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Sección III: ANTICUERPOS

Los anticuerpos son las principales proteínas recombinantes que se aprovechan del sistema
inmunitario. Lo que hacemos los biotecnólogos es coger los Ab y tunearlos, y así tendré Ab con
las funciones que yo quiera.

1. Dominio variable y dominio constante

La estructura general de un Ab son dos cadenas pesadas y dos cadenas ligeras. Su estructura
globular se llama dominio de Ig. Este dominio contiene dos capas de láminas plegadas en β, cada
una compuesta de tres a cinco hélices de cadenas polipeptídicas antiparalelas. Las dos capas se
mantienen unidas mediante un enlace disulfuro, y hélices adyacentes de cada lámina β se
conectan mediante asas cortas. Esta estructura es altamente funcional y muy estable.

Las cadenas pesadas y ligeras

constan de regiones amino
terminales variables (V) que
participan en el reconocimiento del
antígeno y de regiones carboxilo
terminales constantes (C). En las
cadenas pesadas, la región V está
compuesta de un dominio de Ig y la
región C está compuesta de tres o
cuatro dominios de Ig. Cada cadena
ligera se compone de una región V
de dominio de Ig y una región C de dominio de Ig. Las regiones variables se llaman así porque
contienen regiones variables en la secuencia de aminoácidos que distinguen los anticuerpos
producidos por un clon de linfocitos B de los anticuerpos producidos por otros clones. La región
V de una cadena pesada (VH) y la región V adyacente de una cadena ligera (VL) forman una zona
de unión al antígeno. Las regiones C de las cadenas pesadas median las funciones efectoras
(median la mayoría de las funciones biológicas de los anticuerpos). Las cadenas pesadas pueden
anclar los anticuerpos membranarios en las membranas plasmáticas de los linfocitos B, o bien
se secreta cuando se asocia a cadena ligeras de Ig.

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Características estructurales de las regiones variables del anticuerpo

Si se mira la secuencia de los aminoácidos de las dos cadenas, pesada u ligera, se observa que si
se alinean secuencias de diferentes anticuerpos se ve que hay regiones de poca variabilidad
(parte constante) y otras de mucha variabilidad (parte variable).

La mayoría de las diferencias en la secuencia y la variabilidad entre diferentes anticuerpos se

limitan a tres secuencias cortas en la región V de la cadena pesada y a tres secuencias en la
región V de la cadena ligera. Estas secuencias diversas se llaman segmentos hipervariables y
corresponden a tres asas que sobresalen y conectan hebras de láminas β que componen los
dominios V de las cadenas pesada y ligera de Ig. En una molécula de
anticuerpo, las tres regiones hipervariables de un dominio VL y las tres
regiones hipervariables de un dominio VH se unen para formar una superficie
de unión al antígeno.

Obs: Las asas hipervariables pueden imaginarse como unos dedos que
sobresalgan de cada dominio variable, tres dedos de la cadena pesada y tres
de la cadena ligera, que se juntan para formar una zona de unión al antígeno.

Como estas secuencias forman una superficie que es complementaria a la

estructura tridimensional del antígeno unido, las regiones hipervariables se llaman también
regiones determinantes de la complementariedad (CDR, complementarity-determining regions,
de color rojo). Procediendo desde los extremos amino terminales de VL o VH, estas regiones se
llaman CDR1, CDR2 y CDR3. Los CDR3 de los segmentos VH y VL son los CDR más variables y más
extensos. Las diferencias entre las secuencias de los
CDR de diferentes moléculas de anticuerpo
contribuyen a diferentes superficies de interacción y,
por tanto, a las especificidades de los anticuerpos
individuales. La capacidad de una región V de
plegarse en un dominio de Ig está determinada,
sobre todo, por las secuencias conservadas de las
regiones estructurales adyacentes a los CDR. La
limitación de la variabilidad de la secuencia a los tres
tramos cortos permite mantener la estructura básica
de todos los anticuerpos a pesar de la variabilidad
entre diferentes anticuerpos. Estas CDRs están
flanqueadas por regiones estructurales menos
variables (framework: FR1, FR2, FR3 y FR4, de color
amarillo).

Idiotipo: diferencias entre dos anticuerpos con diferentes aminoácidos en las regiones variables.

