UNIVERSIDAD NACIONAL AMAZONICA DE MADRE

DE DIOS

PROCEDIMIENTO DE ANALISIS DE
COLIFORMES FECALES POR FILTRO DE
MEMBRANA

Dr. Blgo. Roberto Carlos Gonzales

Gonzales
 RELACIÓN ENTRE COLIFORMES
TOTALES, TERMOTOLERANTES Y E.coli
 ORGANISMOS COLIFORMES

Bacterias Gram-negativas, forma de bastoncillos

Se desarrollan en presencia de sales biliares u otros
agentes tensoactivos
Tienen propiedades de inhibición.
Fermentan la lactosa a 35-37°C, produciendo gas,
ácido y aldehído en 24-48 horas.
Son oxidasa negativa y no forman esporas.
Presentan actividad a la b-galactosidasa
 GRUPO COLIFORME

GÉNEROS FUENTE

Escherichia HECES (humanos y animales)

Klebsiella HECES, AMBIENTE

Enterobacter HECES, AMBIENTE

Citrobacter AMBIENTE

Serratia AMBIENTE

ORGANISMOS PATÓGENOS EN EL AGUA

1. Coliformes fecales (termotolerantes): bacterias que forman
parte del total del grupo Coliforme y son definidas como bacilos
gram-negativos, no esporulados que fermentan la lactosa con
producción de ácido y gas a 44,5 ºC ± 0,2ºC dentro de las 24
hrs. ± 2 hrs. La mayor especie del grupo de Coliformes fecales
(termotolerantes) es la Escherichia coli.

2 Unidades Formadores de Colonias (UFC): es el número

mínimo de células separables sobre la superficie, o dentro de un
medio de agar que da lugar al desarrollo de una colonia
visible del orden de decenas de millones de células
descendientes. Las UFC pueden ser pares, cadena o racimos,
así como células individuales. Las “Unidades Formadoras de
Colonias” (UFC) se miden en UFC/mL, UFC por mililitro.
3 Recuento de Coliformes fecales: es el cálculo
de la densidad sobre la base del número de
colonias típicas contadas sobre la membrana
filtrada, el volumen filtrado y la dilución de la
muestra si hubiera.
La densidad bacteriana se obtiene a través de la
formula facilitada y se expresa como UFC de
Coliformes fecales /100 mL.
RESUMEN

La prueba consiste en hacer filtrar volúmenes de agua

adecuados, con ayuda de una bomba de vacío, a través
de una membrana de nitrocelulosa de 47 mm. de
diámetro, con una porosidad de 0,45 um; la cual se
coloca en una placa petri conteniendo el caldo mFC, e
incuba a una temperatura de 44,5 °C ± 0.2ºC por 24
horas.

Esta técnica permite examinar volúmenes muy variables

de agua y ofrece un resultado directo de la
concentración de bacterias coliformes (por el recuento
de colonias), en lugar de un estimado estadístico, como es
el caso de Tubos múltiples.
 Medios de cultivo  Agar o Caldo M–FC Filtro de
 Acido rosólico membrana
NMP:  Caldo lauril triptosa.
Tubos  Agua de dilución (Solución tampón de fosfato)
 Caldo EC con Mug
múltiples  Tiosulfato de sodio

Equipo y materiales
Incubadora
Equipo de filtración.
Equipo generador de vació (Bomba)
Membrana de nitrocelulosa de 0,45 micras Filtro de
de porosidad y 47 mm de diámetro.
Pinzas de punta plana. membrana
Almohadillas absorbentes.
Placas petri de vidrio esterilizables.
 Incubadora de baño de agua a 44,5 ± 0,2 ºC.
NMP: Frascos con agua de dilución, con una
Tubos capacidad de 100 ml., autoclavables.
múltiples Pipetas serológicas de 10 mL y 1 mL.
Tubos de ensayo y tubos Durham.

Preparación de la muestra
Seleccionar el volumen de la muestra, el cual dependerá
de la densidad bacteriana que se desee esperar.
El volumen ideal de muestra, es aquel que nos proporciona
un recuento de 20 – 60 colonias de Coliformes fecales
por membrana.
Las muestras deben recolectarse en frascos estériles
de 500 ml, de boca ancha con tapa rosca. En el caso
que es agua tratada y tiene cloro residual, los frascos
deben contener tío sulfato de sodio al 3% (0,25 mL
por cada 250 mL de muestra).

