Tesis Clorf

Universidad Austral de Chile
Facultad de Ciencias
Escuela de Ciencias
Profesor Patrocinante:
Dr. Iván Gómez O.
Instituto de Biología Marina
Profesor Co-Patrocinante:
Dra. Susan Hess F.
Instituto de Química
“PIGMENTOS FOTOSINTÉTICOS EN LA COLUMNA DE AGUA DETERMINADOS
MEDIANTE TÉCNICAS ESPECTROSCÓPICAS Y CROMATOGRÁFICAS (HPLC-RP):
VARIABILIDAD ESPACIO-TEMPORAL Y EFECTOS DE RADIACIÓN UV”
Tesis de Grado presentada como

parte de los requisitos para optar
al grado de Licenciado en Ciencias
Biológicas.
CONSTANZA DANIELA ROSAS RIEDEL

VALDIVIA-CHILE
2007
Dedicado a mis papás
Patricio y Eliana, por
enseñarme que no
existen imposibles…..
Agradecimientos
En primer lugar agradezco a mis dos profesores patrocinantes y co-patrocinantes, Dr. Iván
Gómez Ocampo, del Instituto de Biología Marina, quien me acogió con mucho entusiasmo y
amabilidad en su Instituto, brindándome siempre un gran apoyo y tiempo para resolver mis
inquietudes. A la Dra. Susan Hess, del Instituto de Química, gracias por el apoyo, consejos y
dedicación para lograr esta tesis. Además por tratar de que sea un poco más química que
bióloga.
Agradezco de igual manera a Marcela, del Instituto de Biología Marina, quien siempre con
una gran disponibilidad me facilitó los medios y demostró preocupación hacia este trabajo. Y
a mis compañeras del laboratorio: Francisca y Karina por ayudarme cuando lo necesité, y a
la Anita por enseñarme a utilizar el equipo de HPLC.
También merecen mi agradecimiento, el Profesor Juan Carlos Paredes del Instituto de
Química, Paz y Jina del Instituto de Biología Marina, quienes me facilitaron laboratorios y
materiales para el desarrollo de la presente Tesis. Gracias a todos por su tiempo y
conocimientos entregados. Y a todas las personas que trabajan en el Instituto de Biología
Marina, en especial a Alex y Oriana.
A mis papás Patricio y Eliana por hacer de mí la persona que soy, por apoyarme en todos
los caminos que he tomado en mi vida. A ti papá por mostrarme e inculcarme el sentido de
la responsabilidad en cada uno de tus actos. A ti mamá por ser mi amiga y compañera por
ayudarme a levantar en momentos difíciles. Gracias papis sin su apoyo ninguno de mis
sueños se hubiesen realizado. A mi hermana Priscila por estar conmigo siempre y compartir
grandes e innumerables momentos de felicidad.
Te agradezco a ti Felipe, por ser mi compañero que me ayuda en mis días más
complicados, te agradezco por entregarme tu amor, conocimientos y tener siempre una
palabra de apoyo.
Para finalizar agradezco, al proyecto FONDECYT 1050552, a través del Prof. Robert Stead,
que ha permitido el financiamiento de esta tesis.
I
ÍNDICE
Pág.
Índice I
Índice de figuras IV
Índice de tablas IX
Abreviaturas XII
1.-RESUMEN 01
1.1.-SUMMARY 03
2.- INTRODUCCIÓN 05
2.1. Aspectos generales de los pigmentos fotosintéticos 05
2.1.1. Estructuras de los pigmentos fotosintéticos 06
2.1.1.1 Clorofilas 06
2.1.1.2. Carotenoides 08
2.1.1.3. Ficobiliproteínas 09
2.2. Pigmentos fotosintéticos en la columna de agua 11
2.2.1. Dinámica espacial y temporal de los pigmentos 12
2.2.2. Técnica para la determinación de pigmentos fotosintéticos 13
2.3. Efecto de la radiación solar sobre los pigmentos fotosintéticos 14
2.3.1. El espectro de radiación solar incidente 14
2.3.2. Penetración de la radiación UV-B en la columna de agua 15
2.3.3. Efecto de la radiación UV-B en los ecosistemas acuáticos 16
2.3.4. Efecto de la radiación UV sobre los pigmentos fotosintéticos 18
2.4. Comunidades de algas 18
2.4.1. Fitoplancton 19
2.4.2. Macroalgas 20
2.5. La situación en los ambientes costeros del Sur de Chile 21

II
2.6. Hipótesis de Trabajo 22
2.7. Objetivo General 22
2.8. Objetivos Específicos 22
3.- MATERIALES Y MÉTODOS 24
3.1. Área de estudio y recolección de muestras 24
3.2. Diseño experimental exposición a radiación UV 25

3.3. Análisis químico 27
3.3.1. Extracción y partición de pigmentos fotosintéticos 27
3.3.1.1. Clorofilas y carotenoides 27
3.3.1.2. Productos de degradación de la clorofila 28
3.3.1.3. Ficobilinas 28
3.3.2. Cuantificación de los pigmentos fotosintéticos por 29
espectrofotometría
3.3.2.1. Clorofila y feopigmentos 30
3.3.2.2. Clorofila a, b, c y carotenoides 31
3.3.2.3. Ficobilinas 32
3.3.3 Determinación de pigmentos fotosintéticos por HPLC de 33

fase reversa
3.3.3.1. Reactivos empleados en análisis de pigmentos 35
fotosintéticos
3.3.3.2. Determinación de clorofilas y carotenos 36
3.3.3.3. Identificación y calibración y cuantificación de 37
pigmentos fotosintéticos
3.3.3.3.1. β-caroteno 37
3.3.3.3.2. Clorofila a y b 37
3.4. Estudios fisiológicos 38
3.4.1. Medición de la fluorescencia de clorofilas del fotosistema II 38
3.4.1.1 Rendimiento Cuántico Máximo (Fv/Fm) 39
3.4.1.2 Tasa de transporte de electrones (ETR) 40
3.5. Análisis estadísticos 41
III
4.- RESULTADOS 42
4.1. Variación estacional y en profundidad de pigmentos fotosintéticos 42
en muestras de Fitoplancton de la zona de Coihuín
4.1.1. Caracterización de las condiciones oceanográficas 42
4.1.2. Espectrofotometría 43
4.1.2.1. Clorofila “a” y feopigmentos 43
4.1.3. HPLC 52
4.1.3.1. Identificación, calibración de los pigmentos 52
fotosintéticos por RP- HPLC
4.1.3.2. Análisis pigmentos fotosintéticos en muestras de 56
Fitoplancton
4.2. Efecto de la radiación UV sobre los pigmentos fotosintéticos de 62
macroalgas de la zona de Niebla.
4.2.1. Espectrofotometría 62
4.1.2.1. Clorofila “a” y feopigmentos 62
4.1.2.3. Ficobiliproteínas 76
4.2.2. HPLC 79
4.2.2.1. Pigmentos fotosintéticos en macroalgas 79

4.3. Efecto de la radiación UV sobre la fotosíntesis de macroalgas 89
de la zona de Niebla
4.3.1 Rendimiento Cuántico Máximo (Fv/Fm) 89
4.3.2 Tasa de transporte de electrones (ETR) 93
5.- DISCUSIÓN 97
5.1.- CONCLUSIONES 105
6.- BIBLIOGRAFÍA 107
IV
ÍNDICE DE FIGURAS Pág
Figura 1. (A) Estructura molecular y (B) espectro de absorción de la molécula de clorofila. 7

Figura extraída y modificada de Strasburger, 1994.
Figura 2. (A) Estructura molecular y (B) espectro de absorción de lamolécula de carotenoide. 8

Figura extraída y modificada de Strasburger, 1994
Figura 3. (A) Estructura molecular y (B) espectro de absorción de las moléculas de 10

ficobiliproteinas. Figura extraída y modificada de Strasburger, 1994
Figura 4. Muestra de Fitoplancton de la zona cercana a Puerto Montt indicando los 19

principales grupos taxonómicos dominantes.
Figura 5. Ejemplares de macroalgas utilizados en el estudio: A) Ulva sp. Y B) Gracilaria chilensis 20
Figura 6. Ubicación geográfica de los sitios de colecta de fitoplancton y macroalgas. A) 24

Cohíun (Puerto Montt), B) Playa Chica (Valdivia).
Figura 7. Esquema del sistema de incubación termorregulado, donde se indica la disposición 26

de los tratamientos (lámparas y fitros) utilizados para la exposición de los discos
con macroalgas.
Figura 8. Espectrofotómetro SCINCO UV/Visible utilizada para la medición de las 29

absorbancias de pigmentos totales (clorofilas, carotenoides y ficobiliproteinas)
presentes en microalgas y fitoplancton analizadas. Este equipo emplea dos
fuentes diferentes de energía para cubrir el intervalo especificado de longitudes
de onda. Una lámpara de arco Deuterio suministra la radiación ultravioleta y una
de Tungsteno la radiación visible.
Figura 9. Equipo cromatográfico HPLC Hewlett Packard serie 1100 Agilent de fase reversa, 33
utilizando columna Alltech ODS-2 C (250 x 4.60 mm; tamaño de partícula 5µ).
18
Figura 10. Fluorímetro de amplitud modulada PAM 2000 (Walz, Alemania). Instrumento portátil, 38
permite medir la cinética de conversión de energía y parámetros fotoquímicos en el
aparato fotosintético in vivo.
Figura 11. Cinética de emisión de fluorescencia determinada con el fluorímetro PAM 2000 (Walz, 39
Effeltrich, Alemania). Las flechas negras indican el encendido de la luz de
medida. Las flechas negras quebradas indican los pulsos de saturación. Con las
flechas rojas se indica el encendido y apagado de la luz actínica y con las lilas el
pulso del rojo lejano. Figura extraída de Figueroa & Gómez (2001).
Figura 12. Condiciones oceaonográficas de la zona de Coihuin (Puerto Montt). A) perfiles de 43

radiación solar (UV-B, UV-A y PAR) en la columna de agua medidos con un
espectroradiómetro acuático Ramses a lo largo de un rango de 40 m; B) Perfiles de
Chl a, salinidad y temperatura determinados con un CTD en un rango de
profundidad de 20 m.
Figura 13. Concentraciones de la clorofila a y feopigmentos medidas en extractos fitoplancton, 47
V
determinada mediante el espectrofotómetro UV/Visible SCINCO en muestras

obtenidas por botella Niskin. Profundidad: a) superficie (0-5 m), b) intermedio
(5-15 m). Las muestras fueron recolectadas durante las distintas estaciones del año.
Los valores son promedio n= 3 ± D.E.
Figura 14. Concentraciones de la clorofila y feopigmentos medidas en extractos de 47

fitoplancton determinadas mediante el espectrofotómetro UV/Visible SCINCO en
muestras tomadas en trampas a 70 m de profundidad, siendo recolectadas
durante las distintas estaciones del año. Los valores son promedio n= 3 ± D.E.
Figura 15. Concentraciones de clorofilas a, b, c y carotenoides medidos en extractos de 51

fitoplancton determinadas mediante el espectrofotómetro UV / Visible SCINCO
en, muestras obtenidas por la botella Nisksin. Profundidad: a) superficie (0-5 m),
b) intermedio (5-15 m). Las muestras fueron recolectadas durante las distintas
estaciones del año. Los valores son promedio n= 3 ± D.E
Figura 16. Concentraciones de clorofilas a, b, c y carotenoides medidos en extractos de 51

fitoplancton determinadas mediante el espectrofotómetro UV / Visible SCINCO en
muestras tomadas en trampas a 70 m de profundidad, siendo recolectadas
durante las distintas estaciones del año. Los valores son promedio n= 3 ± D.E.
Figura 17. Cromatogramas de los estándares de los pigmentos fotosintéticos: A) β-caroteno B) 54

Clorofila a C) Clorofila b, correspondiente a la concentración 50, 4, 2,5 ppm,
respectivamente, resuelto en HPLC fase reversa, inyectando 50 µL de muestra a un
-1
flujo 2,0 mL/min , controlado por bomba peristáltica cuaternaria a una longitud de
450 nm con detector UV-visible, controlado por bomba peristáltica cuaternaria, a
temperatura ambiente y con gradiente de solventes acetonitrilo-metanol-buffer Tris
HCL 0,1 M pH 8,0 y metanol-acetato de etilo y corrida isocrática con la última
mezcla de solventes.
Figura 18. Curvas de calibración de los estándares puros de: β-caroteno, clorofila a y b corridos 55
en HPLC de fase reversa.
Figura 19. Concentraciones de pigmentos fotosintéticos medidas en extractos de fitoplancton 59

mediante HPLC (Hewlett Packard serie 1100 Agilent) fase reversa, en muestras
obtenidas por la botella Niskin. Profundidad en: a) superficie (0-5 m), b) intermedio
(5-15 m). Las muestras fueron recolectadas durante las distintas estaciones del
año. Los valores son promedio n= 3 ± D.E.
Figura 20. Concentraciones de pigmentos fotosintéticos medidas en extractos de fitoplancton 59

mediante HPLC (Hewlett Packard serie 1100 Agilent) fase reversa, en muestras
tomadas en trampas a una profundidad de 70 m. Las muestras fueron
recolectadas durante las distintas estaciones del año. Los valores son promedio
n= 3 ± D.E.
Figura 21. Cromatogramas de pigmentos fotosintéticos en extractos de fitoplancton, muestras 60

obtenidas mediante botella Niskin analizados según profundidad y estación del año.
A) Primavera; B) Otoño. Resuelto por HPLC (Hewlett Packard serie 1100 Agilent)
fase reversa. Volumen de inyección de muestra 50 µL a un flujo de
-1
2,0 mL/min , controlado por una bomba peristáltica cuaternaria, longitud de onda
VI
de 450 nm con detector UV-visible, a temperatura ambiente.
Figura 22: Cromatogramas de pigmentos fotosintéticos en extractos de fitoplancton, muestras 61

obtenidas mediante trampas a 70 m de profundidad, A) Verano; B) Invierno.
Resuelto por HPLC (Hewlett Packard serie 1100 Agilent) fase reversa. Volumen de
-1
inyección de muestra 50µL a un flujo de 2,0 mL/min , controlado por una bomba
peristáltica cuaternaria, longitud de onda de 450 nm con detector UV/visible, a
temperatura ambiente.
Figura 23. Concentraciones de clorofila “a” y feopigmentos medidas en extractos macroalga, 67

mediante el espectrofotómetro UV/Visible SCINCO. Las determinaciones fueron
realizadas mediante exposición a tratamientos de radiación a distintos tiempo,
siendo: A) UV-B y PAR en Ulva sp., B) UV-B y PAR en Gracilaria chilensis. Las
muestras fueron recolectadas en el mes de Agosto. Los valores son promedio n=
3 ± D.E.
Figura 24. Concentraciones de clorofila “a” y feopigmentos medidas en extractos macroalga, 68

muestras fueron recolectadas en el mes de Octubre. Los valores son promedio
n= 3 ± D.E
Figura 25. Concentraciones de clorofila a, b y carotenoides medidas en extractos macroalga, 74

muestras fueron recolectadas en el mes de Agosto. Los valores son promedio
n= 3 ± D.E.
Figura 26. Concentraciones de clorofila a, b y carotenoides medidas en extractos macroalga, 75

siendo: A) UV-B y PAR en Ulva sp.,B) UV-B y PAR en Gracilaria chilensis. Las
muestras fueron recolectadas en el mes de Octubre. Los valores son promedio n=
3 ± D.E
Figura 27. Concentración de ficoeritrina (R-PE) en extractos de macroalga Gracilaria chilensis 79

obtenidas, mediante el espectrofotómetro UV/Visible SCINCO. Las
determinaciones fueron realizadas mediante exposición a tratamientos de
radiación (UV-B y PAR) a distintos tiempos. A) experimento del mes de Agosto,
B) experimento del mes de Octubre. Los valores son promedio n= 3 ± D.E.
Figura 28. Concentraciones de pigmentos fotosintéticos medidas en extractos de macroalga, 85

en 30 mg de muestra peso seco, según los tratamientos de radiación. En
análisis se realizó mediante HPLC (Hewlett Packard serie 1100 Agilent) fase
reversa. A) UV-B y PAR en Ulva sp., B) UV-B y PAR en Gracilaria chilensis. Las
muestras fueron recolectadas en el mes de Agosto. Los valores son promedio n=
3 ± D.E
Figura 29. Concentraciones de pigmentos fotosintéticos medidas en extractos de macroalga,

VII
en 30 mg de muestra peso seco, según los tratamientos de radiación. En 86

análisis se realizó mediante HPLC (Hewlett Packard serie 1100 Agilent) fase
reversa. A) UV-B y PAR en Ulva sp, B) UV-B y PAR en Gracilaria chilensis. Las
muestras fueron recolectadas en el mes de Octubre. Los valores son promedio n=
3 ± D.E.
Figura 30. Cromatogramas de los pigmentos fotosintéticos en extractos de macroalga A) Ulva 87

sp. B) Gracilaria chilensis recolectadas en el mes de Agosto. Resuelto por HPLC
(Hewlett Packard serie 1100 Agilent) fase Reversa. Volumen de inyección de
-1
muestra 50 µL a un flujo de 2,0 mL/ min , controlado por una bomba peristáltica
cuaternaria, longitud de onda de 450 nm con detector UV-visible, a temperatura
ambiente.
Figura 31. Cromatogramas de los pigmentos fotosintéticos en extractos de macroalga A) Ulva 88

sp. B) Gracilaria chilensis, recolectadas en el mes de Octubre. Resuelto por HPLC
(Hewlett Packard serie 1100 Agilent) fase Reversa. Volumen de inyección de
-1
muestra 50 µL a un flujo de 2,0 mL/ min , controlado por una bomba peristáltica
cuaternaria, longitud de onda de 450 nm con detector UV-visible, a temperatura
ambiente.
Figura 32. Parámetros de fluorescencia (Fv/Fm: rendimiento cuántico máximo) medidos en 92

extractos de macroalga A) Ulva sp. y B) Gracilaria chilensis, mediante el
fluorímetro de amplitud modulada PAM 2000. Las determinaciones fueron
realizadas a través de exposición a radiación a distintos tiempos. Las muestras
fuero recolectadas en el mes de Agosto. Los valores son promedio n= 3 ± D.E.
Figura 33. Parámetros de fluorescencia (Fv/Fm: rendimiento cuántico máximo) medidos en 92

extractos de macroalga A) Ulva sp. y B) Gracilaria chilensis, mediante el fluorímetro
de amplitud modulada PAM 2000. Las determinaciones fueron realizadas a
través de exposición a radiación a distintos tiempos. Las muestras fueron
recolectadas en el mes de Octubre. Los valores son promedio n= 3 ± D.E.
Figura 34. Parámetros de fluorescencia ETR (Tasa de transporte de electrones) medidos en 95

extractos de macroalga, mediante el fluorímetro de amplitud modulada PAM
2000. Las determinaciones fueron realizadas mediante exposición a radiación a
distintos tiempos, siendo A) Ulva sp. tratada con UV-B y PAR B) Gracilaria
chilensis tratada con UV-B y PAR. Las muestras fueron recolectadas en el mes de
Agosto. Los valores son promedio n= 3.
Figura 35. Parámetros de fluorescencia ETR (Tasa de transporte de electrones) medidos en 96

extractos de macroalga, mediante el fluorímetro de amplitud modulada PAM
2000. Las determinaciones fueron realizadas mediante exposición a radiación a
distintos tiempos, siendo A) Ulva sp tratadas con UV-B y PAR B) Gracilaria
chilensis tratadas con UV-B y PAR. Las muestras fueron recolectadas en el mes de
Octubre. Los valores son promedio n= 3.
VIII
ÍNDICE DE TABLAS Pág.

3 45
Tabla 1. Concentraciones de clorofila (Chl a) y feopigmentos (Pheo) (mg/m ) en extractos
fitoplancton, obtenidos por botella Niskin. Estas fueron determinadas según el
método de Lorenzen (1967) por medio de espectrofotometría UV/Visible a 665
y 750 nm en los diferentes tiempos de exposición a los tratamientos de radiación.
Los valores son promedio n= 3 ± D.E. Se indican los resultados de un análisis de
ANOVA de una vía para diferencias entre estaciones del año. Letras similares
indican diferencias significativas (p<0,05) según el test de Tukey HSD.
3 46
Tabla 2. Concentraciones de clorofila (Chl a) y feopigmentos (Pheo)(mg/m ) en extractos
fitoplancton, obtenidos por trampa. Estas fueron determinadas según el método
de Lorenzen (1967) por medio de espectrofotometría UV/Visible a 665 y 750 nm en
los diferentes tiempos de exposición a los tratamientos de radiación. Los valores
son promedio n= 3 ± D.E. Se indican los resultados de un análisis de ANOVA de
una vía para diferencias entre estaciones del año. Letras similares
indicandiferencias significativas (p<0,05) según el test de Tukey HSD.
3 49
Tabla 3. Concentraciones de pigmentos fotosintéticos (mg/m ) en extractos de fitoplancton,
obtenidos por botella Niskin. Estas fueron determinadas según el método Strickland
& Parson (1972) por medio de espectrofotometría UV/Visible a 480, 510, 630, 647
y 664 nm en los diferentes tiempos de exposición a los tratamientos de radiación.
Los valores son promedio n= 3 ± D.E. Se indican los resultados de un análisis de
indican diferencias significativas (p<0,05) según el test de TukeyHSD.
3 50
Tabla 4. Concentraciones pigmentos fotosintéticos (mg/m ) en extractos de fitoplancton,
obtenidos por trampas. Estas fueron determinadas según el método de Strickland &
Parson (1972) por medio de espectrofotometría UV/Visible a 480, 510, 630, 647 y
664 nm en los diferentes tiempos de exposición a los tratamientos de radiación. Los
valores son promedio n= 3 ± D.E. Se indican los resultados de un análisis de
Tabla 5 . Tiempos de retención (min) de estándares de pigmentos fotosintéticos analizados en

53 HPLC de fase reversa, provisto columna C , se inyectó un volumen de 50 µl de
18
muestra del estándar (β-caroteno, Clorofila a y Clorofila b a concentraciones de: 5,
-1
10, 25, 50; 4, 3, 2, 1; 0,5, 1, 2,5, 5 ppm, respectivamente) a un flujo de 2,0 ml/min .
Estos fueron detectados a una longitud de onda de 350 nm con detector UV-visible,
a temperatura ambiente y con una gradiente modificada de solventes: a)
acetonitrilo metanol-buffer Tris HCL 0,1 M pH 8,0; b) metanol-acetato de etilo. n= 3.
Tabla 6. Concentraciones de pigmentos fotosintéticos (ppm) en extractos de fitoplancton, 57

obtenidos por botella Niskin. Estas fueron analizadas con HPLC fase reversa
detectadosa una longitud de onda de 450 nm con un detector UV/visible, a
temperatura ambiente y con una gradiente modificada de solventes: a)
acetonitrilo–metanol–buffer Tris HCL 0,1 M pH 8,0 b) metanol-acetato de etilo en
una vía para diferencias entre estaciones del año. Letras similares indican
diferencias significativas (p<0,05) según el test de Tukey HSD.
IX
Tabla 7. Concentraciones de pigmentos fotosintéticos (ppm) en extractos de fitoplancton, 58

obtenidos por trampas. Estas fueron analizadas con HPLC fase reversa
detectados a una longitud de onda de 450 nm con un detector UV/visible, a
temperatura ambiente y con una gradiente modificada de solventes: a)
acetonitrilo- metanol - buffer Tris HCL 0,1 M pH 8,0 b) metanol–acetato de etilo en
una vía para diferencias entre estaciones del año. Letras similares indican
Tabla 8a. Concentraciones de clorofilas y feopigmentos (mg/gPS) en extractos de macroalga 63

Ulva sp. tratadas con radiación UV-B y PAR, en el mes de Agosto. Estas fueron
determinadas según el método de Lorenzen (1967) por medio de
espectrofotometría UV/Visible a 665 y 750 nm en los diferentes tiempos de
exposición a los tratamientos de radiación. Los valores son promedio n= 3 ± D.E.
Se indican los resultados de un análisis de ANOVA de 2 Vías. Letras similares
Tabla 8b. Concentraciones de clorofilas y feopigmentos (mg/gPS) en extractos de macroalga 64

Ulva sp. tratadas con radiación UV-B y PAR, en el mes de Octubre. Estas fueron
determinadas según el método de Lorenzen (1967) por medio de
Tabla 9a. Concentraciones de clorofilas y feopigmentos (mg/gPS) en extractos de macroalga 65

Gracilaria chilensis tratadas con radiación UV-B y PAR, en el mes de Agosto.
Estas fueron determinadas según el método de Lorenzen (1967) por medio de
Tabla 9b. Concentraciones de clorofilas y feopigmentos (mg/gPS) en extractos de macroalga 66