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Características estructurales de las regiones constantes del anticuerpo

Las moléculas de anticuerpo pueden dividirse en distintas

clases y subclases en función de diferencias en la estructura de
las regiones C de su cadena pesada. Las clases de moléculas de
anticuerpo se llaman también isotipos y se denominan IgA, IgD,
IgE, IgG e IgM. Las regiones C de la cadena pesada de todas las
moléculas de anticuerpo de un isotipo tienen prácticamente la
misma secuencia de aminoácidos, y es por tanto esta secuencia
es diferente en los anticuerpos de otros isotipos. Esta diferencia
es lo que provoca que cada isotipo realiza diferentes funciones
efectoras, la cual está mediada por la unión de regiones C de la
cadena pesada a receptores para el Fc en diferentes células
(como fagocitos, linfocitos NK o proteínas del complemento).

2. Generación de anticuerpos
Anticuerpos Policlonales

Inyectamos un antígeno a un ratón con el objetivo de

generar una respuesta inmune. Si tenemos suerte este
ratón empezará a generar anticuerpos, y si es un
antígeno complejo tendremos diferentes epítopos (lo
reconocerán diferentes anticuerpos). Cuanto más
grande sea el Ag mejor porque tendrá más epítopos. Si
sacamos sangre de este animal y separamos el suero
obtendremos antiserum: suero que contiene una
mezcla de anticuerpos monoclonales producido cada
uno por un clon específico de células B del ratón, cada
uno específico para uno de los epítopos que muestra el
antígeno. Todos los anticuerpos que podremos
purificar de este antiserum serán anticuerpos
policlonales: son una mezcla de anticuerpos dirigidos
cada uno contra un único antígeno (contra diferentes
epítopos de un antígeno).

Saber diferenciar entre plasma (sangre centrifugada y

sin células, aunque aun quedan factores de
coagulación) y serum (no hay mierda de proteina, más
puro).

Inconvenientes:

- El antisuero está compuesto por una mezcla de poblaciones de ac con afinidades

diferentes
- El antisuero está compuesto por una mezcla de poblaciones de ac con especificidades
diferentes

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- La producción de antisuero está limitado a la vida del animal inmunizado

- La cantidad de antisuero es limitada
- El ag debe ser puro
- Problemas si los ac los quiero utilizar en terapias en humanos

Anticuerpos Monoclonales

No es factible la purificación directa de anticuerpos monoclonales a partir de un preparado de

anticuerpos policlonales.

Un anticuerpo monoclonal se
obtiene si inmunizamos un ratón con
un ag (se hace varias veces para
estimular específicamente las células
B), se testa el nivel en sangre de ac,
se sacrifica el animal y se extrae el
bazo. Se separan las células
plasmáticas y se fusionan con una
línea celular de mieloma (célula
plasmática cancerígena). Se ha
desarrollado una técnica para
mezclar una célula B y un mieloma, y
se forma un hibridoma: posee las
propiedades de crecimiento inmortal
de la célula de mieloma y secreta
anticuerpos producidos por la célula B.

Es posible que los hibridomas no adquieran las

propiedades (% de fracaso) ya que en la fusión de núcleos
puede haber pérdida de cromosomas. Las células
plasmáticas que no se han fusionado son fáciles de
eliminar ya que tienen una vida media de días, y si no
tienen estímulos morirán de forma natural. El problema
está con la línea de mieloma. Lo que se hace es poner a las

células en medio HAT

(Hipoxantina, Aminopterina y
Timidina) que bloquea con la
aminopterina la Vía de Novo, y los
mielomas sin fusionar no podrán
producir los nucleótidos. Los
hibridomas podrán seguir la
producción de nucleótidos ya que
hay una vía alternativa (Vía
Salvage) y por lo tanto serán los
únicos que podrán sobrevivir.

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El hibridoma se pone en una placa de cultivo. Los clones resultantes de células de hibridoma,
que secretan grandes cantidades de anticuerpo monoclonal y son inmortales, se cultivan en cada
pozo una sola célula, que empezará a crecer y a formar más clones. Estos anticuerpos (Mab) se
llaman monoclonales porque vienen de única célula B, que es un clon de células híbridas -
hibridoma- en cultivo. Un ac monoclonal está compuesto por moléculas idénticas que solo
reconocen un solo determinante antigénico.

El primer anticuerpo monoclonal de ratón utilizado en humanos (1986) es el OKT3 dirigido

contra linfocitos T para el rechazo del trasplante de órganos. Lo malo es que proviene de ratón
y no es una opción muy eficaz a pesar de que funcionaba. A partir de aquí, como vemos en el
timeline, el campo de los ac monoclonales ha avanzado mucho y empiezan a utilizarse en
tratamientos clínicos.

