Validacion de Metodo Analitico Trazas de Benzocaina

Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación
UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO

FACULTAD DE FARMACIA Y BIOQUÍMICA
ESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL DE FARMACIA Y BIOQUÍMICA
A
IC
M
UI
Q
O
BI
Y
“VALIDACIÓN DE UN MÉTODO ANALÍTICO POR
IA
CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE ALTA RESOLUCIÓN PARA LA

AC
DETERMINACIÓN DE TRAZAS DE BENZOCAÍNA, EN LAS

RM
SUPERFICIES DE UN EQUIPO DE FABRICACIÓN

FA
FARMACÉUTICA”
DE
CA
INFORME DE PRÁCTICAS PRE-PROFESIONALES

TE
IO
PARA OPTAR EL TÍTULO PROFESIONAL

BL
DE
BI
QUÍMICO FARMACÉUTICO
AUTORA: Br. VÁSQUEZ PÉREZ, GÉNESIS CYNTIA DEL PILAR
ASESOR: Dr. ALVA PLASENCIA, PEDRO MARCELO
TRUJILLO – PERÚ
2012
Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú.
Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/
Agradecimientos:
A
IC
M
A Dios:
UI
Q
Gracias por el regalo de la vida y
O
por iluminar cada paso
BI
Y
IA
de mi camino.
AC
RM
FA
Gracias por permitirme lograr mis metas,

DE
por el inmenso amor que me regalas

CA
y por bendecir a mis seres

TE
IO
queridos.
BL
BI
A mis padres Rocío Pérez y Feliciano Vásquez,
A
desde lo más profundo de mi corazón
IC
M
mil gracias por su apoyo, por su ayuda
UI
Q
incondicional, comprensión y estar
O
siempre conmigo.
BI
Y
IA
AC
RM
FA
A mis hermanas Taly y Lucero,

DE
gracias por prestarme su ayuda cuando

CA
más lo he necesitado y apoyarme

TE
IO
en los momentos más

BL
BI
difíciles.
A
IC
M
UI
Un sincero agradecimiento al
Q
O
Dr. Pedro Alva Plasencia
BI
Y
por su apoyo y asesoramiento
IA
AC
en la realización del
RM
presente trabajo.
FA
DE
CA
TE
IO
BL
BI
JURADO EVALUADOR
----------------------------------------
A
IC
M. Sc. Segundo Miranda Leyva
M
UI
PRESIDENTE
Q
O
BI
Y
IA
AC
RM
-----------------------------------
FA
Mg. Roger Rengifo Penadillos

DE
MIEMBRO
CA
TE
IO
BL
BI
-----------------------------------
Dr. Pedro Alva Plasencia
MIEMBRO
PRESENTACIÓN
Señores miembros del jurado:
A
IC
M
Dando cumplimiento a las disposiciones establecidas en el Reglamento
UI
para la obtención de GRADOS Y TÍTULOS DE LA FACULTAD DE
Q
O
FARMACÍA Y BIOQUÍMICA DE LA UNIVERSIDAD NACIONAL DE
BI
TRUJILLO, presento a vuestra consideración y elevado criterio el Informe de
Y
Prácticas Pre-profesionales, intitulado: “VALIDACIÓN DE UN METODO
IA
AC
ANALÍTICO POR CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE ALTA

RESOLUCIÓN PARA LA DETERMINACIÓN DE TRAZAS DE
RM
BENZOCAÍNA, EN LAS SUPERFICIES DE UN EQUIPO DE

FA
FABRICACIÓN FARMACÉUTICA”, con el que pretendo obtener el Título

DE
de Químico Farmacéutico.
CA
Dejo a vuestra consideración, señores miembros del jurado la calificación del

TE
presente Informe de Prácticas Preprofesionales.

IO
BL
BI
Trujillo, julio de 2012
Génesis C. Vásquez Pérez
INDICE
A
IC
RESUMEN…………………………………………………....i
M
UI
ABSTRACT………………………………………..…………ii
Q
O
BI
Y
I. INTRODUCCIÓN ................................................................... 1
IA
AC
II. MATERIAL Y MÉTODO ..................................................... 7

RM
III. RESULTADOS ......................................................... ….…. 25

FA
IV. DISCUSIÓN ......................................................................... 28

DE
CA
V. CONCLUSIONES ................................................................ 34
TE
VI. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS.............................. 35

IO
BL
ANEXOS ..................................................................................... 39
BI
RESUMEN
El objetivo del presente estudio fue demostrar que el método analítico por
cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) desarrollado para la
determinación de trazas de benzocaína en las superficies de un equipo de
fabricación farmacéutica cumple con los parámetros de validación
considerados por la Organización Mundial de la Salud (OMS). Para lo cual se
A
utilizó como fase móvil la solución de Metanol: Agua: Heptanosulfonato de
IC
M
sodio 0,005 M (50:50:2) y como fase estacionaria la columna RP-18 (5µm)
UI
150 x 4,6 mm. Se determinó la ausencia de interferencias en el tiempo de
Q
retención del pico de benzocaína para el blanco y la presencia del pico de
O
BI
benzocaína en la muestra. En la linealidad del estándar, la pendiente (b) fue
Y
20,1364 y el intercepto (a) de 0,4255; el coeficiente de correlación fue 0,9999
IA
y el coeficiente de determinación de 0,9999; los límites de confianza de “b”

AC
fueron 2,8287 y 37,4440; y texp = 2,5130; los límites de confianza de “a”

RM
fueron - 216,1889 y 217,0399; y texp = 0,0042; mediante el test estadístico del

FA
coeficiente de correlación se obtuvó tr = 307,6225 y la desviación estándar

DE
relativa fue de 0,66% en el test de linealidad, por tanto el método es lineal en

el intervalo de concentraciones de 3 a 20 μg/mL. Los límites de detección y
CA
cuantificación fueron evaluados para ser 0,0331 μg/mL y 0,0489 μg/mL

TE
respectivamente, siendo estos resultados conformes para un límite de

IO
limpieza de 9,70 μg/mL. Se obtuvó un porcentaje de recuperación de 76,05%

BL
y 75,50% en los equipos Agilent Techologies VWD 1200 y Agilent

BI
Techologies VWD 1260 respectivamente, mediante el método de muestreo

por superficies usando hisopos humedecidos con metanol. Por tanto los
resultados obtenidos permiten dar como validado el método analítico por
HPLC para la determinación de trazas de benzocaína, en las superficies de
equipos de fabricación farmacéutica, al cumplir con los parámetros de
validación considerados necesarios por la OMS.
Palabras claves: HPLC, benzocaína, validación, OMS.
ABSTRACT
The purpose of this study was to demonstrate that the analytical method by high
performance liquid chromatography (HPLC) developed for the determination of trace
amounts of benzocaine on the surfaces of pharmaceutical manufacturing equipment
meets the validation parameters considered by the World Health Organization
(WHO). To which was used as mobile phase solution Methanol: Water: 0,005 M
A
sodium heptanesulfonate (50:50:2) as stationary phase column RP-18 (5μm) 150 x
IC
M
4,6 mm. Was determined by the absence of interference in the retention time of
UI
benzocaine peak in the white and the presence of the benzocaine peak in the sample.
Q
The linearity of the standard, the slope (b) was 20,1364 and the intercept (a) of
O
BI
0,4255; the correlation coefficient was 0,9999 and the coefficient of determination of
Y
0,9999; the confidence limits "b" were 2,8287 and 37,4440; and texp = 2,5130; the
IA
confidence limits of "a" were - 216,1889 and 217,0399; and texp = 0,0042; using the
AC
statistical test of the coefficient of correlation was obtained tr = 307,6225 and the
RM
relative standard deviation was 0,66% in the test of linearity, therefore the method is
FA
linear over the concentration range of 3 to 20 μg/mL. The detection and

DE
quantification limits were evaluated to be 0,0331 μg/mL and 0,0489 μg/mL

respectively, these results conform to a limit of cleaning 9,70 μg/mL. We obtained a
CA
recovery rate of 76,05% and 75,50% in the Agilent Techologies 1200 and Agilent
TE
Techologies VWD 1260 respectively, using the sampling method using swabs wetted
IO
surfaces with methanol. Thus the results obtained are given as validated HPLC
BL
analytical method for the determination of trace amounts of benzocaine in the areas
BI
of pharmaceutical manufacturing equipment, to meet the validation parameters

considered by WHO.
Keywords: HPLC, benzocaine, validation, WHO.
ii
I. INTRODUCCIÓN
Los productos farmacéuticos pueden ser contaminados por una variedad de

sustancias tales como contaminantes asociados a los microbios, productos anteriores
(tanto ingredientes farmacéuticos activos (API) y residuos de excipientes), residuos
de agentes de limpieza, materiales transportados por el aire, lubricantes,
desinfectantes y los residuos de descomposición 1.
A
IC
M
Por tanto los procedimientos adecuados de limpieza desempeñan un papel importante
UI
en la prevención de la contaminación y la contaminación cruzada. La validación del
Q
O
método de limpieza proporciona evidencia documentada de que un procedimiento de
BI
limpieza proporcionará un equipo limpio, adecuado para su uso previsto, por tanto
Y
los procedimientos de limpieza deben ser validados y los métodos para determinar
IA
trazas de ingredientes farmacéuticos activos, deben considerarse con especial

AC
atención 1,2,3,17.
RM
FA
Una limpieza inadecuada de una planta de fabricación de productos farmacéuticos o

DE
inadecuada depuración de las piezas individuales de equipos usados en la fabricación

CA
de múltiples productos o equipos que no se dedican a productos individuales, pueden

conducir a la contaminación del siguiente lote de productos farmacéuticos fabricados
TE
con el mismo equipo 4.

