Química farmacéutica, grupo 5-CIE –C

VALIDACIÓN Y CUANTIFICACIÓN DE METODOS ANALITICOS POR CROMATOGRAFÍA

LÍQUIDA DE ALTA EFICACIA

Domínguez Daniela, Herrera Melani, Ramírez

Sergio, Rodríguez Faizury

Sábado 25 de Mayo de 2019

RESUMEN

Mediante el presente estudio se realizará la cuantificación de varias muestras;

parabenos, paracetamol, cafeína y amoxicilina, haciendo uso de HPLC y llevando a cabo
diferentes métodos como patrón interno, patrón externo, y validación de una técnica
analítica, para finalmente obtener así concentraciones experimentales que serán
comparadas con las teóricas siendo posible resaltar la exactitud que posee el instrumento
de trabajo; además de características externas como la preparación de las muestras, que
podrían afectar los resultados.

Palabras Clave: HPLC, patrón interno, patrón externo

ABSTRACT

Through this study, the quantification of several samples will be carried out; Parabens, paracetamol,
caffeine and amoxicillin, using HPLC and carrying out different methods as internal pattern, external
pattern, and validation of an analytical technique, to finally obtain experimental concentrations that will
be compared with The theoretical is possible to highlight the accuracy of the work instrument; In addition
to external characteristics such as the preparation of the samples, which could affect the results.

Key Words: HPLC, internal pattern, external pattern

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1. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

ANÁLISIS DE PARABENOS

A continuación se muestran los cromatogramas

correspondientes al estudio.

Cromatograma # 3 80% ACN 1mL/min en fase

móvil, concentración de 0,001 mg/mL.

Cromatograma # 1 100% ACN 1 mL/min en fase

móvil, concentración de 0,001 mg/mL.

En este cromatograma podemos observar que

el tiempo de retención; que es el punto más
alto del analito transcurrido entre la inyección
de la muestra y la aparición de la respuesta
máxima inicio 1,15 minutos con un ancho
banda 0,4 mm para el caso del metilparabeno y
Cromatograma # 4 80% ACN 1,5mL/min en en
en el caso del propilparabeno el tiempo fase móvil, concentración de 0,001 mg/mL.
retención inicio 1,25 minutos con un ancho de
banda de 0,1cm .

Cromatograma # 5 70% ACN 1,0mL/min en en

fase móvil, concentración de 0,001 mg/mL.
Cromatograma # 2 90% ACN 1mL/min en fase
Para los cromatogramas de 2 a 5 el tiempo de
móvil, concentración de 0,001 mg/mL.
retención y el ancho de banda se analizó igual

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que el cromatograma uno pero se puede En los analitos que es inadecuada, la resolución
observar tabulado los resultados en la tabla # 1 de picos adyacentes puede mejorarse ya sea
aumentando la separación entre los picos o
Las bandas analizadas anteriormente de los
disminuyendo los anchos de los picos
analitos se ensanchan gradualmente conforme
individuales. El cromatograma # 2 muestra una
emigran a través de la columna cromatográfica
buena eficiencia, pero podría tener una mejor
según el estudio de los parabenos siendo el
selectividad, el cromatograma # 3 y 4 muestran
primero pico el metil ya que es positivamente
una buena eficiencia y selectividad.En cuanto a
más polar a comparación del propil .
los principios los RS = 1.0, es este caso para
La resolución de los analitos individuales en 80 % ACN 80% 1,0mL / min, 80 % ACN 1,5 mL/
bandas discretas ocurre solamente en las min y el 70 % ACN 1,0 mL / min que
bandas que se ensanchan en menos medida que corresponde aproximadamente a un 3% de
lo que se separan los máximos de los picos. Los sobreposición (contaminación cruzada) de las
valores en la línea base de los anchos de bandas áreas de los picos.
adyacentes son casi constantes. Analizando los
cromatogramas anteriormente estudiados
pudimos denotar que el 80 % ACN 80% 1,0mL
/ min, 80 % ACN 1,5 mL/ min y el 70 % ACN
1,0 mL / min estos analitos cumplen con la
resolución ya que es, W2 = W1, no es
exactamente igual pero sus valores son
similares.

