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Universidad de Oriente

Núcleo Bolívar

Escuela de Ciencias de la salud

Departamento de Ciencias Fisiológicas

Profa. Katina Colmenares

Profa. María G De Armas

Profa. Evelyn Maurell

Profa. Carmen Rodríguez

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Enero, 2018
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Competencias a las que contribuye la asignatura y su ubicación dentro del mapa

curricular vigente.

Niveles de Desempeño en Ciencias

El conjunto de prácticas del presente manual le permitirá llegar a un desempeño

​ e desarrollan un
de Nivel 4 de acuerdo la clasificación de CONOCER, a saber ​Nivel 4.- S
conjunto de actividades de naturaleza diversa, en las que se tiene que mostrar creatividad
y recursos para conciliar intereses. Se debe tener habilidad para motivar y dirigir grupos
de trabajo.

Contribución al desarrollo de habilidades y destrezas:

- Asimilación de los conocimientos generales adquiridos, desarrollando la capacidad para

interpretar la información recibida, plantear y resolver problemas básicos bioquímicos.

- Capacidad para relacionar las propiedades químicas y estructurales de las moléculas

biológicas con su funcionabilidad.

- Experiencia de trabajo en el laboratorio, con la utilización de las técnicas básicas

apropiadas para la experimentación bioquímica.

- Capacidad de evaluación y clasificación de los datos experimentales, con la posibilidad

de deducir conclusiones y elaborar hipótesis de trabajo.

- Capacidad para buscar y utilizar la literatura científica, que le permita ampliar sus
conocimientos en un determinado tema cuando lo necesite, leyendo críticamente la
literatura científica original.

EVALUACIÓN

● Las actividades prácticas de la asignatura se evaluarán para cada uno de los

períodos de acuerdo al cumplimiento del estudiante. Este representa el 20% de la
nota de la materia.
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● Se realizarán un examen final de laboratorio, que tendrá un valor de 0,6 ptos de la

nota del laboratorio.

● Al finalizar la práctica el estudiante presentará una prueba corta con relación a la

práctica de laboratorio. Este tiene un valor de 0,4 ptos del total de la nota del
laboratorio.

● Al finalizar la práctica el estudiante realizará un reporte de trabajo que consistirá

en: un protocolo de la práctica efectuada que entregara en la próxima practica (de
forma esquemática), los resultados obtenidos, discusión de estos resultados y
gráficas. Este reporte representa 1 pto del total de la nota de laboratorio.

● El desempeño en el laboratorio será considerado para la evaluación y corresponde

a 10% del total de la nota de laboratorio.

LINEAMIENTOS GENERALES

1. Los estudiantes deberán cumplir con el 75% de asistencias al curso teórico y al

laboratorio. Deberán presentar los exámenes, tareas y trabajos que el profesor considere
indispensables para tener derecho a calificación final.

2. Los cambios de grupo o sección de laboratorio deberán realizarse en ella primera

semana de actividades prácticas.

3. Habrá una tolerancia de 10 minutos en la hora de entrada para cada horario de

laboratorio.

4. El estudiante sólo podrá realizar las prácticas en su horario semanal y grupo que le
corresponda.

5. El estudiante permanecerá en el laboratorio solo en su horario de práctica

correspondiente bajo responsabilidad de su profesor.

6. Los alumnos deberán utilizar bata blanca durante todas y cada una de las sesiones de
laboratorio, la bata debe usarse abotonada.

7. Se abstendrán de introducir alimentos y bebidas al aula y al laboratorio.

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8. Mantendrán apagados los celulares y/o aparatos de comunicación en aulas y

laboratorio.

9. Por medidas de bioseguridad queda expresamente prohibido el uso de sandalias en el

recinto de laboratorio.

10. En todas y cada una de las sesiones de laboratorio, los alumnos deberán respetar
todas las indicaciones que les sean mencionadas por su profesor, por el personal del
Departamento adscrito al laboratorio, o a través de avisos.

Desempeño en el laboratorio

a) Comportamiento personal. ​Éste se refiere a la conducción general de las actividades

del estudiante dentro del laboratorio de prácticas tales como asistencia puntual,
permanecer en el laboratorio durante la práctica, evitar fumar y comer en el área de
trabajo, respetar el trabajo de otros equipos, así como también mantener el respeto hacia
personal técnico del laboratorio.

b) Organización de las actividades experimentales. Saber qué se va a hacer y cómo, a fin

de disponer adecuadamente del equipo de trabajo. Antes de actuar, el estudiante deberá
planificar su actividad para evitar improvisaciones.

c) Observación. Descripción de las actividades experimentales realizadas y los registros

obtenidos; anotación cuidadosa de resultados.

d) Razonamiento metodológico. El estudiante analizará sus resultados en función de

argumentos teóricos, de conocimientos impartidos en clase y de sus revisiones
bibliográficas con relación al tema.

El Reporte

- Deberá ser entregado, ​sin excepción​, al inicio de la práctica, al momento de tomar la

asistencia y corresponderá a la práctica anterior.

- Comprenderá las actividades que el estudiante realizó durante la sesión de laboratorio,

sus cálculos y conclusiones.
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- Si el estudiante presenta la prueba corta, realiza la práctica y a la semana siguiente no

entrega el informe respectivo, queda a juicio del profesor a cargo la anulación de la nota
de la prueba. El informe de laboratorio es análogo a la boleta de resultados que entrega el
Bioanalista al paciente y por ser una constancia de su trabajo de laboratorio, es la parte
más importante de la actividad experimental.

El reporte llevará las siguientes partes:

a)​ ​Titulo y propósito de la práctica.

b) Resultados. ​Presentación y descripción de registros, número de muestra y datos

obtenidos (en este punto queda fuera de lugar mezclar comentarios e impresiones sobre
los mismos).

c) Cálculos.​ Fórmulas, promedios, porcentajes, tablas, gráficas, entre otros.

d) Discusión-Conclusión. Confrontar los datos obtenidos con conocimientos previos e

indicar la concordancia o discordancia de los mismos a manera de discusión. Comparará
sus resultados con valores de referencia y argumentará una explicación con fundamentos
teóricos.

e) Referencias.​ Contendrá las citas bibliográficas utilizadas en la conclusión.

Pipetas
Una pipeta es un utensilio de laboratorio utilizado para transferir un volumen específico o
variable de líquido.

Existen tres tipos de pipetas:

* Para contenido.

Con soplado o enrase simple o terminales

* Para transferir

(serológicas)

Sin soplado o enrase doble o sub-terminales

● Para transferencia.
(Mohr)
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Pipetas para contenido o pipeta de enjuague

Estas pipetas contienen una cantidad exacta de líquido que debe ser
completamente transferido para la medición adecuada. Deben volver a llenarse o
enjuagarse con el solvente apropiado luego que dicho solvente ha sido drenado.
Ejemplo: pipeta de Sahlí para hemoglobina.

Pipeta para transferencia (Mohr)

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PRÁCTICA Nº 1

DILUCIONES Y SOLUCIONES AMORTIGUADORAS

I.- PROPOSITO DE LA PRÁCTICA

​Al finalizar la práctica el estudiante deberá estar en capacidad de:

a) Preparar diluciones realizando los respectivos cálculos matemáticos y

utilizando adecuadamente las pipetas necesarias para este fin.
b) Comparar la acidez y basicidad de diversas soluciones a través del
comportamiento de un pigmento vegetal (antocianina) que actúa como un
indicador natural.

II.- INTRODUCCIÓN
a) DILUCIONES

Una dilución consiste en aumentar la cantidad de disolvente de una disolución.

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En el laboratorio, en muchas ocasiones es necesario diluir las muestras o los

reactivos para obtener concentraciones adecuadas a las técnicas. La perfecta
preparación de estas diluciones en imprescindible para la obtención de resultados
correctos y requiere un uso adecuado del material volumétrico (Ver Anexo sobre
“Material Volumétrico” al final de esta guía de prácticas).

La dilución realizada se expresa generalmente como una unidad de la solución

inicial por unidades de la solución final. Por ejemplo, una dilución al 1/10 requiere
que una cantidad de la solución inicial sea o haya sido diluida hasta un volumen
de 10 unidades.

Aquellas concentraciones en las cuales se expresa la concentración como

cantidad de soluto en un volumen fijo de disolución, como es el caso de la
Normalidad, Molaridad o % p/v, se denominan escalas volumétricas de
concentración.

Cuando la concentración se expresa sobre una de estas escalas volumétricas,

la cantidad de soluto contenido en un volumen dado de solución es igual al
producto del volumen por la concentración:

Cantidad de soluto = Volumen * Concentración

Si se diluye una solución, el volumen de la misma aumentará a la par que

disminuye su concentración, mientras que la cantidad de soluto presente
permanecerá constante. Por ello, dos soluciones con distintas concentraciones,
pero que contienen las mismas cantidades de soluto, están relacionadas de la
siguiente forma:

V​1​ . C​1 =
​ V​2​ . C​2

Si se conocen tres de los términos de esta ecuación, se puede calcular el

cuarto. Las cantidades a los dos lados de la ecuación deben expresarse en las
mismas unidades.

