MI

1.
Puriﬁcación parcial de la PPO

1.a. Preparación del extracto crudo
Se toman entre 40 y 50 gramos de plátano y champiñón , y por separado se homogeneizan
con una homogeneizador de cuchillas (en este caso se puede utilizar una batidora), con 200
mL de la disolución de tampón TPK (tampón fosfato potásico) 20 mM, 10 mM NaCl, 1%
PEG 8000 y 1% Triton X-100.
A continuación se centrifuga la muestra durante 30 minutos a 13000 g a 4ºC. La
centrifugadora debe estar bien equilibrada para que el eje no sufra. Después de la
centrifugación se toma el sobrenadante,que es donde se encuentran las proteínas, vertiéndolo
con cuidado en un vaso de precipitados.
Se guardan 20 ml de sobrenadante, que va a ser el extracto crudo que se utiliza
posteriormente.
De estos 20 ml se toman de 1 a 1,5 ml, los cuales se guardan a 4ºC y se usan posteriormente
para medir actividad, para electroforesis... El resto se precipitan con acetona.
1.b. Precipitación con acetona.

Se añade a los 15 ml de sobrenadante restantes 1,6 veces el volumen de acetona, es decir 24
ml, que tiene que estar a -80 ºC.
Se agita por inversión.
A continuación se incuba al menos 10-15 minutos en hielo y sal en proporción 3:1, para crear
una mezcla criogénica.
Se centrifuga durante 30 minutos a 15000 g entre 0-4 ºC y se toma el precipitado, retirando
primero el sobrenadante.
Se resuspende la mitad del volumen original con 7,5 ml de TPK 40 mM pH 8 y se incuba toda
la noche a 4ºC. (CUANTO GUARDAMOS DE ACETONA).
1.c. Cromatografía de intercambio iónico

En primer lugar se prepara la columna. Para ello se agita el tubo que contiene 10 ml de resina
hasta que ésta se quite de las paredes. Luego se vierte en la columna hasta que se asiente.
A continuación se lava o equilibra con 5 volúmenes, es decir 50 ml de TPK 40 mM pH 8.
Se debe tener cuidado de que la columna no se quede sin líquido para que no se seque y para
que el líquido no baje se coloca una pinza en el extremo inferior.
El precipitado resuspendido anteriormente, se vuelve a centrifugar a 15000 g durante 30
minutos. Se recupera el sobrenadante y se mide el volumen. Se guarda 1 ml de ese
sobrenadante en un ependorf y el resto se carga en la columna. Si no hay suficiente volumen
de sobrenadante para cargarlo, se vuelve a centrifugar el precipitado a 15000 g durante 12
minutos a 4ºC.
Al siguiente día se vuelve a verter TPK 40 mM pH 8 hasta llenar la columna, dejando que
caiga hasta el límite de la resina para lavarla. Se utiliza ese tampón porque es con el que se ha
suspendido la proteína.
Se numeran los tubos de ensayo, hasta 50, para recoger las fracciones posteriormente.
A continuación se aplica la muestra y se comienza a recoger fracciones de aproximadamente 5
ml, vertiendo poco a poco 100 ml de TPK 40 mM pH 8.
Al acabar este tampón se comienza a verter 50 ml de TPK 80 mM pH 8, recogiendo
fracciones de 2,5 ml.
Se lava de nuevo la columna con una disolución de 25-40 ml de TPK 100 mM pH 8 y NaCl
0,1 M y se recogen fracciones de 2,5 ml.
2. Medida de la actividad PPO

