Universidad de Pamplona

Pamplona - Norte de Santander - Colombia

Tels: (7) 5685303 - 5685304 - 5685305 - Fax: 5682750 - www.unipamplona.edu.co

PRACTICA 8
TINCIONES COMPUESTAS

Linda Ramírez, Marjorie Jaimes, Marcela gamboa, Sandra Riveros.

DOCENTE: CARMEN OMAIRA ROZO GARCIA

UNIVERSIDAD DE PAMPLONA
FACULTAD DE CIENCIAS AGRARIAS
PROGRAMA DE INGENIERÍA AGRONOMICA

RESUMEN
El objetivo principal de la práctica desarrollada consiste en identificar de manera correcta y
precisa las distintas colonias obtenidas en los medios de cultivos presentes en el laboratorio de
microbiología, para ello se realizó como procedimiento experimental los métodos propuestos.
Las tinciones bacterianas son de gran importancia en la microbiología, debido a que permiten
conocer las propiedades y características de las bacterias. Esta práctica tiene como objetivo
conocer los diferentes tipos de tinciones, simples y compuestas realizadas en los laboratorios de
microbiología. Los colorantes que se usan para realizar una tinción, se pueden clasificar de dos
maneras: naturales y sintéticos. Se utilizó las técnicas de tinción de capsulas como coloración
GRAM, métodos de HISS, tinción de NIGROSINA, tinción de ESPORAS. La tinción de Gram
se considera básica en la valoración inicial de muestras para análisis bacteriológico, mientras que
la tinción de Wright se ocupa para el diagnóstico de enfermedades muy particulares en el rubro
de la parasitología. Hay técnicas tinto riales específicos de gran utilidad, como la tinción de Ziehl-
Neelsen, que se utiliza para el diagnóstico de enfermedades crónicas como la tuberculosis o la
actinomicosis, o la tinción de azul de lacto fenol, que preserva e identifica a los componentes
estructurales de los hongos Las diferentes tinciones en el laboratorio microbiológico tienen una
utilidad fundamental para el diagnóstico y tratamiento oportuno de múltiples patologías de
etiología infecciosa.

Palabras clave: * tinción * colorantes * esporas * bacterias

INTRODUCCIÓN colorante utilizado sirve solo para denotar la

TINCIÓN: Es el proceso por el cual las morfología celular. [1]
moléculas de un colorante se adsorben a una La tinción es un proceso por el cual las
superficie. El uso de colorantes permite moléculas de un colorante se absorben a una
cambiar el color de las células de los superficie. El uso de colorantes permite
microorganismos y poder realizar la cambiar el color de las células de los
observación en microscopio óptico. De microorganismos y poder realizar la
acuerdo a la reacción que ocurre, existen observación en microscopio óptico. Dado
diferentes tipos de tinción, pero nos que las bacterias son casi incoloras, no
enfocaremos en la Tinción simple el presentan contraste con el medio en el cual
se encuentran suspendidas y no pueden