DILUCIONES SERIADAS

En el Laboratorio de Bioanálisis, principalmente en el área de Inmunología, es

frecuente la utilización de diluciones seriadas, que se llaman así porque después
de la primera todas son iguales.

Ejemplo: Diluir un suero al 1:2 por adición de 1 ml de suero a 1 ml de solución

salina. Tubo (1).
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​1 ml 1 ml 1 ml 1 ml

Tubo 1 Tubo 2 Tubo 3 Tubo 4 Tubo 5

1 ml de suero

1 ml de sción salina Cada uno contiene 1 ml de solución salina

Dilución final: ​1 : 2 1:4 ​1 : 8 1 : 16​ ​1 : 32

(luego de transferir)

Respuesta: A partir del Tubo (1) se preparan cuatro tubos más (tubos 2, 3, 4 y
5) que contienen cada uno 1 ml de solución salina como diluyente. Se realiza la
dilución seriada por transferencia de 1 ml del Tubo (1) al Tubo (2), luego se debe
mezclar y transferir 1 ml del Tubo (2) al Tubo (3), y así sucesivamente hasta el
Tubo (5).
La concentración del suero decrece según un factor 2 en cada dilución.

b) SOLUCIONES AMORTIGUADORAS

En los organismos vivientes el pH debe permanecer en límites fijos, los cuales

difieren según la especie, el órgano, la célula o aun la partícula subcelular
considerada. Para mantener el pH en el valor fisiológico, el organismo dispone de
sistemas llamados “tampones” (buffers) o amortiguadores. Se llama tampones a
las sales de ácido débil y de base fuerte en equilibrio con su ácido débil. Cuando
una reacción química libera protones en el medio, el sistema tampón reacciona de
tal forma que la cantidad de protones permanece constante, dicho de otro modo
que el pH no varía. A la inversa, si las reacciones utilizan protones, el sistema
tampón los libera y mantiene el pH.
 10

Los organismos vivos no soportan variaciones de pH mayores de unas

décimas de unidad y por eso han desarrollado a lo largo de la evolución sistemas
de tampón o buffer, que mantienen el pH constante mediante mecanismos
homeostáticos. Los sistemas amortiguadores del organismo son: sistema
amortiguador Bicarbonato-Ácido carbónico, sistema amortiguador de
Hemoglobina, sistema amortiguador de proteínas y el sistema amortiguador
fosfato.

El tampón bicarbonato es común en los líquidos intercelulares, mantiene el

pH en valores próximos a 7,4, gracias al equilibrio entre el ión bicarbonato y el
ácido carbónico, que a su vez se disocia en dióxido de carbono y agua:

HCO​-​3​ + H​+​ H​2​CO​3 -​​ CO​2​ + HO

Así, por ejemplo, el ión bicarbonato (H​2​CO​3 -​​ ) actúa también en los medios
orgánicos. Si el pH es ácido habrá un exceso de iones H​3​O​+​; estos serán captados
por el ión HCO​-​3​, que a su vez, se descompondrá en CO​2 y H​2​O. La reacción se
desarrolla a la inversa si hay pocos iones H​3​O​+​. El ión bicarbonato actúa como un
tampón eficaz para valores de pH en las proximidades de 7, que es el pH de la
sangre. En los medios intracelulares el tampón más frecuente es el ión fosfato
(H​2​PO​4​-​).

El agua es la biomolécula más abundante

Todos los seres vivos precisan de ella, la inmensa mayoría de las

reacciones bioquímicas se desarrollan en el seno del agua y obedecen a las leyes
físico-químicas de las disoluciones acuosas.

El agua es líquida en un amplio margen de temperaturas (0 – 100ºC); esto

permite que la vida pueda desenvolverse en condiciones climáticas y ambientales
muy dispares; presenta una densidad máxima a 4ºC, en consecuencia el hielo
flota sobre el agua líquida actuando como aislante térmico. De esta manera, la
gran masa de los océanos se mantiene sin congelarse por debajo de los 4ºC lo
que permite la vida de innumerables seres acuáticos. Estas y otras propiedades
del agua se deben a que sus moléculas se hallan enlazadas por fuerzas
intermoleculares, especialmente enlaces de hidrógeno y fuerzas polares.
 11

El agua es un electrolito débil. Solo una pequeñísima fracción de moléculas

se disocia en los iones H​+ y OH​-​. Sin embargo, esta disociación es de interés
crucial en Bioquímica.

Los valores de concentraciones de iones H​+ han sido reemplazados por una
notación logarítmica que permite razonar en números relativamente simples y se
ha utilizado el concepto de pH. El pH se define como el logaritmo negativo de la
concentración de hidrogeniones. El pH más adecuado para que una solución
amortiguadora funcione correctamente, es cuando se encuentra en un rango de
pH igual a su pK ​+​ 1.

El pH se suele medir por el método colorimétrico o por el método

potenciométrico. En el método colorimétrico se encuentra el papel indicador y las
sustancias indicadoras. Una medida aproximada del pH se obtiene
colorimétricamente por medio del papel indicador. Se trata de un papel
absorbente que ha sido impregnado por una sustancia o mezcla de sustancias
cuya coloración varía con el pH. Suelen ser ácidos o bases débiles cuyas formas
disociadas y sin disociar tienen coloraciones distintas.

Por su parte, los indicadores pueden ser químicos o naturales, en esta

actividad práctica se utilizará la antocianina, pigmento vegetal hidrosoluble que se
halla en las vacuolas de las células vegetales y que otorga el color rojo, púrpura o
azul, dependiendo del pH vacuolar, a hojas, flores y frutas. Desde el punto de vista
químico, las antocianinas pertenecen a un grupo denominado flavonoides y se
encuentran ampliamente distribuidos entre las plantas.

Las medidas más precisas de pH se efectúan por el método

potenciométrico. Existen en todos los laboratorios de Bioquímica, potenciómetros
especiales llamados pHmetros. Estos aparatos miden una diferencia de potencial
que se establece entre los electrodos y que depende de la concentración de
hidrogeniones del medio que se analiza. En los pHmetros modernos, los dos
electrodos se presentan integrados en un electrodo combinado. Para que este
equipo proporcione resultados fiables se requiere calibrarlo periódicamente con
soluciones patrones de pH conocido.

III.- MATERIALES

a) Diluciones

​Instrumental
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Tubos de ensayo 16 x 150

Pipetas serológicas: 0.1, 0.2, 1 y 2 ml

Gradilla

Balanza analítica

Cilindro graduado

Vasos de precipitado

Matraz aforado

Reactivos
Suero

Solución salina

Agua destilada

Reactivos sólidos

Reactivos líquidos

b) Soluciones amortiguadoras:

Cinta indicadora de pH

Tubos de ensayo

Gradilla

Papel absorbente

pHmetro

Repollo morado

Buffer fosfato pH 7,3

Pipetas de 1 ml

Pipetas Pasteur
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IV.- ACTIVIDAD PRÁCTICA

a) Diluciones

1) Preparar disoluciones, utilizando adecuadamente el material de vidrio y

tomando medidas de bioseguridad, según las instrucciones del facilitador.

2) Preparar diluciones seriadas utilizando suero y solución salina.

3) Identificar pipetas y otros materiales de vidrio de uso en el laboratorio.

b) Soluciones amortiguadoras

-Preparación de las soluciones de Repollo morado:

Cortar el repollo en finos trozos y colocar en un vaso de precipitado que

contenga de 100 a 200 ml de agua corriente y en otro vaso con buffer fosfato,
coloque en una plancha de calentamiento o mechero hasta que hierva y el repollo
se decolore.

Filtre y coloque en un frasco limpio, rotule como solución de Repollo A (agua

corriente) y solución de Repollo B (buffer).

PROCEDIMIENTO

PARTE I

1.- Enumere nueve (9) tubos de ensayo.

2.- Agregue 3 ml de la solución de Repollo A.

3.- Agregue las siguientes cantidades de ácido o de base que se especifican a

continuación:

Tubos 1 2 3 4 5 6 7 8 9

HCl * 0,4 0,3 0,2 0,1 0 - - - -

NaOH * - - - - 0 0,1 0,2 0,3 0,4

(*): concentración 0,1 mol/ml

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4.- Anote sus observaciones en cada uno de los tubos y complete la siguiente
tabla.

Tubo Color

5.- De acuerdo a lo explicado en relación con las sustancias indicadoras, qué cree
usted que está pasando con la solución de Repollo A?