En el caso que se filtre volúmenes de 20 mL, se debe

añadir 10 mL de agua de dilución estéril al embudo antes
de la filtración, permitiendo de esta manera aumentar el
volumen de la muestra y una mejor dispersión uniforme
de la muestra en la superficie de la membrana.

 Las placas de agar o caldo M- FC, deben estar

preparadas, antes de iniciar el proceso de análisis, así
mismo, marcar cada placa con el código de la muestra,
fecha y dilución.
Para preparar las placas de cultivo, hay que
seguir los siguientes pasos:
1. colocar una almohadilla absorbente en la
placa petri y agregar de 1,8 a 2 mL de
medio M-FC, hasta saturar la almohadilla.
2. Eliminar cuidadosamente de la placa de
cultivo el posible exceso de líquido.

Filtración de la muestra
Se coloca con pinzas estériles un filtro de
membrana estéril (con la trama hacia arriba)
sobre la placa porosa del receptáculo. Situar
con cuidado la unidad del embudo
correspondiente sobre el receptáculo y fijar.
 La filtración se lleva a cabo bajo un vació
parcial. Terminado el proceso, se procede a
retirar el embudo y la membrana con unas
pinzas estériles, colocándola en el medio
seleccionado Agar o caldo M-FC, evitando que
quede aire atrapado debajo de la membrana.

Las placas de cultivo sembradas, deben sellarse

o envolverse, para luego ser incubadas a 44,5 ±
0,2 ºC durante 24 ± 2 hrs.
Recuento
Las colonias típicas de Coliformes fecales,
tienen las siguientes características,
presentan distintos matices del color azul.
Contar todas las colonias de
diferentes matices de color azul
con ayuda de una lupa
estereoscópica de 10 a 15
aumentos, o simplemente otro
instrumento óptico.

Las colonias de Coliformes no fecales son de tonos

grises a cremosas. En condiciones normales, se
observan pocas colonias de Coliformes no fecales en el
medio M-FC, debido a la acción selectiva de la elevada
temperatura y a la adición de la sal del ácido
rosólico.
Verificación de Coliformes fecales
Seleccionar 5 colonias azules típicas, con una asa
de inoculación repicar colonia en un tubo con caldo
Lauryl triptosa incubar a 35ºC x 48 horas, los
tubos positivos, pasar al caldo EC, incubar a
44,5ºC ± 0,2 por 24 hrs ± 2 hrs.
La incubación se lleva a cabo en un baño de agua
caliente, luego de cumplirse el tiempo se procede
a realizar las lecturas, apuntando los tubos
positivos, que son aquellos que presentan
turbiedad y formación de gas.

Caldo Lauryl Caldo EC

triptosa con Mug
Cálculo de la densidad de Coliformes fecales
Se reporta como el número de Coliformes fecales
por 100 mL.
Calcular el recuento utilizando filtros de
membrana que tengan 20 – 60 colonias de
Coliformes fecales por membrana.
Se aplica la siguiente formula:

Coliformes fecales / 100mL = Colonias de Coliformes fecales contadas x 100

Vol. de muestra filtrado
Si no se observan colonias de Coliformes, reportar los resultados como: “<1 Coliforme /100 mL.”
 En el caso que se utilizan diluciones, se debe
aplicar la siguiente formula:

Coliformes fecales / 100mL = Colonias de Coliformes fecales contadas x 100

Vol. de muestra filtrado x Dilución
 ANEXO 1:
Diagrama de flujo del procedimiento
 VENTAJAS DEL MÉTODO DE
FILTRACIÓN POR MEMBRANA

• Proporciona recuentos directos.

• Es más preciso ( se obtienen resultados más
reproducibles) que la prueba de NMP.
• Rápido y fácil de realizar.
• Analiza mayores volúmenes de muestras con
bajas concentraciones de organismo.
 DESVENTAJAS DEL MÉTODO DE
FILTRACIÓN POR MEMBRANA

• Intervienen los altos niveles de turbiedad.

• Los coliformes debilitados pueden sobrevivir
mejor en la prueba de FTM o NMP.
• Las altas concentraciones de no coliformes
interfieren en el recuento.
• Efecto del tipo de filtro de membrana.
REGLAMENTO DE LA CALIDAD DEL AGUA PARA
CONSUMO HUMANO DECRETO SUPREMO
No 031-2010 SA
 UNIVERSIDAD NACIONAL AMAZONICA DE
MADRE DE DIOS

PROCEDIMIENTO DE ANALISIS DE
COLIFORMES TOTALES POR FILTRO DE
MEMBRANA

Dr. Blgo. Roberto Carlos Gonzales

Gonzales
1. Coliformes totales: son bacterias que forman parte del grupo
Coliformes y son definidas como bacilos gram negativos, no esporulados
que fermentan la lactosa con producción de ácido y gas a 35 ± 0.5 °C
dentro de las 48 ± 3 horas.