IO
BL
BI
Los desafíos para la validación de limpieza se encuentran especialmente en el

desarrollo de métodos analíticos sensibles capaces de detectar trazas de ingredientes
farmacéuticos activos que son susceptibles de permanecer en la superficie del equipo
después de la limpieza 4,5,16.
Es así que todo laboratorio farmacéutico debe emplear el método analítico en

combinación con el método de muestreo para demostrar que los contaminantes
pueden ser recobrados de la superficie del equipo y determinar la concentración 6.
El método analítico debe ser validado antes que la validación de la limpieza se lleve
a cabo. La validación del método de análisis debe incluir según proceda: linealidad,
selectividad, límite de detección, límite de cuantificación, porcentaje de recuperación
y reproducibilidad 7.
La selectividad evalúa inequívocamente el analito y evidencia la presencia de otros

componentes. Típicamente estos pueden incluir impurezas, degradantes, matriz, etc
A
8,9
.
IC
M
UI
La linealidad de un método analítico permite obtener resultados de prueba
Q
proporcionales ya sea directamente, o por medio de una transformación matemática
O
BI
bien definida, a la concentración de analito en muestras dentro de un intervalo dado
Y
8,9
.
IA
AC
El límite de detección es la mínima cantidad de analito en la muestra que se puede

RM
detectar aunque no necesariamente cuantificar, bajo las condiciones experimentales

FA
descritas 8,9.
DE
Se entiende por límite de cuantificación a la mínima cantidad de analito presente en

CA
la muestra que se puede cuantificar bajo las condiciones experimentales descritas 8,9.
TE
IO
Existen varios procedimientos para determinar el límite de detección y el límite de

BL
cuantificación. Estos se basan en la evaluación visual, en la relación señal-ruido o en

BI
la desviación estándar de la respuesta del blanco y la pendiente de la recta de

calibrado (Métodos instrumentales que corrigen la señal frente a un blanco, métodos
instrumentales que no corrigen la señal frente a un blanco y el método basado en la
extrapolación de la recta de calibrado a concentración cero) 9, 11, 12.
El porcentaje de recuperación se calcula a partir de la cantidad valorada con respecto

a la cantidad conocida de analito añadida a la muestra. Los estudios de recuperación
deben ser realizados para evaluar y verificar la aplicabilidad del método analítico, y
2
el procedimiento de muestreo para recuperar residuos de las superficies que tienen

contacto con el producto 8,10.
Dos métodos de muestreo se consideran aceptables. Estos son muestreo con hisopo o
por raspado en superficie y muestreo por enjuague. Una combinación de los dos es
generalmente la más aceptable 7.
A
El método de muestreo con hisopo o por raspado en superficie (método directo), es el
IC
método de muestreo más utilizado y consiste en tomar un material inerte (por
M
UI
ejemplo algodón) en el extremo de una sonda (referido como un "hisopo") y frotarlo
Q
en una superficie. El tipo de material del hisopo de muestreo utilizado debe tener la
O
BI
característica de estar preparados con materiales inertes que no generen
Y
interferencias 7,13,14.
IA
AC
Los factores que deben ser considerados incluyen el proveedor de la torunda, el área
RM
de frotis, el número de hisopos utilizados, si son hisopos húmedos o secos, manejo

FA
del hisopo y la técnica de hisopado. El lugar desde donde se toma la muestra debe
DE
tener en cuenta la composición del equipo, la ubicación y los peores lugares deben
ser considerados 7.
CA
TE
El método de muestreo con hisopo tiene la ventaja de ser reproducible, disolver y

IO
físicamente remover la muestra, es útil en muchos tipos de superficie, aplicable a

BL
activos, detergentes y microorganismos. Entre sus desventajas se encuentran el ser de

BI
uso limitado en áreas de difícil acceso, estar influenciado según el entrenamiento y la

habilidad del operador 10.
Muestreo por enjuague, este método permite el muestreo de una gran superficie, de
las áreas que son inaccesibles o que no pueden ser desmontadas y habitualmente
proporcionan una imagen en conjunto e involucra el uso de un volumen conocido de
agua para enjuagar el área de la superficie del equipo 7,15.
Método de enjuague tiene la ventaja de permitir el muestreo de grandes áreas, no

depende del operador y es de fácil muestreo. Presenta la desventaja de no permitir
detectar el punto de contaminación, el volumen utilizado es crítico y no todas las
sustancias son solubles 10.
Para desarrollar el método de la presente validación para la determinación de trazas

de benzocaína en las superficies de equipos de fabricación farmacéutica se utilizó la
A
técnica de separación, Cromatografía líquida de alta resolución (HPLC).
IC
M
UI
El término cromatografía de líquidos, según se usa en los diferentes compendios, es
Q
sinónimo de cromatografía de alta presión y de cromatografía de alta resolución. La
O
BI
cromatografía de líquidos es una técnica de separación basada en una fase
Y
estacionaria sólida y una fase móvil líquida 8.
IA
AC
Las fases estacionarias más comúnmente usadas son la sílice modificada o las
RM
microperlas de polímero. El tipo de relleno especifico necesario para completar un

FA
análisis se indica mediante la designación “L” en una monografía individual 8,12.

DE
La fase móvil es un disolvente o mezcla de disolventes, según se define en la

CA
monografía individual 8.
TE
IO
Un cromatógrafo de líquidos consta de un recipiente que contiene la fase móvil, una

BL
bomba para forzar el paso de la fase móvil a través del sistema a alta presión, un
BI
inyector para introducir la muestra en la fase móvil, una columna cromatográfica, un

sistema de detección y un sistema de proceso de datos 8,12.
Así en varios países del mundo se han realizado estudios similares, como el realizado
por Klinkenberg R, Streel B, Ceccato Una. (2003) Bélgica, titulado “Desarrollo y
validación de un método de cromatografía de líquidos para la determinación de
residuos de amlodipino sobre las superficies del equipo de fabricación”, en el cual se
desarrolló un muestreo de frotis con el fin de controlar el procedimiento de limpieza,
4
el porcentaje de recuperación fue de 90% con hisopos humedecidos en metanol, para

determinar la amlodipina residual se realizó la cromatografìa a 25 °C en el modo
isocrático en una fase estacionaria RP-18 utilizando una fase móvil compuesta de
acetonitrilo, metanol, solución trietilamina pH 3,0 (15:35:50 v/v/v). El método ha
demostrado ser selectivo y lineal en el intervalo de concentraciones variando desde
0,39 a1,56 μg/mL 2.
A
En el estudio realizado por Arayne MS, Sultana N, Sajid SS, SS Ali. (2008) Pakistán,
IC
departamento de Química de la Universidad de Karachi, Titulado “Validación de la
M
UI
limpieza de ofloxacino en equipos de fabricación de productos farmacéuticos y la
Q
validación del método deseado por HPLC”. El método para determinar los residuos
O
BI
ofloxacino sobre las superficies del equipo de fabricación fue validado en cuanto a
Y
precisión, linealidad, especificidad, límite de cuantificación y porcentaje de
IA
recuperación sobre la superficie del equipo, así como la estabilidad de un

AC
contaminante potencial en un proceso de validación de limpieza. Se obtuvó una

RM
recuperación media sobre placas de acero inoxidable de 85%. El ensayo fue lineal en
FA
el rango de concentración de 2 μg/mL a 2000 μg/mL (r = 0,99998). El método fue

DE
validado para la exactitud y precisión. Esto confirmó que el nivel deseado de

limpieza se consigue utilizando los procedimientos de limpieza actuales, las cuales
CA
fueron validadas por consiguiente 4.

TE
IO
La benzocaína (4-Aminobenzoato de etilo); cristales pequeños blancos o polvo

BL
cristalino blanco, es un éster con un peso molecular de 165,18913 g/mol, pka 2,5 y
BI
poco soluble en agua. Es un anestésico local, indicado para el alivio temporal del
dolor, actúa bloqueando la conducción de los impulsos nerviosos al disminuir la
permeabilidad de la membrana neuronal a los iones sodio 19.
El principio activo benzocaína, fue considerado como el analito de interés para el

presente trabajo, de ahí que el motivo de estudio es la validación del método analítico
por HPLC para la determinación de trazas en las superficies de un equipo de
fabricación farmacéutica. Dicho analito es componente de un producto farmacéutico
5
analgésico, antiinflamatorio bucofaríngeo indicado para el alivio sintomático de los

procesos inflamatorios de la boca y la garganta.
Es así que la necesidad de determinar trazas de benzocaína después de un proceso de

fabricación hace necesario desarrollar un método de análisis adecuado con la
capacidad de cuantificar cantidades pequeñas de dicho principio activo, lo cual
asegure que el método de análisis de trazas proporcionará de forma consistente y
A
repetitiva resultados que cumplan con las especificaciones establecidas.
IC
M
UI
Por consiguiente se plantea el siguiente problema ¿El método analítico por
Q
cromatografía líquida de alta resolución para la determinación de trazas de
O
BI
benzocaína en las superficies de un equipo de fabricación farmacéutica cumple con
Y
los parámetros de validación considerados por la Organización Mundial de la Salud?.
IA
AC
El objetivo general del presente trabajo es demostrar que el método analítico por
RM
cromatografía líquida de alta resolución, desarrollada para la determinación de trazas

FA
de benzocaína en las superficies de un equipo de fabricación farmacéutica cumple

DE
con los parámetros de validación considerados por la Organización Mundial de la

Salud.
CA
TE
Dentro de los objetivos específicos se consideran:

IO
BL
- Determinar los parámetros de validación (Selectividad, Linealidad, Límite de

BI
detección, Límite de cuantificación y Porcentaje de recuperación) para el

método analítico por cromatografía liquida de alta resolución, para la
determinación de trazas de benzocaína en las superficies de equipos de
fabricación farmacéutica.
- Evaluar los parámetros de validación considerados por la Organización

Mundial de la Salud, para establecer si cumplen con los criterios de
aceptación.
6
II. MATERIAL Y MÉTODO
1. MATERIALES, REACTIVOS Y EQUIPOS
1.1. Materiales
A
1.1.1. Estándares
IC
M
-
UI
Estándar primario Benzocaína USP
Q
USP Reference Standard Benzocaína 500 mg
O
Lote: J1G214
BI
Y
Potencia: 100,0%
IA
AC
- Estándar secundario Benzocaína

RM
Lote: C5031105009
FA
Potencia: 100,36% Tal cual (T/C)

DE
Protocolo: ST 24/11
Reanálisis: 2012-12-20
CA
TE
1.1.2. Material de vidrio

IO
BL
- El de uso común en laboratorio, debidamente verificado.