PARTE II

1. Enumere dos tubos de ensayo.

2. En el tubo 1 agregue 5 ml de solución de Repollo preparada en buffer
fosfato pH 7,3 (solución B).
3. En el tubo 2 agregue 5 ml de solución de Repollo preparada en agua
corriente (solución A).
4. Mida el pH en ambas soluciones y tome nota.
5. A cada una de las soluciones, agregue gota a gota HCL hasta que observe
un cambio en la coloración, anote cuantas gotas de ácido necesito para
lograr este cambio en cada una de ellas.
 15

6. Discuta sus resultados.

7.
PARTE III

I.-INTRODUCCIÓN.

La Hemoglobina es una Proteína Globular pigmentada de color rojo

transportadora de oxígeno que se encuentra en grandes cantidades dentro de los
glóbulos rojos en los vertebrados. Es un tetrámero con dos pares de cadenas
polipeptídicas diferentes. Cada una de ellas posee un derivado de la porfirina
llamado grupo hemo, que a su vez contiene hierro.

Las dos principales funciones de la hemoglobina son el transporte de

oxígeno y amortiguador del pH.

Las concentraciones de hemoglobina están influidas por variaciones

fisiológicas como la edad, sexo, deshidratación, postura y altitud, y por procesos
patológicos. Se encuentran valores patológicos en anemias y en policitemias.

La determinación de la concentración de hemoglobina se ha convertido en

una de las pruebas más importantes en el diagnóstico y tratamiento de la anemia.
Las tres causas principales de anemia son: alteración en la síntesis de los
eritrocitos en la médula ósea, pérdidas de sangre excesivas y transporte alterado
de eritrocitos hacia sangre periférica.

Se observan valores de hemoglobina elevados en policitemia vera,

eritrocitosis, deshidratación, recién nacidos, cianosis congénita o adquirida,
enfermedad renal y pulmonar crónica, quistes renales y en una serie de tumores
productores de eritropoyetina.

El diagnóstico clínico no debe realizarse teniendo en cuenta el resultado de

un único ensayo, sino que debe integrar los datos clínicos y de laboratorio.

FUNDAMENTO DE HEMOGLOBINA

La Hemoglobina (Hb) es convertida a cianometahemoglobina por acción del

cianuro de potasio (KCN) y del ferrocianuro de potasio [ K​3​Fe(CN​6​) ], el color
desarrollado se lee a una longitud de onda de 540 nm o filtro verde. La coloración
producida es directamente proporcional a la concentración de hemoglobina
presente.
 16

Todos los hemocromógenos, a excepción de la sulfohemoglobina,

reaccionan completamente.

III.- MATERIALES

Instrumental:

Espectrofotómetro

Reloj.

Pipetas serológicas terminales.

Pipetas serológicas sub-terminales.

Pipetas de Sahli (hemoglobina)

Tubos.

Propipetas.

Gradillas.

Gasa

Recipientes para pipetas

Marcador o lápiz graso.

Reactivos:

Reactivo de Drabkin (Cianometahemoglobina).

Agua destilada.

IV.- ACTIVIDAD PRÁCTICA

Determinación de hemoglobina a una muestra problema.

En una gradilla coloque tres (3) tubos numerados como Blanco, St y Mx.
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B St Mx

Estándar ------------ 20λ --------------

Muestra de sangre -------------- -------------- 20λ

Reactivo Drabkin 5 ml 5ml 5ml

Las 20λ (0,02ml) deben de agregarse utilizando la pipeta de Sahli, siguiendo las
instrucciones del facilitador.

Mezclar en la forma explicada por el facilitador y esperar 10 minutos para después

hacer las lecturas en el Espectrofotómetro, a una longitud de onda de 540nm.

V.- CÁLCULOS

Para determinar la concentración de una sustancia problema puede hacerse de

tres formas:

● Factor de calibración único.

● Factor de calibración promedio.
● Curva de calibración.

Para conocer la concentración de hemoglobina del paciente en estudio, se

calculará un factor de calibración único, aplicando las ecuaciones siguientes:

Fc = Cp / Lp

Cx = Fc . Lx

Fc: Factor de calibración.

Cp: Concentración del patrón o estándar.

Lp: Lectura del patrón o estándar.

Cx: Concentración de la muestra en estudio.

Lx: Lectura de la muestra en estudio.

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El estándar de hemoglobina, es una muestra de hemoglobina cuya

concentración se conoce. (g/dl).

Una vez calculada la concentración de hemoglobina del paciente, ésta

deberá ser comparada con los respectivos valores de referencia y hacer un
análisis en el reporte de las posibles patologías que tiene el paciente consultando
con apoyo bibliográfico.

VALORES DE REFERENCIA DE HEMOGLOBINA.

Hombres: de 13 a 16 g/dl.

Mujeres: de 11 a 14 g/dl.

Recién nacido: 18-20 g/dl.

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PRÁCTICA N° 2

CUANTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS PLASMÁTICAS POR CURVA DE

CALIBRACIÓN

I.- PROPÓSITO DE LA PRÁCTICA

Al finalizar la práctica el estudiante deberá estar en capacidad de aplicar los

métodos de cuantificación de proteínas totales y albúmina de una muestra
utilizando los métodos de Biuret y Verde de Bromocresol respectivamente, y a
través de una curva de calibración establecer el perfil de proteínas de un paciente
en estudio.

II.- INTRODUCCIÓN

Las proteínas son macromoléculas, de peso molecular elevado, que están

formadas por moléculas llamadas aminoácidos que se unen entre sí por enlaces
peptídicos. ​Existen 20 aminoácidos diferentes que se combinan entre ellos de
múltiples maneras para formar cada tipo de proteínas.

Las proteínas son introducidas en el organismo a través de los alimentos,

donde se dividen en aminoácidos para formar posteriormente las nuevas proteínas
a través del proceso conocido como síntesis de proteínas. Las proteínas realizan
multitud de funciones en nuestro organismo para su correcto funcionamiento.

Cuando se hace referencia a las proteínas totales en suero, se trata una

medición aproximada de todas las proteínas presentes en la parte líquida de la
sangre. La prueba que determina las proteínas totales en sangre, examina
específicamente la cantidad total de dos tipos de proteínas: globulinas y albúmina.
Este examen a menudo se hace para diagnosticar problemas nutricionales,
enfermedad renal o enfermedad hepática. Si los niveles de proteínas totales son
anormales, por ejemplo, en caso de que el paciente presente proteínas totales
bajas (hipoproteinemia), es necesario realizar exámenes adicionales con el fin de
identificar el problema específico.
 20

Las proteínas totales son útiles a la hora de realizar el seguimiento de los

cambios en los niveles de proteínas que causan diversos estados de enfermedad.
Generalmente la comprobación de las proteínas totales se realiza junto con otras
pruebas como la electroforesis de proteínas, la seroalbúmina o las pruebas de la
función hepática.

La determinación de los niveles de proteínas totales es útil en la detección

de:

a) Hiperproteinemia causada por deshidratación, hemoconcentración o aumento

en la concentración de proteínas específicas.

b) Hipoproteinemia por hemodilución producida por un defecto en la realización de

la síntesis proteica, catabolismo proteico excesivo o pérdidas excesivas
(hemorragias).

c) La deshidratación, las enfermedades hepáticas crónicas y el mieloma múltiple

son estados que pueden producir niveles altos de proteínas totales.

d) El descenso de los niveles de proteínas totales es propio del fallo hepático

terminal y de la enfermedad renal.

Con frecuencia se calcula una proporción de albúmina/globulina a fin de

obtener información adicional. El diagnóstico clínico debe realizarse teniendo en
cuenta todos los datos clínicos y de laboratorio.

El plasma sanguíneo normal contiene de 6,5 a 8,2 gramos de proteínas por

cada 100 ml (g/dl). La cantidad considerada como valor normal de proteínas
totales puede variar ligeramente entre pruebas realizadas por distintos
laboratorios.

Las proteínas plasmáticas pueden dividirse en tres grupos: fibrinógeno,

globulinas y albúmina. El fibrinógeno está ausente en el suero. La forma de
obtención de plasma y suero tiene sus diferencias:

DIFERENCIAS SUERO PLASMA

Proteínas presentes Albúmina, globulinas. (∗)Albúmina, globulinas,
fibrinógeno.
Obtención Sangre sin anticoagulante Con anticoagulante

(∗) No posee fibrinógeno porque se consume en el proceso de coagulación.

 21

La albúmina es la más abundante de las proteínas séricas. Su importancia

en el funcionamiento del cuerpo es la habilidad para transportar substancias tales
como medicamentos, antibióticos, bilirrubina y ácidos y sirve como almacén de
proteínas de estructura necesarias para el crecimiento de los tejidos. El plasma
sanguíneo normal contiene de 3,5 a 5,5 gramos de albúmina por cada 100 ml
(g/dl).