Gracilaria chilensis tratadas con radiación UV-B y PAR, en el mes de Octubre.
Estas fueron determinadas según el método de Lorenzen (1967) por medio de
exposición a los tratamientos de radiación. Los valores son promedio n= 3 ±
D.E. Se indican los resultados de un análisis de ANOVA de 2 Vías. Letras
similares indican diferencias significativas (p<0,05) según el test de Tukey HSD.
Tabla 10a. Concentraciones de pigmentos fotosintéticos (mg/L) en extractos de macroalga Ulva 70

sp.tratada con radiación UV-B y PAR, en el mes de Agosto. Estas fueron
determinadas según el método Strickland & Parson (1972) por medio de
espectrofotometría UV/Visible a 480, 510, 630, 647 y 664 nm en los diferentes
tiempos de exposición a los tratamientos de radiación. Los valores son
promedio n = 3 ± D.E. Se indican los resultados de un análisis de ANOVA de 2
Vías. Letras similares indican diferencias significativas (p<0,05) según el test de
Tukey HSD.
Tabla 10b. Concentraciones de pigmentos fotosintéticos (mg/L) en extractos de macroalga 71

Ulva sp. tratada con radiación UV-B y PAR, en el mes de Octubre. Estas fueron
determinadas según el método Strickland & Parson (1972) por medio de
X
espectrofotometría UV/Visible a 480,510, 630,647 y 664 nm en los diferentes

tiempos de exposición a los tratamientos de radiación. Los valores son promedio n
= 3 ± D.E. Se indican los resultados de un análisis de ANOVA de 2 Vías. Letras
Tabla 11a. Concentraciones de pigmentos fotosintéticos (mg/L) en extractos de macroalga 72

Gracilaria chilensis tratada con radiación UV-B y PAR, en el mes de Agosto. Estas
fueron determinadas según el método Strickland & Parson (1972) por medio de
espectrofotometría UV/Visible a 480, 510, 630, 647 y 664 nm en los diferentes
tiempos de exposición a los tratamientos de radiación. Los valores son promedio
n= 3 ± D.E. Se indican los resultados de un análisis de ANOVA de 2 Vías.
Letras similares indican diferencias significativas (p<0,05) según el test de
Tukey HSD.
Tabla 11b. Concentraciones de pigmentos fotosintéticos (mg/L) en extractos de macroalga

73 Gracilaria chilensis tratada con radiación UV-B y PAR, en el mes de Octubre.
Estas fueron determinadas según el método Strickland & Parson (1972) por medio
de espectrofotometría UV/Visible a 480, 510, 630, 647 y 664 nm en los diferentes
tiempos de exposición a los tratamientos de radiación. Los valores son promedio n=
3 ±D.E. .Se indican los resultados de un análisis de ANOVA de 2 Vías. Letras
Tabla 12a. Determnación de la concentración de ficoeritrina (mg/gPS) por el método de Beer & 77
Eschel (1985), en extractos de macroalga Gracilaria chilensis, tratadas con
radiación UV-B y PAR, en el mes de Agosto, por medio de espectrofotometría
UV/Visible a 455, 564 y 592 nm en los diferentes tiempos de exposición a los
tratamientos de radiación. Los valores son promedio n= 3 ± D.E. Se indican los
resultados de un análisis de ANOVA de 2 Vías. Letras similares indican diferencias
significativas (p<0,05) según el test de Tukey HSD.
Tabla 12b. Determinación de la concentración de ficoeritrina (mg/gPS) por el método de Beer & 78
Eschel (1985), en extractos de macroalga Gracilaria chilensis, tratadas con
radiación UV-B y PAR, en el mes de Octubre, por medio de espectrofotometría
UV/Visible a 455, 564 y 592 nm en los diferentes tiempos de exposición a los
tratamientos de radiación. Los valores son promedio n= 3 ± D.E. Se indican los
Tabla 13a. Concentraciones de pigmentos fotosintéticos (mg/gPS) en extractos de macroalga 81

Ulva sp. tratadas con radiación UV-B y PAR, en el mes de a Agosto. Estas
fueron analizadas con HPLC fase reversa detectados a una longitud de onda de
450 nm con un detector UV/visible, a temperatura ambiente y con una gradiente
modificada de solventes: a) acetonitrilo- metanol–buffer Tris HCL 0,1 M pH 8,0 b)
metanol - acetato de etilo. Los valores son promedio n= 3 ± D.E. Se indican los
resultados de un análisis de ANOVA de 2 Vías. Letras similares indican
Tabla 13b. Concentraciones de pigmentos fotosintéticos (mg/gPS) en extractos de macroalga 82

Ulva sp. tratadas con radiación UV-B y PAR, en el mes de Octubre. Estas fueron
analizadas con HPLC fase reversa detectados a una longitud de onda de
450 nm con un detector UV/visible, a temperatura ambiente y con una gradiente
modificada de solventes: a) acetonitrilo–metanol-buffer Tris HCL 0,1 M pH 8,0 b)
metanol–acetato de etilo. Los valores son promedio n= 3 ± D.E. Se indican los
XI
Tabla 14a. Concentraciones de pigmentos fotosintéticos (mg/gPS) en extractos de macroalga 83

Gracilaria chilensis tratadas con radiación UV-B y PAR, en el mes de Agosto.
Estas fueron analizadas con HPLC fase reversa detectados a una longitud de onda
de 450 nm con un detector UV/Visible, a temperatura ambiente y con una gradiente
modificada de solventes: a) acetonitrilo-metanol-buffer Tris HCL 0,1 M pH 8,0 b)
metanol-acetato de etilo. Los valores son promedio n= 3 ± D.E. Se indican los
resultados de análisis de ANOVA de 2 Vías. Letras similares indican diferencias
Tabla 14b. Concentraciones de pigmentos fotosintéticos (mg/gPS) en extractos de macroalga 84

Gracilaria chilensis tratadas con radiación UV-B y PAR, en el mes de Octubre.
Estas fueron analizadas con HPLC fase reversa detectados a una longitud de onda
de 450nm con un detector UV-visible, a temperatura ambiente y con una gradiente
modificada de solventes: a) acetonitrilo-metanol-buffer Tris HCL 0,1 M pH 8,0 b)
metanol-acetato de etilo. Los valores son promedio n=3 ± D.E. Se indican los
Tabla 15a. Efecto de la radiación UV el rendimiento cuántico máximo (Fv/Fm) medidas en 90

extractos de macroalga Ulva sp. y Gracilaria chilensis. Las determinaciones fueron
realizadas mediante exposición a tratamientos de radiación a distintos tiempos,
en el mes de Agosto. Los valores son promedio n= 3 ± D.E. Se indican los
Tabla 15b. Efecto de la radiación UV el rendimiento cuántico máximo (Fv/Fm) medidas en 91

extractos de macroalga Ulva sp . y Gracilaria chilensis. Las determinaciones
fueron realizadas mediante exposición a tratamientos de radiación a distintos
tiempos, en el mes de Octubre. Los valores son promedio n= 3 ± D.E. Se indican
los resultados de un análisis de ANOVA de 2 Vías. Letras similares indican
Tabla 16a. Efecto de la radiación UV en la tasa de transporte de electrones (ETR) medidas 94

en extractos de macroalga Ulva sp. y Gracilaria chilensis. Las determinaciones
tiempos, en el mes de Agosto. Los valores son promedio n= 3. Se indican los
resultados de un análisis de ANOVA de 2 Vías.
Tabla 16a. Efecto de la radiación UV en la tasa de transporte de electrones (ETR) medidas 94

en extractos de macroalga Ulva sp. y Gracilaria chilensis. Las determinaciones
tiempos, en el mes de Agosto. Los valores son promedio n= 3. Se indican los
resultados de un análisis de ANOVA de 2 Vías.
XII
LISTA DE ABREVIATURAS
A Absorptancia
Abs Absorbancia
ACN Acetonitrilo
β-carot. β-caroteno
AP Aloficocianina
Chl a Clorofila a
Chl b Clorofila b
Chl c Clorofila c
Chls Clorofilas
COD Carbono orgánico disuelto
D Día
D.E Desviación estándar
ETR Tasa de transporte de electrones
Fm Fluorescencia máxima o potencial de una planta adaptada a oscuridad
Fo Fluorescencia mínima o inicial
Fv Fluorescencia variable
Fv/Fm Eficiencia fotoquímica máxima del PSII
g Gramo
HCL Ácido clorhídrico
HPLC “High Performance Liquid Chromatography”, Cromatografía
Líquida de Alta Resolución
h Horas
Kd Coeficiente de atenuación
mAU Mili unidades de absorbancia
2
m Metro cuadrado
min Minuto
mg Miligramo
mm Milímetro
nm Nanómetro
PAM Flurímetro de amplitud de pulso modulada
XIII
PAR Radiación fotosintéticamente activa

PBP Ficobiliproteínas
PC Ficocianina
PE Ficoeritrina
Pheo Feopigmentos
PBS Ficobilisoma
Ppm Partes por millón
PSI Fotosistema I
PSII Fotosistema II
ΦPSII Rendimiento cuántico efectivo del PSII
PS Peso Seco
RP-HPLC Cromatografía Líquida de Alta Resolución con fase reversa
R-PE R-Ficoeritrina
SM Sin muestra
T° Temperatura
µl Microlitros
µm Micras
UV Radiación ultravioleta
UV-A Ultravioleta A
UV-B Ultravioleta B
UV-C Ultravioleta C
1
1.- RESUMEN
Las principales fuentes de pigmentos presentes en la columna de agua incluyen al

fitoplancton y el aporte de comunidades de algas bentónicas, bacterias fototróficas y
plantas acuáticas o macrofitas. Estos pigmentos son degradados tanto en la columna de
agua como en su posterior depositación en el sedimento.
El presente estudio tiene por finalidad realizar una aproximación experimental para
detectar cambios en la composición pigmentaria a lo largo de la columna de agua, en una
plataforma submareal de la zona de Puerto Montt (Coihuín). La variabilidad espacial y
temporal se estudió para poder reconocer algunos factores ambientales involucrados en
sus fluctuaciones. Otro aspecto principal fue determinar si la radiación UV-B afecta las
fuentes de pigmentos en el sistema. Paralelamente se llevó a cabo la medición de la
fotosíntesis in vivo basada en la determinación de la fluorescencia de clorofila del
fotosistema II (PSII), mediante pulsos de amplitud modulada (PAM), siendo medidos el
rendimiento cuántico máximo (Fv/Fm) y la tasa de transporte de electrones (ETR). Ambos
tipos de determinaciones fisiológicas fueron llevadas a cabo en macroalgas previamente
expuestas a distintas combinaciones de radiación UV-B, UV-A y visible (PAR) usando
lámparas en el laboratorio. En la concentración de los pigmentos fotosintéticos se
determinó clorofilas (a y b), carotenoides (β-caroteno) presentes en las macroalgas Ulva
sp. y Gracilaria chilensis y fitoplancton mediante estudios espectrofotométricos y
Cromatografía Líquida de Alta Resolución (HPLC) de Fase Reversa.
En las muestras de fitoplancton las concentraciones de los pigmentos fotosintéticos,
clorofila a, b y β-caroteno, variaron en relación con la profundidad y la estacionalidad,
observandose los mayores valores (1,80; 0,94; 12,39 ppm) respectivamente en la capa
superficial de la columna en los meses de primavera, disminuyendo hacia el invierno (1,17;
0,22; 4,13 ppm). Por otra parte, a una mayor profundidad se presentaron niveles más altos
de concentración (1,07; 0,16; 2,05 ppm) en invierno y una disminución en primavera
(0,358; 0,163; 4,563 ppm). Se observó una clara estratificación en algunos meses del año,
posiblemente debido a la variación de la termoclina, lo que pudo afectar directamente la
distribución de los pigmentos en las masas de agua.
2
En el caso de las macroalgas Ulva sp. y Gracilaria chilensis y los efectos de

radiación UV, se observó en la medición de ambos parámetros fisiológicos Fv/Fm (27,1 %;
35,7 %) y ETR (46,3 %; 54,4 %) una disminución a mayor tiempo de exposición. Esta
disminución podría estar indicando efectos asociados a fotoinhibición crónica, un
fenómeno que exhiben las macroalgas en respuesta a un exceso de radiación. En cuanto
a los pigmentos fotosintéticos analizados, las concentraciones de clorofila a y b
disminuyeron en relación con la exposición a la radiación UV, lo cual podría estar
relacionando con una foto-oxidación de la clorofila o una disminución en su biosíntesis,
afectando en mayor proporción a la concentración de la clorofila b respecto de la clorofila
a. En el caso del β-caroteno se observó un aumento en su concentración, surgiendo la
síntesis de este pigmento como un mecanismo de protección en respuesta al exceso de
radiación UV-B.
3
1.1.- SUMMARY
The principal source of pigments present in the water column includes

phytoplankton and the contribution of communities of benthic seaweeds, phototrofic
bacteria and aquatic plants or macrophytes. These pigments are degraded both in the
water column and in the sediment after deposition.
The goal of the present study was to experimentally detect changes in pigment
composition in the water column of a subtidal platform near Puerto Montt (Coihuín). The
spatial and temporal variability of photosynthetic pigments was assessed in order to
identify some environmental factors involved in such fluctuations. Another main aspect was
to determine whether the UV-B radiation affects the levels of pigments. In parallel, alive in
measurements of fluorescence of PSII-chlorophyll a, by means of a pulse amplitude
modulation fluorometer (PAM), were performed. Here, the maximum quantum yield (Fv/Fm)
and the electron transport rate (ETR) were especially determined. Both types of
physiological determinations were carried out in macroalgae previously exposed to a
combination of UV-B, UV-A and PAR lamps in the laboratory. The concentration of
photosynthetic pigments chlorophylls (a and b), carotenoids (β-carotene) present in the
macroalgae Ulva sp. and Gracilaria chilensis and phytoplankton were determined using
both Spectrophotometry and Reverse Phase High Perfomace Liquid Chromatograpy RP-
HPLC).
In phytoplankton, the concentrations of photosynthetic pigments, chlorophyl a, b and
β-carotene, varied in relation to depth and seasonality, with highest values found in
surface layers (1.80; 0.94; 12.39 ppm) of the column during spring months, decreasing
toward winter (1.17; 0.22; 4.13 ppm). On the other hand, higher concentrations were
observed deep (1.07; 0.16; 2.05 ppm) in winter and decreasing in spring (0,358; 0,163;
4,563 ppm). An obvious stratification in some months of the year was observed, possibly
due to variations in the thermocline that could affect the distribution of pigments in the
water column.
With regards to the macroalgae Ulva sp. and Gracilaria chilensis and the radiation
effects UV, the measurements of both physiological parameters Fv/Fm (21, 7 %; 35, 7 %)
and ETR, indicated a decrease (46, 3 %; 54, 4 %) in relation with the exposure time. This
4
decrease could be associated to a chronic fotoinhibition, a phenomenon exhibited by plants

in response to excess solar radiation. In the case of pigments examined, concentrations of
Chl to and Chl b decreased with exposure to UV radiation, which may be related to
oxidation of chlorophyl or effects on its biosynthesis. This situation affected more strongly
chlorophyl b than chlorophyl a. In the case of the β-carotene, an increase in the
concentration was detected, which could be indicative of a mechanism of photoprotection
in response to the excess of UV B radiation.
5
2.- INTRODUCCIÓN
2.1. Aspectos generales de los pigmentos fotosintéticos
Los pigmentos fotosintéticos son moléculas con una gran capacidad de absorber de
la energía de los fotones y posibilitan la fotosíntesis. Estos pigmentos se organizan en
estructuras captadoras de luz denominadas antenas, constituidos por pigmentos unidos a
proteínas, las cuales están rodeando a los centros de reacción clorofila a (chl a) cuya
función es transformar la energía fotónica en electroquímica. En relación a la clorofila a,
existen dos tipos según se trate de organismos fotosintéticos procariotas o eucariotas,
bacterioclorofila a y clorofila a respectivamente y además están acompañados de otros
pigmentos accesorios, cuya función es ampliar el espectro de absorción de los pigmentos
primarios y además, en el caso de algunos tipos y en ciertas circunstancias, pueden servir
como protección frente a la luz excesiva (Barceló, 2001)
Los pigmentos presentes en organismos del fitoplancton incluyen numerosos
grupos de compuestos con diversas características físicas y químicas. Fundamentalmente,
los pigmentos de las plantas se dividen en 3 grupos: clorofilas (a, b, c1, c2, c3),
carotenoides (carotenos y sus derivados oxigenados conocidos como xantofilas), y
ficobiliproteínas (aloficocianinas, ficocianinas, ficoeritrinas) son esenciales para la
fotosíntesis. Estos compuestos poseen distintas características, una de las más
importantes es la capacidad de absorber luz a distintas longitudes de onda, ya que de
esto depende el rango efectivo de acción del pigmento. Por ejemplo las clorofilas absorben
en el rango de 430-450 nm y 600-690 nm, los carotenoides entre 400-500 nm y las
ficobiliproteínas absorben entre 450-550 nm para la ficoeritrina y 500-640 nm para la
ficocianina, estando presentes en células de todos los organismos autotróficos
(procariontes y eucariontes), y localizándose en las membranas tilacoidales (Fogg et al.
1973; Strasburger, 1994; Barceló, 2001). Como se ha mencionado anteriormente la
función primordial de la clorofila es la de absorber energía lumínica, formando parte
fundamental de la maquinaria captadora de luz en los tilacoides y además en el caso
especifico de la clorofila a, además forma parte del centro de reacción que inicia, por
diferencia de carga por la llegada del “exciton”, reacciones Redox que darán origen al
6
transporte de electrones necesarios para llevar los electrones excitados por los fotones
absorbidos hasta sus finales aceptores, las moléculas de NADP oxidado que pasarán a
NADPH reducido.
Los pigmentos fotosintéticos se encuentran agrupados en sistemas funcionales
denominados fotosistemas. Cada fotosistema consiste, en promedio, de unas 200
moléculas de clorofila y unas 50 moléculas de carotenoides. De todas estas moléculas
solo unas pocas, mayoritariamente clorofilas, asociadas con el centro de reacción son
capaces de transducir la energía luminosa en energía electroquímica. El resto de
pigmentos, también mayoritariamente clorofilas, actúan como captadores de la luz y se
denominan moléculas antena. La luz es absorbida por las moléculas antena y se va
transfiriendo por resonancia hasta que alcanzan el centro de reacción. Esta transferencia
se realiza con una altísima eficacia (Strasburger, 1994; Barceló, 2001).
En algas y plantas superiores existen dos tipos de fotosistemas, cada uno con su
centro de reacción y su grupo de moléculas antena: el PSI, cuya molécula activa del
centro de reacción, un dímero de clorofila a especializada, tiene un máximo de absorción a
700 nm (P700) y el PSII, cuya molécula activa del centro de reacción, probablemente una
molécula de clorofila a especializada, tiene un máximo a 680nm (P680) (Strasburger, 1994).
2.1.1. Estructuras de los pigmentos fotosintéticos:
2.1.1.1. Clorofilas
Estos pigmentos que se ubican en las membranas tilacoidales, su color verde se

debe a que absorben todas las longitudes de onda de la luz visible excepto el verde-
amarillo (fenómeno conocido tambien como “ventana verde”), el cual es reflejado y
percibido por nuestros ojos. Están conformadas por estructuras policíclicas planas
estables, formados por cuatro anillos pirrólicos cíclicos con un anillo de ciclopentanona
fusionado al pirrol III, donde los cuatro átomos de nitrógeno que poseen estos cuatro
+2
anillos están asociados a un átomo de Mg . Además, poseen una cadena terpenoide
constituida por el alcohol fitol, esterificado en el cuarto anillo. Este alcohol de 20 átomos de
carbono con un doble enlace (C H OH) confiere a la molécula la característica de ser
20 39
7
altamente hidrofóbica (Fig. 1 A) y que le otorga la propiedad de unirse a los dominios

apolares de las proteínas que anclan el sistema a la membrana tilacoidal. En los
A B
Figura 1: (A) Estructura molecular y (B) espectro de absorción de la molécula

de clorofila. Figura extraída y modificada de Strasburger, 1994.
cloroplastos se encuentran tanto clorofila a como b. Si bien las dos son verdes, varían
en el grupo unido al anillo pirrólico II, la clorofila a presenta un grupo metilo (-CH ),
3
mientras que la clorofila b presenta un grupo formilo (-CHO). Sus espectros de absorción
son suficientemente diferentes como para permitir que los dos pigmentos complementen
sus rangos de absorción en la región visible. La mayoría de las plantas contienen el doble
de clorofila a que clorofila b (Stryer, 2002). La gran eficiencia que presentan estas
moléculas como fotorreceptores se debe a la presencia alternante de enlaces simples y
dobles en su estructura (Andreo, 1984). Las clorofilas difieren en sus espectros de
absorción ya que absorben la luz en dos regiones del espectro, cerca de los 400 nm y
desde los 600 nm, variando y dependiendo un poco de los diferentes estados de
agregación de las moléculas de clorofila o a las proteínas a las cuales estén asociadas
(Fig. 1 B).
8
2.1.1.2. Carotenoides:
En algas y plantas los carotenoides se encuentran ubicados en los tilacoides de los

cloroplastos. Son pigmentos accesorios en la fotosíntesis, captando energía luminosa en
regiones del espectro donde la clorofila no absorbe eficientemente, además protegen de la
luz intensa que puede dañar la clorofila e inactiva las especies reactivas de oxígeno o
directamente el estado triplete de la clorofila (Stryer, 2002).
Figura 2: (A) Estructura molecular y (B) espectro de absorción de la molécula de

carotenoides. Figura extraída y modificada de Strasburger, 1994.
Los carotenoides o carotenos son terpenoides constituidos por largas cadenas

poliisoprenoides, presentando dobles enlaces conjugados que poseen en ambos extremos
anillos de ciclohexano sustituidos. Debido a la presencia de éstas características son
fuertes cromóforos. Cada cromóforo es responsable del espectro de absorción
característico y del color de la molécula (Britton & Goodwin 1971; Andreo, 1984; Stryer,
2002). En la larga cadena de hidrocarburos (Fig. 2 A), proporciona a estos compuestos la
9
propiedad de ser insolubles en agua, pero sí solubles en solventes grasos. Se dividen en

carotenos que son hidrocarburos insaturados y en xantofilas que son derivados
oxigenados de los anteriores. El cuerpo básico de los carotenos esta formado por 40
átomos de carbono consistente en 8 unidades de isoprenos. Estas unidades poseen una
estructura central en forma de cadena con 14 átomos de carbono y 7 enlaces dobles
conjugados además de 4 grupos metilo en forma de cadenas laterales. La cadena central
lleva en uno o en los dos extremos un agrupamiento en forma de anillo, además, poseen
máximos de absorbancia a longitudes de onda distintas de las clorofilas. Absorben en la
gama de 400-500 nm y actúan como moléculas receptoras de luz suplementarias en
regiones del espectro en que las clorofilas no tienen absorción, aumentando de esa
manera la eficiencia con que las células fotosintetizadoras aceptan la luz (Fig. 2 B).
2.1.1.3. Ficobiliproteínas:
La ficocianina (azul) y la ficoeritrina (roja) se encuentran presentes en distintas

proporciones en las cianobacterias, las rodofíceas y los criptófitos enmascarando a la
clorofila (Strasburger, 1994). Son proteínas fluorescentes que contienen grupos
tetrapirrólicos covalentemente unidos a la apoproteína (Glauser, et al., 1992; MacColl,
1998). En cianobacterias y rodofíceas las biliproteinas se encuentran situadas, en forma
de gránulos, ficobilisoma, de unos 40 nm, en la superficie del tilacoide, del lado del
citoplasma o del estroma (Strasburger, 1994), cuya principal función es la captación y
conducción de luz hasta los centros de reacción fotosintéticos (Glazer, 1989). Las
ficobiliproteínas se encuentran en el ficobilisoma de acuerdo a sus propiedades de emisión
y absorción para lograr una eficiencia cercana al 100% en la conducción de luz (MacColl,
1998). En una misma especie suelen estar presentes los dos tipos de ficobiliproteínas,
aunque, en general, predomina una de ellas (Barceló, 2001). La aloficocianina y las
ficocianinas A, B, C o R se encuentran en todas las cianobacterias y rodofíceas. La
ficoeritrina R o B es el pigmento principal de las Rodocífeas. El cuerpo básico de estas
moléculas consiste en cuatro anillos de pirrol unidos entre si por puentes de metilo, pero
en este caso no forman un anillo cerrado como en la clorofila, por lo tanto no hay un átomo
metálico en posición central. Los anillos de pirrol llevan en los carbonos 1 y 8 un carbón
10
por átomo de oxígeno, en 4 y 5 un resto propiónico que a través de sus grupos carboxilos
estén unidos el grupo cromóforo a la proteína por medio de enlaces peptídicos (Fig. 3 A).
Los anillos de pirrol y los puentes de metilo forman un sistema de dobles enlaces
conjugados entre átomos de carbono y de nitrógeno.
Figura 3: (A) Estructura molecular y (B) espectro de absorción de la molécula de ficobilina.