BI
1.2. Reactivos y solventes
- Agua ultrapura.
- Heptanosulfonato de sodio Fisher Scientific 25 g, lote 101723.
- Metanol grado HPLC Merck 4 L, lote I577107 106.
1.3. Equipos
PROTOCOLO
DESCRIPCIÓN MARCA MODELO SERIE DE
CALIFICACIÓN
PCI-CC.016
Balanza analítica Ohaus PA214 8328320492 PCO-CC.016
A
PCD-CC.016
IC
M
Cromatógrafo PCI-CC.004
UI
líquido de alta Agilent 1200 --- PCO-CC.004
Q
resolución HPLC Series PCD-CC.004
O
Cromatógrafo BI
Y
1200 ITCI-CC.033
líquido de alta
Agilent Infinite --- ITCO-CC.033
IA
resolución HPLC
Series ITCD-CC.033
AC
VWD 1260
RM
PCI-CC.045
MSE3.6P-
Microbalanza Sartorius 27203340 PCO-CC.045
000-DM
FA
PCD-CC.045
DE
Purificador de PCI-CC.046
Millipore Reference F1NA21877C PCO-CC.046
agua
CA
PCD-CC.046
Fisher
TE
PCI-CC.016
Ultrasonido Scientific FS23 222043 PCO-CC.016
IO
PCD-CC.016
BL
BI
Daigger ITCI-CC.007
Vórtex Vórtex Genie G-560E 2-79085 ITCO-CC.007
2 ITCD-CC.007
1.4. Otros
- Guantes de látex, Rubbercare lote 110.
- Jeringas de plástico 5 mL 21G x 11/2”.

- Membrana de filtración Sartolon Polyamida, tamaño de poro 0,45 um x
25 mm; lote 1111 25006 1140783.
- Membrana de filtración Sartolon Polyamida, tamaño de poro 0,45 um x
45 mm; lote 0811 25006 1140493.
- Papel Parafilm “M”, Laboratorio Film.
- Portafiltro descartable Agilent Technologies Econofilter 25 cm de
A
diámetro x 0,2 um de tamaño de poro PTFE.
IC
- Tapas y septas Agilent Technologies, lote 091996-3-1.
M
-
UI
Viales 100/PK Agilent Technologies, lote 1112001095.
Q
O
2. MÉTODO:
BI
Y
IA
2.1. Condiciones cromatográficas

AC
RM
Columna : RP-18 (5µm) 150 x 4,6 mm; equivalente a L1

FA
según USP 34
DE
Longitud de onda : 254 nm

Flujo : 1 mL/min
CA
Volumen de inyección : 20 μL
TE
Temperatura : 25 °C
IO
BL
2.2. Preparación de la fase móvil y solución diluyente

BI
- Fase Móvil
Metanol: Agua: Heptanosulfonato de sodio 0,005 M (50:50:2)
Solución de Heptanosulfonato de sodio 0,005 M: En un matraz

volumétrico de 100 mL; se pesó 101,12 mg de Heptanosulfonato de
sodio, disolviéndose y llevó a volumen con agua.
9
- Solución diluyente
Metanol: Agua (50:50)
2.3. Preparación de las soluciones de trabajo
- Preparación de la solución estándar
A
IC
Se pesó aproximadamente 25 mg de benzocaína estándar y añadió a un
M
UI
matraz volumétrico de 50 mL, disolviéndose y enrasó con metanol.
Q
Luego se transfirió 2 mL de ésta solución en un matraz volumétrico de
O
BI
100 mL, enrasándose con solución diluyente, luego se homogeneizó y
Y
filtró a través de membrana de Polyamida con tamaño de poro de 0,45
IA
µm x 25 mm. Se preparó estándares por duplicado e inyectó 5 veces.

AC
RM
- Preparación de la muestra
FA
DE
Al tubo de ensayo conteniendo 100 µL de metanol y luego de haber

CA
realizado el hisopado correspondiente se le adicionó volumétricamente

TE
10 mL de solución diluyente, dejándolo reposar por 30 minutos. Se

IO
sonico por 10 minutos y agitó con ayuda del vórtex por 1 minuto, luego
BL
se filtró las muestras e inyectó por duplicado.

BI
2.4. Parámetros de validación
2.4.1. Selectividad
Se analizó el hisopo a emplear para determinar posibles interferencias

durante el análisis de las muestras, empleándose hisopos de muestreo
10
de algodón poliéster diseñado específicamente para validaciones de

limpieza, en técnicas analíticas por HPLC.
a. Preparación del blanco
- Se dispuso de tubos de ensayo conteniendo 100 µL de metanol y se

colocó el hisopo de muestreo.
-
A
Luego se adicionó 10 mL de solución diluyente.
IC
- Se dejó reposar por 30 minutos, sonico por 10 minutos y agitó en el
M
UI
vórtex por 1 minuto.
Q
- Se filtró a través de membrana de 0,45 µm x 25 mm e inyectó las
O
muestras por duplicado.
BI
Y
IA
b. Preparación de las muestras

AC
RM
- Se dispuso de tubos de ensayo conteniendo 100 µL de metanol y se

FA
colocó el hisopo de muestreo.

-
DE
Se adicionó 10 mL de la solución estándar de benzocaína, dejándolo

reposar por 30 minutos, se sonico por 10 minutos y agitó en el vórtex
CA
por 1 minuto.
TE
- Se filtró a través de membrana de 0,45 µm x 25 mm e inyectó las

IO
muestras por duplicado.

BL
BI
Criterio de aceptación 8,9

El blanco (Hisopo + solución diluyente) no presenta interferentes en el
tiempo de retención del analito benzocaína.
La muestra (Hisopo + solución diluyente + solución estándar de
benzocaína) no presenta interferentes en el tiempo de retención del
analito benzocaína; asimismo en caso de presentarse, el interferente
próximo al pico de benzocaína debe tener una resolución mayor o igual a
1,5.
11
2.4.2. Linealidad
Se analizaron por triplicado 5 soluciones estándar de Benzocaína a

concentraciones decrecientes de 30%, 20%, 10%, 5% y 3%. Se
determinó la pendiente “b” y el intercepto o término independiente “a” a
partir de la ecuación de la recta de regresión Y = b X + a tomando como
X la concentración y como Y la respuesta.
A
IC
a. Preparación de las muestras
M
UI
Q
- Muestra 3 %
O
BI
Y
Se pesó aproximadamente 15,0 mg de benzocaína estándar y añadió a un
IA
matraz volumétrico de 100 mL, se disolvió y enrasó con metanol; de

AC
esta solución se transfirió 2 mL en un matraz volumétrico de 100 mL y

RM
se enrasó con solución diluyente (3,0 µg/mL), luego se homogeneizó y

FA

DE
µm x 25 mm.
CA
- Muestra 5 %
TE
IO

BL

BI

µm x 25 mm.
- Muestra 10 %
12

µm x 25 mm.
- Muestra 15 %
A
IC
M
UI
Q
matraz volumétrico de 50 mL, se disolvió y enrasó con metanol; de esta
O
BI
solución se transfirió 3 mL en un matraz volumétrico de 200 mL y se
Y
enrasó con solución diluyente (15,0 µg/mL), luego se homogeneizó y
IA

AC
µm x 25 mm.
RM
FA
- Muestra 20 %
DE

CA

TE
esta solución se transfirió 2 mL en un matraz volumétrico de 50 mL y se

IO
enrasó con solución diluyente (20,0 µg/mL), luego se homogeneizó y

BL

BI
µm x 25 mm.
b. Cálculos 8,9,11
- Determinación de la curva de calibración
Se determinó la curva de calibración relacionando la respuesta (área) con

la concentración de analito (μg/mL) sobre los puntos sin promedio.
13
Ecuación de la recta:
Y bX a
Donde:
X : Concentración de analito (μg/mL)
A
Y : Área del pico cromatográfico
IC
b : Valor de la pendiente de la recta
M
UI
a : Valor del intercepto o del término independiente de la recta
Q
con el eje “Y”
O
Donde:
BI
Y
IA
AC
Xi Yi
Xi Yi n
b
RM
2
2 Xi
X i n
FA
DE
Yi b Xi
CA
a n
TE
IO
- Coeficiente de correlación (r)

BL
BI
El coeficiente de correlación "r" refleja el grado de relación o ligazón

existente entre las variables X e Y. Si es cercano a la unidad significa que
existe correlación con una probabilidad elevada.
Xi Yi
Xi Yi
r 2
n
2
Xi Yi
X i2 n
Yi 2
n
14
Criterio de aceptación
“r” no debe ser significativamente diferente de 1, valores mayores a

0,999 se consideran como aceptables.
- Coeficiente de determinación (r2)
A
Es el cuadrado del coeficiente de correlación "r" e indica la proporción
IC
de la varianza total de "Y".
M
UI
Q
O
BI
Y
“r2” no debe ser significativamente diferente de 1, valores mayores a
IA
0,990 se consideran como aceptables.

AC
RM
- Test de verificación de la pendiente “b” o de la Linealidad (Límites

FA
de confianza de la pendiente y test de t para n-2 grados de libertad y

DE
p=0,05)
CA
Hipótesis nula (H0): “b” es igual a 0

TE
Hipótesis alternativa (Ha): “b” es diferente de 0

IO
BL
Varianza del error experimental total o Residual (S2y,x)

BI
2
y2 a y b xy
s y,x
n 2
Varianza de la pendiente (S2b)
2 S y2, x
s
b 2
2 x
x
n
15
Desviación estándar de la pendiente (Sb)
sb sb2
Desviación estándar relativa de la pendiente (Sb rel. (%))
A
Sb
IC
Sb rel .(%) x100
b
M
UI
Q
Límites de confianza de la pendiente
O
BI
Y
b ± t Sb
IA
AC
Test de t
RM
b
texp
FA
Sb
DE
CA
Criterios de aceptación
TE
IO
En los límites de confianza de “b”, no se incluyen el cero.