Los niveles bajos de albúmina ocurren comúnmente en una variedad de

enfermedades tales como el síndrome nefrítico, enfermedades hepáticas,
infecciones agudas y mala nutrición haciendo así a las determinaciones de
albúmina de primordial importancia. Muchos métodos han sido descritos para
determinar a la albúmina sérica. En 1965, Rodkey introdujo un método simple
basado en la unión de colorantes como es el verde de bromocresol. Este método
ha sufrido algunas modificaciones posteriores.

a) Reacción de Biuret: Se utiliza en la determinación cuantitativa de las proteínas

plasmáticas y para evidenciar proteínas en líquidos biológicos. El nombre «biuret»
alude a un derivado de la urea que también da positiva esta reacción.
El reactivo contiene tartrato de sodio y potasio, hidróxido de sodio, yoduro
de potasio y sulfato de cobre, importantes para evidenciar la positividad de la
reacción ya que se forman complejos de coordinación entre los iones Cu​++​, el
nitrógeno peptídico y el oxígeno del agua.
Fundamento:​ Las proteínas y los péptidos al reaccionar con el reactivo de Biuret,
en medio alcalino, forman quelatos solubles con el ión Cu​++​, de coloración
característica, desde el azul intenso al violeta o rosa. La intensidad del color es
proporcional a la cantidad de enlaces peptídicos presentes en la muestra.
Las proteínas de elevado peso molecular dan una coloración violeta. Los
péptidos formados por más de tres aminoácidos dan una coloración rosada muy
clara.
 22

b) ​Fundamento de la reacción Verde de Bromocresol​: la albúmina sérica se

enlaza de forma específica con el verde de bromocresol a un pH de 4,2 para
producir un complejo coloreado con un máximo de absorbancia a 628nm. El color
del complejo obtenido es directamente proporcional a la concentración de
albúmina.

c) ¿Cómo construir una Curva de Calibración?

1.- Disponer de una solución madre de concentración conocida, por ejemplo,

solución madre de albúmina si la curva de calibración se utilizará para conocer
concentración de albúmina de un paciente.

2.- Preparar patrones de diferentes concentraciones, partiendo de la solución

madre, estos deben incluir valores menores, iguales y mayores a los valores de
referencia del metabolito que se desea analizar (en el caso de la curva de
calibración de albúmina que se efectuará en esta práctica, los patrones están
representados por alícuotas de la solución madre de albúmina).

3.- Se aplica la técnica correspondiente del metabolito a analizar. Debe observar

que todos los tubos tengan el mismo volumen final.

4.- Obtener las absorbancias de los diferentes patrones.

5.- Se construye la curva de calibración en un papel milimetrado graficando las

absorbancias de los patrones con sus respectivas concentraciones. Estas últimas
deberá calcularlas mediante una regla de tres, tomando en cuenta la
concentración de la solución madre y los ml agregados a cada patrón.

6.- Trazar una línea recta que parte del origen y debe pasar por el mayor número
de puntos graficados. Coloque título a la gráfica.

d) ¿Cómo utilizar la curva de calibración?

Ubique el valor de absorbancia que obtuvo “del paciente o muestra” en el

eje de absorbancias y por interpolación ubique la concentración en el otro eje de
coordenadas.
Curva de Calibración de Albúmina
 23

III.- MATERIALES
Instrumental​: Baño de María a 50°C, espectrofotómetro, gradilla de acero
inoxidable, pipetas volumétricas de 1, 2, 5 y 10 ml, tubos de ensayo.
Reactivos​: Suero humano, patrón de proteínas 8 mg/ml, reactivo de Biuret, patrón
de albúmina de 40 g/L, v​erde de bromocresol en tampón a pH 4,2.

IV.- ACTIVIDAD PRÁCTICA

a) Procedimiento para la determinación de Proteínas Totales:

Preparar los tubos agregando las cantidades que indica la tabla, en ml.

PREPARACIÓN DE PATRONES
Tubo 1 Tubo 2 Tubo 3 Tubo 4 Muestra Blanco
Suero --- --- --- --- 0,1 ---
Solución
madre
0,25 0,50 0,75 1,0 --- ---
(8 mg/ml)

NaCl 0,9% 0,75 0,50 0,25 --- 0,9 1

Reactivo de
Biuret 3 3 3 3 3 3
MEZCLAR
INCUBAR A 50ºC POR 10 MINUTOS
LEER EN ESPECTROFOTOMETRO A 580 nm
COMPLETAR LA PARTE INFERIOR DE ESTA TABLA CON SUS RESULTADOS
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Absorbancia ---
Proteínas
totales (mg) (*) ---
(*) El resultado del paciente o muestra se obtiene en la curva de calibración.

Observe el contenido del Tubo Blanco, para qué se utiliza este tubo?

b) Procedimiento para la determinación de Albúmina:

Preparar los tubos agregando las cantidades que indica la tabla, en ml.

PREPARACIÓN DE PATRONES
Tubo Tubo Tubo Tubo Tubo Tubo Tubo Muestra Blanco
1 2 3 4 5 6 7
Suero --- --- --- --- --- --- --- 30λ ---
Agua --- --- --- --- --- --- --- --- 30λ
Solución --- ---
madre (40
0,01 0,02 0,03 0,04 0,05 0,06 0,07
g/L)

Reactivo
3 3 3 3 3 3 3 3 3
Verde de
Bromocresol

MEZCLAR
DEJAR REPOSAR POR 10 MINUTOS
LEER EN ESPECTROFOTOMETRO A 628 nm
COMPLETAR LA PARTE INFERIOR DE ESTA TABLA CON SUS RESULTADOS

Absorbancia ---
Albúmina
(mg) (*) ---
(*) El resultado del paciente o muestra se obtiene en la curva de calibración.

V.- PROCESAMIENTO DE DATOS

a) Proteínas Totales:
- Debe calcular los mg de proteína contenidos en cada tubo patrón para graficar.
 25

- El resultado del paciente obtenido en la gráfica está expresado en “mg por cada
0,1 ml” ya que 0,1 ml fue la cantidad que Ud agregó al tubo “muestra”. Haga la
conversión a g/dl. – Ha obtenido así el resultado de Proteínas Totales del
paciente.
b) Albúmina:
- Debe calcular los mg de albúmina contenidos en cada tubo patrón para graficar.
- El resultado del paciente obtenido en la gráfica está expresado en “mg por cada
0,03 ml” ya que 0,03 ml fue la cantidad que Ud agregó al tubo “muestra” (es decir,
30λ). Haga la conversión a g/dl.
- Ha obtenido así el resultado de Albúmina del paciente.
c) Calcule el valor de Globulinas y la Relación albúmina/globulina.

VII.- REPORTE DE RESULTADOS

Proteínas totales _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ g/dl

Albúmina _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ g/dl
Globulinas _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ g/dl
Relación A/G _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ (sin unidades, es un cociente)

Los resultados deben compararse con los Valores de Referencia:

- Proteínas totales = 6,5 – 8,2 g/dl

- Albúmina = 3,5 – 5,5 g/dl
- Globulinas = 1,5 – 3,0 g/dl
- Relación A/G = 1,5 – 2,7

Elabore su conclusión, con apoyo bibliográfico, relacionando sus resultados con

posibles patologías en el caso de valores por encima o por debajo de lo normal.
26
 27

PRÁCTICA Nº 3
CROMATOGRAFIA COMO METODO DE SEPARACIÓN

I.- PROPOSITO DE LA PRÁCTICA

Al finalizar la práctica el estudiante deberá estar en capacidad de realizar la

separación de aminoácidos por la técnica de cromatografía en papel relacionando
su posición en la misma con su solubilidad en cada fase y aplicar la técnica de
cromatografía en columna por exclusión molecular.
I.-INTRODUCCION
La cromatografía moderna comenzó en 1906 cuando Michael S. Twest detalló
la separación de pigmentos vegetales (clorofila).

​croma​ = color ​grafe​ = estructura

En general Cromatografía es un término colectivo referido a un grupo de

métodos de separación donde una mezcla de solutos disueltos en un solvente
común, son separados unos de otros por su distribución diferencial en dos fases.
Una fase, el solvente, es móvil y lleva los solutos mezclados a través de otra fase,
fija o estacionaria.

El método cromatográfico resuelve con notable éxito el problema de la

separación e identificación de los compuestos de un grupo de sustancias
químicamente parecidas o la demostración de sustancias de muy baja
concentración en los líquidos biológicos.

Es una prueba cualitativa, a veces con una variante de técnica cuantitativa, que
se utiliza para separar e identificar aminoácidos con respecto a sus gradientes de
solubilidad.

Las técnicas cromatográficas representan el método más eficiente para

separar e identificar los aminoácidos en una mezcla. Este procedimiento
primeramente fue aplicado a la separación de los compuestos coloreados y hoy
día es uno de los métodos más sencillos para la separación cualitativa y
cuantitativa de compuestos químicos de estructura muy parecida.