Formando líderes para la construcción de un

nuevo país en paz
observarse claramente sin algún tratamiento agua con el cristal violeta. En este punto las
previo. De acuerdo a la reacción que ocurre, células se mantienen iguales.
existen diferentes tipos de tinción: 3) Se inicia con la decoloración usando
· Simple: el colorante utilizado sirve una solución de Alcohol-acetona, sustancias
solo para denotar la morfología celular. en las que es soluble el complejo I2-Cristal
· Diferencial: el colorante utilizado violeta. Algunos microorganismos no se
pone de manifiesto diferencias entre células decoloran. La diferencia esencial entre los
bacterianas o entre partes de una misma dos tipos de células es la resistencia que
célula, estas técnicas utilizan más de un presentan ante la decoloración.
colorante o bien ciertos reactivos La tinción de Gram es uno de los métodos
complementarios para la tinción. de tinción más importantes en el laboratorio
Los colorantes más usados son: azul de bacteriológico. Su utilidad en la práctica de
metileno, cristal violeta, safranina, estos son referencias a la morfología celular
catiónicos y se combinan fuertemente con bacteriana (cocos, bacilos, positivos,
componentes celulares cargados negativos, etc.) se basan justamente en la
negativamente, como los ácidos nucleicos y tinción de GRAM
los polisacáridos ácidos. 1. Se tiñe el espécimen con el primer
Las células generalmente son tratadas para colorante, cristal violeta.
coagular el protoplasma antes de teñirlas, 2. Se añade el mordiente, yodo.
proceso conocido como fijación. Después 3. Se aplica el agente decolorante,
de esta habitualmente se realiza la tinción. normalmente una solución de acetona o
La fijación produce generalmente etanol. En este momento, las bacterias Gram
encogimiento de las células, la tinción, por negativas pierden su tinción violeta, pero las
el contrario, hace que las células parezcan Gram positivas retienen el colorante.
mayores de lo que son realmente. 4. Como colorante de contraste se añade
Algunos colorantes teñirán mejor solo safranina, que tiñe de rosa las bacterias
después de que la célula haya sido tratada Gram negativas, previamente decoloradas;
con otra sustancia química, que no es un mientras que a las bacterias Gram positivas
colorante por sí mismo. El mordiente se les proporciona un color violeta más intenso.
combina con un constituyente celular y lo
altera de manera que ahora sí podrá atacar el Esta tinción se denominada así por el
colorante. bacteriólogo danés Christian Gram, quien la
desarrolló en 1844. Sobre la base de su
Tinción de Gram reacción a la tinción de Gram, las bacterias
1) Las células son fijadas por medio del pueden dividirse en dos grupos,
calor sobre un portaobjetos, se tiñen primero grampositivas y gramnegativas (en este
con una solución de cristal violeta y son caso, los términos positivo y negativo no
lavadas después para quitar el exceso de tiene nada que ver con carga eléctrico, sino
colorante. En este punto las células Gram simplemente designan dos grupos
positivas y Gram negativas, están teñidas de morfológicos distintos de bacterias).
azul/violeta. Descripta en forma breve, la secuencia de la
2) El portaobjetos se cubre con una tinción es la siguiente: el Frotis fijado con
solución de yodo-yoduro potásico. El KI calor se tiñe 1 min con Violeta Cristal, se
hace soluble el I2 en agua. El I2 entra en las lava con agua, se cubre con solución Yodada
células y forma un complejo insoluble en durante 1 - 2 min. y se lava de nuevo con
agua, decolorar con mezcla alcohol