Figura extraída y modificada de Strasburger, 1994.
Esta configuración es la responsable del color de estos pigmentos. Absorben

intensamente zona variables de entre 480 a 670 nm. La ficocianina tiene su máximo de
absorción en los 618 nm, en el caso de la ficoeritrina entre 540 y 570 nm, captando así
longitudes de onda poco utilizadas por las clorofilas (Fig. 3 B). Su color intenso puede
enmascarar el verde de las clorofilas (Barceló, 2001).
11
Debido a la presencia de ficobiliproteínas, las algas verde-azules y rojas están

capacitadas para cubrir con su absorción una parte del espectro de la radiación visible en
que la absorción de la clorofila es débil (Strasburger, 1994).
2.2. Pigmentos fotosintéticos en la columna de agua
Las principales fuentes de pigmentos presentes en la columna de agua incluyen al

fitoplancton y el aporte de comunidades de algas bentónicas (Carpenter et al., 1986;
Steinman et al., 1998), bacterias fototróficas (Yacobi et al., 1990; Hurley & Garrison, 1993;
Overmann et al., 1993) y plantas acuáticas o macrofitas (Bianchi et al., 1993).
Además el agua y los sedimentos contienen pigmentos asociados al material detrital
que puede encontrarse temporalmente suspendido, transportado al ambiente terrestre o a
depositarse en el fondo (Carpenter et al., 1988; Leavitt & Carpenter, 1989; Winfree et al.,
1997). En todos los casos, los pigmentos se degradan tanto en la columna de agua como
en su posterior depositación en el sedimento (Hurley & Armstrong, 1990; Damste &
Koopmans, 1997; Hodgson et al., 1998).
Debido a que los pigmentos poseen diferentes características funcionales y de
composición en los diferentes grupos de organismos (la distribución de pigmentos
accesorios en los grupos de las algas son únicos) (Rowan, 1989; Wright et al., 1991,
Bianchi et al., 1997; Schluter & Havskum 1997), ellos han sido usados como
biomarcadores debido a su precisión taxonómica (Jeffrey et al., 1997) y también tienen el
potencial de representar la producción primaria potencial de la comunidad fototrófica
entera. Por lo tanto, la clorofila y carotenoides, pueden ser utilizados taxonómicamente en
la identificación directa de clases de fitoplancton, su biomasa, condición y etapa del
desarrollo comunitario (Wright & Enden 2000; Mackey et al., 2002). El conocimiento de
concentraciones de pigmentos fotosintéticos y fotoprotectores facilita la determinación de
las propiedades de absorción de fitoplancton (Wozniak et al., 2000) y la tasa de
fotosíntesis en aguas naturales (MacIntyre et al., 2000).
En la actualidad se han encontrado más de 30 formas de clorofilas activas en la
fotosíntesis y alrededor 600 carotenoides en cianobacterias, algas y hongos (Liaaen -
Jensen & Andrewes, 1985). En el caso del fitoplancton, actualmente más de 50 pigmentos
12
y sus productos de degradación pueden ser separados en un solo análisis (Wright et al.,
1991; Wright & Jeffrey, 1997).
2.2.1. Dinámica espacial y temporal de los pigmentos
La variabilidad espacio-temporal del fitoplancton está determinada por un gran

número de variables, entre las que se destacan las características geomorfométricas del
área (conformación geográfica y tamaño), circulación y características químicas y físicas
de las masas de aguas, ejemplo la luz y la temperatura (Wood, 1967). Debido a la acción
de los vientos y las corrientes, existe un dinámica espacial en la columna de agua que
dependerá de diferentes características locales ya sea hidrológicas como orográficas. En
sistemas de surgencia o en costas con gran dinámica, existe un transporte de nutrientes
desde zonas profundas hacia la zona eufótica que tiene consecuencias en la composición
de la comunidad fitoplancton (Ahel et al., 1996; Obayashi et al., 2001; Vidussi et al., 2001).
Estos cambios y patrones en la composición del fitoplancton pueden ser detectados y
evaluados mediante la determinación de los pigmentos fotosintéticos.
En general, sólo una fracción de la producción fototrófica de la columna de agua
finalmente termina en la superficie de sedimento. La degradación más extensa de
pigmentos ocurre durante su paso por la columna de agua y en el sedimento superficial
sobre todo si la luz y el oxígeno están disponibles (Leavitt 1993; Cuddington & Leavitt,
1999). Debido a la alta tasa de degradación de los pigmentos en la columna de agua, la
velocidad de hundimiento es de gran importancia en la fracción de pigmentos. Por
ejemplo, las diferencias en la velocidad de hundimiento entre diferentes grupos de algas
puede afectar la composición de pigmentos en la columna de agua y como consecuencia
en el sedimento. Varios mecanismos pueden acelerar la sedimentación: la agregación y
coagulación, que aumentan con la biomasa, pueden segregar diferentes velocidades de
hundimiento dependiendo del tamaño de las partículas (Kiørboe et al., 1994). Por otro
lado, los pigmentos pueden ser modificados por acción del zooplancton herbívoro; Por
degradación durante el paso por el tracto digestivo (Cuddington & Leavitt, 1999). Por otro
lado el transporte de los pigmentos hacia el fondo se ve favorecido al ir formando parte de
13
los pellet fecales, los cuales además ayudan a la preservación de los pigmentos
retardando la degradación bacteriana en la columna de agua (Leavitt, 1993).
La estacionalidad es otro factor que puede inducir cambios en la composición de los
pigmentos en la columna de agua, así como las tasas de transporte y depositación final en
el sedimento La dinámica estacional del fitoplancton en regiones temperadas,
básicamente esta determinada por la condición de la mezcla o estratificación que presenta
la columna de agua, la que puede determinar las variables de temperatura y salinidad.
Raymont (1980) y Neshba (1987) detectaron una disminución de las poblaciones
fitoplanctónicas en invierno debido a intensificación de la mezcla vertical y a los bajos
valores de irradiancia y menor penetración de PAR en la columna de agua. Hacia el final
del invierno aumentaría la estratificación debido al calentamiento superficial de las aguas,
la que junto al aumento de la intensidad luminosa provocaría el florecimiento primaveral de
las microalgas, el cual dependería de la concentración de los nutrientes. Verticalmente
estas mismas condiciones hidrográficas afectarían la distribución del fitoplancton.
2.2.2. Técnicas para la determinación de pigmentos fotosintéticos
La cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) es una herramienta poderosa

para investigar la composición pigmentaria del fitoplancton (Mackey et al., 1996; Jeffrey et
al., 1997). Esta técnica es una de las más usadas en los últimos años debido a su
sensibilidad, fácil aplicabilidad en determinaciones cuantitativas exactas, a su idoneidad
para la separación de especies no volátiles o termolábiles y por su uso en la determinación
de sustancias de interés en la industria e investigación (Skoog & Leary, 2001). Esta
técnica permite una rápida determinación de carotenoides, clorofilas y sus derivados en
ecosistemas acuáticos (Jeffrey et al., 1999), y su utilización para estudiar sedimentos lleva
más de 50 años (Fox ,1944; Fox et al., 1944; Vallentyne, 1954, 1956). A menudo las
concentraciones de carotenoides y clorofilas son cuantificadas por RP-HPLC (Fase
Reversa),que se basa en el principio de separar los distintos pigmentos en base a su
polaridad. La idea de emplear el RP-HPLC en estudios ambientales fue introducida por
Mantoura & Llewellyn, (1983) ha sido desarrollada por muchos investigadores (Bidigare et
14
al., 1985; Wright et al., 1991; Wright & Jeffrey, 1997; Heukelem & Thomas, 2001; Brotas &
Plante-Cuny, 2003; Ston & Kosakowska, 2000; Ston & Kosakowska, 2002).
2.3. El efecto de la radiación solar sobre los pigmentos fotosintéticos
2.3.1. El espectro de radiación solar incidente
Dentro del espectro de radiación solar de importancia biológica en procesos

fotobiológicos podemos indentificar tres fracciones: la radiación ultravioleta (UV)
correspondiente al 10 % de la radiación incidente, la radiación fotosintéticamente activa
(PAR) que comprende longitudes de onda entre 400 y 700 nanómetros (nm) equivale al 40
% y la radiación infrarroja (entre 700-3000 nm) equivalente al 50%. La radiación UV
podemos dividirla en: radiación UV-C (< 280 nm), la radiación UV-B, entre 280 - 315 nm, y
la radiación UV-A, entre 315 - 400 nm (Holm-Hansen et al., 1993).
La radiación UV-A es débilmente absorbida por el ozono estratosférico, alcanza la
superficie terrestre y ocasiona en las plantas diferentes reacciones fotoquímicas (Caldwell
1978; Björn 1999). Mantiene relativamente constante su nivel, no siendo afectada
mayormente por factores latitudinales, altitudinales o estacionales (Greenberg et al.,
1997), presentado efectos similares a la radiación UV-B pero en dosis unas 1000 veces
superior, por lo que proporcionalmente resulta menos perjudicial. La radiación UV-B es
absorbida parcialmente por el ozono estratosférico llegando muy atenuada a la superficie
terrestre, variando según altitud, latitud, ángulo de incidencia del sol y reflectancia solar de
la atmósfera que varía con la presencia de diferentes partículas que provocan su
absorción (Farman et al., 1985; Lissy & Sanhueza, 1996; Herman & McKenzie, 1998). Es
llamada también Radiación Ultravioleta Biológica ya que es capaz de provocar daños
letales en los organismos vegetales, siendo muy peligrosa para la vida en general.
Representa sólo el 5% de la radiación UV y el 0.25% de toda la radiación solar, que llega
a la superficie de la terrestre, sin embargo tiene alta energía por fotón. Finalmente la
radiación UV-C, es altamente energética y extremadamente dañina para todos los seres
vivos y en presencia de la cual no sería posible la vida en la Tierra, es totalmente
15
absorbida por el oxígeno molecular y parcialmente por el ozono atmosférico, de modo que
en ningún caso alcanza la superficie terrestre (Madronich, 1992).
La Radiación Fotosintéticamente Activa (conocida por su sigla en inglés PAR)
representa la proporción predominante de la radiación solar incidente en la superficie
terrestre, y es fundamental para la fotosíntesis. En exceso, la fracción PAR puede afectar
a las plantas, las cuales responden a través de diversos mecanismos de fotoprotección,
por ejemplo, la fotoinhibición dinámica.
2.3.2. Penetración de la radiación solar en la columna de agua
La radiación solar se atenúa en la columna de agua como resultado de cuatro

factores: a) el agua; b) compuestos disueltos (e.g.,gelbstoff); c) materia inerte y
d) organismos fotosintéticos (material particulado). Por lo tanto, el agua constituye un filtro
natural que absorbe la radiación solar en forma diferencial y el coeficiente de absorción
aumenta en forma significativa con longitudes de onda mayores que 550 nm (Kirk, 1994).
La atenuación de los diferentes componentes del espectro solar en la columna de agua se
puede calcular globalmente utilizando el coeficiente de atenuación (Kd):
Kd = (Ln(Eo) - Ln(Ez)) / z (m-1)
Donde Eo y Ez es la radiación en la superficie y a la profundidad (z)

respectivamente. La turbidez y las diferentes características hidrológicas (además de
bióticas) determinan que los cuerpos de agua posean diferentes coeficientes de
atenuación de la luz. Existen diferentes clasificaciones de los tipos de agua, pero una de
las más utilizadas es la de Jerlov (Kirk, 1994). Para los organismos fotosintéticos, tiene
muchas implicancias, pues al haber una atenuación de la cantidad de luz, también existe
una atenuación en la calidad ya que las diferentes longitudes de onda del espectro PAR se
atenúan de manera diferente.
En el caso de la radiación UV-B, por mucho tiempo se consideró que la radiación
UV solo podía penetrar en los primeros centímetros de la columna de agua, sin embargo
desde los primeros trabajos de Jerlov (1950) se comprobó que esta radiación puede
16
penetrar varios metros de profundidad. De hecho ahora se sabe que la radiación de UV-B
puede alcanzar profundidades ecológicamente significativas (Smith & Baker, 1979;
Karentz & Lutze, 1990; Smith et al., 1992; Boelen et al., 1999). La composición y
características del material disuelto en el agua puede dar origen a diversos tipos de
espectros de absorción que dependen del ambiente, en general las sustancias disueltas
tienen un efecto más pronunciado para longitudes de onda cercanas al azul. En el caso
del material inorgánico particulado hay que considerar también el efecto de dispersión de
la radiación, puesto que este material particulado tiene poca absorción relativa a
longitudes altas del espectro visible, pero su absorción crece en forma significativa en la
región del ultravioleta. La absorción por parte de pigmentos fotosintéticos (clorofila,
carotenoides y ficobiliproteínas) tienen especial influencia en la radiación visible.
2.3.3. Efecto de la radiación UV-B en los ecosistemas acuáticos
Diversos estudios sugieren que la extensión del área que corresponde a la

disminución de la capa ozono esta influenciando las condiciones más allá del continente
Antártico y alcanza áreas pobladas del Hemisferio Sur (Orce & Helbling, 1997; Huovinen et
al., 2006). Por lo tanto, el aumento en el flujo de la radiación UV-B solar en la superficie
terrestre (Kerr & McElroy, 1993) ha despertado la preocupación por sus efectos dañinos
en la vida, no sólo en ecosistemas terrestres, sino también en los acuáticos, tanto
marítimos como de agua dulce (Holm-Hansen et al., 1993; Williamson ,1994; Häder et al.,
1995; Gómez & Figueroa, 1998; Villafañe et al., 2003).
La radiación solar es la mayor fuente de energía para la productividad de los
ecosistemas acuáticos (Wetzel, 1975), sin embargo, la cantidad y calidad de energía solar,
así como los nutrientes y la temperatura, son determinantes de la estructura y procesos de
esta (Vollenweider, 1968; Elser, 1990; Sterner et al., 1997). Por lo tanto, los organismos
acuáticos en su hábitat pueden ser afectados, directa o indirectamente por cambios en la
radiación UV en el medio (Zepp, 1982; Palenik et al., 1991; Arfsten et al., 1996; Scully et
al., 1997). Sin embargo, los movimientos activos o pasivos de organismos dentro de la
columna de agua causan una fluctuación de su exposición a la radiación UV. Debido a
esto en la última década se ha reconocido que existe un potencial riesgo de daños por
17
niveles altos de radiación solar, evidenciándose que la radiación biológicamente deletérea,

es decir, radiación de longitud de onda corta (UV-B, 280-320 nm), ha incrementado debido
al adelgazamiento de la capa ozono estratosférico (Cabrera et al., 1995; Madronich, 1992;
Kerr & McElroy, 1993). A pesar de que potenciales efectos de la exposición a la radiación
UV-B pueden ser muy perjudiciales para la biología de los organismos, el efecto neto de la
radiación UV en estos puede ser mitigado por diferentes mecanismos protectores y de
reparación (Karentz et al., 1991a; Mitchell & Karentz, 1993; Vincent & Roy, 1993).
Aunque los estudios realizados en organismos acuáticos son menos que los
efectuados en vegetales terrestres, se ha detectado que los aumentos en la UV-B
incidente tienen varios efectos sobre los organismos marinos: En el caso del fitoplancton
se ha determinado que elevadas dosis de UV afectan la reproducción (Häder et al., 1995)
y el crecimiento (Holm-Hansen et al., 1993; Häder et al., 1995; Klisch & Häder, 2000),
observándose cambios en el aparato fotosintético y en la concentración de pigmentos
involucrados en la recepción de luz, producción fotosintética (Helbling et al., 1992) y
metabolismo de nitrógeno y carbono (Döhler & Alt, 1989; Sinha et al., 1995). En caso de
severo estrés por efecto de radiación UV-B, puede llegar a producir daño de ADN, ARN y
muerte celular (Klisch & Häder, 2000; Häder, 2001). En cianobacterias se ha observado
una disminución en el crecimiento, desarrollo y respuestas fisiológicas (Sinha & Häder,
1997). En macroalgas la variación diaria de la radiación solar, es uno de los factores
determinantes en la variabilidad de las respuestas fotosintéticas y procesos relacionados
(Falkowski & Raven, 1997; Figueroa et al,. 1997; Bischof et al., 1998; Gómez et al., 1998).
Al ser organismos sésiles no poseen las mismas estrategias que el fitoplancton para
adaptarse a los cambios de luz. Debido a esto es usual que el exceso de luz repercuta en
el aparato fotosintético y en los diferentes procesos que involucran los mecanismos de
defensa a los excesos de energía lumínica. Es por ello que gran parte de las macroalgas
bentónicas exhiben mecanismos fotoprotectores tales como la fotoinhibición dinámica. A
escalas mayores tales efectos pueden configurar cambios en la estructura de las
comunidades de macroalgas en los sistemas acuáticos (Bischof et al., 1998; Wiencke et
al., 2000).
18
2.3.3. Efecto de la radiación UV sobre los pigmentos fotosintéticos
Aunque la radiación UV-B esta restringida a los primeros metros de la columna de

agua, su acción sobre los organismos tiene consecuencias muy importantes en términos
de la concentración y de composición de pigmentos. En consecuencia, tales efectos se
reflejaran en el perfil pigmentario a través de toda la columna de agua y en los
sedimentos. En general, por efecto de la radiación UV-B, se observa una disminución del
contenido de clorofilas y carotenoides en plantas (Ormrod & Hale, 1995). La alta
irradiación de UV-B combinada con un bajo nivel de PAR provoca reducción significativa
en los contenidos de clorofila, posiblemente, debido a la foto-oxidación de la clorofila por
acción de la radiación UV-B o a la inhibición de su biosíntesis. Además, se ha reportado
aumento en la relación clorofila a/b, debido a que la radiación UV-B afecta mayormente a
la clorofila b (Kulandaivelu et al., 1996).
En el caso de los carotenoides, se han reportaron incrementos en su contenido de
algunas especies vegetales por efecto del aumento de radiación UV-B, donde actúan
como filtro natural UV-B evitando el fotoblanqueamiento de la clorofila, y como
antioxidante inactivando posibles radicales libres generados por acción del UV-B
(Greenberg et al.,1997; Gotz et al., 1999). Los carotenoides, con respecto a las clorofilas,
son menos afectados por la radiación UV-B, lo que se explicaría por su rol fotoprotector en
el aparato fotosintético (Kulandaivelu et al., 1996).
2.4. Comunidades de algas
2.4.1. Fitoplancton
El fitoplancton se encuentra constituido por un conjunto de organismos

microscópicos, unicelulares en su mayoría y fotosintéticos, caracterizados por su baja
capacidad de movimiento, aunque algunas poseen cierto poder de locomoción,
desplazándose mediante flagelos y otros mecanismos. En general, estos organismos son
transportadas en forma pasiva por el movimiento de las masas de agua (Alvial & Avaria,
1981, 1982; Muñoz & Alvial, 1986a) siendo distribuidos ampliamente en aguas oceánicas,
19
costeras, estuarinas y lacustres. Estas microalgas se concentran, principalmente en la

parte superior de la columna de agua (zona fótica), donde se favorecen los procesos de
fotosíntesis y se constituye en la puerta de entrada de la energía solar a los ecosistemas
marinos (Margalef, 1958). Debido a los procesos adaptativos convergentes al medio físico
altamente estable y heterogéneo en el que habitan estas microalgas, son consideradas
como las principales productores primarios en estos ecosistemas, por cuanto a través de
éstas se genera materia orgánica y energía, la que queda disponible para los distintos
niveles tróficos. Estas poblaciones fitoplanctónicas sufren fluctuaciones cualitativas y
cuantitativas a lo largo del año, evidentes en diferentes escalas espacio-temporales:
asociadas a cambios en los factores ambientales, estacionales, entre otros (Currie, 1990).
El fitoplancton del área de Coihuín muestran las características de las comunidades
de los fiordos nord-patagónicos, con predominancia de diatomeas por sobre
dinoflagelados (Fig. 4).
1. Ceratium tripos
2. Ceratium fusus
3. Rhizosolenia styliformis
4. Coscinodiscus centralis
5. Prorecentrum micans
6. Nitzchia seriata
7. Actinoptychus senari
8. Rhizosolenia setigera
8. Thalassiothrix nitzchioides
Figura 4. Muestra de fitoplancton de la zona cercana a Puerto Montt, indicando los

principales grupos taxonómicos dominantes.
20
2.4.2. Macroalgas
Ulva sp.: conocida como “lechuga de mar”, pertenece a la división Chlorophyta. Presenta
talo verde laminar, foliáceo, lobulado, formado por dos capas de células, se encuentra
fijado al sustrato por rizoides que crecen como expansiones de las células basales del talo
(Hoffmann & Santelices, 1997). Puede llegar a medir 1 m de longitud, de contorno más o
menos redondeado, a veces dividido. Es una especie dioica cuyos talos productores de
gametos masculinos se distinguen de los productores de gametos femeninos por la
tonalidad de los márgenes de la lámina: verde amarillento en los primeros y verde oscuro
en los segundos. Habitan en el intermareal, en charcas, rocas o sublitoral hasta 20 m
(Fig. 5A). Al tolerar salinidades bajas puede encontrase en estuarios, y también
frecuentemente en zonas donde existen aportes nitrogenados. En el país, se ha
encontrado entre Tierra del Fuego (Región de ) y Antogasta (Región de Antofagasta),
también en el Archipielago Juan Fernández y las Islas Desventuradas. Es un género
cosmopolita.
A B
Figura 5. Ejemplares de macroalgas utilizados en el estudio, A) Ulva sp.

B) Gracilaria chilensis.
Gracilaria chilensis: es una especie endémica de Chile, conocida con el nombre “Pelillo”,
perteneciente a la división Rhodophyta (Hoffmann & Santelices, 1997). Es un alga de talos
cilíndricos filamentosos, de color pardo rojizo y a veces amarillento, midiendo entre
21
1 y 2 mm y hasta 2 m de largo, formado por uno o varios ejes alargados, ramificados en

forma alternada hasta 1,5 m de largo (Fig. 5B). Crece en ambientes protegidos, tanto en la
zona intermareal como submareal. En poblaciones naturales del intermareal crecen
adheridas, a bolones o rocas asociadas a playas de arena. En el submareal las adheridas
a piedras, enterrados en la arena en fondos blandos de estuarios, bahías protegidas y
fiordos (Santelices, 1981). Su distribución batimetrica va desde la superficie hasta los 10 m
de profundidad, con mayor frecuencia enterrados en la arena. En el país esta especie se
distribuye entre Bahía Inglesa, (Región de Atacama), hasta Coyhaique (Región de Aysén).
2.5. La situación en los ambientes costeros del Sur de Chile
Diversos estudios llevados a cabo en el último tiempo (Gómez et al., 2004, 2005;
Huovinen et al., 2006, etc.) demuestran que los organismos bentónicos del Sur de Chile
son expuestos a condiciones de estres fisiológico como resultado de la exposición a la
radiación solar UV. Esta problemática asociada a sistemas pelágicos de nuestra costa no
ha sido estudiado en detalle ni tampoco existe mucha información acerca de la dinámica
de los pigmentos y su tasa de deposición en los sedimento. Tomando en cuenta que en la
Bahía de Puerto Montt (Coihuín) se encuentra la plataforma fondos blandos más grande
del país, muchos de las interacciones entre la columna de agua y los sedimentos son
fundamentales en la ecología de los organismos que allí habitan.
En el presente estudio por lo tanto se realiza una aproximación experimental para
detectar cambios en la composición pigmentaria a lo largo de la columna de agua así
como en los sedimentos. Se estudió la variabilidad espacial y temporal en orden a
reconocer algunos factores ambientales involucrados en sus fluctuaciones. El otro aspecto
principal fue determinar si un factor importante como es la radiación UV-B afecta las
fuentes de pigmentos en el sistema: Como organismos modelos se utilizó dos especies de
macroalgas marinas comunes a esta zona: Gracilaria chilensis y Ulva sp. Con esta
información será posible generar una visión preliminar de la dinámica de los pigmentos en
los sistemas de fondos blandos del Sur de Chile y conocer el impacto de la radiación UV
sobre los componentes principales que determinan la productividad primaria en esta zona.
22
2.6. Hipótesis
H1: La composición y concentración de pigmentos fotosintéticos en el agua variará en

relación con la profundidad y con la estacionalidad.
H2: La radiación ultravioleta (UV) provoca cambios en la composición y cantidad de

pigmentos fotosintéticos de macroalgas en relación con la dosis de exposición.
2.7. Objetivos generales
a) Conocer la composición espacial y temporal de los pigmentos fotosintéticos en la

columna de agua y en una plataforma submareal de la zona de Puerto Montt (Coihuín).
b) Evaluar el efecto de la radiación UV sobre la composición y concentración pigmentaria

de algunas macroalgas.
2.8. Objetivos específicos
Determinar y caracterizar la composición de pigmentos a través de un gradiente de

profundidad en la columna de agua a través de cromatografía líquida de alta
resolución (HPLC) y espectrofotometría.
Determinar la composición de pigmentos en algunas algas bentónicas que podrían ser

fuente de pigmentos en la columna de agua.
Determinar efecto de la radiación UV sobre la composición de los pigmentos

fotosintéticos en dos especies de macroalgas.
23
Determinar la concentración de pigmentos fotosintéticos (Clorofilas a y b, carotenoides,

y ficobiliproteínas) en fitoplancton y algunas macroalgas usando métodos
espectrofotométricos.
24
3.- MATERIALES Y MÉTODOS
3.1. Área de estudio y recolección de muestras:
igura 6. Ubicación geográfica de los sitios de recolección de fitoplancton y macroalgas.