El propósito de una técnica cromatográfica es separar los componentes de una

muestra dada a un tiempo razonable; se separan por su distribución entre una
 28

fase fija y una móvil. Su objetivo es detectar o cuantificar un componente

particular o grupo de componentes de interés de forma pura.

Las interacciones con la fase estacionaria incluyen:

➢ Adsorción: proceso por el cual una sustancia se adhiere a otra a

causa de las fuerzas de atracción de los átomos en la superficie de
ambas (es distinto de absorción).
➢ Partición: proceso por el cual un sólido se distribuye entre dos fases
inmiscibles. (inmiscible = que no se unen o mezclan)
➢ Exclusión de tamaño.
➢ Interacciones electrostáticas.

TIPOS DE CROMATOGRAFÍA

a.- Partición – adsorción: se basa en las propiedades de solubilidad (polaridad).

b.- Intercambio iónico: depende de la carga del compuesto.

c.- Exclusión molecular: depende del tamaño de las partículas.

TECNICAS DE LA CROMATOGRAFÍA.

1) Cromatografía en papel.
2) Cromatografía en capa fina.
3) Cromatografía en columna.
4) Cromatografía por afinidad.
5) Cromatografía de gases (gas- líquido).
6) Cromatografía líquida de alta precisión (HPLC).

a) CROMATOGRAFÍA EN PAPEL.

Es una técnica de la cromatografía de partición (líquido-líquido) en la cual el

papel de filtro actúa como soporte de una fase líquida estacionaria que es agua
firmemente unida al papel, sobre la que fluye una fase líquida móvil que es una
mezcla de solventes o un solvente orgánico.

La cromatografía en papel puede ser de dos tipos; ascendente y descendente,

según como se coloque el sistema de solventes y el sistema de soportes que
contiene la muestra. En el método ascendente el solvente se desplaza hacia
arriba por la acción de las fuerzas capilares pero ese ascenso es frenado por la
acción de la gravedad, en tanto que en el descendente intervienen la capilaridad y
la fuerza de gravedad está a favor.
 29

A medida que progresa el solvente se establece una distribución de

contracorriente de los compuestos de la mezcla y éstos se separan a los
diferentes coeficientes de partición entre ambas fases.

El procedimiento consiste en ubicar gotas de las sustancias que se van a

separar en el extremo de la tira de papel de filtro. Luego se permite que un
solvente adecuado fluya por la tira de papel suspendida. En el proceso lento de la
migración del solvente a través del papel, las sustancias son transportadas a
distintas velocidades según la solubilidad diferencial de las sustancias en cada
una de las dos fases (la acuosa y la orgánica). La separación está basada en la
separación líquido - líquido de los componentes.

Una vez que el solvente se ha desplazado una distancia prudencial, se seca el

papel y se procede al revelado de los compuestos que se están estudiando.

La relación del recorrido de los compuestos con el recorrido del solvente, desde
el punto donde se coloca la gota de muestra (origen) se llama ​Factor de
Retención​ (​Rf​) del compuesto.

Distancia entre el origen y el recorrido de la muestra

Rf = -----------------------------------------------------------------------------------
Distancia entre el origen y el recorrido del solvente

Ejemplo:

Rf A = 4cm/8cm = 0,5
Rf B = 6cm/8cm = 0,75
 30

Bajo condiciones estrictamente controladas el Rf es una constante importante

para identificar sustancias. El método anteriormente descrito es el de la
"cromatografía mono dimensional".

Otros conceptos importantes son los siguientes. ​Resolución, ​es el grado

de separación de los compuestos después del desarrollo. La ​carga ​es la cantidad
aplicada de muestra como mancha o banda sobre el papel o capa fina.

La “cromatografía bidimensional” es una variante donde la muestra es

colocada en una esquina y se hace un desarrollo en una dirección con un
solvente; se seca la hoja, se le da una rotación de 90° y se hace de nuevo
desarrollo con otro solvente. En este caso el poder de separación es
considerable.

La técnica de cromatografía en papel se basa en la propiedad de partición- adsorción. Es de gran

utilidad para reconocer e identificar aminoácidos y azúcares. Ha sido muy útil para el aislamiento
de aminoácidos que provienen de la hidrólisis de proteínas puras; permitió lograr la identificación
completa de los aminoácidos que constituyen la insulina.
Las variaciones de la técnica incluyen:

➢ Cromatografía en papel ascendente o descendente.

➢ Circular o radial.
➢ Mono dimensional o bidimensional.
La cromatografía en papel tiene tres etapas.

1) Colocación de la muestra.
2) Desarrollo del cromatograma.
3) Revelado con ninhidrina.
En toda cromatografía existen dos fases, en el caso de la cromatografía en
papel se tiene:
 31

Una ​fase estacionaria que es agua firmemente unida al papel, esto se refiere al
porcentaje de humedad contenida en la celulosa del papel de filtro la cual se une
al componente más polar del grupo de solventes (el agua). La celulosa del papel
está cubierta con una capa acuosa que sirve de fase estacionaria o fija.

Una ​fase móvil ​que está representada por los solventes orgánicos. Estos son
mezclas polares binarias, ternarias o más complejas de agua, alcoholes y ácidos o
bases. Los componentes menos polares constituyen esta fase.

El soporte lo constituye el papel de filtro Whatman Nº 1.

b) CROMATOGRAFÍA EN COLUMNA.

Es otra técnica de la cromatografía que utiliza una columna de vidrio como

soporte. La ​fase estacionaria está constituida por una resina o polímero que
recubre el interior de la columna y de cuyas características va a depender el
fundamento de la separación, por ejemplo, si la resina tiene carga separará
compuestos de distinta carga que sean atraídos o repelidos por ella (cromatografía
de intercambio iónico); y si la resina tiene poros separará compuestos en base al
tamaño, los más pequeños quedarán atrapados en los poros (cromatografía de
exclusión molecular o de filtración en gel).

La ​fase móvil estará constituida por un solvente o sistema de solventes que

finalizará la separación; es decir, permitirá separar las demás fracciones del
compuesto que quedaron atrapadas en la resina.

Uno de los polímeros más usados en la cromatografía de exclusión

molecular es el Sephadex, consiste en unidades de dextrano entrecruzadas que
dan origen a una estructura tridimensional porosa.

​Elución

En la cromatografía en columna se utiliza el término elución, la elución

implica el transporte de una especie a través de una columna por la adición
continuada de nueva fase móvil. El proceso empieza cuando una única porción de
la muestra se introducen a la parte superior de la columna (tiempo t0) después de
lo cual los componente de la muestra se distribuyen entre las dos fases, La
introducción de fase móvil adicional, el eluyente, hace que la fase móvil que
contiene una parte de la muestra avance por la columna, donde tienen lugar un
posterior reparto entre la fase móvil y las porciones frescas de la fase estacionaria
a las que accede (tiempo t1). Al mismo tiempo, tiene lugar una distribución entre el
 32

disolvente nuevo y la fase estacionaria en el lugar en el que inicialmente se

ubicaba la muestra.

II.- MATERIALES

a) Cromatografía en papel:

Hojas de papel Whatman N° 1 de 21x21 cm.

Soluciones patrones de aminoácidos.

Sistema de solventes:

a) Alcalino: butanol normal / amoníaco 2.8% / etanol 96% 10:4:3 v/v

b) Acido: Butanol normal / ácido acético / agua 4:1:1 v/v

Campanas de cromatografía.

Tubos capilares.

Revelador: solución de ninhidrina al 0.2% en acetona.

Ganchitos de metal.

Hilo de coser blanco.

Secador de pelo.
 33

b) Cromatografía en columna:

Mezcla de 0,4 ml de gelatina 3% p/v y 0,2 ml de riboflavina 0,3% p/v.

(Preparar al momento de usarla).

Sephadex G50.

Reactivo de Biuret.

Columna de cromatografía.

Una ampolla de riboflavina o vitamina B12.

III.- ACTIVIDAD PRÁCTICA

a) Cromatografía en papel.

1.- Colocación de la muestra:

Sobre una hoja de papel filtro Whatman N° 1, marque con un lápiz de grafito,
dos líneas paralelas, al borde inferior y lateral izquierdo de la misma, a una
distancia aproximada de 1,5 cm.

Deposite con el recurso de los tubos capilares 1 μl de una solución hidrolizada

de proteínas. La misma debe ser manejada cuidadosamente, para evitar
contaminación del material. En uno de los ángulos libres de la hoja anote
previamente el tipo del material sembrado, sentido del flujo de cada solvente y
fecha del experimento.

Enrolle la hoja en forma de cilindro, y coloque el hilo de coser blanco en forma

de lazo.

2.- Desarrollo del cromatograma.