(a partir de aquí se lo he robado a Fer)

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Tras esto, se realiza la separación. En los orígenes de la técnica se realizaban diluciones en placas
de 96 pocillos y se buscaban colonias aisladas en cada pocillo. Cada clon que caía en un pocillo
forma en un principio una colonia. Si caen dos se ven perfectamente dos colonias (aunque estén
pegadas) y no serviría pues no tendríamos el anticuerpo monoclonal. Actualmente es fácil
separar una célula por pocillo gracias a técnicas como FACS (cell sorters en general). Se puede
coger el sobrenadante y probar contra el antígeno. Si hay unión (buena respuesta), rápidamente
se replica y se congela para tener una alícuota sin alteraciones adicionales que afecten a las
características del anticuerpo o la estabilidad de la línea celular.

Podemos tener bastantes anticuerpos que responden contra mi antígeno, pero aún tenemos
que saber muchas más cosas; por ejemplo, contra qué epítopos van dirigidos estos anticuerpos
monoclonales. Para comprobar esto se realiza la reacción cruzada entre todos los clones. Así, se
adhiere un anticuerpo de un clon en la base de un pocillo; se añade el antígeno; y se añade
después el otro anticuerpo marcado. Si reaccionan contra el mismo epítopo, no tendremos señal
(pues el hueco estará ocupado), pero si no son específicos para éste, tendremos señal. (Se
pueden utilizar los anticuerpos contra sí mismos como control negativo). De esta manera
podemos determinar diferentes familias, siendo una aquella que recoge los clones que
reconocen un mismo epítopo. Si reconozco 5 familias, tengo 5 grupos de ac.

A partir de aquí, también podemos pedir que un laboratorio de síntesis peptídica nos sintetice
péptidos superpuestos que compongan toda la longitud de la secuencia aminoacídica del
antígeno (si hay 500aa en total, diseño del 1 al 20, del 2 al 21, del 2 al 22, etc). Así, si los fijamos
en una lámina de nitrocelulosa o nylon, podemos probar cada anticuerpo y ver con qué zona de
la proteína interaccionan. Aquí veríamos muy claro los determinantes antigénicos lineales. No
obstante es posible apreciar ciertas zonas marcadas, pero menos, que nos indiquen que hay un
determinante conformacional o discontinuo (más difícil).

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Otra opción es recoger el sobrenadante de cada clon/colonia, purificar el mRNA y obtener el

cDNA de las inmunoglobulinas expresadas. Así, hemos obtenido la secuencia. Se puede
amplificar fácilmente (PCR) y es posible clonarlo en un vector. Sobre éste se puede tratar de
realizar mutagénesis dirigida, para probar a aumentar la afinidad, etc. Este vector se
transformaría y se volvería a probar. También se puede coexpresar con proteína de fusión y
generar monstruitos variables con la parte que me interesa. Al clonarse se podría comenzar su
producción a gran escala.

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Y to esto pa que. Gracias a la clonación, las posibilidades que se abren son enormes:
construcciones tetraméricas, con otros dominios de proteínas o incluso hacer modificaciones en
cuanto a proteínas de fusión para simplificar. En la imagen de abajo tenemos unas cuantas de
las posibilidades, podemos hacer lo que nos dé la gana. Esto es gracias a que el dominio variable
de Ig es muy estable y permite hacer todo tipo de combinaciones. Por ejemplo se reduce el
tamaño molecular al mínimo en terapias con Lab on Chip (o como se llame).

Genoteca de Fagos

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Imaginemos por un momento alternativas. De hecho, imaginemos que no necesitamos un ratón,

ni un antígeno puro (en ocasiones muy difícil de obtener). Así, otras posibilidades es trabajar con
linfocitos B de un animal (inmunizado o no), e incluso con linfocitos B humanos. De éstos
obtenemos el mRNA y el cDNA, y realizamos una amplificación de las regiones variable ligera y
pesada por PCR utilizando ciertas zonas un poco más constantes de los extremos. Con esto
puedo generar genotecas combinatoriales de expresión en fagos. En ésta tendré todos los
anticuerpos que quiera, ya que tendremos todo el repertorio antigénico. De hecho, si se realiza
una buena conservación, con realizarlo una vez puedo mantener todo el repertorio de
anticuerpos para toda la vida.

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El vector fágido o fagémido es un bacteriófago filiforme con origen de replicación, gen de

selección de resistencia, etc. Uno de los extremos tiene 5 copias de la proteína G3 en la cual se
generarán unas bolitas formadas por región variable y constante unidas por la región linker. Esto
se transfecta en E.coli que expresan el resto de genes que componen el fago. Cuando ponga β-
galactosidasa se expresará la proteína fusionada (las otras se expresan constitutivamente) y solo
falta ésta para producir los fagos. Se producirán fagos y fagos.