Formando líderes para la construcción de un

nuevo país en paz
etílico/acetona. Escurrir y cubrir con decoloran, mientras que otros
Safranina (color de contraste) durante 1 – 2 (gramnegativos) lo hacen. La diferencia
min. Lavar y secar. Las bacterias Gram- esencial entre esos dos tipos de células está
positivas y Gram-negativas tiñen de forma por tanto en su resistencia a la decoloración;
distinta debido a las diferencias esta resistencia se debe probablemente al
constitutivas en la estructura de sus paredes hecho de que en el caso de bacterias gram-
celulares. La pared de la célula bacteriana negativas, la mezcla de alcohol/acetona es
sirve para dar su tamaño y forma al un solvente lipídico y disuelve la membrana
organismo, así como para prevenir la lisis exterior de la pared de la célula (y también
osmótica. El material de la pared celular puede dañar la membrana citoplásmica a la
bacteriana que confiere rigidez es el que se une peptidoglicano). La delgada capa
peptidoglicano. La pared de la célula Gram- de peptidoglicano es incapaz de retener el de
positiva es gruesa y consiste en varias capas complejo cristal violeta-yodo y la célula se
interconectadas de peptidoglicano, así como decolora. Las células grampositivas, a causa
algo de ácido técnico. Generalmente, 80%- de sus paredes celulares más espesas (tienen
90% de la pared de la célula Gram-positiva más peptidoglicano y menos lípido), no son
es peptidoglicano. La pared de la célula permeables al disolvente, provocando que el
Gram-negativa, por otro lado, contiene una de complejo cristal violeta-yodo quede
capa mucho más delgada, únicamente de atrapado dentro de la pared celular. Después
peptidoglicano y está rodeada por una de la decoloración las células grampositivas
membrana exterior compuesta de son todavía azules, pero las gramnegativas
fosfolípidos, lipopolisacáridos, y son incoloras. Para poner de manifiesto las
lipoproteínas. Sólo 10% - 20% de la pared células gramnegativas se utiliza una
de la célula Gram-negativa es coloración de contraste. Habitualmente es
peptidoglicano. un colorante de color rojo, como la safranina
o la fucsina básica. Después de la coloración
Las células fijadas al calor sobre un de contraste las células gramnegativas son
portaobjetos se tiñen, primero con una rojas, mientras que las grampositivas
solución de cristal violeta (otros colorantes permanecen azules.
básicos no son tan efectivos) y son lavadas Deben destacarse algunos aspectos cruciales
después para quitar el exceso de colorante. de la tinción de Gram: 1) El tratamiento con
En este estado, todas las células, tanto las cristal violeta debe preceder al tratamiento
grampositivas como las gramnegativas, con yodo. El yodo por sí solo tiene poca
están teñidas de azul. El portaobjetos se afinidad con las células. 2) EI proceso de
cubre entonces con una solución de yodo- decoloración debe ser corto y es esencial un
yoduro potásico. El ingrediente activo es cálculo preciso del tiempo para evitar que
aquí el I2; el KI simplemente hace soluble pierdan la tinción las células grampositivas.
el I2 en agua. El I2 entra en las células y 3) Cultivos de más de 24 horas de teñidos
forma un complejo insoluble en agua con el pueden perder su habilidad de retener el
cristal violeta. De nuevo tanto las células complejo cristal violeta - yodo.[2]
grampositivas como las gramnegativas se
encuentran en la misma situación. Se lleva a
cabo después la decoloración, usando una
mezcla de alcohol-acetona, sustancias en las
que es soluble el complejo I2-cristal violeta.
Algunos organismos (grampositivos) no se

Formando líderes para la construcción de un

nuevo país en paz
TINCIÓN DE ESPORAS (TÉCNICA DE 30 segundos. Lave con agua de la llave a
SHAEFFER-FFULTON) baja presión y escurra.

cubra ahora con colorante de contraste y deje

Se trata de un procedimiento de tinción actuar por 45 segundos. Lave con agua de la
diferencial, conocido como método de llave a baja presión y escurra. Permita que se
Ziehl-Neelsen, que tiene gran relevancia por seque al aire dejando la lámina en posición
su aplicación clínica. Permite poder inclinada. Observe al microscopio con los
distinguir aquellos microorganismos cuya siguientes objetivos: 10X – 40X – 100X
coloración resiste la acción de alcoholes y utilizando este último con aceite de
ácidos suaves (ácido-alcohol resistentes) de inmersión
otros que no resisten la decoloración (no
ácido-alcohol resistentes). Dentro de las DIAGRAMA DE FLUJO
bacterias ácido alcohol resistentes
encontramos dos importantes patógenos:
Mycobacterium tuberculosis y
Mycobacterium leprae, microorganismos
responsables de la tuberculosis y la lepra
respectivamente. Estas bacterias pertenecen
al Phyllum Actinobacteria, un grupo grande
y complejo de bacterias gram positivas, que
incluye a la Familia Mycobacteriaceae
caracterizada por contener en sus paredes
celulares un alto contenido lipídico, ceras
Fig1. agrego una gota de agua
con una gran diversidad de ácidos
destilada se realiza el frotis
micólicos,

2. METODOLOGIA

TINCIÓN GRAM
lo primero que se realizo fue limpiar y
desinfectar el área de trabajo luego
procedió encender un mechero, para
continuar con la práctica se puso una gota de
agua destilada en un portaobjeto, luego se
realizó un frotis al cultivo con un asa
caliente se procedió fijarlos al calor.