 34

a) Primera dimensión: Prepare la cantidad apropiada del solvente alcalino,

colóquela en las placas de Petri (utilizados como cápsulas) e impregne los
papeles secantes, para la adecuada saturación dentro de la campana.
Coloque las hojas de papel de filtro, (cromatograma) previamente preparadas en
las placas de Petri con solvente, sobre su borde inferior. Cubra el conjunto
del sistema con una campana, sellando los bordes con vaselina.

Terminado el proceso cuando el frente del solvente alcanza el borde superior de la

hoja, de 8 a 10 horas, retire el cromatograma y déjelo secar.

b) Segunda dimensión: Se corta una banda en el borde superior del

cromatograma, la hoja resulta cuadrada. Enrollar nuevamente la hoja en
forma de cilindro, con su eje perpendicular al sentido de la primera
dimensión. Preparar solvente ácido y continuar igual desarrollo anterior,
apoyando el cilindro de papel, sobre su borde lateral derecho.

3.- Revelado. El cromatograma desarrollado y seco, se revela por inmersión o

aspersión con la solución de ninhidrina. Una vez seco, incubar a 60°C por cinco
(5) minutos.
 35

IV.- INTERPRETACIÓN DE LA CROMATOGRAFÍA.

Si se realizara una cromatografía en papel con los 20 aminoácidos presentes

en las proteínas, luego del revelado con ninhidrina, se obtendría la siguiente
ubicación de ellos:

Aminoácidos con grandes cadenas laterales no polares migran más que

aquellos con cadenas laterales más cortas no polares y migran menos aquellos
aminoácidos con cadenas laterales polares. Esto refleja la mayor solubilidad
relativa de las moléculas en la fase estacionaria hidrófila y de las moléculas no
polares en solventes orgánica o fase móvil.

EJEMPLOS:

 El aminoácido Acido aspártico (Asp), luego del revelado, quedaría ubicado

cerca del origen, porque ​se solubiliza con la fase estacionaria -fase más polar-
debido a que es un aminoácido con grupo R polar con carga. Este grupo de
aminoácido es más soluble en agua.

 El aminoácido Serina quedaría en posición intermedia porque ​se solubiliza a

medias con cada fase debido a que es un aminoácido con grupo R polar sin carga.
Este grupo de aminoácidos puede formar puentes de hidrógeno a través de sus
grupos polares.

 La Isoleucina (​I​le), se situaría lejos del origen, migra junto al sistema de

solventes porque ​se solubiliza con la fase móvil - fase menos polar – debido a
que es un aminoácido con grupo R no polar de cadena larga. Los de este grupo
son menos solubles en agua que el resto de los aminoácidos.

 El aminoácido Alanina migra un poco menos que la isoleucina , este también

se solubiliza ​con la fase móvil pero su cadena lateral alifática no polar es más
corta.

En conclusión para poder interpretar la cromatografía, es importante analizar la

estructura de cada aminoácido, para ubicarlo en la clasificación según la polaridad
del grupo R y entender con cuál fase se solubiliza.
 36

V.- CALCULOS

1.- Mídase la distancia desde el punto de colocación de la solución de

aminoácidos al centro de las manchas.

2.- Mídase la distancia del mismo sitio de colocación de los aminoácidos al lugar
donde llegó el solvente.

3.- Calcúlese el Rf para cada uno de los aminoácidos utilizados.

- RESULTADOS

Describa la probable identidad de cada uno de los aminoácidos.

**Recuerde: Para la comprensión de la interpretación de la cromatografía debe

conocer la “Clasificación de los aminoácidos según la polaridad del grupo R”
b) Cromatografía en columna.
PROCEDIMIENTO

1. Enumere 6 tubos de ensayo y márquelos con un volumen de 3,5 ml.

2. Con cuidado quite el tapón de la parte inferior de la columna para que salga el
agua destilada presente en la parte superior. NO DEJE QUE EL GEL SE
SEQUE.
 37

3. Una vez eliminada el agua, cierre momentáneamente la parte inferior de la

columna y añada cuidadosamente la mezcla a separar, por las paredes de la
columna, empleando una pipeta Pasteur.

4. Permita que la muestra entre en la resina abriendo cuidadosamente la salida y

agregando simultáneamente solución de cloruro de sodio 0,85% en la parte
superior para evitar que se seque la resina. Hacer esto con una pipeta Pasteur
y por goteo a través de las paredes.

5. Comience a colectar las fracciones. Cierre la salida cada vez que colecte una
fracción.

6. Siga adicionando solución de cloruro de sodio en la parte superior de la

columna manteniéndola así hidratada.

7. Una vez terminado de colectar el eluido de la sexta fracción, lave la columna

con agua destilada agregando agua destilada en la parte superior hasta que
por la salida se complete aproximadamente 25 ml.

8. Cierre la columna verificando que no haya fuga de agua por la salida.

9. Tome las 6 fracciones colectadas y lea la densidad óptica a 430 nm.

10. Tome una alícuota de 1 ml de cada fracción y proceda a realizar la prueba de

Biuret, tal como lo hizo en la práctica de cuantificación de proteínas.

11. Agregue a cada tubo 3 ml de reactivo de Biuret, mézclese bien el contenido de

cada uno de los tubos.

12. Lleve a baño de María a 50ºC, durante 10 minutos. Deje enfriar.

13. Leer en espectrofotómetro a 630 nm, utilizando un blanco reactivo.

RESULTADOS
En una cromatografía en columna lo habitual es recoger ​fracciones ​del
líquido que sale (o ​eluye​), para analizarlas individualmente y así trazar el ​perfil de
elución ​de la cromatografía.

Con los resultados obtenidos de densidad óptica y prueba de Biuret para

cada fracción, haga dos gráficos que le permita llegar a conclusiones sobre la
experiencia realizada. Las gráficas se denominarán Gráfica # 1. Perfil de elución
de la Riboflavina y .Gráfica #2. Perfil de elución de la Gelatina.

CONCLUSIÓN
 38

Tomando en cuenta las representaciones graficas, concluya en su informe

cual de las sustancias eluye primero y justifique su respuesta. Señale además en
cual(es) de las fracciones colectadas se observa la mayor elución tanto de gelatina
como de riboflavina.
 39

PRÁCTICA Nº 4

EFECTO DE TEMPERATURA Y pH SOBRE LA ACTIVIDAD CATALITICA

DE LA AMILASA DEL MAIZ

I.- PROPOSITO DE LA PRÁCTICA

Al finalizar la práctica el estudiante deberá estar en la capacidad de analizar

el efecto de la temperatura y el pH sobre la actividad catalítica de las amilasas del
maíz al hidrolizar el almidón.

II.- INTRODUCCION

El almidón es el principal polisacárido de reserva de las plantas superiores y

se almacena en grandes cantidades en muchas semillas y en tubérculos,
constituyendo una fuente de alimentos que servirán para la formación de nuevos
tejidos cuando la planta vuelva a iniciar su crecimiento luego de un período de
latencia.

Cuando el vegetal necesita emplear estas reservas, son de fundamental

importancia las enzimas hidrolíticas α-amilasa, β-amilasa y almidón fosforilasa.

La producción de α-amilasa es importante durante el proceso de

germinación de las semillas. Ellas actúan hidrolizando el almidón para generar
unidades de glucosa necesarias para la germinación del embrión.

Almidón. ​Químicamente es un hidrato de carbono complejo (C​6​H​10​O​5​),

inodoro e insípido, en forma de grano o polvo. Se acumula en las hojas de las
plantas, en los cloroplastos, donde es un producto directo de la fotosíntesis. En los
órganos de almacenamiento, se acumula en los amiloplastos, en los cuales se
forma después de la translocación de sacarosa u otro carbohidrato proveniente de
las hojas.

En los vegetales, el almidón se encuentra en uno o más granos amiláceos

en un plastidio. La cantidad de almidón en diversos tejidos depende de muchos
factores genéticos y ambientales. El almidón se acumula a la luz del día cuando la
fotosíntesis excede las tasas combinadas de respiración y translocación, después
parte de él desaparece por la noche.

Se presentan dos tipos de almidón en la mayoría de los granos amiláceos:

amilosa y​ ​amilopectina,​ ambos compuestos por unidades de ​D​-glucosa unidas por
 40

enlaces α(1 4). Cada almidón de cada grano difiere de la proporción en que se
encuentren estos dos polisacáridos; para el caso del maíz difiere de la proporción
en que se encuentran 27% de amilopectina y 73% de amilosa.

La formación de almidón ocurre sobre todo por un proceso que implica la

donación repetida de unidades de glucosa provenientes de un nucleótido-azúcar
activado similar al UDP-Glucosa y que se denomina ​difosfoglucosa de adenosina​,
ADP-Glucosa.

Hidrólisis del almidón. La hidrólisis implica la ruptura de un enlace

mediante la adición, en medio del mismo, de los elementos del agua. Los
polisacáridos de la dieta se metabolizan mediante hidrólisis a monosacáridos.