BL
En el Test de t, el valor de texp debe ser mayor al valor de ttabla (texp > ttabla);
BI
para n-2 grados de libertad y un nivel de confianza del 95% (p=0,05),

para que “b” sea diferente de cero (Ha).
- Test de verificación de la variable independiente o Intercepto o de

proporcionalidad “a” (Límites de confianza del término
independiente y test de t para n-2 grados de libertad y p=0,05)
16
H0: “a” es igual a 0

Ha: “a” es diferente de 0
Varianza del término independiente o intercepto (S2a)
2 2 x2
s a S x
b
n
A
IC
M
Desviación estándar del término independiente o intercepto (Sa)
UI
Q
O
sa BI Sa2
Y
IA
AC
Desviación estándar relativa del término independiente o intercepto

RM
(Sarel. (%))
FA
Sa
DE
S a rel .(%) x100

a
CA
TE
Limites de confianza del término independiente o intercepto

IO
BL
a ± t Sa
BI
Test de t
a
texp
Sa
17
En los límites de confianza de “a”, estos incluyen el cero.

En el Test de t, el valor de texp debe ser menor al valor de ttabla (texp <
ttabla); para n-2 grados de libertad y un nivel de confianza del 95%
(p=0,05), para que “a” sea estadísticamente igual a cero (Ho).
A
Test estadístico del coeficiente de correlación "r"
IC
M
UI
HO: No hay correlación entre X e Y
Q
O
Ha: Hay correlación entre X e Y
BI
Y
IA
r n 2
tr
AC
1 r2
RM
FA
Donde:
DE
r: Coeficiente de correlación
CA
r2: Coeficiente de determinación

TE
n: Número de determinaciones
IO
BL
BI
Si el valor de tr obtenido es mayor que el ttabla calculado para (n-2) grados

de libertad y un nivel de confianza del 95% (α=0,05); entonces existe
correlación lineal significativa y se rechaza la H0.
- Test de linealidad
Se define obteniendo el factor de respuesta (f) por cada determinación:
18
Y
f
X
Donde:
X : Concentración de analito (μg/mL)

Y : Área del pico cromatográfico
A
IC
M
UI
Q
Desviación estándar relativa (DSR): ≤ 2%
O
BI
Y
2.4.3. Determinación del límite de detección y límite de cuantificación
IA
AC
El límite de detección y cuantificación de Benzocaína se determinó a

RM
partir de la curva de calibración realizada a niveles de concentración

FA
cercanos a los límites esperados, mediante el método basado en la

DE
extrapolación de la curva de calibración a concentración cero.

CA
a. Determinación de la curva de calibración

TE
IO
Se obtuvó una curva de calibración, a partir de las concentraciones de

BL
3, 5 y 10 µg/mL, determinándose la ecuación de esta nueva recta de

BI
calibración y se extrapoló la respuesta a concentración cero (Ybl).
Se determinó la desviación estándar (S) de cada concentración de la

nueva curva de calibración y se efectuó el análisis de regresión
tomando como X a la concentración y la desviación estándar de la
respuesta como Y. Se extrapoló la desviación estándar de la respuesta
a concentración cero (Sbl).
19
b. Cálculos 8,9,11
- Límite de detección
Ybl 3Sbl
Limite de det ección
b
A
Donde:
IC
M
UI
Ybl: Respuesta a concentración cero
Q
Factor: 3
O
Sbl:
BI
Desviación estándar de la respuesta a concentración cero
Y
b: pendiente
IA
AC
- Límite de cuantificación
RM
FA
Ybl 10Sbl
Limite de cuantificación
DE
b
CA
Donde:
TE
IO
Ybl: Respuesta a concentración cero

BL
Factor: 10
BI
Sbl: Desviación estándar de la respuesta a concentración cero

b: pendiente
2.4.4. Determinación del porcentaje de recuperación
Se determinó el porcentaje de recuperación del método de muestreo en

combinación con el método analítico.
20
a. Preparación de la solución estándar
Se preparó la solución estándar por duplicado según lo descrito

anteriormente e inyectó 5 veces.
b. Preparación de la Solución Stock
A
Se pesó aproximadamente 25 mg de benzocaína estándar y llevó a un
IC
M
matraz volumétrico de 25 mL, disolviéndose, enrasó con metanol y
UI
homogenizó.
Q
O
BI
c. Determinación del volumen de saturación (Volumen de solvente
Y
utilizado para el muestreo por hisopado)
IA
AC
Se dispuso de una batería de tubos conteniendo diferentes volúmenes de

RM
metanol en cantidades mínimas de 0,1 a 1,0 mL (100 μL, 200 μL, 300
FA
μL, 500 μL y 1000 μL), colocándose un hisopo en cada tubo y dejándolo

DE
reposar por 5 minutos. Luego se observó los tubos.

CA
TE
IO
BL
Se eligió el tubo de ensayo que no muestre sobrante de solvente; el

BI
volumen presente en dicho tubo constituye el volumen de saturación. El

volumen de solvente a utilizar para efectuar las pruebas de hisopado será
la mitad del volumen de saturación.
d. Preparación de las muestras
Se tomó 100 µL de la solución stock, se “ensució” 25 cm2 de una

superficie similar al equipo utilizando una plantilla de acero y se dejó
secar.
21
e. Hisopado
- Para realizar el muestreo se eligió el método de muestreo en superficie

o también llamado hisopado, ya que permite tener acceso a los puntos
más críticos del equipo sobre el cual se realiza el muestreo para la
validación del procedimiento de limpieza (Secadora de lecho fluido
TF Glatt 60).
- Se utilizó hisopos dispuestos en tubos de ensayo conteniendo 100 µL
A
IC
de metanol. Los hisopos utilizados fueron Texwipe TX715 de algodón
M
UI
poliéster (Anexo 6) diseñado específicamente para la determinación
Q
de trazas de analitos en técnicas analíticas como HPLC.
O
- El muestreo se realizó sobre placas de acero en una superficie de área
BI
Y
conocida (25 cm2), en tres direcciones (horizontal, vertical y diagonal,
IA
este último en ambas direcciones) y con una concentración conocida

AC
de la solución estándar de benzocaína.

RM
- Se adicionó volumétricamente 10 mL de solución diluyente y se dejó

FA
reposar por 30 minutos.

- Se sonico por 10 minutos y agitó con ayuda del vórtex por 1 minuto.
DE
- Filtró las muestras e inyectó por triplicado.

CA
- Se repitió este ensayo con tres muestras.

TE
IO
f. Cálculos 8,9,10, 11,22

BL
BI
- Se determinó los µg/mL de benzocaína recuperados a partir de la

siguiente fórmula:
AMP
C Hallada x CSt
ÄSt
22
Donde:
CHallada : Concentración en µg/mL hallados

AMP : Área de la muestra
ASt : Área del estándar
CSt : Concentración del estándar (µg/mL)
A
IC
-
M
Se determinó el porcentaje de recuperación a partir de la siguiente
UI
fórmula:
Q
O
BI
Y
C hallado
%R x 100
IA
C agregado
AC
RM
Donde:
FA
DE
%R : Porcentaje de recuperación
CA
C hallado : concentración hallada (µg/mL)

TE
C agregado : concentración agregada (µg/mL)

IO
BL
BI
El uso del factor de corrección para los estudios de recuperación se

realizó según la siguiente tabla:
23
% DE RECUPERACION FACTOR DE CORRECCION
A
IC
< 50 % Método no adecuado
M
UI
> 50 < 89% Requerido
Q
O
> 90 % < 100% No Requerido
BI
Y
>111 < 150 Requerido
IA
> 150 Método no adecuado

AC
RM
FA
DE
CA
TE
IO
BL
BI
24
III. RESULTADOS
Cuadro 1: Parámetro de Selectividad para la validación del método analítico

por cromatografía líquida de alta resolución para la determinación de trazas
de benzocaína, en las superficies de un equipo de fabricación farmacéutica
Resultado a Conformidad
A
Prueba Criterio de aceptación
IC
M
Ausencia de
Ausencia Conforme
UI
Blanco interferentes en el tR
Q
del pico de benzocaína
O
Ausencia de
interferentes en el tR
BI Ausencia
Y
Muestra (Benzocaína Conforme
del pico de benzocaína,
IA
en caso de presentarse tR=3,349)

AC
R ≥ 1,5
RM
Tiempo de retención (tR), Resolución (R)

FA
a: En el anexo 1 se muestra los cromatogramas obtenidos de la solución

DE
muestra y la muestra con analito.

CA
TE
Cuadro 2: Parámetro de Linealidad para la validación del método analítico

IO
por cromatografía liquida de alta resolución para la determinación de trazas

BL
de benzocaína, en las superficies de un equipo de fabricación farmacéutica

BI
Criterio de
Estimadores estadísticos aceptación Resultado b Conformidad
Coeficiente de correlación 0,9999 Conforme

r > 0,995
(r)
Coeficiente de Conforme
r2 > 0,990 0,9999
determinación (r2)
25
Estimadores estadísticos Criterio de Resultado Conformidad

aceptación
Test de verificación de la
pendiente
LS= 37,4440 Conforme

g. Límite de LC no incluye el LI= 2,8287
A
confianza (LC)
cero
IC
texp= 2,5130
M
h. Test de t texp > ttabla ttabla= 2,160
UI
Q
O
Test de verificación de la
variable independiente
BI
Y
IA
LS= 217,0399 Conforme

i. Límite de
LC incluye el cero LI= -216,1889
AC
confianza (LC)
RM
texp < ttabla texp= 0,0042

j. Test de t
ttabla= 2,160
FA
Test estadístico del

DE
coeficiente de correlación 307,6225 Conforme

tr > ttabla
CA
"r"*
TE
DSR ≤ 2% 0,66 % Conforme

Test de linealidad
IO
BL
BI
*ttabla: 2,160 para: α=0,05 y n-2 grados de libertad

Y = 20,1364 X + 0,4255
Límite inferior (LI), Límite superior (LS)
b: En el anexo 2 se muestra los datos obtenidos y cálculos realizados.
26
Cuadro 3: Límite de detección y Límite de cuantificación para la validación

del método analítico por cromatografía liquida de alta resolución para la
determinación de trazas de benzocaína, en las superficies de un equipo de
fabricación farmacéutica
Estimadores
estadísticos del límite de limpieza c Resultado d Conformidad
A
IC
Límite de 0,0331 μg/mL Conforme
9,70 μg/mL
M
detección
UI
Q
O
Límite de
9,70 μg/mL 0,0489 μg/mL Conforme
cuantificación BI
Y
IA
c: En el anexo 3 se muestra los datos obtenidos y cálculos realizados.