Se vertió sobre el frotis Cristal Violeta

déjelo actuar por 1 minuto. Luego lavamos
con agua de la llave a baja presión y se dejó
escurrir . Después Cubrió el frotis con lugol
dejándolo actuar por 1 minuto. Lave con
agua de la llave a baja presión y escurra. Fig.2 ese está fijando le frotis
Cubra ahora con solución decolorante por

Formando líderes para la construcción de un

nuevo país en paz
 Fig.6 Lavar con presión baja

Fig.3.Cristal violeta déjelo actuar por

un minuto

Fig7. alcohol

Fig.4 Lavar con presión baja

Fig.8.Lavar con presión baja

Fig. 5. lugol

Formando líderes para la construcción de un

nuevo país en paz
 TINCIÓN DE ESPORAS (TÉCNICA DE
SHAEFFER-FULTON)

Se realizó un extendido fino con una

suspensión del microorganismo esporulado en
un portaobjeto y luego lo fijamos al calor. Se
cubrió el portaobjetos con solución acuosa de
verde de malaquita al 5 %.

A continuación, calentamos sobre la llama

del mechero de Bunsen hasta causar
Fig.9.Cubra ahora con solución desprendimiento de vapores y retirar la llama.
decolorante por 30 segundos Repetir la operación durante de 6 a 10
minutos.

Luego lavamos a presión baja con agua. El

siguiente paso fue cubrir el portaobjetos con
safranina acuosa al 0,5 % durante
30seg.Observe al microscopio con los
siguientes objetivos: 10X – 40X – 100X
utilizando este último con aceite de
inmersión segundos; Con esta técnica las
esporas se presentan de color verde y los
bacilos de color rojo.

Fig.10.Lavar con presión baja

DIAGRAMA DE FLUJO

Fig1. Gota de agua

Fig.11.Dejar secar y luego observar

Formando líderes para la construcción de un

nuevo país en paz
 FIG.2 frotis Fig.4. evaporar el frotis

Fig.5. lavar con agua a baja presión

Fig.3.Colorante verde malaquita

Formando líderes para la construcción de un

nuevo país en paz
 4 RESULTADOS

TINCIÓN DE GRAM (e-coli)

Fig.6. agregar safranina dejar durante

30seg Imagen de e-coli

E. coli (bacilos rosa)

Escherichia coli es un bacilo Gram negativo

por dar un resultado de (color rosado),
anaerobio facultativo de la
Fig.7. cubrir con cubreobjetos y familia Enterobacteriaceae.
observar en el microscopio

Formando líderes para la construcción de un

nuevo país en paz
 TINCIÓN DE ESPORAS (TÉCNICA DE
TINCIÓN DE GRAM SHAEFFER-FULTON) (Bacillus)
(staphylococcus aureus)

Im. De bacillus

Imagen de staphylococcus aureus

imagen de bacillos en el microscopio 40x

En esta práctica pudimos observar los

bacilos Gram positivos formadores de
staphylococcus aureus (color violeta ) esporas son de las especies de Bacillus y
Clostridium. Estos bacilos son ubicuos y,
debido a su capacidad para formar esporas,
Staphylococcus aureus conocido pueden vivir en el ambiente por varios años.
como estafilococo áureo o estafilococo Si bien las especies de Bacillus son aerobias,
dorado, es una bacteria anaerobia las especies de Clostridium son anaerobias.
facultativa, Gram positiva por la razón de De las muchas especies de Bacillus y
que se tiño de morado. géneros afines que aún no han sido bien
clasificadas en la microbiología médica, la
mayoría no causa enfermedades. Sin