La mayoría de los pasos de la degradación de almidón a glucosa pueden

ser catalizados por tres enzimas distintas, si bien hay otras más que se necesitan
para completar el proceso. Las tres primeras enzimas son α​-amilasa, β-amilasa y
almidón fosforilasa.

a) ​α-amilasa: Al parecer solo puede atacar gránulos de almidón intactos,

por lo que cuando participan la β-amilasa y la almidón fosforilasa, es probable que
actúen sobre los primeros productos liberados por la α-amilasa. La α-amilasa
ataca de manera aleatoria enlaces (1 4) en las moléculas de amilosa y
amilopectina, al principio creando huecos al azar en los granos de almidón y
liberando productos que aun son grandes.

En cadenas de amilosa no ramificadas, el ataque repetido por la α-amilasa

produce maltosa, un disacárido que contiene dos unidades de glucosa. Sin
embargo, la α-amilasa no puede atacar los enlaces (1 6) localizados en los
puntos de ramificación de la amilopectina, por lo que la digestión de amilopectina
cesa cuando aun quedan ​dextrinas ramificadas con cadenas de longitud corta.
Muchas α-amilasas son activadas por Ca​++​, lo cual es una de las razones por las
que el calcio es un elemento esencial.

b) ​β-amilasa: ​Hidroliza al almidón en β-maltosa; la enzima actúa primero

solo sobre los extremos no reductores. La β-maltosa cambia con rapidez, por
mutarrotación, para formar las mezclas naturales de isómeros α y β. La hidrólisis
de amilosa por la β-amilasa es casi completa, pero la degradación de amilopectina
es incompleta porque no son atacados los enlaces de los puntos de ramificación.
La actividad de ambas amilasas implica la incorporación de una molécula de agua
por cada enlace roto, por lo que son enzimas hidrolasas.
 41

Las reacciones hidrolíticas no son reversibles, de modo que no se pueden

detectar síntesis de almidón por amilasas. Las amilasas están diseminadas en
diversos tejidos pero son mas activas en las semillas que están germinando, ricas
en almidón. Es probable que la α-amilasa tenga más importancia que la β-amilasa
para la hidrólisis de almidón. Gran parte de la α-amilasa se localiza dentro de los
cloroplastos, muchas veces unida a los granos de almidón que atacará. Actúa
tanto en el día como por la noche aunque, por supuesto, durante la luz de día hay
producción neta de almidón por la fotosíntesis.

c) ​Almidón fosforilasa: Degrada parcialmente a la amilopectina. La

reacción procede de manera consecutiva a partir del extremo no reductor de cada
cadena principal o cadena ramificada hasta llegar a unos residuos de glucosa de
las uniones α-(1 6) de las ramificaciones, por lo que de nuevo dan dextrinas.
La amilosa, que tiene pocas ramificaciones, se degrada casi por completo, por
eliminación repetida de unidades de glucosa a partir del extremo no reductor de la
cadena. La enzima almidón fosforilasa está ampliamente distribuida en la planta y
a veces resulta difícil determinar cual enzima digiere la mayor parte del almidón en
las células de interés.

Como referencia general, se reportan los siguientes valores de pH y

temperatura óptimos para las amilasas del trigo, los cuales no difieren mucho con
los valores de amilasas para maíz:

Enzima pH óptimo Temperatura Temperatura de

(trigo) óptima (ºC) inactivación (ºC)
α- amilasa 4,6 60 - 66 73
β- amilasa 4-5 55 65

III.- MATERIALES

Instrumental​:

Morteros

Bisturí

Baños de María

Tubos de centrífuga
 42

Pipetas graduadas serológicas

Tubos de ensayo de 15x150

Centrífuga

Espectrofotómetro

Balanza

Gasa

30 semillas de maíz

Balones de 50 ml

IV.- ACTIVIDAD PRÁCTICA

1) Preparación de la semilla de maíz y extracto enzimático.

Se realizará tres días antes de la práctica. Se desinfectarán 60 semillas de

maíz en cloro (hipoclorito de sodio) durante 20 minutos y se enjuagarán varias
veces con agua hervida; luego se pondrán a germinar en un plato hondo limpio
que contenga una capa de algodón húmedo. De igual manera se realizarán otras
germinaciones dos días antes de la práctica y otra un día antes de la práctica.
- Para empezar la práctica se ponen a remojar en agua las semillas de maíz
de 1, 2 y 3 días de germinación, por separado.
- Se les quita el embrión y el escueto con ayuda de un bisturí, para que solo
quede el endospermo almidonoso.
- Una vez limpios los maíces, se prepara un ​extracto enzimático​:
a) Tomar 20 semillas de la misma clase y en las mismas condiciones,
colocarlas en un mortero.
b) Triturar el endosperma y agregar 20 ml de buffer acetato.
c) Filtrar por gasa o tela.
d) Centrifugar el filtrado 10 min a 3000 rpm. El sobrenadante contendrá
las enzimas para nuestro propósito.

2) Efecto de las distintas temperaturas sobre la actividad enzimática de amilasa:

a) Preparación de tubos problema:

 43

Rotule 5 tubos de ensayo, y agregue los reactivos según la siguiente tabla. Debe
prepararlos uno por uno para poder controlar el tiempo exacto de reacción.

TABLA 1

1 2 3 4 5

Solución de almidón
0,5 0,5 0,5 0,5 0,5
(1,4 g/l)

Extracto enzimático
con
1 día de germinación 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5
(ml)
Temperatura
0º C 37º C 40º C 65º C 80º C
Incubar 10 min
Solución de lugol (ml) 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5

Retirar los tubos y 10 10 10 10 10

agregar agua (ml)

● Mezclar por inversión y leer en el espectrofotómetro a la absorbancia de

660 nm, ajustando el equipo con agua destilada. Color estable 1 hora.

● Repetir este procedimiento utilizando los extractos enzimáticos con 2 días

de germinación y con 3 días de germinación.

b) Preparación de tubos controles: Rotule 5 tubos de ensayo.

TABLA 2

1 2 3 4 5

Solución de 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5

almidón (1,4 g/l)

Temperatura 0º C 37º C 40º C 65º C 80º C

Incubar 10 min
 44

Solución de lugol 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5

(ml)

Extracto
enzimático con
0,5 0,5 0,5 0,5 0,5
0 día de
germinación​ (ml)

Retirar los tubos y 10 10 10 10 10

agregar agua (ml)

- Mezclar por inversión y leer en el espectrofotómetro a la absorbancia de 660 nm,

ajustando el equipo con agua destilada. Color estable 1 hora.

3) Efecto de los distintos pH sobre la actividad enzimática de amilasa.

a) Preparación de tubos problema:

Rotule 5 tubos de ensayo, y agregue los reactivos según la siguiente tabla. Debe
prepararlos uno por uno para poder controlar el tiempo exacto de reacción.

TABLA 3

1 2 3 4 5

1 ml de 1 ml de 1 ml de 1 ml de 1 ml de
buffer buffer buffer buffer buffer
Buffer a distintos
pH 4 pH 5 pH 7 pH 8 pH 11
pH

Solución de 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5

almidón (1,4 g/l)

Extracto
enzimático con
0,5 0,5 0,5 0,5 0,5
1 día de
germinación​ (ml)
 45

Incubar a 37° C por 10 minutos

Solución de lugol 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5

(ml)

Retirar los tubos y 10 10 10 10 10

agregar agua (ml)

● Mezclar por inversión y leer en espectrofotómetro a la absorbancia a 660

nm, ajustando el equipo con agua destilada. Color estable 1 hora.

● Repetir este procedimiento utilizando los extractos enzimáticos con 2 días

de germinación y con 3 días de germinación.

b) Preparación de tubos controles:

Rotule 5 tubos de ensayo, y agregue los reactivos según la siguiente tabla.

TABLA 4

1 2 3 4 5

1 ml de 1 ml de 1 ml de 1 ml de 1 ml de
buffer buffer buffer buffer buffer
Buffer a distintos
pH 4 pH 5 pH 7 pH 8 pH 11
pH

Solución de 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5

almidón (1,4 g/l)

Incubar a 37ºC por 10 minutos

Solución de lugol 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5

(ml)
 46

Extracto
enzimático con
0,5 0,5 0,5 0,5 0,5
0 día de
germinación​ (ml)

Retirar los tubos y 10 10 10 10 10

agregar agua (ml)

● Mezclar por inversión y leer en espectrofotómetro a la absorbancia a 660

nm, ajustando el equipo con agua destilada. Color estable 1 hora.

V.- CÁLCULOS

1) Efecto de las distintas temperaturas sobre la actividad enzimática.

- Calcular la actividad enzimática para cada temperatura. La actividad

enzimática se calcula como descenso de la Absorbancia por minuto.