A) Coihuín (Puerto Montt), B) Playa Chica (Valdivia). Extraída de Google.
El lugar de estudio para la toma de muestas de fitoplancton es una extensa área de

(22.78 km2) en la planicie submareal de Coihuín a 15 km al este de Puerto Montt (41º 31'
S; 72º 53' W) (Fig. 6). Esta es una zona profunda de depositación de partículas ubicado a
100-270 m de la superficie, siendo un ambiente costero fangoso.
Las condiciones oceanográficas presentes en la zona de Coihuín se determinaron
midiendo las variables físico-químicas de la columna de agua, realizando perfiles de
radiación solar, Chl a, temperatura y salinidad. Estas determinaciones fisico-químicas
fueron llevadas a cabo el 10 de Enero de 2007, usando un CTD Seacat 19 plus (Seabird
Electronics Inc., USA) dotado con fluorómetro. Las condiciones lumínicas fueron
25
monitoreadas con un espectroradiómetro acuático RAMSES-ACC-UV/Vis (Trios GMBH,

Alemania).
La toma de las muestras en la columna de agua se llevó a cabo a diferentes
gradientes de profundidad. El agua fue muestrada con una botella tipo Niskin de 5 L
(vertical) (Hydro-Bios GmbH). Los volúmenes filtrados para estas muestras variaron entre
1 a 1,5 litros. En el caso de muestras de trampas, estas fueron tomadas a 70 m de
profundidad, los volúmenes filtrados variaron entre 250 y 300 ml respectivamente. La toma
de las muestras se realizó de forma estacional tanto para las de botella como las de
trampas. Una vez finalizado los muestreos, el material fue mantenido en frío (-70 °C)
para posterior análisis espectrofotométrico y de HPLC fase reversa (ver adelante). Los
muestreos y mediciones fisicoquímicas del agua fueron realizados en la Motonave
“Melipulli”, dependiente de la Universidad de Los Lagos.
En paralelo se tomaron muestras de macroalgas bentónicas comunes a la zona de
estudio (Ulva sp, Gracilaria chilensis) para la posterior caracterización de los pigmentos
fotosintéticos presentes en ellas. En este caso las macroalgas fueron recolectadas en la
Playa Chica de Niebla, Valdivia (39° 51' S; 73° 23' W) en los meses de agosto y octubre
(Fig. 6). Las muestras fueron mantenidas en frío (-70°C) para posterior análisis
espectrofotométrico y de HPLC fase reversa (ver adelante).
3.2. Diseño experimental de exposición a radiación UV
El desarrollo de los experimentos se realizó en el Instituto de Biología Marina de la

Universidad Austral de Chile, donde se procedió a la extracción de pigmentos
fotosintéticos obtenidos de las muestras mediante espectrofotometría (ver más adelante).
El material preparado con los pigmentos fue trabajado posteriormente para análisis
cualitativos y cuantitativos mediante la cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) de
fase reversa que se llevó a cabo en el Instituto de Química (ver más adelante)
Las macroalgas Ulva sp. y Gracilaria chilensis fueron transportadas a la sala de
acuarios del Instituto de Biología Marina y, mantenidas en estanques cilíndricos de 20 L
con agua de mar, a una temperatura entre 13 y 15º C, salinidad de 30 PSU y aireación
26
constante. Bajo estas condiciones las algas fueron aclimatadas durante un período de 24h
antes de realizar las respectivas mediciones fisiológicas.
Las exposiciones a radiación UV se realizaron bajo tres diferentes tratamientos de
radiación: a) PAR + UV-A + UV-B (PAB), b) PAR + UV-A (PA) y c) PAR (P), utilizando un
set de 2 lámparas (Osram L36w/640) de radiación PAR (Photo-sytheticatically Active
Radiation), una lámpara Q-Panel 313 (USA) que emite radiación centrada en UV-B y una
lámpara Q-Panel 340 (USA) que emite radiación centrada en UV-A. Para obtener los
diferentes tratamientos se utilizaron filtros que cortan la radiación a diferentes longitudes
de onda: Ultraphan 400 que corta la radiación bajo de los 400 nm, excluyendo la radiación
UV-B y UV-A, Ultraphan 295 que corta solo UV-C y Folex 320, que corta la radiación bajo
los 280 nm (Fig. 7).
Figura. 7. Esquema del sistema de incubación termorregulado, donde se indica la

disposición de los tratamientos (lámparas y filtros) utilizados para la exposición de los
discos con las macroalgas.
Para realizar la incubación de las macroalgas se contó con un baño termorregulado

donde se depositaron las algas en recipientes de plástico transparente con 2L de agua de
mar filtrada y aireación constante. Cada recipiente fue cubierto con los distintos tipos de
filtros mencionados anteriormente (Fig. 7). Estos recipientes fueron incubados a una
distancia de 15 cm de las lámparas artificiales a diferentes tiempos (inicial, 6h, 24h, 2 días
27
y 6 días), con la finalidad de lograr dosis crecientes de exposición. Al final de cada

período de exposición se determinó la fluorescencia de clorofila y la tasa de transporte de
electrones (ETR). Paralelamente se tomaron muestras a cada tiempo de exposición para
la determinación de pigmentos fotosintéticos vía espectrofotómetro y HPLC (ver más
adelante).
3.3. Análisis químico
3.3.1. Extracción y partición de pigmentos fotosintéticos
Los pigmentos fotosintéticos son característicos de los diferentes grupos de algas,

por lo tanto, su extracción es distinta. Puesto que presentan sus propias características, no
se pueden usar los mismos solventes para extraer los pigmentos presentes en las
muestras.
Dentro de las consideraciones metodológicas generales se debe mencionar que
clorofilas, carotenoides y biliproteínas son compuestos inestables, por lo que deben ser
manejados cuidadosamente, para no alterar sus propiedades químicas. Son isomerizados
y oxidados por la luz y el aire, lo cual cambia su composición química y color. La alteración
fotoquímica se acelera cuando los pigmentos son adsorbidos en superficies
cromatográficas. La presencia de pequeñas cantidades de ácido removerá el magnesio de
la clorofila produciendo feofitinas y causará izomerizaciones cis/trans en carotenoides. Los
álcalis fuertes pueden romper el grupo fitol de las clorofilas causando alteraciones
químicas en algunos carotenoides.
3.3.1.1. Clorofilas y carotenoides
Las clorofilas y los carotenoides generalmente son moléculas liposolubles y pueden

ser extraídas a través de la membrana del tilacoide con solventes orgánicos tales como:
acetona, metanol, o DMSO.
Macroalgas: Se pesaron 30 mg de muestra para Ulva y 60 mg para Gracilaria. Para

molerlas se utilizó un mortero con arena. Luego la muestra fue introducida en un tubo de
28
ensayo donde se le agregaron 10 ml de acetona al 90%, para la extracción de los

pigmentos. Después de agitar esta mezcla, se dejó reposar los extractos, almacenados
herméticamente y mantenidos por 24-48 horas en la oscuridad dentro de un refrigerador
a 4 ºC.
Fitoplancton: Los filtros de microfibra de borosilicato (diámetro de 47 mm, ADVANTEC

MFS) que contenían las muestras fueron introducidos en los tubos de ensayos donde se
procedió a agregarles 10 ml de acetona al 90%, para la extracción de los pigmentos.
Fueron agitados y mantenidos por 24-48 horas en oscuridad dentro de un refrigerador
a 4 ºC.
3.3.1.2. Productos de degradación de la clorofila:
Los productos de degradación de la clorofila pueden formar una fracción importante

del contenido total de pigmentos del fitoplancton que existe en una muestra de agua de
mar. Estos productos son el resultado de los procesos de a) digestión del zooplancton que
convierten la clorofila en feopigmentos siendo estos: feofitina formada por retiro del átomo
de magnesio de una o otra clorofila y feoforbidos que carecen tanto de magnesio como de
la cadena de fitol de la molécula de clorofila (Carpenter & Bergquist, 1985) y b) procesos
de descomposición orginados por las enzimas hidrolíticas del fitoplancton que pueden
convertir la clorofila en clorofilida. El coeficiente de absorción de este último pigmento al
ser el mismo que el de la clorofila, no puede ser estimado por espectrofotometría. Sin
embargo, pueden determinarse los feopigmentos al presentar un espectro de absorción
más bajo que la clorofila en la región de los 665nm. Para esto, se mide la extinción a 665 y
750 nm antes y después de la transformación de toda la clorofila de la muestra en
feopigmentos.
3.3.1.3. Ficobilinas
Las ficobiliproteínas (PBP) presentes en las algas rojas se extraen de forma íntegra
debido al enlace covalente que se establece entre los cromóforos y la fracción apoproteíca
29
del pigmento. Al ser pigmentos solubles en agua, las ficobilinas no son bien extraídas por
los solventes orgánicos. Por lo tanto, para su extracción se utilizó Buffer Fosfato de
acuerdo al método de Beer & Eschel (1985).
Para la extracción se utilizaron 50 mg peso fresco de la muestra de Gracilaria.
Colocándose en un mortero con ayuda de arena y N2 líquido se procede a molerlas. Se
introduce al tubo de ensayo donde se le agrega 10 ml de buffer fosfato 0.1M a pH 6.5
mantenidos durante 24-48 horas, en condiciones de oscuridad en un refrigerador a 4 ºC
(Moon & Dawes, 1976), para extraer los pigmentos.
3.3.2. Cuantificación de los pigmentos fotosintéticos por espectrofotometría
La cuantificación espectrofotométrica de los distintos tipos de pigmentos se basa en

la lectura, mediante un espectrofotómetro (Fig. 8), de la densidad óptica a las longitudes
de onda en las que la absorbancia de luz es máxima para un determinado pigmento. Con
el espectrofotómetro se mide la extinción de la luz al atravesar una cubeta en la que se ha
Figura 8. Espectrofotómetro SCINCO UV/Visible utilizado para la medición de las

absorbancias de pigmentos totales (clorofilas, carotenoides y ficobiliproteínas) presentes
en macroalgas y fitoplanton analizadas. Este equipo emplea dos fuentes diferentes de
energía para cubrir el intervalo especificado de longitudes de onda. Una lámpara de arco
Deuterio suministra la radiación ultravioleta y una de Tungsteno la radiación visible.
30
colocado un extracto de pigmentos celulares, es decir la intensidad de luz que absorben

estos pigmentos a una determinada longitud de onda (λ), que está directamente
relacionada con la concentración de estos pigmentos en el extracto (Ley de Lambert-Bee).
En el extracto se encuentra una mezcla de los pigmentos contenidos en la célula, y
por lo tanto las absorbancias de éstos se suman. Mediante una serie de coeficientes se
transforman estas densidades ópticas en concentraciones pigmentarias de los diferentes
pigmentos (clorofilas y carotenoides principalmente).
3.4.3.1. Clorofila y Feopigmentos:
Macroalgas y Fitoplancton:
1.- Las muestras en los tubos de centrífuga, se introducen en la centrífuga, donde se

realiza la separación del extracto / precipitado centrifugando a 3000 rpm durante 10 min.
2.- Posteriormente se llena una cubeta de espectrofotometría con el extracto acetónico. A

continuación, se leen las absorbancias 665 y 750 nm (el valor debe ser inferior a 0.015, en
caso de que fuera mayor indicaría que hay demasiada materia en suspensión). Después
se lava la cubeta con acetona al 90% y se llena de acetona para realizar una lectura para
corregir la absorbancia debida al disolvente en cada una de las longitudes de onda
(Blanco). Se añaden 2 gotas de ácido clorhídrico (HCL) a la cubeta y se agita bien para
degradar los pigmentos, también se les mide la extinción a 665 y 750 nm.
La muestra fue acidificada (pH 2.5) añadiendo 2 gotas de ácido a la cubeta, se agitó
y se midió la extinción a 665 y 750 nm. La turbidez de la muestra se corrigió restándole el
valor de 750 nm a la extinción obtenida a 665 nm (antes y después). De esta forma se
elimina el efecto de la dispersión de la luz por las partículas en suspensión. Para calcular
la concentración de clorofila a y feopigmentos se utilizaron las ecuaciones de Lorenzen
(1967). Los resultados se obtienen en mg/m3:
31
Clorofila a (mg/ m3) = [ 26,7 x (A665o - A665a)] x v (mL)

Vxl
Feopigmentos (mg/ m3) = [26,7 x (1.7 A665a – A665o)] / v (mL)

Vxl
Siendo A la absorbancia leída a la longitud de onda señalada.
donde: A665a = extinción a 665 nm después de acidificar

A665o = extinción a 665 nm antes de acidificar
V = volumen de agua filtrado (L)
l = longitud de la cubeta (cm)
v = volumen del extracto acetónico en mL
3.3.2.2. Clorofila a, b, c y carotenoides:
Fitoplancton y Macroalgas:

realiza la separación del extracto/precipitado centrifugando a 3000 rpm durante 10 min.
2.- Seguidamente se llena una cubeta de espectrofotometría con el extracto acetónico. A

continuación, se leen las absorbancias 630, 645, 647 y 664 nm para las clorofilas y 480 y
510 nm para los carotenoides.
Para la calcular la concentración de las clorofilas y carotenoides extraídos con acetona al

90 %. Se Utilizó las ecuaciones indicadas en Strickland & Parson (1972)
Clorofila a (mg/L) = 11,85 (A664) – 1,54 (A 647) – 0,08 (A630)
Clorofila b (mg/L) = 20,03 (A647) – 5,43 (A664) – 2,66 (A630)

32
Clorofila c (mg/L) = 24,52 (A630) – 1,67 (A664) – 7,60 (A647)
Carotenoides = 7,6 (A480 – 1,49 A510)
Las concentraciones de clorofila y carotenoides fueron transformadas a mg/m3 a

partir de la siguente fórmula:
mg clorofila /m3 = C x v
V x 10
Donde: C= es sustituido por las clorofilas Ca, Cb y Cc

v= volumen del extracto acetónico en mL.
V = volumen en litros
10 = longitud de la cubeta
3.3.2.3. Ficobilinas

realiza la separación del extracto/precipitado centrifugando a 4500 rpm durante 30 min.
2.- Seguidamente se llena una cubeta de espectrofotometría y se lava con buffer fosfato
0,1 N a pH 6,5, para realizar una lectura para corregir la absorbancia debida al disolvente
en cada una de las longitudes de onda (Blanco). A continuación, se leen las absorbancias
455, 564 y 592 nm respectivamente.
A partir de la fracción supernadante, se determina la concentración de PBP

espectrofotométricamente por medio de las ecuaciones cromáticas dadas por Beer &
Eshel (1985) para las PBP (R-Ficoeritrina, R-PE, y R-Ficocianina, R-PC):
R-PE (mg /g-1 PS) = [(A564- A 592)-(A455-A592)0.2] x 0.12 x V (mL)

peso seco (g)
33
R-PC (mg/ g-1 PS) = [(A618-A645)-(A592-A645)0.51] x 0.15 x V (mL)

peso seco (g)
3.3.3. Determinación de pigmentos fotosintéticos por HPLC de fase reversa
La cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) permite realizar muy buenas

separaciones e identificaciones de componentes o mezclas de componentes en un tiempo
relativamente corto, tanto cualitativa como cuantitativamente (Fig. 9). Su funcionamiento
se basa en una columna cromatográfica, empacada con una fase estacionaria, que
permite separar los componentes de una mezcla, la cual es disuelta en una fase móvil o
Figura 9. Equipo cromatográfico HPLC Hewlett Packard serie 1100 Agilent de fase
reversa, utilizando columna Alltech ODS-2 C (250 x 4.60 mm; tamaño de partícula 5µ).
18
34
eluente, siendo pasada a través de la columna. Generalmente los equipos HPLC

presentan un sistema de detección continuo que localiza los analitos presentes en el
eluente midiendo sus propiedades físicas o químicas. El detector de la respuesta a través
de un gráfico en función del tiempo, o volumen del eluente, mostrando una serie de picos
llamados cromatograma (Puentes et. al, 2004).
En el caso de la cromatografía en fase reversa se caracteriza por presentar una
columna cromatográfica con una fase estacionaria no polar (con frecuencia se trata de
un hidrocarburo como octilo C8 y octadecilo C18), en conjunto con una fase móvil polar
(agua, metanol, acetonitrilo) bombeada a alta presión a través de una columna de acero
inoxidable empacada con sílica. Con este método los componentes más polares aparecen
primero, y un aumento de la polaridad de la fase móvil provoca un aumento de la elusión,
acortando el tiempo de retención (Skoog & Leary, 2001). La interacción de los
componentes de la muestra se produce según la polaridad; el componente más polar o
que se une débilmente a la fase estacionaria eluye primero con la fase móvil polar (tiempo
de retención corto) y, por ende, el componente menos polar o que es retenido fuertemente
por la interacción con la fase estacionaria apolar eluye al final (largo tiempo de retención).
La retención y la selectividad pueden ser alteradas por cambio de la polaridad de la fase
estacionaria o, (más fácilmente) por causa del eluente. Los métodos de HPLC son
particularmente sensibles a pequeños cambios en las condiciones ambientales, incluida
la temperatura. En fase reversa, la temperatura influye sobre cuatro magnitudes
importantes: solubilidad y tiempo de retención de la muestra, viscosidad de la fase móvil y
eficacia de la columna. Es conveniente controlar la temperatura debido a que en algunas
columnas la eficiencia puede variar con cambios muy pequeños de temperatura ambiente,
del orden de 2-4º C (Yost et al., 1980).
La elusión de los componentes de una muestra puede realizarse de dos maneras:
isocráticamente, es decir; una separación que utiliza un solo disolvente, o una mezcla de
solventes, pero con una composición constante, o bien, usando una elusión por gradiente
de solventes que utiliza dos o más disolventes con polaridad significativamente distinta,
variando sus preparaciones en forma programada durante el tiempo de elusión (Skoog &
Leary, 2001).
35
Las ventajas que presenta la cromatografía en fase reversa son variadas:

Puede separar muestras de un amplio rango de polaridades.
Permite la elección dentro de una amplia variedad de fases estacionarias.
Usa fases móviles relativamente económicas.
Hay un rápido equilibrio entre la fase móvil y la fase estacionaria.
Provee una separación rápida, simple y reproducible (Puentes, 2004):
Las limitaciones que presenta son:

Muchas fases unidas a la sílica son estables sólo entre pH 3 y 8.
La presencia de grupos silanoles no reactivos en la superficie de la sílica pueden
producir colas en los picos, incrementar los tiempos de retención y causar
irreproducibilidad en análisis entre columnas.
Los mecanismos de retención de fase reversa aún no han sido completamente
entendidos (Puentes, 2004).
Basándose en lo anterior, la separación y determinación de los pigmentos

fotosintéticos presentes en los extractos de las muestras de macroalgas y columna de
agua a analizar, fueron determinadas cualitativa y cuantitativamente mediante
cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) en fase reversa (Skoog & Leary, 2001).
Para lo cual se utilizó un equipo cromatográfico Hewlett-Packard modelo 1100 Agilent de
fase reversa (Fig. 9) en una columna Alltech ODS-2 C (250 x 4.60 mm, tamaño de
18
partícula 5 µm).
3.3.3.1. Reactivos empleados en análisis de pigmentos fotosintéticos:
o Para extracción y partición de pigmentos:

Solventes calidad P.A de la firma Merck: Acetona al 90 % y Buffer Fosfato 0,1 N a pH 6,5.
o Para análisis de pigmentos por HPLC:

Acetonitrilo (Merck), Agua *, Metanol grado HPLC, Buffer Tris HCL 0,1 M pH 8,0 y Acetato
de etilo grado HPLC.
36
o Estándares:
β-caroteno (SIGMA), Clorofila a (SIGMA) y Clorofila b (SIGMA).
*El agua usada en HPLC fue agua bidestilada y desionizada, no grado HPLC, la cual fue
filtrada al vacío mediante empleo de un Kitasato con filtro mezcla celulosa/éster, con
tamaño de poro de 0,2 µm y diámetro 47 mm (Advantec MFS).
3.3.3.2. Determinación de clorofilas y carotenos:
Para la determinación de estos pigmentos fotosintéticos, se introduce un volumen

de 50 µl de muestra en el inyector, previamente filtrado con un filtro de nylon (con tamaño
de poro de 0,2 µm y diámetro de 25 nm, ADVANTEC MFS) para eliminar las impurezas
soluble en el extracto que pudieran dañar la columna, inyectándose a un flujo de
-1
2.0 mL/min , controladas por una bomba peristáltica cuaternaria, a temperatura ambiente
y con una longitud de onda de detección a lo 450 nm utilizando un detector UV-visible. La
longitud de onda se eligió de acuerdo a los espectros de absorción de las muestras y
estándar medidas en un espectrofotómetro de barrido UV/Visible (SCINCO) y a la
comparación de las alturas, separaciones y resoluciones de los peacks que permitieran
una buena identificación y cuantificación del β-caroteno y las clorofilas presente en la fase
etérea de la muestra en estudio. Una separación eficiente de los componentes, se logró
acortando el tiempo de separación, mediante el uso de una gradiente modificada de
solventes: Solvente A: acetonitrilo-metanol-buffer Tris HCL 0,1 M pH 8,0 (78:18:4) y
solvente B: metanol-acetato de etilo (40:60) y una corrida isocrática de esta última mezcla
de solventes.
La mezcla de solvente A y solvente B fueron corrida a través de una gradiente lineal
hasta llegar al 100% de metanol-acetato de etilo en un tiempo de 3 minutos, seguido por
5 minutos de una corrida isocrática con metanol-acetato de etilo. Entre cada inyección de
muestras la columna fue re-equilibrada, con la primera mezcla de solventes, por un
mínimo de 10 minutos, para eliminar los efectos residuales de la mezcla de solventes
metanol-acetato de etilo.
37
3.3.3.3. Identificación, calibración y cuantificación de pigmentos fotosintéticos:
3.3.3.3.1. β-caroteno:
La identificación del β-caroteno de las muestras de la columna de agua y

macroalgas tratadas con radiación UV-B se realizó mediante la comparación de los
tiempos de retención de los picos obtenidos para los extractos con los estándares puros
de β-caroteno en metanol 100%. Los cromatogramas del estándar y de las muestras
fueron obtenidos bajo exactamente la mismas condiciones de temperatura, gradiente y
flujo (Ver Resultados Fig. 17A).
Para cuantificar la banda identificada como β-caroteno se realizó una curva de
calibración con el estándar (Ver Resultados Fig.18) a concentraciones conocidas: 1, 5, 10,
25, 50 ppm.
Con las ecuaciones de la recta obtenidas de las curvas de calibración del estándar
fue posible obtener la concentración del β-caroteno identificado en cada una de las
muestras estudiadas.
A partir de estos datos fue posible identificar y calcular cuantitativamente la
concentración del β-caroteno presente en las muestras estudiadas.
3.3.3.3.2. Clorofila a y b:
La identificación de la clorofila a y b presentes en las muestras se realizó siguiendo

el mismo criterio que en β-caroteno. Los cromatogramas de los estándares de clorofila
a y b, de las muestras se obtuvieron bajo iguales condiciones (Ver resultados Fig. 17B y
17C).
Para cuantificar la concentración de las clorofilas a y b identificados se realizaron
curvas de calibración en HPLC de fase reversa con cada uno de los estándares a
concentraciones conocidas: Clorofila a 1, 2, 3 y 4 ppm y Clorofila b 0,5, 1, 2,5 y 5 ppm
respectivamente (Fig.18).
38
Con las ecuaciones de la recta obtenidas de las curvas de calibración de los

estándares fue posible obtener la concentración del la clorofila a y b identificados en cada
una de las muestras estudiadas.
A partir de estos datos fue posible identificar y calcular cuantitativamente la
concentración de la clorofila a y b presentes en las muestras estudiadas.
3.4. Estudios fisiológicos
3.4.1. Medición de la fluorescencia de clorofilas del fotosistema II:
El método se basa en la fluorescencia emitida por las clorofilas, donde se midió la