Para agilizar el proceso, mientras se recogen las fracciones, se mide la absorbancia en el
espectrofotómetro a una longitud de onda de 280 nm, y se apuntan los resultados. Para hacer
los blancos en el espectrofotómetro se utilizan los tampones usados en la columna
anteriormente.
Al terminar se guardan las fracciones a 4ºC.
Para medir la Δabsorbancia / minuto de la proteína, se utiliza una mezcla de reacción con
TPK 100 mM pH 7, dopamina 20 mM (preparada a partir de dopamina 40 mM diluída en
TPK 100 mM) y la enzima contenida en las fracciones recogidas.
Para medir la Δabsorbancia / minuto de la proteína en cada fracción, primero se mide el
blanco que es el TPK 100 mM pH 7. A continuación, para cada fracción se vierte en la cubeta
con las pipetas adecuadas 0,75 ml de TPK 100 mM pH 7, 0,75 ml de dopamina 20 mM y 50
µl de la fracción y se mezcla con ayuda de la pipeta. Se mide la absorbancia durante 1 minuto
en el espectrofotómetro con una longitud de onda de 470 nm. Se debe tener cuidado al recoger
la dopamina porque es fotosensible, por lo que se vierte en la cubeta dentro del
espectrofotómetro y tapar el recipiente.
También se mide la actividad de la proteína del extracto crudo y de la muestra que contiene
acetona.
Se anotan los valores obtenidos de la Δabsorbancia / minuto.
A continuación se calcula la actividad específica y la actividad total de las fracciones que
presentaban mayor actividad.
Se guardan las fracciones que mayor actividad específica presentan y se mezclan.
Se mide la actividad de la proteína con dos sustratos diferentes, una vez el sustrato es
dopamina 18 mM y otra es 4- metilcatecol 6 mM.
Primero se mide dos o tres veces la actividad de la enzima del extracto crudo. Para ello se
pone en la cubeta del espectrofotómetro 1,5 ml de dopamina 18 mM y se marca auto cero, se
añaden 50 µl de la enzima y se comienza la medición. De los valores obtenidos se hace una
media y se apuntan.
El mismo proceso se realiza con el precipitado de acetona y las fracciones guardadas
anteriormente. Una vez obtenidas las medias de las actividades, se sigue el estudio de la
actividad solo con la muestra que mayor actividad presente.
Se mide la actividad de la proteína dos o tres veces, de la misma forma, en concentraciones de
dopamina cada vez más diluída con TPK 100 mM pH 8, siempre dando una suma de 1,5 ml
entre el TPK y el sustrato. Éstas concentraciones son, 9 mM, 6 mM, 3 mM, 1,5 mM y 0,75
mM.
Utilizando las medias de la actividad en cada concentración se realiza un gráfica de Michaelis
Menten.
El proceso anterior de medición de la actividad de la proteína se repite, utilizando como
sustrato 4-metilcatecol en lugar de dopamina. Se realiza otra gráfica de Michaelis Menten.
3. Cuantiﬁcación de proteínas
3.a.Método espectrofotométrico
Se calcula la conentración de proteína siguiendo la siguiente fórmula:
[proteína] (mg/ml) = 1,55 Abs280 – 0,76 Abs260
Para ello se preparan las muestras junto con TPK 40 mM pH 8, con el que se ha hecho
previamente el blanco, en cubetas de cuarzo y se mide su absorbancia a una longitud de onda
de 280 nm y 260 nm, se obtienen los resultados y se aplica la fórmula, obteniendo la
concentración de proteína.
3.b. Método de Bradford
Para ver la concentración de proteínas por este método se utiliza un ensayo en placa
multipocillos. Se necesita un patrón, que en este caso es la ovoalbúmina en una concentración
de 10 mg/ml, el reactivo de Bradford diluido 1/5 y las muestras.
Se preparan dos diluciones con TPK 40 mM pH 8 de cada muestra.
Para el extracto crudo una diluida 1/10 y otra 1/20; para la acetona una diluida 1/5 y otra 1/15
y para las fracciones una diluida 1/5 y otra 1/15.
