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    RT PCR

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    Luis S. Montoya
    La RT-PCR implica la transcripción reversa de ARN en ADNc seguida de la amplificación por PCR. Consta de dos protocolos: de un paso, que combina la transcripción reversa y la PCR en una sola reacción; o de dos pasos, separando la transcripción reversa de la PCR en etapas distintas. La RT-PCR se utiliza comúnmente para detectar y cuantificar ARN viral o mensajero.

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    RT PCR

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    Luis S. Montoya
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    La RT-PCR implica la transcripción reversa de ARN en ADNc seguida de la amplificación por PCR. Consta de dos protocolos: de un paso, que combina la transcripción reversa y la PCR en una sola reacción; o de dos pasos, separando la transcripción reversa de la PCR en etapas distintas. La RT-PCR se utiliza comúnmente para detectar y cuantificar ARN viral o mensajero.

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    RT PCR

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    La RT-PCR implica la transcripción reversa de ARN en ADNc seguida de la amplificación por PCR. Consta de dos protocolos: de un paso, que combina la transcripción reversa y la PCR en una sola reacción; o de dos pasos, separando la transcripción reversa de la PCR en etapas distintas. La RT-PCR se utiliza comúnmente para detectar y cuantificar ARN viral o mensajero.

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    La RT-PCR implica la transcripción reversa de ARN en ADNc seguida de la amplificación por PCR. Consta de dos protocolos: de un paso, que combina la transcripción reversa y la PCR en una sola reacción; o de dos pasos, separando la transcripción reversa de la PCR en etapas distintas. La RT-PCR se utiliza comúnmente para detectar y cuantificar ARN viral o mensajero.

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    RT-PCR

    1. Definicin:
    En la RT-PCR, se retrotranscribe una hebra de ARN en ADN
    complementario (ADNc) usando una enzima llamada transcriptasa
    inversa o transcriptasa reversa, y el resultado se amplifica mediante
    una PCR tradicional. El trmino PCR en transcripcin reversa no debe confundirse
    con la PCR en tiempo real, tambin denominada PCR cuantitativa (Q-PCR), que en
    ocasiones, por una mala traduccin del ingls, se abrevia de la misma manera (RT-
    PCR, por Real Time-PCR).
    2. Componentes de la RT-PCR:

    Componentes para la reaccin RT-PCR


    1. ARN molde.
    2. Cebador (pueden ser Oligo dT, aleatorios o especficos a una
    secuencia).
    3. dNTPs.
    4. Agua DEPC.
    5. Enzima transcriptasa ( AMV o MMVL)
    6. Buffer + DTT + Inhibidor de ARN asa
    7. MgCl2
    Componentes para la PCR:
    1. Cebador
    2. dNTPs
    3. Buffer Tris-HCl
    4. MgCl2
    5. Taq polimerasa.
    6. ADNc
    Equipos y materiales:

    1. Termociclador
    2. Camara de bioseguridad
    3. Guantes
    4. Micropipetas
    5. Microtubos

    3. Etapas

    a) Hibridacin del cebador.


    b) Polimerizacin del ADN.
    c) Inactivacin de la enzima.
    4. Protocolo de la RT-PCR
    RT-PCR puede ser llevado a cabo por el protocolo de RT-PCR de un paso o el
    protocolo de RT-PCR de dos pasos.

    A. RT-PCR de un solo paso

    1. Seleccione un kit de RT-PCR de un paso, que debe incluir una mezcla de la


    transcriptasa reversa y el sistema PCR como una relectura de la polimerasa
    Taq ADN polimerasa.
    2. Obtener todos los materiales necesarios, equipos e instrumentos (kits deben
    incluir una lista detallada de artculos necesarios).
    3. Preparar una mezcla de reaccin, que incluir dNTPs, cebadores, RNA
    molde, enzimas necesarias y un tampn.
    4. Aadir la mezcla a un tubo PCR para cada reaccin. A continuacin aadir el
    RNA molde
    5. Colocar los tubos de PCR en el termociclador para comenzar el ciclo. El
    primer ciclo es transcripcin reversa para sintetizar el cDNA. El segundo
    ciclo es la desnaturalizacin inicial. Durante este ciclo de la transcriptasa
    reversa es inactivada. Los ciclos siguientes (40 a 50) son el programa de
    amplificacin, que consiste en tres pasos: (1) desnaturalizacin, (2)
    recocido, (3) alargamiento.
    6. Los productos de RT-PCR pueden analizarse entonces con electroforesis en
    gel

    B. RT-PCR de dos pasos

    Paso uno

    1. Combinan la plantilla de RNA, cartilla, mezcla de dNTP y agua libre de


    nucleasas en un tubo de PCR.
    2. Agregar inhibidor de RNasa y transcriptasa reversa al tubo de PCR.
    3. Colocar los tubos en el termociclador para un ciclo que incluye hibridacin,
    elongacin y luego inactivar la transcriptasa reversa.
    4. Proceder directamente a la PCR o almacenar en hielo hasta que se puede
    realizar PCR.
    Paso dos

    1. Aadir una mezcla maestra (que contiene tampn, mezcla de dNTP,


    MgCl2Taq polimerasa y agua libre de nucleasas) a cada tubo PCR.
    2. Aadir el primer apropiado.
    3. Colocar los tubos en el termociclador durante 30 ciclos del programa de
    amplificacin, que incluye tres pasos: (1) desnaturalizacin, (2) hibridacin,
    (3) alargamiento.
    4. Los productos de RT-PCR pueden analizarse entonces con electroforesis en
    gel.

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