tasa fotosintética (Schreiber et al. 1994), utilizando el fluorímetro de amplitud modulada
(PAM 2000, Walz, Effeltrich, Alemania) (Fig. 10). La fluorescencia se midió a diferentes
intervalos de exposición a la radiación (inicial, 6 hrs, 24 hrs, 2 días y 6 días). El parámetro
fotosintético utilizado fue el rendimiento cuántico máximo (Fv/Fm).
Figura 10. Instrumento portátil, PAM 2000. Permite medir la cinética de conversión de energía y
parámetros fotoquímicos en el aparato fotosintético in vivo.
39
3.4.1.1 Rendimiento Cuántico Máximo (Fv/Fm)
El rendimiento cuántico máximo representa la eficiencia máxima en los procesos de

conversión de la energía fotoquímica de una planta adaptada a oscuridad, es considerado
un buen indicador de fotosíntesis, debido a que se encuentra asociado fuertemente a la
eficiencia fotosintética medida durante la evolución de O (Figueroa et al., 2003). Este
2
Figura 11. Esquema de la medida de rendimiento cuántico máximo (Fv/Fm) y rendimiento

cuántico efectivo (ΦPSII). Las flechas negras indican el encendido de la luz de medida. Las
flechas negras quebradas indican los pulsos de saturación. Con las flechas rojas se indica el
encendido y apagado de la luz actínica y con las lilas el pulso del rojo lejano. Figura extraída de
parámetro corresponde al cociente entre la fluorescencia variable (Fv=Fm-Fo) y la

fluorescencia de una planta aclimatada a oscuridad (Fm). Para su estimación las
macroalgas se sometieron por 30 minutos a incubación de oscuridad, en una cámara de
polietileno negro, para permitir que todos los centros de reacción se encuentren oxidados
(abiertos). Después a través del fluorímetro se les aplicó un pulso de saturación (4000-
-2 -1
6000 µmol m s ) de luz actínica que produce el máximo nivel de fluorescencia (Fm), es
cuando todos los centros de reacción se reducen (cerrados). Debido a que en este
momento las quinonas se saturan, por lo tanto la energía destinada a procesos
40
fotoquímicos se hace cero (quenching fotoquímico= 0) y a que el quenching no-

fotoquímico (o calor) se retrasa a algunos milisegundos, la totalidad de la energía
absorbida es en forma de fluorescencia. Para obtener Fv/Fm (Fig. 11) se necesita
entonces la fluorescencia variable (Fv) que es la diferencia entre la fluorescencia máxima
(Fm) y la fluorescencia basal (Fo) que se obtiene con una luz de emisión de 650 nm de una
planta adaptada a la oscuridad. En el caso de que algas se encuentren adaptadas a la luz
se obtiene el rendimiento cuántico efectivo (ΦPSII) que refleja la eficiencia real (estado
estacionario) bajo una determinada radiación a diferencia de Fv/Fm que es una eficiencia
potencial (Fig. 11).
3.4.1.2 Tasa de transporte de electrones (ETR):
Este parámetro representa la estimación del tránsito de electrones a través de los

diferentes componentes del aparato fotosintético en los tilacoides. El ETR en general, es
un buen indicador de la tasa de fotosíntesis en algas. Fue estimado utilizando curvas de
Fotosíntesis vs. Irradiancia (P-I), mediante la exposición de las macroalgas a intensidades
-2 -1
crecientes (1-400 µmol m s ) de radiación visible PAR, proporcionada por una lámpara
LED integrada en el instrumento PAM 2000. El ETR se midió a distintos intervalos de
exposición a la radiación (inicial, 6 h, 24 h, 48 h y 6 d). ETR fue calculado relacionando el
rendimiento cuántico efectivo (ΦPSII), que corresponde a la fluorescencia de una planta no
adaptada a la oscuridad, y la intensidad de radiación PAR de acuerdo a la siguiente
fórmula modificada a partir de Schreiber et al., (1994):
ETR = ΦPSII * E PAR * A * C.
Donde, E es la intensidad de la luz actínica, A es la absorptancia de las macroalgas

y C que relaciona la absorción de la radiación por partes de los fotosistemas que varia
según la especie de macroalga, para las algas verdes y rojas estos valores han sido
estimados 0,5 y 0,15 respectivamente. La absorptancia (A), que es la fracción que queda
de la sustracción de la luz transmitida y reflejada por una muestra, fue medida colocando
una porción del talo sobre la superficie de un sensor cuántico Licor-190, conectado a un
41
radiómetro Licor-250 (Li-Cor Inc., USA) (Gómez et. al., 2004). Fue calculada mediante la
fórmula modificada descrita por Mercado et al., (1996):
A = (Io – It)* Io-1
Donde, Io es la intensidad de PAR incidente y It es la intensidad de PAR transmitida

una vez que ha atravesado la muestra de alga.
3.5. Análisis estadísticos
Los resultados obtenidos de las concentraciones de los pigmentos fototosintéticos,

Fv/Fm y ETR se realizaron análisis estadísticos por separados con el programa
computacional Statistica 6.0 (StatSoft, Inc., USA). Se realizaron análisis de varianza
(ANOVA) de dos vías, considerando las siguientes variables: tratamiento y tiempo de
exposición para ambos grupos de macroalgas; los parámetros de fluorescencia y
cuantificación de clorofila a, clorofila b y β-caroteno por HPLC determinación de los
pigmentos por medio del espectrofotómetro UV-visible, en las especies de macroalgas. En
cuanto a la determinación de los pigmentos presentes en las muestras de fitoplancton se
realizó un análisis de varianza (ANOVA) de una vía. Con el Test de Tukey se
establecieron las diferencias entre los promedios, considerando como diferencias
significativas un P≤0,05 (*).
42
4.- RESULTADOS
4.1. Variación estacional y en profundidad de pigmentos fotosintéticos en muestras

de Fitoplancton de la zona de Coihuin.
4.1.1. Caracterización de las condiciones oceanográficas
En general, se conoce que la radiación solar en el medio acuático sufre constantes

variaciones espacio-temporales en calidad y cantidad. Mediante la realización de los
perfiles de radiación solar en la columna de agua de esta zona, se observó que en un día
soleado de verano, la penetración de la radiación PAR llega hasta profundidades cercanas
a los 40 m. En el caso de la radiación UV-A y UV-B quedó en envidencia que estas
longitudes de onda son atenuadas por la columna de agua a profundidades de 12 y 5 m,
respectivamente (Fig. 12 A).
En cuanto a la concentración de la clorofila a, se observó un patrón vertical a través
de la columna de agua, variando desde 4,0 µg l-1 en la superficie hasta un máximo de 5,7
µg l-1 alrededor de los 10 m. A mayor profundidad la concentración de Chl a disminuyó a
3,3 µg l-1. (Fig. 12 B).
Las condiciones térmicas y salinas observadas para la plataforma submareal de la
zona de Coihuín, mostraron comportamientos opuestos. La temperatura a nivel superficial
fue de alrededor de 15 ºC, disminuyendo a una profundidad de 10 m a 12 ºC. En el caso
de la salidad cercana a la supeficie, los valores fueron cercanos a 25 PSU, aumentando a
una profundidad de 10 m donde la salinidad llegó a los 30 PSU (Fig. 12 B).
43
Fig. 12. Condiciones oceaonográficas de la zona de Coihuin (Puerto Montt). A) perfiles de

radiación solar (UV-B, UV-A y PAR) en la columna de agua medidos con un
espectroradiometro acuático Ramses a lo largo de un rango de 40 m; B) Perfiles de Chl a,
salinidad y temperatura determinados con un CTD en un rango de profundidad de 20 m.)
4.1.2. Espectrofotometría
4.1.2.1. Clorofila a y feopigmentos:
El patrón de fluctuaciones estacionales para la concentración de clorofila a (Chl a) y

feopigmentos (Pheo) en la columna de agua fue similar (Fig. 13). Las muestras tomadas
con la botella Niskin a distintas profundidades donde se encontraron los máximos de
clorofila se analizaron de acuerdo al siguiente rango de profundidades; superficie (0-5 m) e
intermedio (5–15 m). Las concentraciónes de Chl a y Pheo en la superficie mostraron los
44
3
valores promedio más altos en primavera (5,473; 1,401 mg/m ) (p < 0.05, ANOVA, test
Tukey HSD; Tabla 1), para luego disminuir en verano, terminando con menor
3
concentración en otoño (3,026; 2,144 mg/m ). En general existe una mayor la cantidad de
Chl a respecto a Pheo. La concentración de Chl a y Pheo en la columna intermedia de
3
agua fue mayor en primavera (10,279; 1,840 mg/m ), disminuyendo en verano y otoño,
3
terminando con un valor inferior en la estación de invierno (1,844; 1,253 mg/m ) (p< 0.05;
Tabla 1).
En el caso de la muestras de trampa que fueron tomadas a una profundidad de
70 m en la columna de agua, las concentraciones de Chl a y Pheo (Fig. 14), difieren de las
tomadas en botella, observándose una mayor concentración de Pheo en todas las
estaciones del año respecto a la Chl a. Al analizar las concentraciones por cada estación
se observó que en invierno se encontraron los valores promedio más altos, para luego
disminuir en la estación de primavera y verano (p< 0.05; Tabla 2). Los valores más bajo se
determinaron en otoño.
45
3
Tabla 1. Concentraciones de clorofila (Chl a) y feopigmentos (Pheo) (mg/m ) en extractos
fitoplancton obtenidos con botella Niskin. Estas fueron determinadas según el método de Lorenzen
(1967) por medio de espectrofotometría UV/Visible a 665 y 750 nm en los diferentes tiempos de
exposición a los tratamientos de radiación. Los valores son promedio n= 3 ± D.E. Se indican los
resultados de un análisis de ANOVA de una vía para diferencias entre estaciones del año. Letras
3
Estación del Profundidad Concentración Pigmento (mg/m )
año Chl a Pheo
Invierno Superficie SM SM
Intermedio 1,844± 1,128 1,253 ± 1,052a
____________________________________________________________________________________
Primavera Superficie 5,473 ± 0,407 1,401± 0,786
Intermedio 10,279 ± 4,175 1,840± 0,958 c
____________________________________________________________________________________
Verano Superficie 2,491± 0,616 1,432± 0,853 a,b
Intermedio 6,635± 0,687 4,273± 0,533
____________________________________________________________________________________
Otoño Superficie 3,026± 1,480 2,144± 1,068b,c
Intermedio 1,179± 0,775 0,814± 0,613
ANOVA
Mean SS Superficie 0,00467 0,00198
Intermedio 0,00018 0,01623
Mean SS Error Superficie 0,00018 0,00531
Intermedio 0,00666 0,02840
F Superficie 1,28 0,111
(2,6)
F Intermedio 0,20 4,38

(3,23)
p-level Superficie p<0,89NS p<0,05*

Intermedio p<0,001*** p<0,89NS
Chl a: Clorofila a; Pheo: Feopigmentos; SM: Sin muestra
*P < 0,05; **P < 0,01; ***P < 0,001 (NS) valores no significativos, P > 0,05
46
3
Tabla 2. Concentraciones de clorofila (Chl a) y feopigmentos (Pheo) (mg/m ) en extractos de
fitoplancton, obtenidos por trampa. Estas fueron determinadas según el método de Lorenzen
(1967) por medio de espectrofotometría UV/Visible a 665 y 750 nm en los diferentes tiempos de
3
año Chl a Pheo
Invierno 70 m 34,858± 14,013 79,432± 30,894
____________________________________________________________________________________
Primavera 70 m 14,943± 2,599 25,147± 4,195
____________________________________________________________________________________
Verano 70 m 6,600± 1,085 21,853± 7,079
____________________________________________________________________________________
Otoño 70 m 5,102± 1,457 13,088± 3,459
ANOVA
Mean SS 0,00005 0,00008
Mean SS Error 0,976NS 0,948NS
F 0,07 0,12
(3,29)
p-level p<0,001*** p<0,001***

Chl a: Clorofila a; Pheo: Feopigmentos
47
A) B)
14 14
Chl a Pheo Chl a Pheo
(mg /m 3 )
12 12
(mg /m 3 )
10 10
8 8
Concentración
Concentración
6 6
4 4
2 2
0 0
Primavera Verano Otoño Primavera Verano Otoño Invierno
Estación del año Estación del año
Figura 13. Concentraciónes de la clorofila a y feopigmentos medidas en extractos de fitoplancton,

determinada mediante el espectrofotómetro UV/Visible SCINCO en muestras obtenidas por botella
Niskin. Profundidad: a) superficie (0-5 m), b) intermedio (5-15 m). Las muestras fueron
recolectadas durante las distintas estaciones del año. Los valores son promedio n= 3 ± D.E.
120
100 Chl a Pheo

(mg /m 3 )
80
60
Concentración
40
20
0
Primavera Verano Otoño Invierno
Estaciones del año
Figura 14. Concentraciones de la clorofila a y feopigmentos medidas en extractos de fitoplancton

determinadas mediante el espectrofotómetro UV/Visible SCINCO en muestras tomadas en trampas
a 70 m de profundidad, siendo recolectadas durante las distintas estaciones del año. Los valores
son promedio n= 3 ± D.E.
48
4.1.1.2. Clorofila a, b, c y carotenoides:
Las concentraciones obtenidas para los distintos pigmentos fotosintéticos como la

clorofila a (Chl a), clorofila b (Chl b), clorofila c (Chl c) y carotenoides, se observó un
comportamiento similar en las concentraciones de estos pigmentos, presentando
variaciones a través del ciclo estacional en la columna de agua (Fig. 15). Las
concentraciones registradas para los distintos pigmentos fotosintéticos encontrados en la
superficie muestran la misma tendencia tanto para Chl a, Chl b, Chl c y carotenoides,
siendo en la estación de primavera los valores promedio más altos en general (0,650;
3
0,028; 0,154; 0,163 mg/m ), aunque en verano se obtuvieron las concentraciones más
3
altas, para luego disminuir en otoño (0,289; 0,032; 0,052; 0,098 mg/m ) (p < 0.05,
ANOVA, test Tukey HSD; Tabla 3).
Las concentraciones de los pigmentos fotosintéticos; Chl a, Chl b, Chl c y
carotenoides presentes en el intermedio de la columna, se observó que en primavera se
3
obtuvieron los valores promedio más altos (1,227; 0,095; 0,330; 0,340 mg/m ), para luego
disminuir en verano y otoño, terminando con una menor concentración en invierno ( 0,319;
3
0,057; 0,093; 0,114 mg/m ). Cabe destacar que la Chl a presenta una mayor
concentración respecto a los demás pigmentos presentes en la columna de agua. En el
caso de la muestras de trampa tomadas a la profundidad de 70 m las concentraciones de
los pigmentos encontrados (Fig. 16). Para la Chl a, Chl b, Chl c y carotenoides en invierno
3
(6,78; 5,122; 4,142; 3,126 mg/m ) se observaron los valores promedio más altos,
disminuyendo en la primavera y el verano, terminando con una concentración menor en la
3
estación de otoño (1,811; 0,324; 0,057; 0,132 mg/m ) respectivamente (p < 0.05; Tabla 4).
49
3
Tabla 3. Concentraciones de pigmentos fotosintéticos (mg/m ) en extractos de fitoplancton
obtenidos por botella Niskin. Estas fueron determinadas según el método Strickland & Parson
(1972) por medio de espectrofotometría UV/Visible a 480, 510, 630, 647 y 664 nm en los diferentes
tiempos de exposición a los tratamientos de radiación. Los valores son promedio n= 3 ± D.E. Se
indican los resultados de un análisis de ANOVA de una vía para diferencias entre estaciones del
año. Letras similares indican diferencias significativas (p<0,05) según el test de Tukey HSD.
3
año Chl a Chl b Chl c Carot.
Invierno Superficie SM SM SM SM
Intermedio 0,319± 0,141a 0,057± 0,057 a 0,093± 0,071 0,114 ± 0,073a
____________________________________________________________________________________
Primavera Superficie 0,650± 0,006d,e 0,028± 0,017d 0,154± 0,030 0,163± 0,015
Intermedio 1,227± 0,294a,b 0,095± 0,086 a,b 0,330± 0,092 0,340± 0,187 a,b
____________________________________________________________________________________
Verano Superficie 1,217± 0,188e 0,271± 0,188d 0,135± 0,086 0,291± 0,137
Intermedio 0,392± 0,009 0,089± 0,017 0,182± 0,027 0,053± 0,032
____________________________________________________________________________________
Otoño Superficie 0,289± 0,036c 0,032±0,005 0,052± 0,020 0,098± 0,025
Intermedio 0,319± 0,110b 0,057± 0,034b 0,029± 0,046 0,078 ± 0,054b
ANOVA
Mean SS Superficie 0,000175 0,00090 0,000153 0,000166
Intermedio 0,00834 0,00024 0,00210 0,00153
Mean SS Error Superficie 0,000061 0,00039 0,00033 0,000081
Intermedio 0,00482 0,00121 0,00898 0,00135
F Superficie 8,7 7,0 14 6,2
(2,6)
F Intermedio 13,28 5 16,4 8,7

(3,23)
p-level Superficie p<0,001*** p<0,001*** p<0,001*** p<0,01***

Intermedio p<0,001*** p<0,001*** p<0,001*** p<0,001***
Chl a: Clorofila a; Chl b: Clorofila b; Chl c; Clorofila c; Carot.: Carotenoides; SM: Sin muestra
*P < 0,05; **P < 0,01; ***P < 0,001 (NS) valores no significativos, P < 0,05
50
3
Tabla 4. Concentraciones pigmentos fotosintéticos (mg/m ) en extractos fitoplancton, obtenidos
por trampas. Estas fueron determinadas según el método de Strickland & Parson (1972) por medio
de espectrofotometría UV/Visible a 480, 510, 630, 647 y 664 nm en los diferentes tiempos de
3
año Chl a Chl b Chl c Carot.
Invierno 70 m 6,78 ± 1,699a 5,122 ± 1,897 a 4,142± 1,897a 3,126± 1,706 a,c
____________________________________________________________________________________
Primavera 70 m 2,90± 1,226a, b 0,615± 0,332 a, b 0,786± 0,567a, b 0,423± 0,097 a, b
____________________________________________________________________________________
Verano 70 m 1,801± 0,324 0,345± 0,204 0,034± 0,125 0,220± 0,191c
____________________________________________________________________________________
Otoño 70 m 1,811± 0,310 b 0,324± 0,173 b 0,057± 0,016 b 0,1321± 0,092 b
ANOVA
Mean SS 0,02673 0,05083 0,03793 0,02466
Mean SS error 0,01563 0,03031 0,03131 0,00662
F 16,53 16,23 11,71 36
(3,29)
p-level p<0,001*** p<0,001*** p<0,001*** p<0,001***

Chl a: Clorofila a; Chl b: Clorofila b; Chl c; Clorofila c; Carot.: Carotenoides
51
A) B)
1,6 1,6
(mg /m 3 )
Chl a Chl b Chl c Carot. Chl a Chl b Chl c Carot.
(mg /m 3 )
1,2 1,2
0,8 0,8
Concentración
Concentrción
0,4 0,4
0 0
Figura 15. Concentraciones de clorofilas a, b, c y carotenoides medidos en extractos de

fitoplancton determinadas mediante el espectrofotómetro UV/Visible SCINCO en muestras
obtenidas por la botella Nisksin. Profundidad: A) superficie (0-5 m), B) intermedio (5-15 m). Las
muestras fueron recolectadas durante las distintas estaciones del año. Los valores son promedio
n= 3 ± D.E.
10
(mg /m 3 )
Chl a Chl b Chl c Carot

8
4
Concentración
0
Estación del año
Figura 16. Concentraciones de clorofilas a, b, c y carotenoides medidos en extractos de

fitoplancton determinadas mediante el espectrofotómetro UV/Visible SCINCO en muestras
tomadas en trampas a 70 m de profundidad, siendo recolectadas durante las distintas estaciones
del año. Los valores son promedio n= 3 ± D.E.
52
4.1.3. HPLC
4.1.3.1. Identificación, calibración de los pigmentos fotosintéticos por RP-HPLC:
Con el tiempo de retención apreciado en los cromatograma de los distintos

estándares de los pigmentos fotosintéticos analizados: β-caroteno, Clorofila a y b (Fig. 17)
obtenidos mediante la técnica de HPLC fase reversa, se procedió a la identificación de
estos pigmentos presentes en los extractos de muestras de fitoplancton, obtenidas en la
columna de agua a distintas profundidades en las diferentes estaciones del año. En el
caso de las macroalgas (Ulva sp. y Gracilaria chilensis) fueron expuestas diferentes dosis
de radiación. Se realizó una comparación de los tiempos de retención entre los distintos
estándares de los pigmentos (Tabla 5) y las muestras de fitoplancton y las macroalgas.
Los cromatogramas obtenidos de los estándares y de las muestras fueron realizados bajo
las mismas condiciones de temperatura, gradiente y flujo (Ver Resultados Fig. 21-22;
30-31).
La cuantificación de la concentración de los pigmentos fotosintéticos identificados
se realizó mediante las curvas de calibración obtenidas por HPLC-fase reversa, con cada
uno de los distintos estándares a concentraciones conocidas: β-caroteno (5, 10, 25, 50,
100 ppm), Clorofila a (1, 2, 3, 4 ppm) y Clorofila b (1, 2, 5, 5 ppm) respectivamente.
(Fig. 18).
Las ecuaciones de la recta obtenida para cada uno de los estándares de los
distintos pigmentos fotosintéticos fueron las siguientes:
2
β-caroteno Y= 1,3461 + 1,7394 r = 0,9979
2
Clorofila a Y= 6,7077 – 0,4897 r = 0,9989
2
Clorofila b Y= 17,623 – 0,1202 r = 0,9952
Donde “Y” corresponde a la altura peak del identificado en el cromatograma, y “X” a

la concentración del estándar en ppm.
53
Mediante de estos datos fue posible identificar cada uno de los distintos pigmentos
fotosintéticos presentes tanto en las muestras de fitoplancton y macroalgas estudiadas.
Además de calcular cuantitativamente la concentración de los distintos pigmentos:
β-caroteno, Clorofila a y Clorofila b.
Tabla 5. Tiempos de retención (min) de estándares de pigmentos fotosintéticos analizados en

HPLC de fase reversa, provisto columna C , se inyectó un volumen de 50 µl de muestra del
18
estándar (β-caroteno, Clorofila a y Clorofila b a concentraciones de: 5, 10, 25, 50; 4, 3, 2, 1; 0,5, 1,
-1
2,5, 5 ppm, respectivamente) a un flujo de 2,0 ml/min . Estos fueron detectados a una longitud de
onda de 450 nm con detector UV-Visible, a temperatura ambiente y con una gradiente modificada
de solventes: a) acetonitrilo-metanol-buffer Tris HCL 0,1 M pH 8,0; b) metanol-acetato de etilo.
n= 3.
Estándar Tiempo de retención (min)

β-caroteno 5,083
Clorofila a 4,245
Clorofila b 3,836
54
Figura 17. Cromatogramas de los estándares de los pigmentos fotosintéticos: A) β-caroteno