Formando líderes para la construcción de un

nuevo país en paz
embargo, existen algunas especies que negativas sí tienen, entre la superficie
generan enfermedades importantes en los externa de la membrana citoplasmática y la
seres humanos. interna de la membrana externa

2 ¿Por qué razón los colorantes deben

5 CONCLUSIONES guardarse en frascos de color ámbar?
* Las tinciones utilizadas en el laboratorio
de microbiología permite el diagnóstico Generalmente se usan frascos de color
oportuno y sugerente por lo que juegan un ámbar para guardar sustancias que pueden
papel en la decisión de tratamientos. Las sufrir descomposición o algún tipo de
tinciones son herramientas elementales en el reacción química catalizada por la luz, así el
laboratorio de microbiología frasco absorbe la luz y la sustancia se
mantiene como tal.
* Se conoció las técnicas de coloración
compuesta 3 ¿Que se debe tener en cuenta al
preparar un colorante?
* Se observaron las distintas formas
tamañas de microorganismos analizadas en Tinción simple: En la tinción simple se
el laboratorio utiliza un solo colorante con el que se tiñe
rápidamente el microorganismo,
* Las tinciones Gram es una prueba potente utilizándose fundamentalmente para
y rápida que nos permite diferenciar dos observar su morfología y tamaño. Los
clases de bacterias que son grampositivas y colorantes empleados con mayor frecuencia
gramnegativas. para este tipo de tinción son los siguientes:
azul de metileno, violeta cristal y fascina
* Las grampositivas se tiñen de morado ya fenicada, entre otros Tinción compuesta: En
que el colorante se queda atrapado en la este tipo de tinción, se utiliza más de una
cepa gruesa de peptidoglucano mucho más sustancia tintórea. Los colorantes se aplican,
delgada a la preparación, separados o juntos,
formando parte de una solución. En
6. ANEXOS consecuencia se puede determinar algunas
características propias de diversos géneros
1 ¿En que radican las diferencias que permiten diferenciarlo de los demás, por
estructurales entre bacterias Gram que reciben también el nombre de
positivas y Gram negativas? coloraciones diferenciales. Entre los
métodos más utilizados se encuentran: La
Las bacterias Gram positivas poseen una coloración de Gram. y la de Ziehl Neelsen.
pared celular interna y una pared de Coloración de Gram.En 1884, el danés Hans
peptidocluno. En cambio, las negativas Chistian Gram, ideó un método de
poseen una pared celular más completa. coloración, que es en la actualidad, el más
Las positivas no cuentan con una membrana empleado en los laboratorios de
externa. Las negativas tienen membrana bacteriología, mediante el cual, la bacteria
externa que forma un saco rígido alrededor sometida a esta tinción, en dependencia de la
de la bacteria. composición química de la especie, queda
Las Gram positivas no tienen espacio teñida de color violeta o de color rojo.
periplasmático, mientras que las Gram Principios. A pesar de que esta técnica de