Se realizan una serie de diluciones a partir de los 10 mg/ml de ovoalbúmina con TPK 40 mM
pH 8 para preparar el patrón, 250 µg/ml, 200 µg/ml, 150 µg/ml, 100 µg/ml, 75 µg/ml y 50
µg/ml.
En la placa multipocillo se pone la ovoalbúmina en las columnas 1 y 2, excepto en la letra A
que se pone el tampón que actúa como blanco.
Se ponen las diluciones preparadas anteriormente de las muestras en dos pocillos con ayuda
de una pipeta, el extracto crudo 1/10 en la letra A y el 1/20 en la letra B. La acetona 1/5 en la
C y el 1/15 en la D. La fracción 1/5 en la E y la 1/15 en la F. Por último se echan 200 µl de
reactivo de Bradford 1/5 en todos los pocillos.
Se mide la actividad de todas las muestras en un espectofotómetro UV-visible para placas
multipocillo con una longitud de onda de 595 nm.
Con los valores obtenidos se realiza una recta de regresión con la que obtenemos la
concentración de proteínas en mg/ml.
4. Electroforesis de proteínas
4.a. Electroforesis desnaturalizante (SDS-PAGE)
4.b. Electroforésis no desnaturalizante (sin SDS ni ß-mercaptoetanol)
Se prepara la placa de electroforesis y se comienza a preparar el gel.
Para ello se debe preparar un separador y un concentrador.
Para el separador se mezclan en orden 2ml de H20, 1,7 ml de acrilamida 30% (es una
neurotoxina), 1,3 ml de Tris 1,5 M pH 8,8, 0,05 ml de SDS 10%, 0,05 ml de PSA (persulfato
amónico) 10% y 0,02 ml de TEMED. Se vierte en la placa y se espera hasta que gelifique.
Para el concentrador se mezclan en orden 1,4 ml de H20, 0,33 ml de acrilamida 30%, 0,25 ml
de Tis 1M pH 6,8, 0,02 ml de SDS 10%, 0,02 ml de PSA 10% y 0,002 ml de TEMED. Se
vierte en la placa y se coloca el peine para crear los pocillos.
A continuación se preparan dos muestras de extracto crudo, dos de acetona y dos de
fracciones, que tendrán 100 µl de muestra y 10 µl de tampón de carga, una de ellas carece de
b-mercaptoetanol y se guarda a -20 ºC y la otra contendrá b-mercaptoetanol que se calienta
durante 5 minutos a 95 ºC y posteriormente se guarda a -20 ºC.
Para realizar la electroforesis, se quita el peine y se lavan con agua destilada los pocillos y se
seca.
Se pone tampón de electroforesis en el cátodo de la placa y también en la base y se limpian
los pocillos con dicho tampón. A continuación se pone 5 µl de marcador en el pocillo 7 y se
ponen 25 µl de muestra en cada pocillo.
El marcador contiene a-macroglobulina 180 kDa, b-galactosidasa 116 kDa, lactoferrina 90
kDa, Piruvato kinasa 58 kDa, fumarasa 48,5 kDa, lactato deshidrogenasa 36,5 kDa y triosa
fosfato isomerasa 26,6 kDa.
A la izquierda del marcador se colocan las muestras que contienen b-mercaptoetanol por
orden, extracto crudo, acetona y fracción de champiñón y a continuación de plátano. A la
derecha del marcador se pone extracto crudo de champiñón y plátano y en el último pocillo a
elección propia.
Comienza la electroforesis poniendo 35 miliamperios por gel durante 45 o 60 minutos.
Después se saca la placa, se quita el concentrador y se corta el separador a la altura del
marcador. Las muestras con b-mercaptoetanol se sumergen en oriole en una placa de Petri y
se envuelven en papel de aluminio y se agita en la placa agitadora durante 40 minutos.
Las muestras sin b-mercaptoetanol se sumergen en tampón 100 mM pH 7 en otra placa de
Petri, se retira el tampón y se pone dopamina. Luego se colocan en la placa de luz para
visualizar las bandas.
A continuación se hacen las fotos de ambas bandas

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Puriﬁcación parcial de la PPO

1.b. Precipitación con acetona.

1.c. Cromatografía de intercambio iónico

2. Medida de la actividad PPO

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