B) Clorofila a C) Clorofila b, correspondiente a la concentración 50, 4, 2,5 ppm, respectivamente,
-1
resuelto en HPLC fase reversa, inyectando 50 µL de muestra a un flujo 2,0 mL/min , controlado
por bomba peristáltica cuaternaria a una longitud de 450 nm con detector UV-visible, controlado
por bomba peristáltica cuaternaria, a temperatura ambiente y con gradiente de solventes
acetonitrilo-metanol-buffer Tris HCL 0,1 M pH 8,0 y metanol-acetato de etilo y corrida isocrática
con la última mezcla de solventes.
55
β -caroteno
160
140
120
Altura (mAU)
100
80
60
40 Y = 1,3461x + 1,7394
20 r2 = 0,9979
0
0 20 40 60 80 100 120
Concentración (ppm)
Chl a
30
25
Altura (mAU)
20
15
10
Y = 6,7077x - 0,4897
5 r2 = 0,9986
0
0 1 2 3 4 5
Chl b
100
80
Altura (mAU)
60
40
20 Y = 17,623x - 0,1202
r2 = 0,9952
0
0 1 2 3 4 5 6
Figura 18. Curvas de calibración de los estándares puros de: β-caroteno, clorofila a y b corridos en
HPLC de fase reversa.
56
4.1.3.2. Análisis pigmentos fotosintéticos en muestras de fitoplancton:
En las muestras de fitoplancton analizadas mediante RP-HPLC, a través de los

cromatogramas (Fig. 21-22) se determinó la presencia de clorofila a (Chl a), clorofila b
(Chl b) y β-caroteno. Además se observó que la estacionalidad se encuentra relacionada
en la variación de la concentración de estos distintos pigmentos fotosintéticos. En el caso
de las muestras tomadas con la botella Niskin, se apreció una mayor concentración de
β-caroteno en la estación de primavera - verano tanto en la superficie (0–5 m) como en el
intermedio (5-15 m) de la columna de agua, siendo mayor en ésta, para luego disminuir en
forma considerable en la estación de invierno (Fig. 19). Para la Chl a se evidenció una
mayor concentración respecto a la Chl b, siguiendo la misma tendencia del β-caroteno,
con una aumento en las estaciones de primavera-verano, disminuyendo en forma
paulatina durante el otoño e invierno como se evidencia en la (p < 0.05, ANOVA, test
Tukey HSD; Tabla 6).
En las muestras de trampas a 70 m de profundidad dentro de la columna de agua
se determinó una mayor concentración en la Chl a durante invierno, disminuyendo en
primavera y verano para terminar con un mínimo de concentración en otoño (Fig. 20). Por
otro lado, la Chl b presentó una menor concentración en relación a la Chl a, siguiendo la
misma tendencia en todas las estaciones del año al igual que la Chl a (p < 0,05; Tabla 7).
En el caso del β-caroteno se apreció una mayor concentración en las estaciones de
primavera-verano, disminuyendo de forma considerable en otoño e invierno.
57
Tabla 6. Concentraciones de pigmentos fotosintéticos (ppm) en extractos de fitoplancton,

obtenidos por botella Niskin. Estas fueron analizadas con HPLC fase reversa detectados a una
longitud de onda de 450 nm con un detector UV-visible, a temperatura ambiente y con una
gradiente modificada de solventes: a) acetonitrilo-metanol-buffer Tris HCL 0,1 M pH 8,0;
b) metanol-acetato de etilo en los diferentes tiempos de exposición a los tratamientos de radiación.
Los valores son promedio n= 3 ± D.E. Se indican los resultados de un análisis de ANOVA de una
vía para diferencias entre estaciones del año. Letras similares indican diferencias significativas
(p<0,05) según el test de Tukey HSD.
Estación del Profundidad Concentración Pigmento (ppm)

año Chl a Chl b β-carot.
Invierno Superficie SM SM SM
Intermedio 1,078± 0,030 a 0,164± 0,027 a 2,059± 0,365
____________________________________________________________________________________
Primavera Superficie 1,804± 0,009 0,940± 0,005 12,395± 0,984
Intermedio 1,604± a,b 0,568± a,b 16,532±
____________________________________________________________________________________
Verano Superficie 1,313± 0,064 0,720± 0,017 8,680± 0,343
Intermedio 1,437± 0,050 0,287± 0,032 9,727± 0,229
____________________________________________________________________________________
Otoño Superficie 1,179± 0,034 0,221± 0,025 4,131± 0,895
Intermedio 1,046± 0,013 b 0,101± 0,015 b 4,371± 0,492
ANOVA
Mean SS Superficie 0,00212 0,00708 0,012141
Intermedio 0,00153 0,00373 0,12415
Mean SS Error Superficie 0,00008 0,00076 0,000515
Intermedio 0,00109 0,00223 0,01937
F Superficie 79 85 70,69
(2,6)
F Intermedio 10,7 12,8 49,14

(3,23)
p-level Superficie p<0,001*** p<0,001*** p<0,001***

Intermedio p<0,001*** p<0,001*** p<0,001***
Chl a: Clorofila a; Chl b: Clorofila b; β-carot.: β-carot eno; SM: Sin muestra
58
Tabla 7. Concentraciones de pigmentos fotosintéticos (ppm) en extractos de fitoplancton,

obtenidos por trampas. Estas fueron analizadas con HPLC fase reversa detectados a una longitud
de onda de 450 nm con un detector UV-visible, a temperatura ambiente y con una gradiente
modificada de solventes: a) acetonitrilo-metanol-buffer Tris HCL 0,1 M pH 8,0; b) metanol-acetato
de etilo en los diferentes tiempos de exposición a los tratamientos de radiación. Los valores son
promedio n= 3 ± D.E. Se indican los resultados de un análisis de ANOVA de una vía para
diferencias entre estaciones del año. Letras similares indican diferencias significativas (p<0,05)
según el test de Tukey HSD.
Estación del Profundidad Concentración Pigmento (ppm)

año Chl a Chl b β-carot
Invierno 70 m 0,627± 0,078 a,c 0,349± 0,040 a,c 1,475 ± 1,317a,c
____________________________________________________________________________________
Primavera 70 m 0,358± 0,068 a,b 0,163± 0,015 a,b 4,563 ± 1,342 a,b
____________________________________________________________________________________
Verano 70 m 0,198± 0,032 c 0,042± 0,015 c 4,459 ± 0,551 c
____________________________________________________________________________________
Otoño 70 m 0,134± 0,230 b 0,040± 0,223 b 1,662 ± 0,622 b
ANOVA
Mean SS 0,00211 0,00215 0,02041
Mean SS Error 0,00166 0,00092 0,01792
F 12,3 22,7 11,01
(3,29)
p-level p<0,001*** p<0,001*** p<0,001***

Chl a: Clorofila a; Chl b: Clorofila b; β-carot.: β-carot eno
59
A) B)
20 20
Chl a Chl b β-carot
(ppm )
( ppm )
16 16
12 12
Concentración
Concentración
8 8
4 4
0 0
Figura 19. Concentraciones de pigmentos fotosintéticos medidas en extractos de fitoplancton

mediante HPLC (Hewlett Packard serie 1100 Agilent) fase reversa, en muestras obtenidas por la
botella Niskin. Profundidad en: A) superficie (0-5 m), B) intermedio (5-15 m). Las muestras fueron
recolectadas durante las distintas estaciones del año. Los valores son promedio n= 3 ± D.E.
8
(ppm )
4
Concentración
0
Estación del año
Figura 20. Concentraciones de pigmentos fotosintéticos medidas en extractos de fitoplancton

mediante HPLC (Hewlett Packard serie 1100 Agilent) fase reversa, en muestras tomadas en
trampas a una profundidad de 70 m. Las muestras fueron recolectadas durante las distintas
estaciones del año. Los valores son promedio n= 3 ± D.E.
60
Figura 21. Cromatogramas de pigmentos fotosintéticos en extractos de fitoplancton, muestras

obtenidas mediante botella Niskin analizados según profundidad y estación del año. A) Primavera;
B) Otoño. Resuelto por HPLC (Hewlett Packard serie 1100 Agilent) fase reversa. Volumen de
-1
inyección de muestra 50 µl a un flujo de 2,0 mL/min , controlado por una bomba peristáltica
cuaternaria, longitud de onda de 450 nm con detector UV-visible, a temperatura ambiente.
61
Figura 22: Cromatogramas de pigmentos fotosintéticos en extractos de fitoplancton, muestras

obtenidas mediante trampas a 70 m de profundidad, A) Primavera; B) Otoño. Resuelto por HPLC
(Hewlett Packard serie 1100 Agilent) fase reversa. Volumen de inyección de muestra 50 µl a un
-1
flujo de 2,0 mL/min , controlado por una bomba peristáltica cuaternaria, longitud de onda de
450 nm con detector UV-visible, a temperatura ambiente.
62
4.2. Efecto de la radiación UV sobre los pigmentos fotosintéticos de macroalgas de

la zona de Niebla.
4.2.1. Espectrofotometría
4.2.1.1. Clorofila a y feopigmentos:
Las concentraciones determinadas mediante el espectrofotómetro UV/visible

(SCINCO) para la clorofila a (Chl a) y feopigmentos (Pheo). Se observó en el experimento
del mes de Agosto los valores más altos en la macroalga Ulva sp. tanto en la
concentración de Chl a y Pheo con (0,512 mg/gPS) (0,267 mg/gPS) en relación a
Gracilaria chilensis con (0,095 mg/gPS) (0,029 mg/gPS), siendo ambas macroalgas
tratadas con exposición a radiación (p < 0.05, ANOVA, test Tukey HSD; Tabla 8a-9a). Sin
embargo, a las 24 h la Chl a aumento su concentración, no así los feopigmentos que
disminuyeron (Fig. 23), al término del período de exposición a la radiación, se observó que
las concentraciones de Chl a y Pheo tanto para el tratamiento UV-B como el PAR,
disminuyeron en ambas macroalgas. En el caso del experimento realizado en Octubre se
apreció el mismo comportamiento de la concentraciones de Chl a y Pheo, siendo estas
mayores que las del mes de Agosto. Al inicio presentaron las Chl a y Pheo valores de
(1,918 mg/gPS) (0,267 mg/gPS) para Ulva y Gracilaria (2,838 mg/gPS) (1,270 mg/gPS)
respectivamente (Fig. 24). En Ulva se evidenció un aumento de la cantidad de Chl a a las
24 h, disminuyendo paulatinamente hasta el sexto dia de exposición a la radiación en
ambos tratamientos, la concentración de los Pheo al igual que la Chl a siguieron el mismo
comportamiento. En el caso de Gracilaria se observó una tendencia similar en la variación
de la concentración de Chl a y Pheo, siendo menor en relación a Ulva (p < 0,05; Tabla
8b-9b).
63
Tabla 8a. Concentraciones de clorofilas y feopigmentos (mg/gPS) en extractos de macroalga Ulva

sp. tratadas con radiación UV-B y PAR, en el mes de Agosto. Estas fueron determinadas según el
método de Lorenzen (1967) por medio de espectrofotometría UV/Visible a 665 y 750 nm en los
diferentes tiempos de exposición a los tratamientos de radiación. Los valores son promedio
n= 3 ± D.E. Se indican los resultados de un análisis de ANOVA de 2 Vías. Letras similares indican
Estación Tratamiento Tiempo Concentración Pigmento (mg/gPS)

Chl a Pheo
Inicial 0,512± 0,040 0,267± 0,047
6h 0,382± 0,315 0,542± 0,230
UV-B 24 h 0,725± 0,176 0,225± 0,015
48 h 0,454± 0,253 0,108± 0,011
6d 0,464± 0,256 0,104± 0,051
Agosto _________________________________________________________________
Inicial 0,512± 0,040 0,267± 0,047
PAR 6h 0,757± 0,146 0,194± 0,032
24 h 0,929± 0,224 0,110± 0,069
48 h 0,735± 0,052 0,137± 0,020
6d 0,494± 0,247 0,103± 0,053
ANOVA 2 VÍAS Pigmentos Tratamiento Tiempo Trat *Tiempo

Mean SS Chl a 0,00036 0,00050 0,0013
Pheo 0,0050 0,00013 0,00115
F Chl a 6,2 2,2 0,6
(1,20)
Pheo 6,2 2,2 0,6

p-level Chl a
Pheo p<0,001*** p<0,001*** p<0,001***
64
Tabla 8b. Concentraciones de clorofilas y feopigmentos (mg/gPS) en extractos de macroalga Ulva

sp. tratadas con radiación UV-B y PAR, en el mes de Octubre. Estas fueron determinadas según
el método de Lorenzen (1967) por medio de espectrofotometría UV/Visible a 665 y 750 nm en los
diferentes tiempos de exposición a los tratamientos de radiación. Los valores son promedio
n= 3 ± D.E. Se indican los resultados de un análisis de ANOVA de 2 Vías. Letras similares indican
Estación del año Tratamiento Tiempo Concentración Pigmento (mg/gPS)

Chl a Pheo
Inicial 1,918± 0,100 0,267 ±0,047
6h 1,227± 0,620 0,542± 0,230
UV-B 24 h 2,024± 1,236 0,225± 0,015
48 h 0,784± 0,079 0,108± 0,011
6d 0,708± 0,204 0,104± 0,051
Octubre _________________________________________________________________
Inicial 1,918± 0,400a 0,267± 0,047a
6h 1,773± 0,224 0,194± 0,032
PAR 24 h 1,207± 0,347 0,110± 0,069
48 h 0,748± 0,079 0,137± 0,020
6d 1,352± 0,143a 0,103± 0,053a
ANOVA 2 VÍAS Pigmentos Tratamiento Tiempo Trat * Tiempo

Mean SS Chl a 0,00001 0,00013 0,00129
Pheo 0,00486 0,00129 0,00288
F Chl a 0,1 8,4 2,2
(1,4)
Pheo 0,1 8,4 2,2

p-level Chl a p<0,001*** p<0,001*** p<0,001***
Pheo p<0,001*** p<0,001*** p<0,001***

65
Tabla 9a. Concentraciones de clorofilas y feopigmentos (mg/gPS) en extractos de macroalga

Gracilaria chilensis tratadas con radiación UV-B y PAR, en el mes de Agosto. Estas fueron
determinadas según el método de Lorenzen (1967) por medio de espectrofotometría UV/Visible a
665 y 750 nm en los diferentes tiempos de exposición a los tratamientos de radiación. Los valores
son promedio n= 3 ± D.E. Se indican los resultados de un análisis de ANOVA de 2 Vías. Letras
Experimento Tratamiento Tiempo Concentración Pigmento (mg/gPS)

exposición Chl a Pheo
Inicial 0,095± 0,043a 0,029 ± 0,017a
6h 0,128± 0,049 0,009± 0,001
UV-B 24 h 0,169± 0,031 0,021± 0,018
48 h 0,217± 0,045a 0,018± 0,017 a
6d 0,177± 0,019 0,006± 0,002
Agosto _______________________________________________________________________
Inicial 0,095± 0,043a,b 0,029 ± 0,017a,b
PAR 6h 0,287± 0,082 0,011± 0,002
24 h 0,219± 0,027 0,009± 0,001
48 h 0,212± 0,036b 0,002 ± 0,006b
6d 0,184± 0,019a 0,026 ± 0,018a

Mean SS Chl a 0,00008 0,00030 0,00016
Pheo 0,00008 0,00030 0,00016
F Chl a 9 9 5
(1,20)
Pheo 9 9 5
p-level Chl a p<0,001*** p<0,001*** p<0,001***
Pheo p<0,001*** p<0,001*** p<0,001***
66
Tabla 9b. Concentraciones de clorofila a y feopigmentos (mg/gPS) en extractos de macroalga

Gracilaria chilensis tratadas con radiación UV-B y PAR, en el mes de Octubre. Estas fueron
determinadas según el método de Lorenzen (1967) por medio de espectrofotometría UV/Visible a

exposición Chl a Pheo
Inicial 0,162± 0,011a 0,092± 0,020a
6h 0,191± 0,014 0,092± 0,016
UV-B 24 h 0,205± 0,020 0,062± 0,022
48 h 0,169± 0,049 0,060± 0,038
6d 0,114± 0,011a 0,014 ± 0,011a
Octubre _________________________________________________________________
Inicial 0,162± 0,011 0,092± 0,020
6h 0,170± 0,071 0,069± 0,087
PAR 24 h 0,250± 0,250 0,064± 0,037
48 h 0,230± 0,250 0,048± 0,030
6d 0,234± 0,234 0,021± 0,006

Mean SS Chl a 0,00008 0,00020 0,00039
Pheo 0,00008 0,00020 0,00039
F Chl a 16 10 18
(1,20) 4,20
Pheo 16 10 18
p-level Chl a p<0,001*** p<0,001*** p<0,001***
Pheo p<0,001*** p<0,001*** p<0,001***

67
A)
UV-B PAR
1,2 1,2
Chl a Pheo
(mg /gPS )
(mg /gPS )
Chl a Pheo
1 1
0,8 0,8
0,6 0,6
Concentración
Concentración
0,4 0,4
0,2 0,2
0 0
Inicial 6h 24 h 48 h 6d Inicial 6h 24 h 48 h 6d
Tiempo de exposición Tiempo de exposición
B)
UV-B PAR
0,8 0,8
(mg /gPS )
(mg /gPS )
0,6 0,6
0,4 0,4
Concentración
Concentración
0,2 0,2
0 0
Figura 23. Concentraciones de clorofila a y feopigmentos medidas en extractos de macroalga,

mediante el espectrofotómetro UV/Visible SCINCO. Las determinaciones fueron realizadas
mediante exposición a tratamientos de radiación a distintos tiempo, siendo: A) UV-B y PAR en
Ulva sp., B) UV-B y PAR en Gracilaria chilensis. Las muestras fueron recolectadas en el mes de
Agosto. Los valores son promedio n= 3 ± D.E.
68
A)
UV-B PAR
2,4 2,4
Chl a Pheo
(mg /gPS )
Chl a Pheo
(mg /gPS )
2 2
1,6 1,6
1,2 1,2
Concentración
Concentación
0,8 0,8
0,4 0,4
0 0
B)
UV-B PAR
0,8 0,8
(mg /gPS )
(mg /gPS )

0,6 0,6
0,4 0,4
Concentración
Concentración
0,2 0,2
0 0
Figura 24. Concentraciones de clorofila a y feopigmentos medidas en extractos de macroalga,

Octubre. Los valores son promedio n= 3 ± D.E.
69
4.2.1.2. Clorofila a, b y carotenoides:
Las concentración obtenidas mediante el espectrofotómetro UV/visible (SCINCO)

para los distintos pigmentos: clorofila a (Chl a), clorofila b (Chl b), y carotenoides. Se
evidenció que las concentraciones de estos pigmentos variaron respecto al tiempo de
exposición a la radiación que se les aplicó. En el experimento realizado en el mes de
Agosto, la Chl a al inicio con un valor de (2,099 mg/L) presentó una mayor concentración
Ulva sp. en relación a Gracilaria chilensis (0,703 mg/L), disminuyendo paulatinamente
hasta el término de la exposición a la radiación (Fig. 25). La Chl b solo se presentó en la
especie Ulva al ser esta una Chlorophyta, observándose una menor cantidad si se
compara con la Chl a. Los carotenoides en Ulva presentaron un aumento a las 24 h (0,797
mg/L) de exposición, para luego disminuir gradualmente hasta el sexto día de exposición,
manteniendo su concentración similar durante todo el período de exposición a la radiación.
En el caso de Gracilaria los carotenoides no se evidenciaron grandes cambios en su
concentración en los diferentes tiempos de exposición a la radiación. Este patrón se
presentó en todos los pigmentos para ambos tratamientos tanto UV-B como PAR
(p < 0.05, ANOVA, test Tukey HSD; Tabla 10a-11a). En el caso del experimento realizado
en el mes de Octubre bajo las mismas condiciones del realizado en Agosto, quedo en
evidencia una mayor concentración de los distintos pigmentos analizados en las dos
especies de macroalgas, respecto al experimento realizado en Agosto. La cantidad de los
pigmentos en Ulva tanto Chl a, Chl b y carotenoides se comportaron de la misma forma,
presentando una mayor concentración al inicio (6,259 mg/L) la que fue disminuyendo
gradualmente hasta el terminó de la exposición tanto en el tratamiento UV-B como PAR
(Fig. 26). La concentración de la Chl a en la especie de Gracilaria, fue aumentando desde
el inicio hasta las 48 h, para luego disminuir hasta el sexto día de exposición en ambos
tratamientos (2,167; 3,047 mg/L) (UV-B y PAR). Los carotenoides no presentaron grandes
cambios a medida que se le aumento el tiempo de exposición a la radiación,
evidenciándose una concentración constante de este pigmento en ambos tratamientos
mencionados anteriormente (p < 0,05; Tabla 10b-11b).
70
Tabla 10a. Concentraciones de pigmentos fotosintéticos (mg/L) en extractos de macroalga Ulva

sp. tratadas con radiación UV-B y PAR, en el mes de Agosto. Estas fueron determinadas según el
método Strickland & Parson (1972) por medio de espectrofotometría UV/Visible a 480,510, 630,
Experimento Tratamiento Tiempo Concentración (mg/L)

Chl a Chl b Carot.
Inicial 2,099± 0,127 a,b 1,310± 0,060a,b,c 0,740 ± 0,093a
6h 0,777± 0,179ª 0,377± 0,047 b 0,387± 0,188
UV-B 24 h 1,006± 0,093 0,143± 0,070 0,797± 0,157
48 h 0,974± 0,174 0,208± 0,031 c 0,502± 0,194
6d 1,314± 0,121b 0,057± 0,037 a 0,516 ± 0,040a
Agosto _______________________________________________________________________
Inicial 2,099± 0,127 1,310± 0,060 0,740± 0,056
6h 1,233± 0,330 0,072± 0,029 0,794 ± 0,144
PAR 24 h 1,630± 0,162 0,019± 0,017 1,403 ± 0,284a
48 h 1,423± 0,145 0,023± 0,015 0,903± 0,302
6d 1,317± 0,266 0,081± 0,070 0,610 ± 0,137a

Mean SS Chl a 0,00080 0,00260 0,00035
Chl b 0,00040 0,01071 0,00068
Carot. 0,00122 0,00143 0,00063
F Chl a 6,7 5,4 0,7
(1,20), 4,20
Chl b 69 46,1 2,9

Carot. 27,6 8,1 3,6
p-level Chl a p<0,001*** p<0,001*** p<0,001***
Chl b p<0,001*** p<0,001*** p<0,001***
Carot. p<0,001*** p<0,001*** p<0,001***
Chl a: Clorofila a; Chl b: Clorofila b; Carot: carotenoides
71
Tabla 10b. Concentraciones de pigmentos fotosintéticos (mg/L) en extractos de macroalga Ulva

sp. tratadas con radiación UV-B y PAR, en el mes de Octubre. Estas fueron determinadas según
el método Strickland & Parson (1972) por medio de espectrofotometría UV/Visible a 480,510, 630,

Chl a Chl b Carot.
Inicial 6,259± 0,365 3,232± 0,281 3,076± 0,206
6h 5,713± 0,632 3,134± 0,473 2,347± 0,687
UV-B 24 h 5,059± 0,302a 3,121± 1,051a 1,830 ± 0,737a
48 h 2,743 ± 0,277 1,623± 0,274 0,695± 0,051
6d 2,215± 0,573a 1,198± 0,104a 1,089± 0,586a
Octubre ________________________________________________________________________
Inicial 6,259± 0,365 3,232± 0,281a 3,076± 0,206a
6h 5,783± 0,632 2,780± 0,367 2,784± 0,201
PAR 24 h 3,335± 0,302a 1,434± 0,105 1,427± 0,137
48 h 4,049± 0,277 1,912± 0,309 1,689± 0,270
6d 1,3751± 0,573a 0,804± 0,354a 0,54 ± 0,115a

Mean SS Chl a 0,00060 0,01848 0,00187
Chl b 0,00057 0,00848 0,00128
Carot. 0,00112 0,01116 0,00185
F Chl a 4,8 30 3,0
(1,20), 4,20
Chl b 7,8 29,0 4,4

Carot. 22,4 19,2 3,2
p-level Chl a p<0,001*** p<0,001*** p<0,001***
Chl b p<0,001*** p<0,001*** p<0,001***
Carot. p<0,001*** p<0,001*** p<0,001***
Chl a: Clorofila a; Chl b: Clorofila b; Carot: carotenoides
72
Tabla 11a. Concentraciones de pigmentos fotosintéticos (mg/L) en extractos de macroalga

determinadas según el método Strickland & Parson (1972) por medio de espectrofotometría
UV/Visible a 480,510, 630, 647 y 664 nm en los diferentes tiempos de exposición a los
tratamientos de radiación. Los valores son promedio n= 3 ± D.E. Se indican los resultados de un
análisis de ANOVA de 2 Vías. Letras similares indican diferencias significativas (p<0,05) según el
test de Tukey HSD.