2 Unidades Formadores de Colonias (UFC): es el número mínimo de

células separables sobre la superficie, o dentro de un medio de agar que
da lugar al desarrollo de una colonia visible del orden de decenas de
millones de células descendientes. Las UFC pueden ser pares, cadena o
racimos, así como células individuales. Las “Unidades Formadoras de
Colonias” (UFC) se miden en UFC/mL, UFC por mililitro.

3 Recuento de Coliformes totales: es el cálculo de la densidad sobre la

base del número de colonias típicas contadas sobre la membrana filtrada,
el volumen filtrado y la dilución de la muestra si hubiera. La densidad
bacteriana se obtiene a través de la formula y se expresa como UFC de
Coliformes totales /100 mL.
 RESUMEN

La prueba consiste en hacer filtrar volúmenes de agua,

adecuados, con ayuda de una bomba de vacío, a través
de una membrana de nitrocelulosa de 47 mm. de
diámetro, con una porosidad de 0.45 Lm; la que luego se
coloca en una placa petri conteniendo el agar M-Endo, e
incubar a temperatura de 35 °C ± 0.5ºC por 24 horas.
Esta técnica permite examinar volúmenes muy variables
de agua y ofrece un resultado directo de la
concentración de bacterias coliformes (por el recuento
de colonias), en lugar de un estimado estadístico, como
es el caso de los Tubos múltiples.
 Medios de cultivo Filtro de
 Agar o Caldo Endo Les
membrana
NMP:  Caldo lauril triptosa.
Tubos  Agua de dilución
 Caldo verde brillante bilis lactosa (BRILLA)
múltiples  Tiosulfato de sodio

Equipo y materiales
Incubadora
Equipo de filtración.
Equipo generador de vació (Bomba)
Membrana de nitrocelulosa de 0,45 micras Filtro de
de porosidad y 47 mm de diámetro.
Pinzas de punta plana. membrana
Almohadillas absorbentes.
Placas petri de vidrio esterilizables.
 Incubadora de baño de agua a 44,5 ± 0,2 ºC.
NMP: Frascos con agua de dilución, con una
Tubos capacidad de 100 ml., autoclavables.
múltiples Pipetas serológicas de 10 mL y 1 mL.
Tubos de ensayo y tubos Durham.

Preparación de la muestra
Seleccionar el volumen de la muestra, el cual dependerá
de la densidad bacteriana que se desee esperar.
El volumen ideal de muestra, es aquel que nos proporciona
un recuento de 20 – 80 colonias de Coliformes y no más
de 200 colonias de todos los tipos.
Las muestras deben recolectarse en frascos estériles
de 500 mL, de boca ancha con tapa rosca. En el caso
que es agua tratada y tiene cloro residual, los frascos
deben contener tío sulfato de sodio al 3% (0,25 mL por
cada 250 mL de muestra).

En el caso que se filtre volúmenes de 20 mL se debe

añadir 10 mL de agua de dilución estéril al embudo
antes de la filtración, permitiendo de esta manera
aumentar el volumen de la muestra y una mejor
dispersión uniforme de la muestra en la superficie de la
membrana.

Las placas de agar Endo Les, deben atemperarse

(colocar las placas a 35ºC), antes de iniciar el proceso
de análisis, así mismo, marcar cada placa con el código
de la muestra, fecha y dilución.
Para preparar las placas de cultivo, hay que
seguir los siguientes pasos:
1. colocar una almohadilla absorbente en la
placa petri y agregar de 1,8 a 2 mL de
medio M-FC, hasta saturar la almohadilla.
2. Eliminar cuidadosamente de la placa de
cultivo el posible exceso de líquido.

Para el caso de diluciones

Preparar las diluciones correspondientes de la muestra, se
debe agitar vigorosamente aproximadamente 25 veces,
para asegurar una buena homogenización, transferir con
una pipeta estéril un volumen de 10 mL de la muestra a un
frasco con 90 ± 2 mL de agua de dilución (Agua
destilada). De esta manera se tiene la primera dilución (10-
1).
Homogenizar el frasco que contiene la dilución (10-1), con una
nueva pipeta estéril transferir 10mL a un nuevo frasco de
dilución, teniendo así la segunda dilución (10-2). Continuar con
este proceso hasta realizar todas las diluciones del caso,
dependiendo del grado de contaminación de la muestra.
Ordenar los frascos conteniendo las diluciones, en secuencia
decreciente de concentración (de
mayor a menor dilución), cuando se trabaja con diluciones se
empieza con la mas diluida.