AC
d: En el anexo 5 se muestra el procedimiento para determinar el límite de limpieza

RM
FA
Cuadro 4: Parámetro de porcentaje de recuperación para la validación del

DE
método analítico por cromatografía liquida de alta resolución para la

CA
determinación de trazas de benzocaína, en las superficies de un equipo de

TE
fabricación farmacéutica
IO
BL
Estimadores estadísticos Criterio de Resultado e Conformidad

BI
aceptación
Porcentaje de
> 50 < 89% Conforme
recuperación (Agilent 76,05%
Techologies VWD 1200)
Porcentaje de
recuperación (Agilent > 50 < 89% 75,50% Conforme
Techologies VWD 1260)
e: En el anexo 4 se muestra los datos obtenidos y cálculos realizados.

27
IV. DISCUSIÓN
En el presente trabajo se desarrolló un método analítico por cromatografía líquida de

alta resolución (HPLC) para la determinación de trazas de benzocaína, en las
superficies de un equipo de fabricación farmacéutica, el cual combina el método
analítico y el método de muestreo utilizado para demostrar mediante resultados que
A
los contaminantes pueden ser recuperados de la superficie de un equipo de
IC
fabricación farmacéutica 6.
M
UI
Q
O
BI
Debido a que no se disponía de un método de análisis para determinar
Y
cuantitativamente trazas de benzocaína después de un proceso de fabricación con el
IA
fin de controlar un procedimiento de limpieza, se propuso un método por HPLC al

AC
ser altamente específico (detectar un único compuesto en presencia de contaminantes

RM
potenciales), directo (hay una correlación directa entre la presencia del residuo
FA
objetivo y la respuesta cuantitativa en el procedimiento analítico), sensitivo, preciso

y altamente reproducible 10.
DE
CA
TE
Para la determinación de trazas de benzocaína se realizó la cromatografía a 25 °C en

IO
el modo isocrático en una fase estacionaria RP-18 (relleno de octadecilsilano unido

BL
químicamente a micropartículas de sílice o cerámica porosa) de 5 µm de tamaño de

BI
partícula y 150 x 4,6 mm de tamaño de columna; equivalente a una columna “L1”

según USP 34, utilizando como fase móvil Metanol: Agua: Heptanosulfonato de
sodio 0,005 M (50:50:2), detección UV a 254 nm, flujo de 1 mL/min y un volumen
de inyección de 20 μL 8,21.
Luego de determinar las condiciones cromatográficas de trabajo, se validó por medio

de estudios de laboratorio que las características del método cumplen con los
28
parámetros de validación establecidos para la aplicación prevista. Se evaluó los

siguientes parámetros: Selectividad, Linealidad, Limite de detección, Limite de
cuantificación y Porcentaje de recuperación 20.
La selectividad es un parámetro definido según la Conferencia internacional sobre la

armonización de requerimientos técnicos para el registro de productos farmacéuticos
A
para uso humano (ICH), como la habilidad para evaluar inequívocamente al analito
IC
en busca de la presencia de componentes esperados como impurezas, productos de
M
UI
degradación y componentes de la matriz, realizada a través de las pruebas de
Q
identificación para asegurar la identidad del analito 9.
O
BI
Y
IA
En el Cuadro 1, encontramos los resultados obtenidos de la prueba de identificación,

AC
así mediante el uso de cromatogramas se identificó que el blanco (Hisopo a emplear

RM
+ solución diluyente), no presenta interferentes en el tiempo de retención (tR) del

FA
pico de benzocaína. En la muestra (Hisopo + solución diluyente + solución estándar

de benzocaína) se comprobó la ausencia de interferentes y la presencia del pico de
DE
benzocaína con un tR igual a 3,349; al compararlos, se puede afirmar que la

CA
identificación del analito benzocaína es posible sin incurrir en resultados falsos

TE
positivos, por lo tanto el resultado es conforme.

IO
BL
BI
Para evaluar el parámetro de linealidad; la USP 34 y la Guía de validación de

métodos analíticos de la Asociación Española de Farmacéuticos de la Industria
(AEFI), establecen que los resultados deben hallarse mediante métodos estadísticos
adecuados como el cálculo de una línea de regresión por el método de los mínimos
cuadrados, la intersección con el eje de ordenadas o variable independiente (b), la
pendiente de la línea de regresión (m) y la suma de los cuadrados residuales. Así
también se debe presentar el coeficiente de correlación (r) el cual indica el grado de
relación entre la variable X (concentración) y la variable Y (respuesta), el valor
29
recomendable es ≥ 0,995. El coeficiente de determinación (r2), expresa la proporción

de la variación total de Y explicada por el método, el valor recomendable es ≥ 0,990
8,11
.
El test de linealidad, verificado mediante el coeficiente de variación de los factores

de respuesta (f), expresa la relación entre Y y X, siendo recomendable considerar la
A
desviación estándar relativa (RSD) ≤ 2 %; o la significación estadística de la
IC
desviación estándar de “b” mediante la prueba “t de Student”, empleada para
M
UI
comprobar que es significativamente distinta de cero. El test de proporcionalidad, el
Q
cual permite evaluar si la recta pasa por el origen de coordenadas determinando si
O
“b” es significativamente distinta de cero. El test estadístico del coeficiente de
BI
correlación "r" (tr>ttabla) permite determinar si el coeficiente correlación “r” es lo
Y
IA
suficientemente grande para afirmar que hay correlación entre los valores X y Y 8,11.
AC
RM
FA
En el cuadro 2, la ecuación de la recta de las cinco concentraciones (3%, 5%, 10%,

15% y 20%) de la solución estándar de benzocaína resultó Y = 20,1364 X + 0,4255.
DE
Del análisis estadístico se obtuvó un valor de r = 0,9999; lo cual demuestra que

CA
existe una relación o ligazón existente entre las variables X e Y con una probabilidad
TE
superior al 99,99%. El valor de r2 fue de 0,9999; lo que significa que “a” explica un
IO
99,99% de la varianza total de Y.

BL
BI
En la linealidad del estándar, los límites de confianza de “b” hallados fueron 2,8287
y 37,4440; este intervalo no incluye el cero, en la aplicación del test de “t” el valor
hallado de texp = 2,5130 es mayor al ttabla = 2,160; por lo tanto se rechaza la hipótesis
nula (H0: b es igual a 0) y se acepta la hipótesis alternativa (Ha: b es diferente de 0);
es decir, el valor hallado indica que la probabilidad de ser “b” diferente de 0 es muy
elevada (> 99,5%).
30
Los límites de confianza de “a" hallados fueron de -216,1889 y 217,0399; este

intervalo incluye el cero, en el test de “t” el valor obtenido de texp = 0,0042 es menor
al ttabla = 2,160; por lo tanto no se rechaza la hipótesis nula (H0: a es igual a 0); es
decir, éste valor hallado indica que la probabilidad de ser “a” igual a 0 es alta
(superior al 99,5%), lo que significa que “a” en el origen es estadísticamente igual a
cero.
A
IC
En la aplicación del test estadístico del coeficiente de correlación "r", se obtuvó el
M
valor de tr = 307,6225 y ttabla = 2,16; al comparar el “tr” obtenido con el “ttabla” se
UI
observó que este último es menor que el primero, con lo cual se rechaza la hipótesis
Q
O
nula (HO: No hay correlación entre X e Y) y se acepta la hipótesis alternativa (Ha); es
BI
decir, hay una correlación significativa entre los valores X y Y.
Y
IA
AC
En la aplicación del test de linealidad, se determinó el valor promedio de f =

RM
20,2095; los cuales indican que no existe diferencia significativa entre el valor de “b”
FA
respecto a los valores de “f” hallados de cada determinación. Así también se halló el
DE
valor de RSD = 0,66 %; los cuales cumplen el test de linealidad.

CA
TE
Esto demostró que el método es lineal, en el rango de concentraciones de 3 a 20

IO
μg/mL, así mismo se cumple con la ley de Beer - Lambert, existe una relación
BL
directamente proporcional entre la absorbancia y la concentración, representada con

BI
una recta (Gráfico N°1).
Según la guía ICH, establecen que siempre que el método de análisis se emplee en la
determinación de impurezas o trazas de principio activo, es recomendable establecer
el límite de detección y el límite de cuantificación. El método basado en la
extrapolación de la recta de calibrado a concentración cero, es un procedimiento que
31
proporciona datos numéricos y utiliza “b” de una recta de calibrado realizada a

niveles de concentración cercanos a los límites esperados 9.
En el cuadro 3, se muestra el límite de detección igual a 0,0331 μg/mL y el límite de

cuantificación de 0,0489 μg/mL, valores que se encuentran por debajo del límite de
limpieza establecido de 9,70 μg/mL; con lo cual se demuestra que el método es
A
realmente capaz de detectar y cuantificar trazas de benzocaína en las superficies de
IC
equipos de fabricación farmacéutica, aún por debajo del valor límite establecido.
M
UI
Q
O
BI
El porcentaje de recuperación según la AEFI, puede evaluarse como su nombre lo
Y
menciona mediante la recuperación del analito. El porcentaje de recuperación se
IA
realiza para poder corregir los resultados por un factor calculado al determinar la
AC
cantidad de analito residual real que se recupera de la superficie muestreada y similar

RM
al equipo a muestrear. Asimismo se considera necesario para determinar trazas de