Cromatograma # 6 solapados de la
Cuantificación cafeína

Bajo condiciones del analito entre la fase

estacionaria y móvil es lineal. De todas maneras,
conforme la banda de soluto pasa a través de la
columna cromatográfica se ensancha y la
concentración en el máximo del pico disminuye.
Este ensanchamiento finalmente afecta la
resolución de las bandas de analitos
adyacentes. En el caso de la eficiencia el mejor
cromatograma en nuestro estudio, ninguno
Tabla # 1 Reconocimiento de los analitos cumple exactamente, pero el Cromatograma # 2
del metilparabeno y propilparabeno. 90% ACN 1mL/min en fase móvil, concentración
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de 0,001 mg/mL. muestra la mejor eficiencia al aceptado que es de 97-103 %,

comparado con los anteriores. considerándolo como satisfactorio y exacto.

Las concentraciones halladas STD mg / ml de

los patrones están dentro del rango válido para
CUANTIFICACIÓN DE ACETAMINOFÉN
la técnica que se utilizó. Es decir, que están por
encima del mínimo de concentración de analito
cuantificable por la técnica de cuantificación y
validación. Este mínimo es conocido como límite
mínimo cuantificable. El estudio nos arroja
también que está por debajo del límite de
linealidad. La relación lineal entre concentración
y área no se suele mantener a altas
concentraciones y el límite de linealidad marca
la concentración máxima para la cual la curva
de calibración nos arrojó fiabilidad.
Cromatograma # 7 solapados de la cuantificación
del acetaminofén .

CUANTIFICACIÓN CAFEÍNA

Para hallar las concentraciones de cada uno de

Tabla # 2 Resultados método de los analitos se utilizaron las áreas mostradas en
cuantificación directo y patrón externo. los espectros de cada una, en los que el primer
Se hallaron inicialmente las áreas, para pico hace referencia de la cafeína en la muestra
determinar las concentraciones para el método y el segundo el patrón externo (ácido benzoico),
de cuantificación directa y patrón externo; además de la concentración constante de este
según los resultados podemos inferir que el último (0,4 mg/mL).
método directo arroja resultados más exactos
con un 0 % en error absoluto se halló la
concentración experimental, que es igual a la
calculada, gracias a este estudio podemos decir
que el método más confiable para una
cuantificación será el dicho anterior mente. %
recuperado es aceptable ya que la curva de
calibración

En cuanto % recuperado es aceptable ya que el

resultado obtenido fue de 100% no sobrepone Tabla # 3 Resultados de la cuantificación
de la cafeína
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según la USP 39 en el capítulo de validación de

procedimientos describe que esta validación
Como bien se puede evidenciar en la tabla de
debe cumplir con característica como linealidad,
resultados no se obtuvieron las concentraciones
exactitud, precisión, especificidad. En la tabla
esperadas; unas están por debajo de lo que se
registra el tratamiento de datos en las cuales
estipulo se iba a obtener, como en el caso del
como primer parámetro se encuentra:
vive 100 y del tinto; en las que probablemente
Linealidad en este procedimiento analítico se
se tomó una muestra muy diluida que afectó de
realizó una tabulación concentración vs área
manera significativa la concentración a analizar.
bajo la curva y con los puntos se realizó la
Por otra parte, las concentraciones como la de ecuación de la recta la cual dio como resultado
coca cola y la muestra estándar se mostraron (5,17x+-2,78), a partir de este resultado se
muy por encima de las teóricas, esto determinó el r2=0,991 para lo cual los
probablemente debido nuevamente a la mala resultados cumplen como los criterios que
preparación de las diluciones de las muestras. establece la USP 39, La linealidad cumple con
los criterios de aceptación.