Filtración de la muestra
Se coloca con pinzas estériles un filtro de
membrana estéril (con la trama hacia arriba)
sobre la placa porosa del receptáculo. Situar
con cuidado la unidad del embudo
correspondiente sobre el receptáculo y fijar.
Llevar a cabo la filtración bajo un vació parcial.
Terminado el proceso, se procede a retirar el embudo
y la membrana con unas pinzas estériles, colocándola
en el medio seleccionado Agar Endo Les, evitando
que quede aire atrapado debajo de la membrana.

La placa se lleva a la incubadora en forma invertida,

por un tiempo de 22 a 24 hrs. A una temperatura de
35± 0,5ºC.
Recuento
Las colonias típicas de Coliformes, tienen
las siguientes características, son de color
rojo oscuro, con un brillo metálico en la
superficie.
Contar las colonias con brillo con ayuda de una
lupa estereoscópica de 10 a 15 aumentos, o
simplemente otro instrumento óptico,

Verificación de Coliformes
Seleccionar 5 colonias con brillo típicas, con una asa de
inoculación repicar colonia en un tubo con caldo Lauryl
Triptosa incubar a 35ºC x 48 horas, los tubos positivos, pasar
al caldo verde Brillante Bilis, incubar a 35ºC ± 0,5 ºC por 24
a 48h. la formación de gas y turbiedad confirman la presencia
de Coliformes totales.

Caldo
VBB

Caldo Lauryl
triptosa
Cálculo de la densidad de Coliformes
Se reporta como el número de Coliformes por 100
mL.
Calcular el recuento utilizando filtros de membrana
que tengan 20 – 80 colonias de Coliformes y no
más de 200 colonias de todos los tipos por
membrana

Se aplica la siguiente formula:

Coliformes totales / 100mL = Colonias de Coliformes contadas x 100

Vol. de muestra filtrado
Si no se observan colonias de Coliformes, reportar los resultados como: “<1 Coliforme /100 mL.”
 En el caso que se utilizan diluciones, se debe
aplicar la siguiente formula:

Coliformes totales / 100mL = Colonias de Coliformes contadas x 100

Vol. de muestra filtrado x Dilución
 MEDIOS DE CULTIVO

Agar Endo Les Composición:

Extracto de levadura 1,2 g Caldo M –FC
Casitona o tripticasa 3,7 g Composición:
Tiopeptona o tiotona 3,7 g Triptosa 10,0 g
Triptosa 7,5 g Proteosa peptona Nº3 o polipeptona
Lactosa 9,4 g 5,0 g
Fosfato de hidrogeno di potásico Extracto de levadura 3,0 g
(K2HPO4) 3,3 g Cloruro sódico, NaCl 5,0 g
Fosfato de dihidrógeno potasio Lactosa 12,5 g
(KH2PO4) 1,0 g Sales biliares Nº3 o mezcla de sales
Cloruro de sodio (NaCl) 3,7 g biliares 1,5 g
Desoxicolato de sodio 0,1 g Azul anilina 0,1 g
Lauryl sulfato de sodio (Na2SO3) 1,6 g Agua destilada 1 L
Fucsina básica 0,8 g
Agar 15,0 g
Agua Destilada 1 L
Caldo lauril triptosa. Composición: Caldo Verde brillante bilis lactosa
Tryptosa 20.0 g (BRILLA):
Lactosa 5,0 g Composición:
Dipotasio hidrogeno fosfato K2HPO4 Peptona 10,0 g
2,75 g Lactosa 10,0 g
Potasio dihidrogeno fosfato, KH2PO4 Oxgall 20,0 g
2,75g Verde brillante 1 L.
Cloruro de sodio 5,0 g
Lauril sulfato de sodio 0,1 g Caldo EC - MUG.
Agua destilada 1 L Composición:
Triptosa o tripticasa 20,0 g
Lactosa 5,0 g
Mezcla de sales biliares Nº 3 1,5 g
Dipotasio hidrogeno fosfato K2HPO4 2,75
g
Potasio dihidrogeno fosfato, KH2PO4
2,75g
Cloruro de sodio 5,0 g 4-metylumberiferil-
V-D-glucoronido (MUG) 0,05 g
Agua destilada 1 L
Correo electrónico: rcgonzales_16@hotmail.com