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Se puede realizar esta técnica solo con la parte variable, o también añadiendo el primer dominio
constante (aportará mayor estabilidad al complejo), aunque también puede dar problemas de
adecuación al tamaño. En el siguiente esquema vemos los pasos a seguir para el protocolo.

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IMPORTANTE DE TODO ESTO: la secuencia linker para añadirla se utilizan dos PCR seguidas. Toda
esta combinación aleatoria de fragmentos se clona en fagémidos (que son plásmidos que
generan fagos), que al transformar E.coli (capaces de sintetizar todo el resto necesario) se
producen fagos con la proteína expresada hacia el exterior normalmente sobre proteína pIII del
fago filiforme, aunque como está en menor cantidad se puede hacer en pVIII (aunque puede
haber más restricciones en cuanto a tamaño, y estructura del fago). Cuando purifico linfocitos
B, a partir del número de 50 millones de células puedo obtener todo el repertorio (10 18) por
simple probabilidad, e incluso obtener cosas que no existen ni en la naturaleza. Si este proceso
se repite, el de selección del fago, podríamos tener una población homogénea de fagos al cabo
de 7 ciclos. También podríamos ir mirando la afinidad de un tipo concreto, y mejorarla.

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4. Humanización de anticuerpos

El problema de la utilización de anticuerpos de ratón es que nuestro propio cuerpo genera una
respuesta contra ellos en forma de HAMA (human anti-mouse Ab), lo que afecta directamente
a la capacidad terapéutica de los anticuerpos monoclonales por formación de inmunocomplejos
y patologías asociadas a hipersensibilidades de tipo III (enfermedad del suero, glomerulonefritis,
etc.).

Para evitar estos problemas se han intentado modificar estos anticuerpos murinos. Por un lado
tenemos los anticuerpos quiméricos que presentan la parte variable de origen murino, mientras
que la parte constante es humano (esto se realiza por técnicas de DNA recombinante). Por el
otro lado están los anticuerpos humanizados o remodelados en los que se insertan los
aminoácidos responsables del reconocimiento (solo unos pocos) en la secuencia de una
inmunoglobulina humana (es decir, se reemplazan los CDR originales).

Aunque parezca lógico seguir el esquema de arriba, realmente se trabaja con una genoteca de
fagos, y se clona en solo lo que nos interesa. Ahora se están creando anticuerpos monoclonales
humanos producidos directamente en ratones.

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Un anticuerpo presenta diferentes tipos de determinantes:

 Determinantes isotípicos: están en la región constante y son los que distinguen cada clase y
subclase de inmunoglobulina dentro de cada especie.
 Determinantes alotípicos: son sutiles diferencias en la secuencia de aminoácidos codificadas
por los diferentes alelos de los genes de cada isotipo. Las diferencias alotípicas se detectan
comparando la misma clase de anticuerpos en diferentes cepas (individuos).
 Determinantes idiotípicos: se generan por la conformación de la secuencia de aminoácidos
de la cadena pesada y ligera de la región variables específica para cada antígeno. Cada
determinante individual se denomina idiotopo y la suma de todos los idiotopos individuales
es el idiotipo.

A partir de aquí, veremos los pasos a seguir para humanizar anticuerpos. Básicamente consiste
en insertar las CDR que nos interesen entre las FR aceptoras que conforman la región variable
del anticuerpo. ¿Cómo se hace? “A lo burro”, PCR secuenciales en donde se va acumulando el
producto hasta conseguir la cadena completa que buscamos. Por este motivo es importante
tener en cuenta la fidelidad de la polimerasa. Por lo que se recomienda el uso de polimerasas
de alta fidelidad para evitar la introducción de mutaciones que alteren el producto.

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La inserción de CDR murinos en modelos de anticuerpos humanos supone muy a menudo la

pérdida de la afinidad del anticuerpo hacia su antígeno. Esto se debe a que determinados
residuos de las regiones estructurales (FR) participan e influyen sobre la estructura del CDR y su
contacto con el epitopo. Para mantener esta afinidad muy a menudo es necesario retocar y
optimizar las FR.