FA
analitos de las superficies de equipos utilizar métodos analíticos altamente sensibles

y capaces de detectar concentraciones muy bajas del analito 11,21,24.
DE
CA
TE
Dos métodos de muestreo se consideran aceptables según la organización mundial de

IO
la Salud, tales como el muestreo con hisopo o por raspado en superficie y el

BL
muestreo por enjuague. El método con hisopo es el más utilizado y consiste en el uso
BI
de hisopos con los cuales se frota en forma horizontal, vertical y diagonal (en ambas
direcciones) las superficies de los puntos críticos considerados en los equipos de
fabricación farmacéutica, se debe tener en cuenta que el material de muestreo no
interfiera en los resultados, por tanto debido al empleo de fuerzas físicas así como el
análisis químico se considera necesario evaluar la eficacia del método analítico
mediante la determinación del porcentaje de recuperación 7,10, 22,23.
32
En el cuadro 4, el porcentaje de recuperación promedio obtenido usando el equipo

Agilent Techologies VWD 1200 (celda de flujo estándar de 10 mm de paso óptico)
fue de 76,05 % del principio activo de benzocaína y de 75,50% utilizando el equipo
Agilent Techologies VWD 1260 (celda de flujo de alta sensibilidad de 60 mm de
paso óptico), encontrándose ambos valores dentro los límites de aceptación (> 50 <
89%). Se consideró necesario realizar el análisis cromatográfico en equipos con
diferentes celdas de paso óptico con la finalidad de comprobar que se obtienen
A
resultados similares; lo que hace más seguro el parámetro de validación, aunque cabe
IC
resaltar que el equipo con una celda de 60 mm demostró ser más sensible que el
M
UI
equipo con celda de paso de 10 mm, como se puede mostrar en el Anexo 7 al
Q
comparar las alturas obtenidas por ambos equipos.
O
BI
Y
IA
Por todo lo mencionado anteriormente se considera que el método analítico para la

AC
determinación de trazas de benzocaína por HPLC en las superficies de un equipo de

RM
fabricación farmacéutica es válido y confiable.

FA
DE
CA
TE
IO
BL
BI
33
V. CONCLUSIONES
1. El método analítico desarrollado para la determinación de trazas de

benzocaína en las superficies de un equipo de fabricación farmacéutica por
cromatografía líquida de alta resolución, cumple con los parámetros de
validación (Selectividad, Linealidad, Límite de detección, Límite de
A
cuantificación y Porcentaje de recuperación) considerados por la
IC
organización Mundial de la Salud.
M
UI
Q
O
BI
Y
IA
AC
RM
FA
DE
CA
TE
IO
BL
BI
34
VI. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS
1. Buenas prácticas de fabricación para establecimientos de la industria químico

farmacéutica dedicados a la fabricación de medicamentos - Norma Oficial
Mexicana NOM-059-SSA1-2006 (modifica a la NOM-059-SSA1-1993,
publicada el 31 de julio de 1998) [Sede Web] 2008. [acceso 05 de Julio del
A
2012] México. Disponible en:
IC
http://www.salud.gob.mx/unidades/cdi/nom/164ssa18.html
M
UI
2. Klinkenberg R, Streel B, Ceccato U. Desarrollo y validación de un método de
Q
O
cromatografía líquida para la determinación de residuos de amlodipino sobre
BI
las superficies del equipo de fabricación. Revista de análisis farmacéutico y
Y
IA
análisis [revista en internet] 2003. [acceso 05 de julio del 2012]; 32 (2).

AC
Disponible en: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12763545

RM
3. Ministerio de Salud. Manual de Buenas Prácticas de Manufactura de

FA
Productos Farmacéuticos. Informe de la Dirección General de Medicamentos,

DE
Insumos y Drogas: DIGEMID. 1999. Pag. 19-20, 26.

CA
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TE
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RM
FA
DE
CA
TE
IO
BL
BI
38
A
IC
M
UI
Q
O
BI
Y
ANEXOS
IA
AC
RM
FA
DE
CA
TE
IO
BL
BI
39
ANEXO 2
Parámetro de Selectividad para la validación del método analítico por cromatografía

líquida de alta resolución para la determinación de trazas de benzocaína, en las superficies
de un equipo de fabricación farmacéutica
Estándar secundario Benzocaína
Lote: C5031105009
Potencia: 100,36% T/C
Protocolo: ST 24/11
Reanálisis: 2012-12-20
% Pesos (mg) Diluciones
A
3 15.334 15.336 15.331 100 2 100
IC
5 25.825 25.820 25.832 100 2 100
M
10 50.382 50.387 50.380 100 2 100
UI
15 50.487 50.481 50.490 50 3 200
20 50.658 50.650 50.660 100 2 50
Q
O
Resultados
BI
X Y
% DATO
Conc.(ug/mL) Y
ÀREA
X2 Y2 XY
A
1 3.0778 62.22213 9.4731 3871.5935 191.5098
I
AC
3 2 3.0782 62.24986 9.4756 3875.0451 191.6201

3 3.0772 62.27084 9.4694 3877.6575 191.6222
RM
4 5.1836 105.76768 26.8696 11186.8021 548.2567

5 5 5.1826 105.63007 26.8592 11157.7117 547.4374
FA
6 5.1850 105.61942 26.8842 11155.4619 547.6366

7 10.1127 204.46223 102.2662 41804.8035 2067.6601
DE
10 8 10.1137 204.40202 102.2865 41780.1858 2067.2563

9 10.1123 204.37863 102.2581 41770.6244 2066.7326
CA
10 15.2006 303.70825 231.0590 92238.7011 4616.5555

15 11 15.1988 303.82870 231.0041 92311.8789 4617.8376
TE
12 15.2015 303.75449 231.0865 92266.7902 4617.5327

13 20.3361 411.58740 413.5589 169404.1878 8370.1021
IO
20 14 20.3329 411.69882 413.4283 169495.9184 8371.0458

BL
15 20.3370 411.45822 413.5916 169297.8668 8367.8054

SUM. 161.7301 3263.0388 2349.5703 955495.2287 22271.6577
BI
PROM. 10.7820 217.5359 156.6380 63699.6819 1855.9715
Ecuación de la recta: Y = 20.1364 X + 0.4255
Pendiente b = 20.1364
Intercepto a = 0.4255
Coeficiente de correlación: r = 0.9999
Coeficiente de determinación r2 = 0.9999
Test de hipótesis tr = 307.6225 t tabla (α : 0,05; v: 13) = 2.160
Especificación: t r > t tabla
Recta de regresión lineal de soluciones en el rango de 40% - 160%
ÁREA vs CONCENTRACIÓN 1. REGRESION

LINEAL
450
y = 20.136x + 0.4255
400
R² = 0.9999
350
300
A
250
IC
ÁREA
M
200
UI
150
Q
O
100
BI
50
0 Y
A
0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0
I
AC
CONCENTRACIÓN (ug/mL)
RM
FA
DE
CA
GRÁFICO N°1: RECTA DE REGRESIÓN LINEAL DE LA RECTA DE LA

TE
LINEALIDAD DEL ESTANDAR

IO
BL
BI
Test de verificación de la pendiente b o de Linealidad:
Varianza del Error Experimental Total o Residual s y2,x:
s 2

y 2
 a y  b xy
n2
y,x
s y2,x  38895.13385
2
Varianza de la Pendiente s b :
A
IC
S y2, x
sb2 
M
 x 
2

UI
x 
2
n
Q
O
sb2 
BI
64.20516876
Y
A
Desviación Estándar de la Pendiente s b
I
AC
sb  sb2
RM
sb 
FA
8.012812787
DE
Desviación Estándar Relativa de la Pendiente s rel .(%) :

b
CA
Sb
TE
Sb rel.(%)  x100
b
IO
Sb rel.(%) 
BL
39.7928
BI
Limites de Confianza de la Pendiente:
𝑏 ± 𝑡 𝑠𝑏
... Siendo 𝑡𝑡𝑎𝑏𝑙𝑎= 2,160 para (n-2) grados de libertad y p =0,05
Límite de Confianza Inferior= 2.8287 Este intervalo de confianza no incluye el cero.

Límite de Confianza Superior= 37.4440
Tesis de t:
b
texp 
Sb
t exp  2.5130
Conclusión: Cumple con el test de Student de la pendiente ya que texp >𝑡𝑡𝑎𝑏𝑙𝑎

Este valor tan alto indica que la probabilidad de ser b ≠ 0 es muy elevada, superior al 99,5%.
A
IC
H0: 𝑏=0 , 𝑃<0,05 ...Se rechaza la H0
M
UI
Q
Test de verificación de la variable Independiente (Intercepto) o de Proporcionalidad:
O
BI
Varianza del termino Independiente sa2 :
Y x
x 2
A
s 2
 S 2
I
a b
n
AC
sa2 
RM
10056.97056
FA
Desviación Estándar del Término Independiente sa

DE
sa  S a2
CA
sa 
TE
100.2844
IO
s a rel .(%)
BL
Desviación Estándar Relativa del Término Independiente :

BI
Sa
Sa rel.(%)  x100
a
Sa rel.(%)  23570.6072
Límite de Confianza del Término Independiente:
𝑎 ± 𝑡S𝑎
Límite de Confianza Inferior = -216.1889 Este intervalo de confianza incluye el cero.

