Geles de Agarosa

Electroforesis en Geles de
agarosa
Clase 2
Biología Molecular 2017
Gabi Lombardi
¿En qué se basa la electroforesis?
• Es la separación de partículas cargadas bajo la influencia de

un campo eléctrico. Las partículas con carga se mueven hacia
el polo de carga opuesta.
• La electroforesis en gel es un método que separa (basado en

el tamaño, carga eléctrica y otras propiedades físicas)
macromoléculas tales como ácidos nucleídos y proteínas.
• Por tanto, las propiedades de la molécula, especialmente la

posesión de grupo ionizables, determina como rápidamente
un campo eléctrico puede mover la molécula a través del
soporte.
Electroforesis en Gel de agarosa
• La agarosa es un polisacárido formado por galactosas alfa y

beta que se extrae de las algas de los géneros Gellidium y
Gracillaria.
• La agarosa forma una matriz inerte y no tóxica que no

interactúa con las macromoléculas. Es soluble en agua a
temperaturas superiores a los 65 °C.
• La agarosa es usada para separar el ADN y ARN. La

concentración del gel de agarosa depende del tamaño del
ADN, y las moléculas del plásmido. Entre más grande sea el
peso molecular del ADN, ARN o plásmido se requiere menos
concentración de gel de agarosa.
4
Usos del gel de agarosa
• Análisis de productos de PCR (clase 2)
• Analisis de la calidad de ADN plasmídico obtenido en una miniprep

(clase 2).
• Permite la estimación de la cantidad de ADN y su calidad.
•La calidad del ADN es estimado por observación de la ausencia de
rayas o fragmentos contaminantes (clase 2).
•La cantidad de ADN es estimada usando un “ladder” lambda que
contiene cantidad específicas de ADN de varias bandas (clase 2-4)
• Análisis del patrón de digestión de enzimas en un plásmido (clase 4)
• La separación del ADN luego de una digestión con enzimas de 5
restricción (clase 4)
¿Cómo es separado el ADN?
Por la carga
negativa de los
grupos fosfato se
mueve hacia el
ánodo
El movimiento depende del tamaño, es decir el peso molecular

de los ácidos nucleídos.
La secuencia de bases y la temperatura no influye
6
significativamente el movimiento en el gel
Factores que influyen en la migración
• VOLTAJE
El voltaje es limitado por el hecho de que este calienta y al final puede causar que el
gel de funda. Los altos voltajes también disminuyen la resolución. A bajo voltaje, la
migración de fragmentos lineales es proporcional al voltaje aplicado.
•CONCENTRACIÓN DE AGAROSA
El tamaño del poro afecta la resolución. Los geles de agarosa con bajo % son mejores
para la separación de moléculas grande de ADN, mientras que los altos porcentajes de
los geles son mejores para los ADN pequeños.
% Agarosa Tamaño de ADN (Kb)
0.75 10-15
1.0 0.5-10
1.25 0.3-5
1.5 0.2-4
2.0 0.1-2.5
2.5 50pb-1kb 7
Factores que influyen en la migración
•LONGITUD DE LA MOLÉCULA DE ADN

Las moléculas lineales de ADN doble cadena, migran a través de
la matriz del gel a tasas que son inversamente proporcionales al
log10 del número de pares de bases que contienen.
• CONFORMACIÓN DE LA MOLÉCULA DE ADN

Plásmido
8
Estructura del ADN
Superenrollamiento
es el retorcimiento o giro sobre si
misma de una hélice, de forma que
su eje no sigue una línea recta, sino
otra hélice
¿Cómo se origina el superenrollamiento?
lineal Circular
cerrado
Forma relajada
Formas tensas
superenrollamiento
negativo positivo
Disminuye la tensión
aumentando el retorcimiento
POSITIVO NEGATIVO
Porqué se usan Buffers para la corrida:
• En ausencia de iones, la conductancia eléctrica es mínima y el ADN migra lentamente o ni

siquiera se desplaza.
• La movilidad electroforética del ADN se ve afectada por la composición y la fuerza iónica

del buffer usado.
• Con elevada fuerza iónica la conductancia eléctrica es muy elevada y se genera una
importante cantidad de calor. Generalmente el gel se funde y el ADN se desnaturaliza.
• El buffer TAE (o Tris/Acetato/EDTA) es el más común usado en electroforesis en gel de