Actividad enzimática/minuto = ∆ Absorbancia / minuto = ​Ac - Ad

10

Ac = Absorbancia del control

Ad = Absorbancia del tubo problema (desconocido)

- Graficar la Actividad enzimática (en el eje de las ordenadas) en función de

las temperaturas ensayadas (en el eje de las abscisas).

Título de la gráfica: “Efecto de temperatura sobre la actividad enzimática

de amilasas del maíz”.

- Sacar conclusiones.

b) Efecto de los distintos pH sobre la actividad enzimática.

- Calcular la actividad enzimática para cada pH.

- Graficar la Actividad enzimática (en el eje de las ordenadas) en función de los

pH ensayados (en el eje de las abscisas).
 47

Título de la gráfica: “Efecto de pH sobre la actividad enzimática de amilasas

del maíz”.

- Sacar conclusiones.
 48

PRÁCTICA Nº 5

CURVA DE CALIBRACIÓN DE GLUCOSA

I.- PROPOSITO DE LA PRÁCTICA

​ l finalizar la práctica el estudiante deberá estar en capacidad de realizar una

A
determinación de glucosa en sangre mediante el método enzimático y relacionar
el resultado obtenido con el estado metabólico.

II.- INTRODUCCIÓN

La glucosa es el carbohidrato más importante del grupo de las aldosas

perteneciente a los monosacáridos. No puede ser hidrolizada en moléculas más
sencillas. Es una hexosa y en su fórmula estructural tiene cinco carbonos
ocupados por funciones alcohólicas y uno con una función aldehído en su forma
lineal. Es dextrógira.

Entre los carbohidratos presentes en la sangre sólo ciertas hexosas como la

glucosa, galactosa y fructosa así como las pentosas ribosa y desoxiribosa son de
importancia bioquímica. Sin embargo la glucosa presente en sangre y en los
tejidos es el azúcar utilizable por excelencia que se oxida fácilmente para liberar
energía.

La fuente de glucosa sanguínea puede ser exógena y endógena y a partir de

ella pueden formarse los demás carbohidratos en el cuerpo:

1.-Exógena: proviene de los alimentos (disacáridos y polisacáridos) que sufren

transformaciones en el aparato digestivo hasta formar glucosa y otros
monosacáridos como fructosa y galactosa. Entra a la sangre donde es captada
por el hígado principalmente y el tejido muscular (glucogénesis tisular).

2.- Endógena:

a) Proviene de la conversión de glucógeno en glucosa (glucogenólisis).

b) Algunos aminoácidos y lípidos pueden ser convertidos en glucosa

(gluconeogénesis).

c) Galactosa y fructosa también pueden ser transformados en glucosa por el

hígado (interconversión de hexosas).
 49

Los valores normales de glucosa sanguínea son 70 a 100 mg/dl. Después de

una comida que contenga carbohidratos, esta cifra se incrementa para volver en
unas dos horas a los niveles basales. Si el ayuno es prolongado el nivel de
glucosa desciende, pero nunca por debajo de 50-60mg/dl, la razón fundamental es
que el sistema nervioso requiere un aporte continuo de glucosa. Cuando la
glicemia sanguínea se eleva por encima del umbral renal (180 mg/dl) se produce
la aparición de glucosa en la orina o glucosuria. En condiciones normales no debe
existir glucosuria, por lo tanto NO se puede hablar de valores normales de glucosa
en orina.

Las enfermedades que se relacionan con carbohidratos incluyen diabetes

sacarina, galactosemia, enfermedades por almacenaje de glucógeno e intolerancia
a la leche.

MÉTODOS DE DETERMINACIÓN DE GLUCOSA:

1.-Métodos basados en la capacidad reductora de la glucosa:

La forma enediol de la glucosa es muy reactiva y se oxida fácilmente.

Consecutivamente a la oxidación, la cadena de carbonos se rompe dando lugar a
la formación de cadenas ácidas más cortas. Sea cual sea el grado de oxidación
se forman diversos productos, esto dependerá del pH, temperatura, concentración
salina y concentración del oxidante el cual puede ser cobre, ferricianuro o ácido
pícrico. Han sido utilizados los métodos clásicos de Folin –Wu, Hagedorn y Jensen
entre otros, hoy en día en desuso.
2.-Métodos basados en la condensación aldosa-amina aromática:

La glucosa y otras aldosas se condensan con aminas aromáticas en

soluciones de ácido acético en caliente dando lugar a la formación de
glucosil-aminas. Numerosas aminas aromáticas han sido empleadas, entre ellas:

● O-aminodifenil
● ácido p-aminosalicílico
● ácido p-aminobenzoico
● O-toluidina.

3.- Métodos enzimáticos:

Son los más empleados en la actualidad. Los métodos enzimáticos son

específicos, se emplean enzimas purificadas que actúan sólo sobre glucosa y esto
ha permitido la aplicación de técnicas altamente específicas en la valoración de
glucosa en líquidos biológicos.
 50

Algunas enzimas utilizadas son:

● glucosa oxidasa, se utilizará en esta práctica.

● hexoquinasa.
● glucosa-6-fosfato deshidrogenasa.

MÉTODO DE LA GLUCOSA OXIDASA

Fundamento:

La β-D-glucosa es oxidada específicamente por la glucosa-oxidasa con la

producción de peróxido de hidrógeno (H​2​O​2​) el cual oxida al cromógeno
(4-AAP/fenol), para producir un compuesto coloreado, mediante una reacción
catalizada por la peroxidasa.

glucosa oxidasa

Glucosa H​2​O+ O​2​ ácido glucónico + H​2​O​2

peroxidasa

H​2​O​2​ + 4 aminoantipipirina + Fenol Compuesto coloreado

I.- MATERIALES

​Instrumental​:

Tubos de ensayo

Gradilla

Balón de 500 ml.

Balanza.

Baño de María a 37 °C

Espectrofotómetro.

Pipetas serológicas
 51

IV.- ACTIVIDAD PRÁCTICA

a) CURVA DE CALIBRACIÓN

Solución madre: pesar analíticamente un gramo (1g) de glucosa, colocarla en

balón volumétrico de 500 ml. Disolver y completar volumen con agua destilada
​ oncentración de la solución madre = 2 mg/ml
hasta el aforo. Mezclar. C

Soluciones patrones: Rotular cinco tubos y prepararlos de la siguiente manera.

TUBOS 1 2 3 4 5

Sol madre 0,25 0,50 0,60 0,75 1,00

(ml)

Agua
destilada
0,75 0,50 0,40 0,25 --
(ml)

Concentración
50 mg/dl 100 mg/dl 120 mg/dl 150 mg/dl 200 mg/dl
final

1. Mezclar el contenido de los tubos.

2. Rotular otra serie de tubos (5) en forma similar por duplicado.
3. Colocar en cada uno 0,02 ml de la dilución respectiva. (patrones)

Estos 5 tubos son llamados “patrones”, se prepararon a partir de una solución

madre (en este caso de glucosa). Se les hará la determinación por el método de
glucosa oxidasa. Los tubos patrones son los que se necesitan para realizar la
curva de calibración.

b) TÉCNICA DE LA GLUCOSA OXIDASA

 52

Tome 2 tubos de ensayo, rotúlelos “blanco” y “muestra”. Los patrones

corresponden a los 5 tubos preparados anteriormente, solo tiene que agregarles el
reactivo de color:

BLANCO MUESTRA PATRONES

Suero o plasma -- 0,02 ml --

Agua destilada 0,02 ml -- --

Patrón de glucosa -- -- 0,02 ml

Reactivo de color 2 ml 2 ml. 2 ml.

En este momento deberá tener 7 tubos.

1. Mezcle bien e incube 10 min. a 37 °C ó 30 min. a temperatura ambiente.

2. Ajustar el fotocolorímetro o espectrofotómetro a densidad óptica de cero
utilizando el blanco y leer luego las soluciones contenidas en los otros tubos en
forma sucesiva, a 510 nm. El color es estable 1 hora.

V.- TABLA DE DATOS

TUBOS LECTURAS concentración

mg/dl

1 50

2 100

3 120

4 150

5 200

muestra (*)

(​*​) Esta concentración se averigua por medio de la

curva de calibración.
 53

VI.- CÁLCULOS

1. Verifique mediante cálculos matemáticos si la concentración de la solución

madre realmente es de 2 mg/ml. Haga lo mismo con la concentración de
glucosa de cada tubo patrón.

2. En papel milimetrado realizar una gráfica de calibración representando en el

eje vertical las lecturas en absorbancia y en el eje horizontal las
concentraciones correspondientes.

3. Según la lectura obtenida para la muestra, ubique en eje de las concentraciones

de glucosa el valor que le corresponde.

V.- RESULTADOS
1. Compare el resultado de la muestra (mg/dl) con los valores normales de
glucosa.
2. Elabore su conclusión con apoyo bibliográfico relacionando el valor obtenido
con patologías, si fuese necesario.