Formando líderes para la construcción de un

nuevo país en paz
coloración se ha venido empleando desde de tinción. El azul de metileno es un buen
hace más de un siglo, aún no se ha podido colorante simple que actúa sobre todas las
determinar con exactitud la base molecular células bacterianas rápidamente y que no
de la reacción, existiendo controversias al produce un color tan intenso que oscurezca
respecto. El criterio más generalizado es que los detalles celulares. Es especialmente útil
la violeta y el lugol forman un complejo que para detectar la presencia de bacterias en
reacciona con los componentes bioquímicos muestras naturales, puesto que la mayor
de la pared celular deshidratada, fijándose parte del material no celular no se tiñe.
en esta. Teniendo en cuenta que la La tinción negativa es el reverso del
composición química de la pared, no es procedimiento de tinción usual: las células
igual en todos los géneros, la reacción se dejan sin teñir, pero se colorea en cambio
resultante será obviamente diferente, lo que el medio que las rodea. Lo que se ve, por
da lugar, que mientras algunos géneros tanto, es el perfil de las células. La sustancia
retienen firmemente el colorante al resultar utilizada para la tinción negativa es un
el complejo impenetrable para el material opaco que no tiene afinidad por los
decolorante, en otros géneros la barrera que constituyentes celulares y que simplemente
se produce es más permeable, lo que permite rodea las células, tal como la tinta china (que
al solvente penetrar y extraer el complejo es una suspensión de partículas de carbono
violeta-lugol, dejando a la bacteria coloidal) o la tirosina (un colorante negro
nuevamente incolora. insoluble en agua). La tinción negativa es un
Fundamento técnico En el primer paso de la modo satisfactorio de aumentar el contraste
coloración, cuando los microorganismos de las células en la microscopia óptica, pero
presentes en el frotis son expuestos a la su máxima utilidad está en revelar la
acción colorante de la violeta de genciana, presencia de cápsulas alrededor de las
todos los géneros que se encuentran en el células bacterianas.Los métodos de tinción
frotis se tiñen de color violeta. Al adicionar son de gran utilidad, pero deben usarse
el lugol, no se produce ningún cambio de siempre con precaución, ya que pueden
color, ya que el lugol no es un colorante, conducir a errores. Las moléculas de
sino un mordiente, que se adiciona con el colorante forman en ocasiones precipitados
objetivo de formar un complejo violeta- o agregados que parecen estructuras
lugol, para fijar el color en la bacteria. celulares auténticas, pero que son
formaciones completamente artificiales
4 ¿por qué algunas tinciones no se fijan inducidas por el mismo colorante. Tales
por color? estructuras se denominan artefactos, y deben
tomarse muchas precauciones para tener la
Algunos colorantes teñirán mejor sólo seguridad de que no nos estamos
después de que la célula haya sido tratada equivocando al creer que un artefacto es una
con otra sustancia química, que no es un estructura realmente existente.
colorante por sí mismo. Esta sustancia se
denomina mordiente; un mordiente habitual 5 ¿Por qué la edad de un cultivo afecta las
es el ácido tánico. El mordiente se combina tinciones?
con un constituyente celular y lo altera de tal
modo que ahora sí podrá atacar el colorante. La edad de las células, las condiciones de
Si se desea simplemente incrementar el cultivo y la actividad de su auto lisinas
contraste de las células para la microscopía, pueden afectar el resultado de la tinción. Las
son suficientes los procedimientos simples células envejecidas, o crecidas en

Formando líderes para la construcción de un

nuevo país en paz
condiciones que impiden la síntesis de
mucopéptido pueden verse de color rojo. La
intensidad de la decoloración con alcohol
suele ser el problema más común

6 BILBIOGRAFIAS

* Selvakumar N et al. Ineffi ciency of 0.3%

carbol fuchsin in ziehl-neelsen staining for
detecting acid-fast bacilli. J Clin Microbiol.
2002; 40: 3041-3043.

* Prescott LM. Microbiology. 5th ed. USA:

McGraw-Hill; 2002.

* Selvakumar N et al. Comparison of

variants of carbolfuchsin solution in Ziehl-
Neelsen for detection of acidfast bacilli. Int
J Tuberc Lung Dis. 2005; 9: 226-229.

* Salud OPDL. Manual para el diagnóstico

bacteriológico de la tuberculosis. Vol. 1.
2008.

* Arredondo GCJ. Conceptos clínicos de

infectología. 10a ed. México DF: Méndez
Editores;1995.

* Farrant JL. An electron microscopic study

of ferritin. Biochim Biophys Acta. 1954; 13:
569-576. 30. Ohi M et al. Negative staining
and image classifi cation - powerful tools in
modern electron microscopy. Biol Proced

Fig.1-fig-11 https://es.wikihow.com/hacer-
una-tinción-de-Gram
Fig1-fig7
https://rua.ua.es/dspace/bitstream/10045/13
098/1/Moneras%20y%20protistas.pdf

Formando líderes para la construcción de un

nuevo país en paz