El proceso para determinar las sustituciones y cambios en las regiones FR (habrá que hacer para
mantener la estructura), y en su caso a veces dentro de las regiones CDR se realiza siguiendo un
proceso de modelización y requiere técnicas de bioinformática. Posteriormente las predicciones
y sustituciones realizadas se ensayarán experimentalmente (BIACORE, ahora lo veremos) para
comprobar la mejora o pérdida de la afinidad del anticuerpo respecto al antígeno.

Hay que tener en cuenta que cristalizar un anticuerpo es relativamente fácil puesto que están
muy estandarizados, y se obtiene modelos en cristal de la construcción y se pueden observar los
ajustes en su conformación “real” después de las simulaciones.

Para determinar la eficacia de un anticuerpo rediseñado se pueden hacer varias pruebas, ya sea
por ELISA o por su efecto práctico directo. Esto da datos orientativos, pero sí de verdad
queremos obtener datos fiables y precisos tendremos que pasar a hacer BIACORE. Lo malo de
estos además, es que necesitan mucho tiempo de realización, requieren una purificación del
anticuerpo, etc.

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Para mayor rapidez, y precisión utilizamos la técnica BIACORE que toma medidas de manera
óptima de la interacción entre un ligando y un receptor. Se utiliza un microcapilar con una base
de oro e incide un láser sobre la base de oro que es tan fina que es trasparente. Este haz es
reflejado y refractado. Cuando solo hay tampón en el capilar se tiene una señal base. Se
introduce en el tubo un analito y se engancha a la superficie de oro y se ajusta la señal para que
se mantenga baja. Entonces se hace pasar el anticuerpo, si se une se generará una variación de
la resonancia de la superficie del plasmón y por tanto el grado de apertura de incidencia varía,
lo que genera una subida considerable de señal. Puede acabar saturándose (final de la subida).

Para desenganchar se utiliza una solución de elevada fuerza iónica (con cloruro sódico) y la señal
baja porque está lleno de sales, luego se limpia con tampón y queda la señal base. Esto dura
fracciones de minutos. La altura y la curvatura (disociación) es lo que nos da la intensidad de la
unión del antígeno al anticuerpo (en este caso), aunque podría ser interacción entre dos
moléculas cualesquiera: proteína-proteína, DNA-proteína, DNA-DNA, etc.

Ver en esta imagen la comparación de diferentes estructuras (se especifican en el siguiente

punto del tema). Ver diferencias en unidades: por ejemplo, scFv alrededor de 13000, mientras
que los dímeros y tetrámeros llegan hasta casi 15000. Las diferentes líneas son diferentes
concentraciones.

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Otras vías de humanización

Aquí se utilizan ratones transgénicos que producen inmunoglobulinas humanas. No hay reacción
contra la parte de ratón (pues no la hay). Se están aprobando para su utilización en clínica (hay
una tabla en el power). En este caso se centra mucho en cáncer, y es bastante prometedor en
general.

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5. Manipulación de anticuerpos

El mismo dominio se puede encontrar de múltiples maneras. Se juega mucho con el fragmento
scFv, y se coloca de mil maneras como vemos en la imagen de abajo (jugando con dímeros y
monómeros).

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No solo se pueden unir entre sí, sino que se pueden unir con una gran variedad de estructuras
para obtener dímeros, trímeros y tetrámeros. Por ejemplo una cremallera de leucina o dominios
alfa hélix-loop-alfa hélix pueden generar dímeros. Para obtener tetrámeros se puede usar
también cremalleras de leucina o dominios de unión de p53 (que en la naturaleza es un
tetrámero).

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En esta imagen observamos múltiples posibilidades que tenemos a la hora de modular un

anticuerpo. Ver que hay mucha variabilidad.

En la imagen de la página siguiente tenemos la manipulación de anticuerpos con otro ratón. Es

un trabajo comparativo de diferentes construcciones. Es muy explicativo. Por ejemplo, resaltar
que cuanto más raro sea, menor será su vida media en sangre. No obstante esto puede variar a
la hora de atacar su diana (puede ser un tumor por ejemplo). Así, el de mayor tamaño identifica
el tumor bien, pero tiene bastante ruido de fondo. Conforme disminuimos el tamaño se
aumenta la precisión: hay que llegar a un equilibrio, para tener la especificidad (llega mejor a su
diana) que deseamos manteniendo una vida media de interés.

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*De CAR no ha explicado nada porque tenemos el seminario entero. Por si acaso leeros las
diapositivas del power para el parcial por si entra algo (no las pongo porque no ha dicho nada).

