cells. Int. J.
Morphol., 22(4):343-350, 2004.

SUMMARY: Developmental Biology and Biotechnology had advanced a lot in the last years. Using new molecular techniques,
the analysis opens a new age in diagnostic and treatment of a number of congenital diseases. At present, some of this knowledge has been
successfully applied to the therapy of some human and animal pathologies, and there are also promising perspectives for protection of
endangered species. In this review, some of the more interesting aspects of clonation, chimerism, and the production of pluripotential
cells as well as the objectives and projections on veterinary and animal health are dealt with.

KEY WORDS: 1. Clonation; 2. Chimeras; 3. Pluripotential cells.

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