Chl a Carot.
Inicial 0,703± 0,116 0,261± 0,085
6h 0,773± 0,171 0,319± 0,057
UV-B 24 h 1,249± 0,080 0,421± 0,080
48 h 0,975± 0,087 0,473± 0,127
6d 1,177± 0,165 0,416± 0,072
Agosto _________________________________________________________________
Inicial 0,703± 0,216 a 0,261± 0,085a
6h 1,393± 0,263 0,476± 0,167
PAR 24 h 1,633± 0,169a 0,227± 0,126a
48 h 1,425± 0,145 0,363± 0,038
6d 1,318± 0,261 0,378± 0,054

Mean SS Chl a 0,00068 0,0145 0,00037
Carot. 0,00103 0,00103 0,00193
F Chl a 4,9 2,6 0,7
(1,20), 4,20
Carot. 1,06 2,67 2,66

p-level Chl a p<0,001*** p<0,001*** p<0,001***
Carot. p<0,001*** p<0,001*** p<0,001***
Chl a: Clorofila a; Carot: carotenoides

73
Tabla 11b. Concentraciones de pigmentos fotosintéticos (mg/L) en extractos de macroalga

determinados según el método Strickland & Parson (1972) por medio de espectrofotometría
UV/Visible a 480,510, 630, 647 y 664 nm en los diferentes tiempos de exposición a los
tratamientos de radiación. Los valores son promedio n= 3 ± D.E. Se indican los resultados de un
análisis de ANOVA de 2 Vías. Letras similares indican diferencias significativas (p<0,05) según el
test de Tukey HSD.
Estación Tratamiento Tiempo Concentración (mg/L)

Chl a Carot.
Inicial 2,838± 0,084a,b,c 1,270± 0,026 a,b,c
6h 3,291± 0,141 1,352± 0,057
UV-B 24 h 3,092± 0,276c 1,387± 0,131c
48 h 3,175± 0,040b 1,445± 0,189b
6d 2,167± 0,224a 1,019± 0,053a
Octubre _______________________________________________________________
Inicial 2,938± 0,084a,b,c 1,270± 0,026a,b,c
6h 2,977± 0,373 1,292± 0,129
PAR 24 h 3,355± 0,354c 1,552± 0,239 c
48 h 2,855± 0,346b 1,264± 0,076b
6d 3,047± 0,296a 1,241± 0,096a

Mean SS Chl a 0,00033 0,00044 0,00046
Carot. 0,00050 0,00024 0,00010
F Chl a 2,1 4,3 4,5
(1,20), 4,20
Carot. 1 7 3
p-level Chl a p<0,001*** p<0,001*** p<0,001***
Carot. p<0,001*** p<0,001*** p<0,001***
Chl a: Clorofila a; Carot: Carotenoides
74
A)
UV-B PAR
2,4 2,4
Chl a Chl b Carot.
( mg /L )
( mg /L )
2 2 Chl a Chl b Carot.
1,6 1,6
1,2 1,2
Concentración
Concentración
0,8 0,8
0,4 0,4
0 0
B)
UV-B PAR
2 2
Chl a Carot Chl a Carot
( mg /L )
( mg /L )
1,6 1,6
1,2 1,2
Concentración
Concentración
0,8 0,8
0,4 0,4
0 0
Figura 25, Concentraciones de clorofila a, b y carotenoides medidas en extractos de macroalga,

Agosto. Los valores son promedio n= 3 ± D.E.
75
A)
UV-B PAR
7 7
Chl a Chl b B-carot Chl a Chl b Carot
( mg /L )
( mg /L )
6
5 5
4 4
3
Concentración
Concentración
2 2
1 1
0 0
B)
UV-B PAR
5 5
Chl a Carot. Chl a Carot.
( mg /L )
( mg /L )
4 4
3 3
Concentración
Concentración
2 2
1 1
0 0
Figura 26. Concentraciones de clorofila a, b y carotenoides medidas en extractos de macroalga,

mediante exposición a tratamientos de radiación a distintos tiempo, siendo: A) UV-B y PAR en Ulva
sp., B) UV-B y PAR en Gracilaria chilensis. Las muestras fueron recolectadas en el mes de
Octubre. Los valores son promedio n= 3 ± D.E.
76
4.2.1.3. Ficobiliproteínas:
Las concentraciones obtenidas de las ficobiliproteínas, presentes en la división

Rodophyta (algas rojas), donde se analizó la ficoeritrina (R-PE) de la macroalga Gracilaria
chilensis, la cual fue expuesta a diferentes tratamiento de radiación. Se evidenció en
experimento realizado en el mes Agosto la concentración de ficoeritrina en las algas
tratadas con UV-B desde el inicio de la exposición disminuyó paulatinamente hasta las
24 h, aumentando a las 48 h de 0,076 a 0,150 mg/gPS, para luego disminuir hasta el 6 d
de exposición a la radiación, observándose un aumento de 0,076 a 0,185 mg/gPS de la
concentración de la R-PE en las algas irradiadas solo con PAR, a las 48 h, disminuyendo
también al 6 d de exposición (p < 0.05, ANOVA, Tukey HSD test; Tabla 12a). Es decir en
el tratamiento UV-B aumentó 0,074 veces y con PAR 0,109; se puede decir que hay
diferencia entre ambos tratamientos, observándose una disminución drástica de la
concentración de la ficoeritrina debido al exceso de UV-B. En el caso del experimento del
mes de Octubre realizado bajo las mismas condiciones que el del mes de Agosto
(Fig. 27). Se evidenció un aumento de la concentración de R-PE desde el inicio de la
exposición a la radiación en ambos tratamientos, a las 48 h en el tratamiento UV-B
aumento de 0,106 a 1,171 mg/gPS, en cambio en el tratamiento solo con PAR de 0,106 a
0,157 mg/gPS. Al comparar ambos tratamientos de radiación a la que fueron sometidas
las algas se observa un mayor aumento en UV-B con 0,065 veces respecto a la irradiación
con PAR de 0,051(p < 0,05; Tabla 12b), al 6 d de exposición se evidenció una drástica
disminución de la concentración de R-PE en el tratamiento UV-B y un aumento en el
tratamiento PAR, concordando con lo observado en el experimento del mes de Agosto.
77
Tabla 12a. Determinación de la concentración de ficoeritrina (mg/gPS) por el método de Beer &
Eschel (1985), en extractos de macroalga Gracilaria chilensis, tratadas con radiación UV-B y PAR,
en el mes de Agosto, por medio de espectrofotometría UV/Visible a 455, 564 y 592 nm en los
diferentes tiempos de exposición a los tratamientos de radiación. Los valores son promedio n= 3 ±
D.E. Se indican los resultados de un análisis de ANOVA de 2 Vías. Letras similares indican

exposición R-PE
Inicial 0,076± 0,021
6h 0,051± 0,019
UV-B 24 h 0,038± 0,013
48 h 0,150± 0,021
6d 0,023± 0,009
Agosto ___________________________________________________________
Inicial 0,076 ± 0,021a,b,c
6h 0,183 ± 0,037a
PAR 24 h 0,186 ± 0,020b
48 h 0,185 ± 0,039c
6d 0,126 ± 0,024
ANOVA 2 VÍAS Tratamiento Tiempo Trat * Tiempo

Mean SS 0,00046 0,00028 0,00022
F 56 9 7
(1,20), 4,20
p-level p<0,001*** p<0,001*** p<0,001***
R-PE: R-Ficoeritrina
*P < 0,05; **P < 0,01; ***P < 0,001*** (NS) valores no significativos, P > 0,05
78
Tabla 12b. Determinación de la concentración de ficoeritrina (mg/gPS) por el método de Beer &
Eschel (1985), en extractos de macroalga Gracilaria chilensis, tratadas con radiación UV-B y PAR,
en el mes de Octubre, por medio de espectrofotometría UV/Visible a 455, 564 y 592 nm en los
diferentes tiempos de exposición a los tratamientos de radiación. Los valores son promedio n= 3 ±

exposición R-PE
Inicial 0,106± 0,106
6h 0,133± 0,133
UV-B 24 h 0,160± 0,160
48 h 0,171± 0,171
6d 0,044± 0,044
Octubre ___________________________________________________________
Inicial 0,106± 0,012
6h 0,163± 0,022
PAR 24 h 0,178± 0,047
48 h 0,157± 0,036
6d 0,199± 0,027
ANOVA 2 VÍAS Tratamiento Tiempo Trat * Tiempo

Mean SS 0,00048 0,00012 0,00022
F 6 2 4
(1,20), 4,20
p-level p<0,05* p<0,05* p<0,05*

R-PE: R- Ficoeritrina
79
A) B)
0,28 0,28
UV-B PAR UV-B PAR
(mg /gPS )
( mg /gPS )
0,24 0,24
0,2 0,2
0,16 0,16
0,12 0,12
Concentración
Concentración
0,08 0,08
0,04 0,04
0 0
Figura 27. Concentraciones de ficoeritrina (R-PE) en extractos de macroalga Gracilaria chilensis

obtenidas, mediante el espectrofotómetro UV/Visible SCINCO. Las determinaciones fueron
realizadas mediante exposición a tratamientos de radiación (UV-B y PAR) a distintos tiempos.
A) experimento del mes de Agosto, B) experimento del mes de Octubre. Los valores son
promedio n= 3 ± D.E.
4.3.2. HPLC
4.3.2.1. Pigmentos fotosintéticos en las macroalgas:
Las concentraciones obtenidas para los distintos pigmentos fotosintéticos

analizados en ambas especies de macroalgas mediante la técnica de RP-HPLC a través
de los cromatogramas (Fig. 30-31), presentaron una variación según los distintos tiempos
de exposición a la radiación. En el experimento realizado en el mes de Agosto se observó
los contenidos de Chl a al inicio son mayores en la especie de Ulva sp. (5,608 mg/gPS) en
relación a Gracilaria chilensis (0,897 mg/gPS). En el caso de la Chl b presente solo en
Ulva se observó menor concentración con (0,777 mg/gPS) respecto a la Chl a. La
concentración de β-caroteno es similar en ambas especies (31,983 mg/gPS) (32,268
mg/gPS) para Ulva y Gracilaria respectivamente, a las pocas horas de exposición mantuvo
una concentración similar (Fig. 28), para luego aumentar al sexto día de exposición a la
radiación en una mayor proporción las muestras tratadas con UV-B en exceso respecto a
80
aquellas muestras tratadas solo con PAR para la especie Ulva (81,656 mg/gPS) (47,206
mg/gPS), en el caso de Gracilaria no presentó un aumento considerable respecto a su
concentración inicial siendo estas (27,802 mg/gPS) en UV-B y (13,881 mg/gPS) en PAR.
Cabe destacar que en la especie de Ulva a las 6 h de exposición a la radiación en PAR
ocurrió un aumento excesivo en la producción de β-caroteno presentado un valor de
(117,592 mg/gPS), lo cual se pudo deber a una fotoaclimatación del alga al exceso de
radiación (p < 0.05, ANOVA, test Tukey HSD; Tabla 13a-14a). En el caso del experimento
realizado en el mes de Octubre se evidenció lo opuesto al realizado en Agosto, los
contenidos de Chl a aumentaron en la especie de Ulva, siendo (14,445 mg/gPS), en el
caso de Gracilaria se mantuvo prácticamente igual que en el experimento de agosto con
una concentración de (0,874 mg/gPS). La Chl b siguió la misma tendencia que la Chl a
aumentado su contenido en (3,053 mg/gPS) (Fig. 29). Respecto al β-caroteno se apreció
una mayor concentración al inicio de la exposición a la radiación (12,088 mg/gPS) (6,526
mg/gPS) para ambas microalgas, Ulva y Gracilaria respectivamente (p < 0,05; Tabla 13a-
14b), el cual fue disminuyendo gradualmente hasta el sexto día, evidenceándose un
aumento debido al estrés UV-B respecto a PAR. Se aprecia que la concentración del
β-caroteno difiere drásticamente en ambos experimentos.
81
Tabla 13a. Concentraciones de pigmentos fotosintéticos (mg/gPS) en extractos de macroalga

Ulva sp. tratadas con radiación UV-B y PAR, en el mes de Agosto. Estas fueron analizadas con
HPLC fase reversa detectados a una longitud de onda de 450 nm con un detector UV/visible, a
temperatura ambiente y con una gradiente modificada de solventes: a) acetonitrilo-metanol-buffer
Tris HCL 0,1 M pH 8,0 b) metanol-acetato de etilo. Los valores son promedio n= 3 ± D.E. Se
indican los resultados de un análisis de ANOVA de 2 Vías. Letras similares indican diferencias
Especie Tratamiento Tiempo Concentración (mg/gPS)

exposición Chl a Chl b β-carot
Inicial 5,608± 1,171 0,777± 0,185 31,983± 0,262
6h 5,021± 1,011 0,787± 0,212 17,143± 1,148
UV-B 24 h 6,677± 1,119 0,991± 0,173 22,537± 0,620
48 h 4,886± 1,114 0,934± 0,344 24,105± 0,792
6d 5,152± 0,632 0,780± 0,208 81,656± 9,136
Agosto _______________________________________________________________________
Inicial 5,608± 1,171a 0,777± 0,185a 31,983± 0,262
6h 6,648± 1,018 0,897± 0,147 117,592± 2,758
PAR 24 h 11,682± 3,238 2,590± 0,705 26,294± 4,230
48 h 7,626± 0,890 1,270± 0,315 52,244± 3,607
6d 6,110± 0,585a 0,288± 0,191a 47,206± 2,812

Mean SS Chl a 0,00594 0,00901 0,00323
Chl b 0,00594 0,00901 0,00323
β-carot 0,00594 0,00901 0,00323
F Chl a 17,79 6,75 2,42
(1,20),4,20
Chl b 17,79 6,75 2,42

β-carot 17,79 6,75 2,42
p-level Chl a p<0,001*** p<0,001*** p<0,001***
Chl b p<0,001*** p<0,001*** p<0,001***
β-carot p<0,001*** p<0,001*** p<0,001***
Chl a: Clorofila a; Chl b: Clorofila b; β-carot: β-caroteno
82
Tabla 13b. Concentraciones de pigmentos fotosintéticos (mg/gPS) en extractos de macroalga

Ulva sp tratadas con radiación UV-B y PAR, en el mes de Octubre. Estas fueron analizadas con
HPLC fase reversa detectados a una longitud de onda de 450 nm con un detector UV/visible, a
temperatura ambiente y con una gradiente modificada de solventes: a) acetonitrilo-metanol-buffer
Tris HCL 0,1 M pH 8,0 b) metanol-acetato de etilo. Los valores son promedio n= 3 ± D.E. Se
indican los resultados de un análisis de ANOVA de 2 Vías. Letras similares indican diferencias
Especie Tratamiento Tiempo de Concentración (mg/gPS)

exposición Chl a Chl b β-carot
Inicial 14,445 ± 0,971a,b,c 3,053± 0,146a,b,c 12,088 ± 0,521a
6h 15,430± 2,750 2,883± 0,721 12,505± 1,635
UV-B 24 h 9,5218±1,615a 1,266± 0,195a 2,208 ± 0,199
48 h 7,0171±1,219b 0,9482± 0,166b 1,262 ± 0,018a
6d 5,4481± 0,937c 1,1595± 0,581c 2,383± 1,092
Octubre _______________________________________________________________________
Inicial 14,445 ± 0,097a,b,c 3,053± 0,146a,b,c 12,088 ± 0,521a
6h 13,361± 0,860 3,149± 0,073 11,063 ± 0,476a
PAR 24 h 6,5199± 0,488a 1,337± 0,114 a 4,233± 0,819
48 h 9,1632± 0,100b 1,951± 0,101b 6,762± 0,936
6d 3,8532± 0,842c 0,501± 0,107c 7,245± 0,239

Mean SS Chl a 0,00066 0,04412 0,00275
Chl b 0,00066 0,04412 0,00275
β-carot 0,00224 0,03188 0,00382
F Chl a 4,5 75,9 4,7
(1,20),4,20
Chl b 4,9 75,9 4,7

β-carot 2,84 10,10 1,21
p-level Chl a p<0,001*** p<0,001*** p<0,001***
Chl b p<0,001*** p<0,001*** p<0,001***
β-carot p<0,001*** p<0,001*** p<0,001***
Chl a: Clorofila a; Chl b: Clorofila b; β-carot: β-caroteno
83
Tabla 14a. Concentraciones de pigmentos fotosintéticos (mg/gPS) en extractos de macroalga

analizadas con HPLC fase reversa detectados a una longitud de onda de 450 nm con un detector
UV/visible, a temperatura ambiente y con una gradiente modificada de solventes: a) acetonitrilo-
metanol-buffer Tris HCL 0,1 M pH 8,0 b) metanol-acetato de etilo. Los valores son promedio n= 3 ±
Estación Tratamiento Tiempo Concentración (mg/gPS)

exposición Chl a β-carot
Inicial 0,897± 0,057a,b 32,268 ± 0,538 a,b

6h 0,723± 0,020b 30,675 ± 1,968b
UV-B 24 h 0,824± 0,096 25,496± 2,744
48 h 1,031± 0,020 15,102± 0,370
6d 0,627± 0,033a 27,802 ± 1,580a
Agosto _________________________________________________________________
Inicial 0,897± 0,057a,b 32,268 ± 0,538a,b
6h 0,745± 0,048 22,221 ± 2,707b
PAR 24 h 1,020± 0,009 16,316± 0,640
48 h 1,126± 0,106 15,173± 0,595
6d 0,665± 0,107a 13,881 ± 1,972a

Mean SS Chl a 0,00008 0,00175 0,00008
β-carot 0,00008 0,00175 0,00008
F Chl a 9 47 2
(1,20),4,20
B-carot 9 47 2
p-level Chl a p<0,001*** p<0,001*** p<0,001***
β-carot p<0,001*** p<0,001*** p<0,001***
Chl a: Clorofila a; β-carot: β-caroteno
84
Tabla 14b. Concentraciones de pigmentos fotosintéticos (mg/gPS) en extractos de macroalga

analizadas con HPLC fase reversa detectados a una longitud de onda de 450 nm con un detector
UV/visible, a temperatura ambiente y con una gradiente modificada de solventes: a) acetonitrilo-
metanol-buffer Tris HCL 0,1 M pH 8,0 b) metanol-acetato de etilo. Los valores son promedio n= 3 ±
Estación Tratamiento Tiempo Concentración (mg/gPS)

exposición Chl a β-carot
Inicial 0,874± 0,115a,b,c 6,526 ± 0,263a,b

6h 0,574± 0,041 5,230± 0,738
UV-B 24 h 0,369± 0,046c 2,393± 0,256
48 h 0,414± 0,082b 0,940 ± 0,163b
6d 0,157± 0,061a 0,709 ± 0,046a
Octubre _________________________________________________________________
Inicial 0,874± 0,115a,b 6,526± 0,263a,b
6h 0,502± 0,026 1,207± 0,296
PAR 24 h 0,501± 0,026 1,137± 0,100
48 h 0,416± 0,031b 1,793 ± 0,319b
6d 0,306± 0,014a 4,059 ± 0,226a

Mean SS Chl a 0,00007 0,00202 0,00021
β-carot 0,00007 0,00202 0,00021
F Chl a 10 72 7
(1,20), 4,20
β-carot 10 72 7
p-level Chl a p<0,001*** p<0,001*** p<0,001***
β-carot p<0,001*** p<0,001*** p<0,001***
Chl a: Clorofila a; β-carot: β-caroteno.
85
A)
UV-B PAR
120 120
(mg /gPS )
(mg /gPS )
Chl a Chl b β-carot 100

100
80 80
60 60
Concentración
Concentración
40 40
20 20
0 0
B)
UV-B PAR
40
40
(mg /gPS )
Chl a β-carot (mg /gPS )

Chl a β-carot
30 30
20 20
Concentración
Concentración
10 10
0 0
Tiempo de exposición Tiempo del exposición
Figura 28. Concentraciones de pigmentos fotosintéticos medidas en extractos de macroalga, en

30 mg de muestra peso seco, según los tratamientos de radiación. En análisis se realizó mediante
HPLC (Hewlett Packard serie 1100 Agilent) fase reversa. A) UV-B y PAR en Ulva sp. B) UV-B y
PAR en Gracilaria chilensis. Las muestras fueron recolectadas en el mes de Agosto. Los valores
86
A)
UV-B PAR
20 20
Chl a Chl b β-carot Chl a Chl b β-carot
16 16
Concentración (mg/gPS)
Concentración (mg/gPS)
12
12
8 8
4
4
0
0
Incial 6h 24 h 48 h 6d
Incial 6h 24 h 48 h 6d
B)
UV-B PAR
8 8
(mg /gPS )
( mg /gPS )
Chl a β-carot Chl a β-carot
6 6
4 4
Concentración
Concentrcaión
2 2
0 0
Figura 29. Concentraciones de pigmentos fotosintéticos medidas en extractos de macroalga, en

30 mg de muestra peso seco, según los tratamientos de radiación. En análisis se realizó mediante
HPLC (Hewlett Packard serie 1100 Agilent) fase reversa. A) UV-B y PAR en Ulva sp, B) UV-B y
PAR en Gracilaria chilensis. Las muestras fueron recolectadas en el mes de Octubre. Los valores
87
Figura 30. Cromatogramas de los pigmentos fotosintéticos en extractos de macroalga A) Ulva sp.
B) Gracilaria chilensis en los distintos tiempos de exposición a la radiación, recolectadas en el mes
de Agosto. Resuelto por HPLC (Hewlett Packard serie 1100 Agilent) fase Reversa. Volumen de
-1
88
Figura 31. Cromatogramas de los pigmentos fotosintéticos en extractos de macroalga A) Ulva sp.
B) Gracilaria chilensis en los distintos tiempos de exposición a la radiación, recolectadas en el mes
de Octubre. Resuelto por HPLC (Hewlett Packard serie 1100 Agilent) fase Reversa. Volumen de
-1
89
4.3. Efecto de la radiación UV sobre la fotosíntesis de macroalgas de la zona de

Niebla.
4.3.1 Rendimiento Cuántico Máximo (Fv/Fm):
Los valores de Fv/Fm obtenidos en las macroalgas Ulva sp., pertence a la división
Chlorophyta y Gracilaria chilensis a la Rodophyta, el cual representa la eficiencia
fotosintética del alga adaptado a la oscuridad, variaron durante los distintos tiempos de
exposición a la radiación en los diferentes tratamientos. Los resultados muestran una
mayor sensibilidad al tratamiento UV-B respecto al PAR. En el experimento realizado en el
mes de Agosto, fue posible observar una disminución paulatina de este parámetro desde
el inicio hasta el sexto día de exposición a radiación, en Ulva (Fig. 32). En el caso de la
Gracilaria también ocurre un descenso, partiendo desde el inicio hasta el sexto día a la
exposición a radiación, los valores de Fv/Fm sufren un descenso considerable respecto al
valor inicial (p < 0.05, ANOVA, test Tukey HSD; Tabla 15a). Adicionalmente se evidenció
la presencia de cistocarpos al final del tiempo de exposición a la radiación en ambos
tratamientos.
En ambas especies de macroalgas Ulva y Gracilaria la exposición a la radiación
provocó despigmentación, en mayor proporción en Gracilaria. En el caso del experimento
realizado en el mes de Octubre se apreció la misma tendencia en los valores del
rendimiento cuántico máximo, en ambas especies de macroalgas disminuyeron en forma
paulatina desde el inicio hasta finalizar el experimento (p < 0.05, ANOVA, test Tukey HSD;
Tabla 15b), en el caso de Gracilaria ocurrió en mayor proporción respecto a Ulva.
(Fig. 33) Repitiéndose la formación de cistocarpos nuevamente en esta macroalga.
Además de la despigmentación en ambas.
90
Tabla 15a. Efecto de la radiación UV el rendimiento cuántico máximo (Fv/Fm) medidos en

extractos de macroalga Ulva sp. y Gracilaria chilensis. Las determinaciones fueron realizadas
mediante exposición a tratamientos de radiación a distintos tiempos, en el mes de Agosto. Los
valores son promedio n= 3 ± D.E. Se indican los resultados de un análisis de ANOVA de 2 Vías.
Letras similares indican diferencias significativas (p<0,05) según el test de Tukey HSD.
Período Tratamiento Tiempo Fv/Fm

exposición Ulva Gracilaria
Inicial 0,770± 0,020 a 0,695± 0,039
6h 0,683± 0,047 0,624± 0,034
UV-B 24 h 0,658± 0,069 0,581± 0,051
48 h 0,622± 0,125 0,61± 0,067
6d 0,592± 0,057a 0,209± 0,043a
Agosto _______________________________________________________________________
Inicial 0,770± 0,020a 0,695± 0,039
6h 0,748± 0,024 0,664± 0,035
PAR 24 h 0,739± 0,038 0,624± 0,060
48 h 0,725± 0,036 0,501± 0,047
6d 0,572± 0,033a 0,338± 0,081a
ANOVA 2 VÍAS Especie Tratamiento Tiempo Trat * Tiempo

Mean SS Ulva 0,00005 0,00046 0,00004
Gracilaria 0,00004 0,00461 0,00036
F Ulva 22 49 5
(1,110), 4,110
Gracilaria 15 42 32
p-level Ulva p<0,001*** 1<0,001*** 1<0,001***
Gracilaria p<0,001*** 1<0,001*** 1<0,001***
91
Tabla 15b. Efecto de la radiación UV el rendimiento cuántico máximo (Fv/Fm) medidos en

mediante exposición a tratamientos de radiación a distintos tiempos, en el mes de Octubre. Los
valores son promedio n= 3 ± D.E. Se indican los resultados de un análisis de ANOVA de 2 Vías.
Letras similares indican diferencias significativas (p<0,05) según el test de Tukey HSD.
Período Tratamiento Tiempo Fv/Fm

exposición Ulva Gracilaria
Inicial 0,725± 0,033a 0,636± 0,049a

6h 0,649± 0,065 0,615± 0,056
UV-B 24 h 0,664± 0,083 0,558± 0,093
48 h 0,665± 0,059 0,559± 0,092
6d 0,621± 0,108a 0,405± 0,118a
Octubre
Inicial 0,725± 0,033a 0,636± 0,049a
6h 0,723± 0,040 0,591± 0,101
PAR 24 h 0,706± 0,052 0,626± 0,046
48 h 0,657± 0,094 0,645± 0,037
6d 0,559± 0,084a 0,448± 0,099a