Aproximaciones biotecnológicas

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Los anticuerpos son generalmente iguales en secuencia, pero existen fuertes variaciones como
por ejemplo las modificaciones de glucosilación que sufren en su dominio constante. Estas
modificaciones son las que permiten que la vida media de los anticuerpos sea alta y facilitan y
estabilizan la interacción entre las dos cadenas pesadas. Se ve que depende del estado del
hibridoma puede haber variaciones dentro del mismo anticuerpo (no son células estables). Por
este motivo es importante reducirlas todo lo posible (dejando lo esencial o lo que nos interese)
para reducir problemas en las glucosilaciones. También puede haber pequeñas modificaciones
de este tipo en la región variable.
También podemos jugar con los puentes disulfuro para dar más movilidad a la molécula
(flexibilidad), con la longitud del cuello, etc.
En cierto modo también se pueden modificar el número de cargas que reconocen las partes
constantes, por ejemplo aumentar la activación del complemento, aumentar la respuesta ADCC,
promover propiedades antiinflamatorias, etc. Se pueden conjugar con radionucleos, fármacos
quimioterapéuticos, toxinas, etc, dejando al anticuerpo como mero vehículo para dirigir la
terapia. Esta conjugación se suele realizar por enlace químico (reacciones ácidos frente a
residuos de Gly), esto es típico de la cola (Fc), aunque hay que vigilar donde ocurre.
*No ha explicado toda la imagen en clase pero yo que vosotros me la leería.

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Se están estudiando también anticuerpos de otros animales para abrir más posibilidades en
cuanto a conformación se refiere (camello, tiburón, etc.).

Hay mil posibilidades de poder usar los

anticuerpos: conjugados con todo lo
de la imagen de abajo. En terapia
contra el cáncer también se está
investigando bastante.

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Aquí, en la imagen de arriba se ha conjugado con auristatina que actúa como antiinflamatorio
(creo). Hay más ejemplos, pero no hay que aprender, solo que hay muchas posibilidades (tabla).
Por ejemplo conjugación de anticuerpos con “fármacos” (anticuerpos terapéuticos), se puede
hacer con alguno muy específico pero que sean funcionales, por ejemplo, tan solo en el interior
celular. La gran mayoría por ahora son antitumorales. Por ejemplo la conjugación se genera con
un enlace sensible a pH ácido, de manera que cuando se internaliza por el endosoma (medio
acidificado), y se libera en el interior celular donde actúa.

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6. Obtención de anticuerpos

En procariotas no se puede obtener en un principio, pero sí que se utilizan para hacer dominios
de inmunoglobulinas que no necesiten extensas modificaciones post-traduccionales (ni muy
importantes), como por ejemplo los scFv.

Por estos motivos, se suelen utilizar células

eucariotas por restricciones de tamaño,
modificaciones post-traduccionales,
plegamiento, etc. No obstante, el proceso de
desarrollo y producción y utilización de estos
dura aproximadamente unos 12 años de
media. Últimamente se han disparado aquellos
que provienen de ratones transgénicos:
humanos producidos en ratones.
Es importante también el escalado e ir
ajustando parámetros de producción, y se
siguen pasos progresivos aumentando el
tamaño del reactor.

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El proceso de producción tiene muchísimos procesos como los que vemos en el esquema
siguiente.

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7. Aplicaciones
Como vemos, las aplicaciones principales son cáncer, autoinmunidad e inflamación (ver tabla).
Esta tecnología pese a conocerse hace más de 30 años, pero se ha comenzado a darle impulso
comercial ahora, pues hasta hace pocos años no era posible, o no se había conseguido. Mirar la
última gráfica que mira el aumento brutal en terapia de los anticuerpos humanos generados en
ratones transgénicos, frente a los utilizados antes.

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Un tumor está plagado de células T reguladoras que generan un ambiente “regulador” en torno
al tumor, donde puede activarse el complemento, pero debido a las T reguladoras existe un
“escudo” que mantiene el resto del sistema inmune alejado y reprimido gracias a citoquinas y/o
quimiocinas. Por ejemplo así, la utilización de un anticuerpo contra CD25 (contra células T
reguladoras) permite eliminar estas células por ADCC y otros mecanismos para facilitar que
nuestro sistema inmune ataque al tumor. En la imagen de abajo vemos un esquema-resumen
de lo explicado aquí.

Por ejemplo, para la autoinmunidad y problemas de inflamación podemos tratar de reprimir la

acción del TNF-alfa, que es el culpable de este tipo de problemas.