Otra característica utiliza fue exactitud la cual se

ANÁLISIS AMOXICILINA determinó mediante la aplicación del
procedimiento analítico respecto del estándar de
referencia el cual se conocía la concentración, al
igual que el anterior método se realizó la
graficación dando como resultado un r2 0,987
está entre el rango de linealidad aceptable, se
realizó también el % de recuperación a las tres
diferentes concentraciones los cuales se
encuentran en 100% lo cual significa que el
metodo analitico es aceptable.

Precisión método el cual evaluó el grado de

reproducibilidad del procedimiento analítico, Se
determinó la variabilidad con el cálculo de
coeficiente de variación 0,13 para lo cual la
Tabla # Resultados tabulados de literatura establece que este coeficiente debe
validación de una método analítico ser menor al 2% lo cual el método es
amoxicilina reproducible. Respecto a los resultados se señal
ruido se determinó que solamente se obtuvo en
En este estudio se realizó la validación de un
el cromatograma ruido y carece de una señal
método analítico para un producto farmacéutico
significativa.
(amoxicilina) el cual se realizó por técnica HLPC.
Con el objetivo principal de verificar si cumple
con las características de desempeño. Para esto

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CONCLUSIONES ● British Pharmacopoeia. Versión 4.0

en CD-Rom. 2000.
● Según los resultados obtenidos, el ● United States Pharmacopoeia USP
método desarrollado para la XXVII. Pharmacopoeial Forum.
cuantificación de parabenos por 2004;29(5):1599-600.
HPLC es válido, en el intervalo ● Norma Cubana NC proyecto 2001.
analizado, para obtener resultados Guía para la validación de métodos
seguros y confiables. Así lo de ensayos químicos para alimentos.
demuestran los ensayos de Ministerio de Salud Pública, La
Habana, junio, 2001. p. 1-23.
especificidad, linealidad,
● United States Pharmacopeial
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Convention. USP XXIII. Validation of
cromatográficas realizados. Es un compendial methods. 23 ed. Rockville
método sencillo y rápido (corrida : Mack Printing; 1995. p. 1982-4.
cromatográficas de 5 min) que ● Knauer H, editor. ChromGate
puede ser aplicado para el control Reference Manual. Revision 3.1.
rutinario de la calidad de este Berlin : Advanced Scientific
medicamento. Instrument; 2003.
● Se puede concluir gracias a los ● Calpena AC, Escribano E, Fernández
resultados obtenidos por método C. Validación de los métodos
hplc que el método de validación analíticos. Farm Clin. 1990;7(9):749-
58.
cumple con lo que la literatura
● Sigarroa A. Biometría y diseño
establece, gracias a las
experimental. La Habana: Editorial
características analíticas utilizadas Pueblo y Revolución; 1985. p. 192-
para la validación de amoxicilina 209.
tableta. Debido a los resultados ● Quattrocchi OA, Abelaira de Andrizzi
obtenidos se determina que es un SI, Laba RF. Introducción a la HPLC,
método confiable y reproducible Aplicación y práctica. Buenos Aires:
para la validación de Artes Gráficas Farro SA; 1992. p. 298-
procedimientos farmacopeicos. 327.
● Gamboa, K. “Vida útil de amoxicilina
tabletas 500 mg fabricadas en el
Laboratorio Farmaceútico Iqfarma”
2013.
● 3. Ramírez, I. y Silva, J.C.
2. BIBLIOGRAFÍA
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● Norma Cubana NC 26/25. Comité química de amoxicilina trihidrato en
Estatal de Normalización. Ministerio suspensión de 250mg/5 mL de
de Salud Pública, La Habana, productos, genérico e innovador”.
noviembre, 1981. p. 1-18. 2011
● Haag T, Lancrini DF. Esters of para-
hidroxibenzoic acid. Cosmet Sci
Technol Ser. 1984; 1:63-77.
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