Límite de Confianza Superior = 217.0399
Tesis de t:
Donde:
a
t exp 
S a
t exp  0.0042
A
IC
M
UI
Conclusión: Cumple con el test de Student de la pendiente ya que texp<𝑡𝑡𝑎𝑏𝑙𝑎
Q
Este valor tan alto indicaque la probabilidad de ser a = 0 es muy elevada, superior al 99,5%.
O
BI
H0: 𝑎=0 , 𝑃<0,05 ...No se rechaza la H0
Y
A
Test de linealidad
I
AC
- Coeficiente de variación de los Factores de Respuesta ( f )

RM
X Y Y/X
FA
Conc.(ug/mL) Area f
3.0778 62.22213 20.2162
3.0782 62.24986 20.2225
DE
3.0772 62.27084 20.2359

5.1836 105.76768 20.4043
CA
5.1826 105.63007 20.3817

5.1850 105.61942 20.3702
TE
10.1127 204.46223 20.2184

IO
10.1137 204.40202 20.2105

10.1123 204.37863 20.2109
BL
15.2006 303.70825 19.9800

BI
15.1988 303.82870 19.9903

15.2015 303.75449 19.9818
20.3361 411.58740 20.2392
20.3329 411.69882 20.2479
20.3370 411.45822 20.2321
Promedio de f Xf = 20.2095
Desviación estándar de f sf = 0.1336
Desviación estándar relativa de f DSR f = 0.66 %
Especificación: DSR ≤ 2%
A
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ANEX
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RM
FA
3.88951E+04
DE
64.20516876
8.012812787
CA
39.79275108
37.44403858
TE
2.828687336
2.51302052
IO
BL
10056.97056
100.2844483
BI
23570.60725
-216.1889442
217.0398722
-0.004242572
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IO
BL
BI
ANEXO 5
1. DETERMINACIÓN DEL LÍMITE DE LIMPIEZA

Para realizar la validación del proceso de limpieza mediante agrupación de
productos y selección del peor caso se siguió el siguiente procedimiento para
determinar el límite de limpieza.
1.1 Se realizó la medición de la superficie total del equipo o tren de equipos que están
en contacto con el producto.
A
IC
1.2 Se elaboró una tabla con todos los productos fabricados en el equipo, considerando
M
el tamaño de lote expresado en Kilogramos (Formas farmacéuticas sólidas o
UI
semisólidas) o Litros (Formas farmacéuticas Liquidas) para poder elegir el menor
Q
tamaño de lote que será el producto B.
O
BI
1.3 Se elaboró una tabla con los productos fabricados, considerando el tamaño de lote
Y
en unidades, el tamaño de lote (Kg) o (L), peso o volumen administrado de la
A
forma farmacéutica (mg) o (mL), número de unidades diarias, dosis diaria de
I
AC
producto (g) o (L), dosis terapéutica del principio activo (mg) y dosis terapéutica
diaria de Principio Activo, para poder determinar el peor caso de contaminación
RM
del lote siguiente “Producto B” que será el producto de mayor dosificación diaria
FA
(incluyendo excipientes), el de menor tamaño de lote, la máxima dosis terapéutica

diaria de principio activo, el menor número de unidades en el lote y el máximo
DE
número de dosis diarias. Estos datos no fueron necesariamente de un mismo

producto.
CA
TE
Datos de Todos los Productos Fabricados en el Equipo

IO
Peso/Volumen
Dosis
Productos Tamaño de Tamaño administrado de la Nº Unidades Dosis diaria de
terapéutica Dosis terapéutica
BL
Fabricados en el Contaminante lote de lote forma diarias Producto

del P.A. diaria del P.A.(g)
equipo (Unidades) (Kg o L) farmacéutica (mg (g o mL)
(mg)
BI
o mL)
Principio Activo 1
PRODUCTO 1 Principio Activo 2
Principio Activo 3
Principio Activo 1
PRODUCTO 2 Principio Activo 2
Principio Activo 3
1.4 Se elaboró una tabla con los productos incluidos en el grupo de validación,
Producto A del cual se seleccionó el producto prototipo, considerando datos como:
dosis terapéutica (mg), LD50 (mg/Kg.), NOEL (mg), ADI (mg) y MACO (mg)
para cada contaminante.
Determinación de la Cantidad Máxima Aceptable en el Lote siguiente para cada contaminante
Dosis
LD50 NOEL ADI MACO
PRODUCTO CONTAMINANTE Terapéutica
(mg/Kg.) (mg) (mg) (mg)
(mg)
Principio Activo 1
PRODUCTO 1
Principio Activo 2
Principio Activo 1
PRODUCTO 2
Principio Activo 2
1.5 A partir de los datos de la tabla elaborada según el ítem 1.4 y considerando los
datos del Producto B se calculó los límites de aceptación para cada contaminante
utilizando el criterio de Dosis terapéutica del Producto A en B o el criterio
A
IC
toxicológico y se dispuso en una nueva tabla.
M
UI
Determinación de Limites de Limpieza para cada contaminante
Q
O
Dosis Límite Dosis Límite Límite más
MACO
PRODUCTO CONTAMINANTES Terapéutica. Terapéutica Diaria Toxicidad estricto
BI
(mg)
(mg) (µg/hisopo) (µg/hisopo) (µg/hisopo)
Principio Activo 1
Y
A
PRODUCTO 1
Principio Activo 2
I
AC
Principio Activo 1
PRODUCTO 2
Principio Activo 2
RM
FA
1.6 Una vez establecidos los límites de cada contaminante por producto fabricado en
el equipo, de acuerdo a los criterios de Dosis Terapéutica y el criterio
DE
Toxicológico, se definió como límite de limpieza general al más estricto entre

estos dos (Límite más bajo), el que no necesariamente coincide con el límite del
CA
contaminante a ser monitoreado.

TE
2. LÍMITE DE LIMPIEZA BASADO EN LA DOSIS TERAPÉUTICA DIARIA

IO
BL
Se realizó el cálculo del Límite basado en la Dosis Terapéutica, para lo cual se

BI
procedió a realizar la búsqueda bibliográfica de:
 La dosis terapéutica diaria máxima del Producto B en g o mL (MTUDB)

 La dosis terapéutica mínima del principio activo del Producto A (LTUDA mg/Kg)
 La dosis terapéutica del producto A normalizada para una persona de 70 Kg,
expresado en mg (LTUD70A) que resulta de multiplicar 70 Kg por LTUDA mg/Kg
2.1 Cálculo del Residuo Máximo Admisible del Producto “A” (MARA)
MARA = LTUD70A/SF
Donde:
LTUD70A: Dosis terapéutica mínima del principio activo del Producto A
SF: Factor de seguridad 1000
2.2 Cálculo de la Máxima Concentración de Residuo del Producto “A” permitida

en el Producto “B” ( MCRA  B )
MARA (mg )
MCRA  B 
MTUDB (g)
A
IC
Donde:
M
UI
MARA : Residuo máximo admisible de A (mg)
MTUDB : Dosis terapéutica diaria máxima del producto B (g ó mL)
Q
O
BI
2.3 Cálculo de la Concentración Máxima de Residuo del Producto “A” sobre la
Y
superficie del equipo (MSCRA) I A
AC
MCRA  B x BSB
MSCRA 
SA(cm 2 )
RM
Donde:
FA
MSCRA: Máxima concentración de residuo sobre la superficie del equipo

expresado en mg/cm2
DE
BSB : Tamaño de lote más pequeño de B expresado en g o mL

CA
SA : Superficie del equipo en contacto con el producto expresado en cm2

TE
2.4 Cálculo del Límite de Limpieza en un área de muestreo

IO
BL
LLug / hisopo  MSCRA  L  1000

BI
Donde:
LL : Límite de limpieza en µg/hisopo
MSCRA : Máxima concentración de residuo sobre la superficie del equipo
expresado en mg/cm2
L : Superficie de muestreo expresado en cm2
2.5 Cálculo del Límite de Limpieza expresado en ppm
Si el hisopo fue sumergido en un volumen determinado de solución para recuperar

el principio activo se aplica la siguiente fórmula:
LLug / hisopo
LL ppm 
V ( mL )
Donde:
A
LLug/hisopo : Límite de limpieza en µg/hisopo
IC
LLppm : Límite de limpieza en ppm
M
V : Volumen utilizado para recuperar el principio activo
UI
del hisopo
Q
O
El límite establecido por equipo resulta de la interpolación del límite de limpieza
BI
encontrado frente a la superficie de contacto del equipo para lo que se aplica la
siguiente fórmula:
Y
A
I
AC
LLug / hisopo  Sequipo

LLequipo 
RM
SA
FA
Donde:
DE
LLug/hisopo : Límite de limpieza en µg/hisopo

CA
LLequipo : Límite de limpieza por equipo en µg/hisopo

Sequipo : Superficie del equipo en cm2
TE
SA : Superficie total del tren de equipos en cm2

IO
BL
BI
3. LÍMITE DE LIMPIEZA BASADO EN DATOS DE TOXICIDAD
Este método consiste en establecer límites aceptables de residuos mediante el

cálculo del MACO (Maximum Allowable Carry Over) cantidad trasferida
aceptable de un producto previo, a partir del cálculo de la ADI (Acceptable Daily
Intake) dosis diaria aceptable y de NOEL (No Observed Effect Level) que es la
cantidad con la cual no se observa nivel de efecto, para estos cálculos se usa los
datos de toxicidad LD50 aplicando un adecuado factor de seguridad.
3.1 Cálculo de NOEL de acuerdo a la siguiente ecuación
NOEL  DL50 x 0,0005 x Peso promedio del adulto (kg )
Donde:
NOEL : No Observed Effect Level (No se observa nivel de efecto)
LD50 : Dosis Letal 50 (mg/kg)
0,0005 : Constante
A
IC
M
3.2 Cálculo de ADI y MACO usando las siguientes fórmulas
UI
Q
NOEL

O
ADI
F
BI
Donde:
ADI Y
: Aceptable Daily Intake (Cantidad ingerida aceptable diaria) (mg)
I A
AC
NOEL : No Observed Effect Level

F : Factor de seguridad (1000 Sólidos)
RM
FA
ADI
MACO  x B x 1000
DE
R
Donde:
CA
MACO: Maximum Allowable Carryover (Cantidad máxima transferida

TE
aceptable en el lote siguiente) (mg)

IO
ADI : Aceptable Daily Intake (Cantidad ingerida aceptable diaria) (mg)

BL
B : Tamaño de lote del Producto B (kg o L)

BI
R : Dosis Terapéutica diaria máxima del Producto B (g o mL)
3.3 Cálculo de Límite de Limpieza (μg/hisopo) usando la siguiente fórmula
MACO
LL ( g / hisopo)  x N x 1000
L
Donde:
LL : Límite de Limpieza (μg/hisopo)
MACO : Maximum Allowable Carryover (Cantidad máxima transferida aceptable) (mg)
L : Área superficial del equipo (m2)
N : Área de muestreo (m2/hisopo)
4. EXPRESION DE LOS RESULTADOS

El límite de limpieza del equipo se expresó en µg/hisopo (muestreo de superficies
del equipo) y mediante fórmulas de conversión se puede expresar en μg/mL
(muestreo de agua de enjuague) y μg/g (muestreo del líquido de inmersión de las
A
unidades de dosificación).
IC
M
UI
Q
O
BI
Y
I A
AC
RM
FA
DE
CA
TE
IO
BL
BI
ANEXO 6
HISOPO TEXWIPE TX715
El Alpha® es un hisopo de muestreo de algodón poliéster diseñado específicamente para la

validación de limpieza usado en técnicas analíticas como HPLC y UV/espectroscopia
visible.
El lavado, la cabeza de punto de poliéster permite muestrear con una mínima
contaminación de fondo (ver gráfico). Un mango largo, rígido y la cabeza interna de la
paleta proporcionan un apoyo firme e incluso el contacto con el área de muestreo.
A
IC
M
UI
Q
O
BI
Y
I A
AC
RM
Características
 Sala limpia-lavado, doble capa de tejido Alpha Lite ®poliéster.
 Propiedad en el proceso de limpieza de eliminar la interferencia en el rango de 230 nm.
FA
 Largo y firme mango de polipropileno para el apoyo durante el muestreo.