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Se han construido muchos tipos de anticuerpos para bloquear esta moléculas (TNF). Tenemos
desde quiméricos (infiliximab), a humanos, y la utilización de scFv PEGilados (la adición de PEG
aumenta la vida media en sangre del anticuerpo). También se ha clonado el receptor del TNF en
un fragmento Fc para tenerlo directamente. Todos se utilizan, pero para usos muy concretos
cada uno, no para todas las enfermedades cualquiera, sino que su eficiencia es mejor o peor en
función de la patología.

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Se han intentado utilizar anticuerpos como enzimas, y aunque parezca una chorrada irrealizable,
ha funcionado. Se fabrican siguiendo el siguiente esquema utilizando moldes de anticuerpos.

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Aquí, tenemos el esquema que demuestra su actividad. Una enzima tiene como función bajar la
energía de activación para una reacción específica. Efectivamente, estos anticuerpos-enzimas
son capaces de realizar esto con bastante eficacia.

Finalmente, están las plantas que producen anticuerpos, los “plantibodies”. No ha dicho gran
cosa sobre esto. “Plants produce Assembled Antibodies”. Como vemos abajo, los efectos son
muy similares a un anticuerpo de mamífero.

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8. bNAbs (broadly Neutralizing Antibodies)

Los bNAbs son anticuerpos de amplio espectro y con una potente capacidad de neutralización.

Tardamos entre 2 y 3 años después de la infección en generar estos bNAbs y cuando aparecen,
las personas dominan la infección con elevada garantía (solo el 20% de las personas son
capaces). Es muy interesante a nivel vacunal ya que si conseguimos los péptidos específicos para
generar un estímulo que vaya directamente a estimular esta respuesta, la efectividad de la
vacuna será inmensa. Tendremos por lo tanto una vacuna preventiva y hasta una vacuna
terapéutica, las personas que ya tengan la infección se podrán curar.

Por ejemplo, se analizaron 1800 sueros de personas infectadas con HIV-1 (Tailandia, Australia,
UK, USA, Países subsaharianos) y se generaron 30000 clones de linfocitos B productores bNAbs
capaces de unirse a: gp120 (JR-CSF), a gp41 (Complejo trimérico, Env, HxB2) y de neutralizar a
los virus JR-CSF y SF162.

Para hacer el experimento y descubrir nuevos Ab monoclonales humanos, se utilizó un sistema

de cultivo de células B a corto plazo para testar el repertorio de células B de memoria. Las células
B de memoria que expresan IgG de superficie se enriquecieron a partir de células mononucleares
de sangre periférica del donante infectado con HIV-1 por depleción negativa con anticuerpos
contra CD3, CD14, CD16, IgM, IgA, IgD en bolas magnéticas (Miltenyi, Auburn, CA). Para
promover la activación de células B, la proliferación, la diferenciación terminal y la secreción de
anticuerpo, se sembraron 30300 CD19+ sIgG+ células B de memoria en placas de microtitulación

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de 384 pocillos con una densidad media de 1,3

células/pocillo en presencia de feeder cells y
medios acondicionados generados a partir de
células T humanas de donantes sanos
(estimuladas con mitógeno).

A la derecha tenemos el resumen de las

actividades de unión y neutralización de
sobrenadantes de pocillos de células B. Los
valores dentro de los círculos representan el
número de sobrenadantes de células B con los
perfiles de unión y/o neutralización indicados.
46,5% de sobrenadantes de células B que
neutralizaron HIV-1SF162 y 97,7% que
neutralizaron HIV-1JR-CSF no se unieron a gp120JR-CSF o gp41HxB2 monomérico, según se
determinó mediante ELISA.

En la imagen tenemos diferentes tipos de HIV enfrentados a diferentes clones de células B. Los
más en rojo tienen más capacidad de infección, y éstos son los bNAbs.

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¿Qué reconocen los bNAbs?

La envoltura del VIH-1 lleva espigas. En

la imagen a vemos que cada pico se
compone de tres moléculas de la
glicoproteína de superficie gp120 y tres
moléculas de la glicoproteína
transmembrana gp41 (proteína
escondida). La glicoproteína gp120
contiene bucles variables V1/V2 y V3,
así como el sitio de unión para CD4. En
la imagen b se marcan los sitios de
unión de anticuerpos neutralizantes
específicos de HIV-1 (círculos rojos). Se
estudia la base de la gp41, aunque los lugares diana que se están investigando hoy en día son la
base del bucle V3 y el sitio de unión a CD4 de la proteína gp120 (círculos verdes) ya que está más
expuesta.

Cuando la gp120 contacta con el CD4, la gp41 lanza unos garfios hidrofóbicos contra la mbna de
la célula que se tiene que infectar y hay fusión de membranas del virus con la célula.