agarosa. TAE tiene la capacidad buffer más baja de los buffer existentes, sin embargo TAE
ofrece la mejor resolución para ADN más grandes. Sin embargo, TAE requiere un voltaje
más bajo y más tiempo.
• El buffer TBE (Tris/Borato/EDTA) es frecuentemente usado para los fragmentos de ADN

pequeños (con menos de 500bp).
12
Buffers utilizados en electroforesis
13
Buffer de carga:
Contiene glicerol que se utiliza para aumentar la

densidad de la muestra y para que quede
localizada en la calle del gel
Contiene colorantes que se agregan para observar

como avanza la corrida
14
Observación de la muestra:
15
Observación de la muestra:
16
Digestión de ADN del fago lambda con ER
Se conoce el genoma del fago Lambda.
Cada combinación de
enzimas de restricción
dará un patrón
diferente de bandas
17
Digestión de ADN del fago lambda con HindIII
Se obtiene un patrón conocido de bandas de tamaños específicos,

la masa dependerá de la cantidad total de ladder sembrado
18
Veamos un ejemplo:
1 2 3 4 5 6 7 pb ng
23130 240
9416 97.5
6557 67.5
4361 45
2322 25
2027 20
564 5
125
¿Qué vamos a hacer en el TP?
Preparación del vector (YEp357-lacZ) en pequeña escala ( miniprep)
20
¿Cómo puedo purificar el ADN
plasmídico de una bacteria?
Cultivo LB+Amp de una colinia de E.coli (cepa
Nova Blue) conteniendo el plásmido YEp357-
lacZ
método de lisis alcalina de

Birnboim y Doly
P1= 25mM tris-HCl, 10mM EDTA, pH=8

100ug/ml de RNAsa A
P2= 0,2N NaoH, 1%SDS
Incubar a temperatura ambiente

Desnaturalización del ADN plasmídico
y cromosómico
Renaturalización del ADN
la fidelidad de la reasociación es substancialmente diferente para el ADN

plasmídico y cromosómico. La re-naturalización de los plásmidos es
rápida porque las cadenas se encuentran próximas y tienen menor
tamaño.
P3= 5M
D. Transferir el SN a un tubo limpio + 700 ul

de Resina incubar 5 min.
E. pasar todo el contenido por columna con
filtro
F. Lavar con 1 ml de sn de lavado
Repetir paso E y F
•Centrifugar
Pasar el filtro a un tubo limpio,
agregar 50ul de H2O 55-65°C para •Descartar filtro
eluir •Sembrar 10ul en gel de
agarose 0.8%
Prepración del gel de agarosa
Corrida electroforética: gel de agarosa

( 2 horas a 80 V).Tinción con BrEt
Conformaciones plasmídicas
Circulo abierto
lineal
superenrollado

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Electroforesis en Geles de

• Es la separación de partículas cargadas bajo la influencia de

• La electroforesis en gel es un método que separa (basado en

• Por tanto, las propiedades de la molécula, especialmente la

• La agarosa es un polisacárido formado por galactosas alfa y

• La agarosa forma una matriz inerte y no tóxica que no

• La agarosa es usada para separar el ADN y ARN. La

• Análisis de productos de PCR (clase 2)

• Analisis de la calidad de ADN plasmídico obtenido en una miniprep

El movimiento depende del tamaño, es decir el peso molecular

•LONGITUD DE LA MOLÉCULA DE ADN

• CONFORMACIÓN DE LA MOLÉCULA DE ADN

• En ausencia de iones, la conductancia eléctrica es mínima y el ADN migra lentamente o ni

• La movilidad electroforética del ADN se ve afectada por la composición y la fuerza iónica

• El buffer TAE (o Tris/Acetato/EDTA) es el más común usado en electroforesis en gel de

• El buffer TBE (Tris/Borato/EDTA) es frecuentemente usado para los fragmentos de ADN

Contiene glicerol que se utiliza para aumentar la

Contiene colorantes que se agregan para observar

Se conoce el genoma del fago Lambda.

Se obtiene un patrón conocido de bandas de tamaños específicos,

Preparación del vector (YEp357-lacZ) en pequeña escala ( miniprep)

método de lisis alcalina de

P1= 25mM tris-HCl, 10mM EDTA, pH=8

P2= 0,2N NaoH, 1%SDS

Incubar a temperatura ambiente

la fidelidad de la reasociación es substancialmente diferente para el ADN

D. Transferir el SN a un tubo limpio + 700 ul

F. Lavar con 1 ml de sn de lavado

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