DE
 Paleta rígida dentro de la cabeza de poliéster para mantener contacto con la superficie y
consistente.
CA
 Suave y no abrasiva.
 Manejar con muescas para el muestreo con el hisopo.
TE
 Autoclavable.
IO
Beneficios
BL
 Residuo no volátil muy bajo para un muestreo más preciso.

BI
 De partículas de baja y muy baja generación de fibra.

 Buena adsorción de contaminantes superficiales y buena liberación del analito.
 No contamina residuos de adhesivo.
 Excelente resistencia química y de solventes.
 Fácil complemento de la cabeza
Aplicaciones
 Muestreo de superficies para la validación de limpieza.
 El control ambiental de la superficie de carga biológica.
 No debe ser usado para la validación de TOC.
ALPHA ® HISOPO DE MUESTREO
Paleta rígida
A
IC
M
Doble capa Alpha ® de
UI
poliéster
Q
O
Sello térmico
BI
Y
A
Mango de
I
AC
polipropileno
RM
FA
DE
CA
TE
IO
BL
BI
HISOPO
Características físicas
Material de la cabeza Punto Alpha ® de poliéster
Ancho de la cabeza 12,7 mm (0,500 ")
Espesor de la cabeza 4,2 mm (0,165")
Longitud de la cabeza 25,7 mm (1,012")
Material del mango Polipropileno
Ancho del mango 5,2 mm (0,205")
Espesor del mango 3,0 mm (0,118")
A
IC
Longitud del mango 101,8 mm (4,008")
M
Longitud total de hisopo 127,5 mm (5,020")
UI
Enlace de la cabeza Térmico
Q
O
Color Verde
BI
Notas del diseño Paleta de cabeza plana, larga, fácil de manejar
Y
I A
AC
Características de la contaminación
Propiedad Medición Método de prueba*
RM
TM10: Procedimiento para la

FA
Determinación del residuo no

Residuo no volátil IPA volátil (NVR) extraíble
0,12 mg/hisopo
de extracción
DE
a partir de hisopos en un solvente

dado
CA
TM12: La Determinación de Iones

en Toallas y Otros Materiales por
TE
Ion Análisis Capilar de iones (CIA)

IO
BL
cloruro 0,24 μg/hisopo

sulfato 0,44 μg/ hisopo
BI
nitrato 0,48 μg/ hisopo

Fosfato 0,50 μg/ hisopo
Fluor 0,11 μg/ hisopo
Potasio 0,13 μg/ hisopo
Calcio 0,07 μg/ hisopo
Sodio 0,16 μg/ hisopo
Magnesio 0,05 μg/ hisopo
* Prueba de los procedimientos disponibles bajo petición
ANEXO 7
EQUIPO AGILENT TECHNOLOGIES VWD 1200
A
IC
M
UI
Q
O
BI
Y
I A
AC
RM
FA
DE
CA
TE
IO
BL
BI
EQUIPO AGILENT TECHNOLOGIES VWD 1260
A
IC
M
UI
Q
O
BI
Y
I A
AC
RM
FA
DE
CA
TE
IO
BL
BI
DETERMINACION DE LOS LIMITES DE LIMPIEZA PARA CADA CONTAMINANTE DE LOS PRODUCTOS FABRICADOS EN EL SECADOR DE
LECHO FLUIDO GLATT TF 60
A
Dosis Límite Dosis
IC
MACO Límite Toxicidad Límite más estricto
PRODUCTO CONTAMINANTES Terapeutica Terapéut. Diaria
(mg) (µg/hisopo) (µg/hisopo)
M
(mg) (µg/hisopo)
UI
Bencidamina HCl 10 48.52 405.05 125.67 48.52
Q
PRODUCTO PROBLEMA Benzocaína 5 24.26 1,665.09 516.61 24.26
O
Mentol 2
BI
9.70 1,806.32 560.43 9.70
PRODUCTO A Claritromicina 500 2426.09 2,736.84 849.13 849.13
Y
Pargeverina HCl 10 48.52 350.32 108.69 48.52
IA
PRODUCTO B
Clonixinato de lisina 125 606.52 404.51 125.50 125.50
AC
Paracetamol 500 2426.09 1,315.87 408.26 408.26
PRODUCTO C
M
N-Butil Bromuro de Hioscina 10 48.52 569.26 176.62 48.52
R
Paracetamol 325 1576.96 1,315.87 408.26 408.26
FA
Pseudoefedrina HCl 30 145.57 406.15 126.01 126.01
PRODUCTO D
Dextrometorfano Bromhidrato DE 15 72.78 191.58 59.44 59.44
Clorfenamina Maleato 2 9.70 167.49 51.97 9.70
CA
Ciprofloxacino HCL. H2O 500 2426.09 695.1579 215.68 215.68

PRODUCTO E
Fenazopiridina. HCl 100 485.22 258.3579 80.16 80.16
TE
IO
BL
LÍMITE MAS ESTRICTO 9.70

ug/hisopo
BI

Validacion de Metodo Analitico Trazas de Benzocaina

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Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación

UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO

CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE ALTA RESOLUCIÓN PARA LA

DETERMINACIÓN DE TRAZAS DE BENZOCAÍNA, EN LAS

SUPERFICIES DE UN EQUIPO DE FABRICACIÓN

INFORME DE PRÁCTICAS PRE-PROFESIONALES

PARA OPTAR EL TÍTULO PROFESIONAL

AUTORA: Br. VÁSQUEZ PÉREZ, GÉNESIS CYNTIA DEL PILAR

ASESOR: Dr. ALVA PLASENCIA, PEDRO MARCELO

Gracias por permitirme lograr mis metas,

por el inmenso amor que me regalas

y por bendecir a mis seres

A mis padres Rocío Pérez y Feliciano Vásquez,

A mis hermanas Taly y Lucero,

gracias por prestarme su ayuda cuando

más lo he necesitado y apoyarme

en los momentos más

Mg. Roger Rengifo Penadillos

Dr. Pedro Alva Plasencia

Señores miembros del jurado:

ANALÍTICO POR CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE ALTA

BENZOCAÍNA, EN LAS SUPERFICIES DE UN EQUIPO DE

FABRICACIÓN FARMACÉUTICA”, con el que pretendo obtener el Título

Dejo a vuestra consideración, señores miembros del jurado la calificación del

presente Informe de Prácticas Preprofesionales.

Trujillo, julio de 2012

Génesis C. Vásquez Pérez

II. MATERIAL Y MÉTODO ..................................................... 7

III. RESULTADOS ......................................................... ….…. 25

IV. DISCUSIÓN ......................................................................... 28

VI. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS.............................. 35

y el coeficiente de determinación de 0,9999; los límites de confianza de “b”

fueron 2,8287 y 37,4440; y texp = 2,5130; los límites de confianza de “a”

fueron - 216,1889 y 217,0399; y texp = 0,0042; mediante el test estadístico del

coeficiente de correlación se obtuvó tr = 307,6225 y la desviación estándar

relativa fue de 0,66% en el test de linealidad, por tanto el método es lineal en

cuantificación fueron evaluados para ser 0,0331 μg/mL y 0,0489 μg/mL

respectivamente, siendo estos resultados conformes para un límite de

limpieza de 9,70 μg/mL. Se obtuvó un porcentaje de recuperación de 76,05%

y 75,50% en los equipos Agilent Techologies VWD 1200 y Agilent

Techologies VWD 1260 respectivamente, mediante el método de muestreo

Palabras claves: HPLC, benzocaína, validación, OMS.

linear over the concentration range of 3 to 20 μg/mL. The detection and

quantification limits were evaluated to be 0,0331 μg/mL and 0,0489 μg/mL

of pharmaceutical manufacturing equipment, to meet the validation parameters

Keywords: HPLC, benzocaine, validation, WHO.

Los productos farmacéuticos pueden ser contaminados por una variedad de

trazas de ingredientes farmacéuticos activos, deben considerarse con especial

Una limpieza inadecuada de una planta de fabricación de productos farmacéuticos o

inadecuada depuración de las piezas individuales de equipos usados en la fabricación

de múltiples productos o equipos que no se dedican a productos individuales, pueden

con el mismo equipo 4.

Los desafíos para la validación de limpieza se encuentran especialmente en el

Es así que todo laboratorio farmacéutico debe emplear el método analítico en

La selectividad evalúa inequívocamente el analito y evidencia la presencia de otros

El límite de detección es la mínima cantidad de analito en la muestra que se puede

detectar aunque no necesariamente cuantificar, bajo las condiciones experimentales

Se entiende por límite de cuantificación a la mínima cantidad de analito presente en

Existen varios procedimientos para determinar el límite de detección y el límite de

cuantificación. Estos se basan en la evaluación visual, en la relación señal-ruido o en