Hay que tener en cuenta que la glicoproteína gp120 está llena de glicosilaciones y por tanto es
difícil generar Ab con elevada eficiencia contra esta proteína, es una estrategia del HIV-1.

9. Generación de un ratón humanizado

Como que no se puede coger al ser humano como modelo, se humanizan ratones. Para ello se
cogen ratones NRG, también llamados NOD-Rag1null IL2rynull double mutant mice or
NOD.Rag1KO.IL2RycKO mice, ya que son ratones NOD con un KO para Rag en el cromosoma 2
(no producen ni linfocitos B ni T) y tampoco producen IL2 (mutación en cromosoma X) - inútiles
Estos ratones se utilizan para estudios de trasplante celular y tisular, en particular como modelo

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de estudios de trasplantes de células linfohematopoyéticas donde se requiere radioresistencia

del huésped.

Lo que se hace es coger hígado fetal humano, se purifican las HSC y se inyectan a razón de 1,5-
2x105 (son poquitas) en un ratón de 1-5 días que 6h antes se ha tratado con mieloablativos
(quimioterapia). En unas 8 semanas tendremos un ratón humanizado, expresa el sistema
inmunitario completo. Cuando infectemos con HIV responderá como si fuese una persona.

Como podemos ver en la progresión de la infección por el HIV, hay un aumento de copias del
virus, hay una bajada de T CD4 (primeros linfocitos que mueren) y el virus muta con la misma
frecuencia que lo hace en humanos. Por lo tanto vemos que es un muy buen modelo
experimental pero es muy caro.

9. Tratamiento con anticuerpos

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Se hace un estudio de inmunoterapia con 5 bNAbs en ratones

humanizados infectados por HIV. Cada animal recibe 0,5 mg de
forma subcutánea cada semana o cada dos semanas. Podemos ver a
los 6-7 días en el gráfico cómo hay Ab más eficientes que otros (por
ejemplo 45-46 baja dos logaritmos el número de copias del HIV, es
más efectivo). El problema fue que a los 30 días, los Ab que
funcionaban mejor habían fracasado. ¿Que ha pasao? El virus ha
mutado.

En los quesitos tenemos las mutaciones de la gp120 de los diferentes animales tratados con cada
Ab monoclonal dependiendo del epítopo.

Aquí tenemos la secuencia de la gp120

para cada Ab a los 30 días. En verde están
marcados los silentes (no generan nueva
secuencia) y en rojo las sustituciones
reales. Si nos fijamos, las mutaciones
están alineadas en lugares específicos,
que es el epítopo que reconoce el Ab. Por
presión selectiva se favorecen los
mutantes para esta zona ya que los Ab no
los reconocerá y por lo tanto el HIV
sobrevivirá.

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Con un Ab no hay suficiente para parar la infección, pero se ha visto que si se combinan los Ab,
hay ratones que son capaces de dominar completamente la infección, se curan. Esto es porque
con 5 Ab a la vez se hace una presión selectiva tan grande que aunque el HIV tenga mutaciones,
el virus no lo podrá superar y el ratón ganará. En el estudio todos los ratones (menos 2 que
murieron por GVHD) bajaron el número de copias del HIV por debajo del basal.

Hay que tener en cuenta que las mutaciones en a gp120 que aparecen en los animales tras el
tratamiento quíntuple NO son las mismas que las de los animales que sucumben y TAMPOCO
son coincidentes.

En este estudio se hace una segunda infección con HIV después de una terapia con anticuerpos
(ID21 es una mezcla de 3 bNAbs (tri-mix) y ID129 es un penta-mix).

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Lo bNAbs presentan mayor tasa de mutación en los FWR que en los CDR (ver números derecha).
Los dos Ab son altamente neutralizantes del HIV-1, mientras los de abajo tienen una
neutralización limitada. Podemos observar la diferencia en el número de mutaciones. Si
revertimos tanto los CDR como los FWR, perdemos la neutralización; si revertimos los FWR de
los Abs poco neutralizantes, no varía en exceso la neutralización.

1 Sin mucha neutralización

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El HIV tiene 3 sistemas de infección que por mucho Ab que tengamos, no lo podemos parar. Son
infecciones sinápticas célula-célula (diana y donante) y el virus entra en contacto en ese mismo
momento. En el caso de las DC, éstas no integran al virus en su genoma pero sí son portadoras
(DC-SIGN marca actina). El tercer caso es la sinapsis virológica combinada con células mieloides.

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