Mean SS Ulva 0,0000 0,00025 0,00011
Gracialaria 0,00003 0,00084 0,00006
F Ulva 0 15 6
(1,110), 4,110
Gracilaria 4 29 2
p-level Ulva p<0,001*** 1<0,001*** 1<0,001***
Gracilaria p<0,001*** 1<0,001*** 1<0,001***
92
A) B)
1,2 1,2
0,8 0,8
Fv/Fm
Fv/Fm
0,4 0,4
UV-B PAR UV-B PAR
0 0
Figura 32. Parámetros de fluorescencia (Fv/Fm: rendimiento cuántico máximo) medidos en

extractos de macroalga A) Ulva sp. y B) Gracilaria chilensis, mediante el fluorímetro de amplitud
modulada PAM 2000. Las determinaciones fueron realizadas a través de exposición a radiación a
distintos tiempos. Las muestras fueron recolectadas en el mes de Agosto. Los valores son
A) B)
1,2 1,2
0,8 0,8
Fv/Fm
Fv/Fm
0,4 0,4
UV-B PAR UV-B PAR

0 0
Figura 33. Parámetros de fluorescencia (Fv/Fm: rendimiento cuántico máximo) medidos en

extractos de macroalga A) Ulva sp.y B) Gracilaria chilensis, mediante el fluorímetro de amplitud
modulada PAM 2000. Las determinaciones fueron realizadas a través de exposición a radiación a
distintos tiempos. Las muestras fueron recolectadas en el mes de Octubre. Los valores son
93
4.3.2 Tasa de transporte de electrones (ETR):
Los valores obtenidos en términos de la tasa de transporte de electrones en las

macroalgas Ulva sp. y Gracilaria chilensis, que representa el tránsito de los electrones a
través de los diferentes componentes del aparato fotosintético, fue determinada utilizando
las curvas ETR v/s radiación, como se muestra en las figuras 34-35. Se observó que el
ETR varió durante los distintos tiempos de exposición a la radiación entre los diferentes
tratamientos, observándose el mismo comportamiento que sufrió el rendimiento cuántico
máximo (Fv/Fm). Los resultados también muestran una mayor sensibilidad al tratamiento
UV-B respecto al PAR. En el experimento realizado en el mes de Agosto, se apreció que
ambas especies de macroalgas: Ulva y Gracilaria exhiben las mayores tasas de transporte
de electrones al inicio del experimento, observandose una disminución paulatina de este
parámetro (p < 0.05, ANOVA, test Tukey HSD; Tabla 16a) durante las 6 h hasta el sexto
día de exposición a radiación (Fig. 34), tanto para los tratamientos UV-B y PAR. En el
caso del experimento del mes de Octubre, se apreció el mismo comportamiento de este
parámetro bajo el efecto de la radiación (p < 0,005; Tabla 16b) los valores son menores en
este mes para ambas macroalgas en relación al realizado en el mes de Agosto, siendo
mayor el descenso en Gracilaria (Fig. 35). Presentado los valores al inicio en relación al
sexto día para Ulva y Gracilaria respectivamente.
94
Tabla 16a. Efecto de la radiación UV en la tasa de transporte de electrones (ETR) medidos en

mediante exposición a tratamientos de radiación a distintos tiempos, en el mes de Agosto. Los
valores son promedio n= 3. Se indican los resultados de un análisis de ANOVA de 2 Vías. Letras

Mean SS Ulva 0,00264 0,07150 0,00213
Gracilaria 0,00104 0,09726 0,00363
F Ulva 0,81 5,48 0,16
(1,100), 4, 100
Gracilaria 0,58 13,60 0,51

p-level Ulva p<0,05 p<0,001 p<0,956528 NS
Gracilaria p<0,001 p<0,001 p<0,05
Tabla 16b. Efecto de la radiación UV en la tasa de transporte de electrones (ETR) medidos en

mediante exposición a tratamientos de radiación a distintos tiempos, en el mes de Octubre. Los
valores son promedio. Se indican los resultados de un análisis de ANOVA de 2 Vías. Letras

Mean SS Ulva 0,01720 0,02946 0,01290
Gracilaria 0,00709 0,00809 0,00388
F Ulva 7,74 3,31 1,45
(1,100), 4,100
Gracilaria 29,8 8,5 4,1

p-level Ulva p<0,001*** p<0,01** p<0,01 **
Gracilaria p<0,001*** p<0,001*** p<0,001***
95
A)
30 UV-B PAR
30
25 25
20 Inicial 20 Incial
6h 6h
ETR
15
ETR
15
24 h 24 h
10 10
48 h 48 h
5
6d 5 6d
0 0
0 100 200 300 400 500 600 0 100 200 300 400 500 600
2
Radiación •m olm - s-
1
Radiación •m olm -2 s-1
B)
20 UV-B 20
PAR
15 15
Inicial Inicial
6h 6h
ETR
10 10
ETR
24 h 24 h
5 48 h 48 h
5
6d 6d
0 0
0 100 200 300 400 500 600 0 100 200 300 400 500 600
Radiación •m olm -2 s-1 2
1
Figura 34. Parámetros de fluorescencia ETR (Tasa de transporte de electrones) medidos en

extractos de macroalga, mediante el fluorímetro de amplitud modulada PAM 2000. Las
determinaciones fueron realizadas mediante exposición a radiación a distintos tiempos, siendo
A) Ulva sp, tratada con UV-B y PAR B) Gracilaria chilensis tratada con UV-B y PAR. Las muestras
fueron recolectadas en el mes de Agosto. Los valores son promedio n= 3.
96
A)
UV-B PAR
25 25
20 20
Inicial Inicial
15 6h 15 6h
ETR
ETR
10 24 h 24 h
10
48 h 48 h
5
6d 5 6d
0
0
0 100 200 300 400 500 600 0 100 200 300 400 500 600
2 1
Radiación •m olm - s- 2
1
B)
UV-B PAR
15 15
Inicial Inicial
10 10
6h 6h
ETR
24 h
ETR
24 h
5 48 h 5 48 h
6h 6d
0
0
0 100 200 300 400 500 600
0 100 200 300 400 500 600
2 1
Radiación •m olm - s- 2
1
Figura 35. Parámetros de fluorescencia ETR (Tasa de transporte de electrones) medidos en

extractos de macroalga, mediante el fluorímetro de amplitud modulada PAM 2000. Las
determinaciones fueron realizadas mediante exposición a radiación a distintos tiempos, siendo
A) Tratamiento UV-B y PAR en Ulva sp B) Tratamiento UV-B y PAR en Gracilaria chilensis. Las
muestras fueron recolectadas en el mes de Octubre. Los valores son promedio n= 3.
97
5.- DISCUSIÓN
Con la presente tesis se evaluó la composición espacial y temporal de los

pigmentos fotosintéticos presente en la columna de agua en la plataforma submareal de la
zona de Coihuín (Puerto Montt) y el efecto de la radiación UV sobre la fotosíntesis y
comportamiento de los pigmentos en macroalgas bentónicas representantes de dos
grupos taxonómicos: Ulva sp. (Chlorophyta) y Gracilaria chilensis (Rhodophyta).
La dinámica de los pigmentos (clorofilas, carotenoides y ficobiliproteínas) fue
analizada mediante técnicas espectrofotométricas (UV-Visible) y cromatográficas (HPLC
de fase reversa). Los resultados obtenidos mediante espectrofotometría permitieron
realizar un análisis cualitativo de los pigmentos a través de sus respectivas absorbancia.
Respecto a los pigmentos fotosintéticos se pudo observar el espectro característico de la
familia de los carotenoides con su banda espectral entre los 450 y 480 nm y el de las
clorofilas con dos picos máximos entre 422 con 666 nm y 475 con 645 nm, lo cual
corresponde a clorofila a y b respectivamente (Stryer, 2002). Estos espectros de absorción
obtenidos sugieren la presencia de determinados pigmentos, incluyendo en el espectro al
total de compuestos que absorben en un rango determinado de longitud de onda. Por ello,
se realizó la separación e identificación de algunos pigmentos, mediante un análisis
cualitativo y cuantitativo por medio de la técnica de HPLC fase reversa.
Las determinaciones de pigmentos en la columna de agua fueron complementadas
con estudios sobre el efecto de la radiación UV bajo condiciones de laboratorio sobre
pigmentos de algas bentónicas con el de evidenciar posibles cambios que puedan ser
extrapolados a la situaciones el ambiente natural. Como una forma de estimar
paralelamente el estatus fisiológico, fotosíntesis a través de la fluorescencia de la clorofila
del fotosistema II (PSII) fue medida (Henley et al., 1991; Schreiber et al., 1995; Hanelt,
1996; Häder & Figueroa, 1997).
98
5.0.1. Variación estacional y en profundidad de los pigmentos fotosintéticos en

muestras de fitoplancton de la zona de Coihuin.
La dinámica del fitoplancton en los ecosistemas acuáticos se encuentra afectada

por interacciones complejas, entre éstos por factores ambientales tales como radiación
solar, temperatura, salinidad, nutrientes así como geomorfométricas e hidrológicas del
área, entre ellas la conformación geográfica, circulación de las aguas y tasa de renovación
(Letelier et al. 1993; Ostrovsky & Yacobi 1999; Cardoso & Marques 2004).
En relación con la radiación solar, la columna de agua la atenúa fuertemente, por lo
tanto la cantidad de energía recibida en cualquier profundidad depende no sólo de la
luminosidad de la superficie, sino que también por la capacidad del cuerpo de agua de
absorber e interceptar los fotones, lo cual se estima a través del parámetro denominado
coeficiente de atenuación (Kd). Los componentes que atenúan la luz en el sistema acuático
son el agua, la materia disuelta especialmente el carbono orgánico disuelto (DOC),
material particulado (fitoplancton) y varios tipos de detritus (Kirk, 1994). En la zona de
Coihuín, los perfiles de radiación solar sub-acuática de un día soleado de verano indican
una penetración de la radiación PAR hasta profundidades cercanas a 40 m, mientras la
radiación UV-A y UV-B se atenúan a profundidades de 12 y 5 m, respectivamente
(Fig. 12).
En general, la radiación solar en el medio acuático sufre constantes variaciones
espacio-temporales en calidad y cantidad. En el caso de la radiación fotosintéticamente
activa (PAR), variaciones estacionales y locales ocurren, las cuales son debido a
nubosidad, la acción de las olas, el grado de turbidez. Aunque normalmente los
organismos sufren déficit de luz para realizar fotosíntesis, existen períodos en los cuales
ellos son expuestos a altas irradiancias en la superficie, lo cual puede conllevar a procesos
de fotoinhibición afectando la abundancia y biomasa en dichas capas (Kirk, 1994).
Las fluctuaciones de las concentraciones de los distintos pigmentos fotosintéticos
presentes en la columna de agua en la plataforma submareal de Coihuín (Puerto Montt)
experimentaron una variación estacional. Sin embrago, hubo diferencias entre los dos
métodos utilizados para cuantificarlos: Por ejemplo, mientras que por el método
espectrofotométrico, las clorofilas fueron los pigmentos dominantes, el uso de HPLC
99
evidenció una predominancia de los carotenoides (β-caroteno). Estas diferencias

claramente indican la mayor sensibilidad del método de HPLC para detectar pigmentos
absorbiendo en rangos menores a 500 nm.
En el caso de los pigmentos medidos por el método espectrofotométrico, se
observó mayores concentraciones de pigmentos en la estación de primavera y menores
valores en invierno en las capas superiores de la columna de agua (hasta 15 m). Este
patrón coincide con la dinámica estacional del fitoplancton en regiones templadas descrita
por Raymont (1980) y Neshba (1987), basándose en la condición de mezcla o
estratificación que presenta la columna de agua, condiciones que se pueden determinar a
partir de variables de temperatura y salinidad. Los aumentos en las concentraciones de los
distintos pigmentos fotosintéticos, lo cual ocurrió similar en cada uno de ellos, se explicaría
por aumentos en las condiciones de luminosidad y mayor disponibilidad de nutrientes
luego del invierno en la zona. Debido a que la concentración de pigmentos detectada por
los diferentes métodos y fórmulas incrementa en función de la luz, estos valores
indudablemente pueden ser correlacionados con aumentos en el número de células en la
columna de agua más que con incrementos en la concentración de pigmentos por célula.
Es interesante identificar que a profundidades entre 5 y 15 m, los valores de feopigmentos
pueden llegar a ser mayores que la Chl a, sobre todo en verano, cuando una mayor
estratificación de la columna de agua. La resolución usando HPLC, indica mayores valores
de carotenoides durante primavera, mientras que Chl a y b varían en menor grado, aunque
también significativamente.
Considerando la profundidad, los resultados indicaron que una profundidad de 70 m
se observó una mayor concentración de los distintos pigmentos medidos por
espectrofotometría durante invierno, presentando un menor valor en el otoño. Estos
valores contrastan con los patrones observados en la columna de agua y no se
correlacionan con el régimen de sedimentación en la zona. Por un lado, durante invierno
tanto la concentración de pigmentos disponible para sedimentar y la tasa de
sedimentación son menores, por lo tanto seria esperable encontrar menores
concentraciones de pigmentos en este período. Sin embargo, si los valores son calculados
en términos de masa, las tendencias se invierten (valores decrecen en invierno) y reflejan
100
mejor la tendencia esperada. Lo que es claro, es el aumento de los feopigmentos en

relación a la Chl a, lo cual se acentúa en invierno.
En el caso de los valores medidos usando HPLC, carotenos y chls tienen un
comportamiento antagónico: carotenos aumentan en primavera verano, mientras que
clorofila a y b aumentan en invierno. Se podría especular que estas diferencias se pueden
deber a diferencias en el grado de descomposición: mientras las clorofilas decrecen en
función de un aumento de los feopigmentos, los carotenoides se mantienen estables por
mayor tiempo, por lo que pueden ser detectados a mayores profundidades.
Alternativamente, un aumento de los carotenoides durante primavera verano podría estar
asociada a mecanismos de fotoprotección, ya que estos compuestos absorben bien a
rangos de UV (ver adelante).
5.0.2. Efecto de la radiación UV sobre los pigmentos fotosintéticos de macroalgas de

la zona de Niebla.
En las macroalgas existen tres pigmentos fotosintéticos que se encuentran

directamente involucrados en el proceso de la fotosíntesis: clorofilas, ficobiliproteínas y
carotenoides, organizados en antenas, las cuales están alrededor de los centros de
reacción (Chl a), cuya función es transformar la energía fotónica en electroquímica
(Strasburger, 1994).
El efecto producido por la exposición a la radiación UV-B sobre los pigmentos de
macroalgas deben ser analizados usando distintos niveles: a) las diferencias entre los
organismos dado por su status taxonómico y por ende la composición intrínseca de sus
pigmentos; b) los características morfo-funcionales y ecológicas de ambas especies que
están dadas principalmente por su distribución en la zona intermareal y sus morfología y
c) las diferencias entre los métodos de medida de los pigmentos.
En general, durante los experimentos de exposición a la radiación UV realizados en
el mes de Agosto (invierno) se observó un incremento inicial (hasta las 24h) seguido de
una disminución en el contenido de las Chl a al final de 6 d. Este patrón se observó en
ambas especies, Ulva sp. y Gracilaria chilensis y en los tratamiento (con y sin UV-B). El
incremento inicial podría estar asociado a una aclimatación rápida de los pigmentos que
101
respondería al cambio de ambiente lumínico desde el natural (altos niveles de radiación

solar PAR) al de laboratorio caracterizado normalmente por irradiancias de PAR menos de
120 µmol m-2 s-1. En Ulva en el Mediterráneo, disminuciones en la concentración de
clorofilas tambien han sido demostradas (Figueroa et al. 2003). Aparentemente, la
disminución en la concentración de Chl a y b en tanto se podría relacionar con una foto-
oxidación o bien a una disminución en su biosíntesis, siendo afectada en una mayor
proporción la concentración de la Chl b respecto de la Chl a, lo cual concuerda con lo
reportado por Kulandaivelu et al. (1996). Se debe indicar, que los feopigmentos fueron
mucho más altos en Ulva sp. comparado con Gracilaria chilensis y durante los meses de
invierno (Agosto). A lo largo del período de incubación ellos decrecen de forma más
acentuada que las clorofilas. Tales respuestas pueden estar definidas en términos del
impacto indirecto de la UV sobre las clorofilas, principalmente sobre proteínas del tilacoide
y por las condiciones experimentales: las bajas irradiancias en el laboratorio pudieron
inducir procesos de fotoaclimatación (incremento de pigmentos), compensando por
disminuciones producto de la radiación UV.
En el caso de los carotenoides, ellos decrecieron en ambos periodos de tiempo
(Agosto y Octubre) y usando ambos métodos de análisis (espectrofotometría y RP-HPLC)
lo cual difirió de la situación observada en las Chls. Si bien es cierto se ha reconocido que
los carotenoides cumplen importantes funciones en las macroalgas como un filtro natural
de luz, evitando el fotoblanqueamiento de la clorofila, y como antioxidante inactivando
posibles radicales libres generados por acción del exceso UV-B en la membrana
fotosintética (Greenberg et al.1997; Gotz et al. 1999), los resultados encontrados en las
exposiciones a la UV no apoyan esta hipótesis, pues en general los valores disminuyeron.
En el caso de las ficobiliproteínas en Gracilaria chilensis, cuya función principal es
la captación y conducción de luz hasta los centros de reacción fotosintéticos (Glazer,
1989), los resultados indicaron que luego de un incremento significativo al cabo de 24 h,
finalmente al cabo de 6 d, los valores en algas expuestas a UV-B disminuyen
significativamente. En el caso de PAR, los valores de ficobiliproteínas no decrecen de
forma significativa. Se debe enfatizar que los contenidos de ficoeritrina y ficocianina son
altamente variable y por ejemplo pueden ser relacionados con la composición del
ficobilisoma, el cual varía de un organismo a otro siendo muy sensible a distintos factores
102
ambientales, como es el caso de algunos de los filamentos de cianobacteria, que pueden

cambiar la composición del ficobilisoma en respuesta a las longitudes de onda frecuentes
de la luz en el ambiente, lo que le permite estos organismos utilizar eficazmente la energía
ligera disponible de conducir el transporte de electrones fotosintético y la fijación de CO
2
según lo reportado por Grossman et al., (1993).

Por otro lado, cuando se analiza la susceptibilidad diferencial de ambas especies se
observo que Gracilaria chilensis siempre tuvo menores valores de pigmentos y sus
variaciones fueron menores que en el caso de Ulva. Los factores explicativos son
múltiples, sin embargo, por su ubicación en el mesomareal Ulva sp. es un alga muy
adaptada a cambiantes condiciones lumínicas y por lo tanto fuertes cambios en las
concentraciones de pigmentos son esperables. Gracilaria chilensis estudiada aquí, en
cambio, constituye una población intermareal de fase gametofítica, no dominante en
condiciones naturales (Gracilaria principalmente habita en ambientes de fondos blandos),
y por lo tanto quizás representa una población marginal menos adaptada al ambiente
intermareal y por ello con menor aclimatación potencial de pigmentos.
Tomando en consideración las dosis de radiación UV-B aplicadas (ejemplo 200-400
kJ m-2 UV-B luego de 24-48 h), las cuales exceden a los niveles medidos en un día de
verano en Valdivia (100 kJ m-2), las reducciones en pigmentación constituyen situaciones
extremas para las algas en condición natural. Sin embargo, dosis a las 12 h (101 kJ m-2)
son similares a las del ambiente natural y en varios casos se observó disminución de
pigmentación a estas dosis. Se debe destacar que estas experiencias sirven de referencia
para poder identificar posibles factores actuando sobre los pigmentos y que efectivamente
estos disminuyen en presencia de altas dosis de radiación solar. Esto finalmente afectará
la composición pigmentaria en la columna de agua.
5.0.3. Efecto de la radiación UV sobre la fotosíntesis de macroalgas de la zona de

Niebla.
El rendimiento cuántico máximo (Fv/Fm) fue afectado por la exposición a la

radiación UV y PAR en el laboratorio disminuyendo paulatinamente. Estos resultados no
son indicativos del fenómeno denominado “fotoinhibición de la fotosíntesis”, ya que la
103
exposición fue a muy baja irradiancia de PAR (cerca de 100 µmol m-2 s-1). El proceso de
fotoinhibición que exhiben las algas en respuesta a un exceso de radiación (Figueroa &
Gómez, 2001), es un mecanismo fotoprotector caracterizado por una des-excitación del
aparato fotosintético, donde se inactiva el fotosistema II (PSII) cuando la radiación PAR
excede la capacidad de transportes de electrones (Krause, 1988; Henley et al., 1991;
Hanelt, 1998; Anderson et al., 1997). En general, no se encontraron diferencias entre
ambos tratamientos ni tampoco entre los dos meses analizados. Estos resultados sugieren
que las algas son capaces de aclimatar su maquinaria fotosintética a las crecientes dosis
de UV y confirman resultados previos observados en una serie de especies del litoral de
Valdivia, donde exposiciones a condiciones naturales de UV en el verano fueron poco
efectivas para causar importantes disminuciones del rendimiento cuántico (Gómez et al.
2004). Aparentemente la disminución en la fotosíntesis luego de 6 d pudo estar asociada a
una adecuación a los bajos niveles de PAR más que a un efecto deletéreo de la radiación
UV.
La tasa de transporte de electrones (ETR) fue mayor en Ulva sp. que en Gracilaria
chilensis y en el término de los diferentes tratamientos. Durante los experimentos de
Agosto, Gracilaria chilensis mostró las mayores disminuciones con respecto al valor
medido inicialmente. En el mes de Octubre, el transporte de electrones medido en
Gracilaria fue bajo, lo cual pudo estar indicando que estas macroalgas presentaban algún
grado de estrés crónico, el cual se prolongo durante las exposiciones. En este sentido, los
menores valores de ETR en primavera en relación al invierno podrían ser explicados por
un mayor amortiguamiento no fotoquímico (asociado a una disipación por calor), debido a
que las macroalgas deben adaptarse a altos niveles de luz. Tomando en consideración las
diferencias entre ambas especies, resulta interesante observar que los valores de ETR
medidos en Ulva sp. fueron relativamente constantes entre Agosto y Octubre, lo cual
confirma previos estudios realizados por Huovinen et al. (2006). Estos autores reportaron
que mientras el alga verde Enteromorpha intestinales, que habita el mesomareal, presenta
valores constantes de fotosíntesis a lo largo del año, algas como Macrocystis pyrifera,
cuya distribución se centra en el limite de la zona intermareal.
A diferencia del fitoplancton las macroalgas bentónicas son sésiles y deben
adaptarse rápidamente a las variaciones lumínicas que se imponen en el ambiente
104
intermareal. Además cabe destacar que ambas especies de macroalgas estudiadas

pertenecen a diferentes grupos, Ulva sp. es una Chlorophyta y Gracilaria chilensis es una
Rhodophyta, por lo tanto, presentan distintas características y mecanismos para responder
a los cambios de factores ambientales. Por ejemplo, Ulva sp. se encuentra más expuesta
a los efectos de la radiación debido a que crece en roqueríos expuestos al oleaje, no así
Gracilaria chilensis que crece en ambientes protegidos tanto en la zona intermareal como
submareal. Lo cual se puede relacionar con una mayor adaptabilidad a mayores dosis de
radiación observada en la especie Ulva sp.
En resumen, los resultados de este estudio referentes a la concentración y
composición de pigmentos han conducido a una mejor comprensión del comportamiento
del fitoplancton en el fraccionamiento superior de la columna, la transformación de
fitoplancton en el interior del océano, durante las variaciones espacio-temporales en las
diferentes estaciones del año. La condición fisiológica de las macroalgas, respecto a la
exposición a diferentes dosis de radiación UV, finalmente tiene implicaciones en los
patrones de estrategia de vida y de distribución de las macroalgas, observándose efectos
en el contenido de los distintos pigmentos fotosintéticos y la fotosíntesis.
105
5.1.- CONCLUSIONES
De acuerdo a los resultados obtenidos en esta investigación y bajo las condiciones

en que se realizaron los experimentos se puede concluir lo siguiente:
a) La estacionalidad y profundidad influyen en las concentraciones de los distintos

pigmentos fotosintéticos presentes en la columna de agua, lo cual puede ser relacionada
con la variabilidad espacio-temporal experimentada por el fitoplancton, asociadas a la
variación de las dosis de radiación PAR y temperatura dentro de la columna.
b) La concentración de los distintos pigmentos fotosintéticos en la capa superficial de la

columna de agua, tanto en el estrato más superficial (0-5 m) como el intermedio (5-15 m),
presentaron mayores concentraciones en la estación de primavera y menores en invierno,
lo cual se explica con el término del invierno aumenta la estratificación, por el
calentamiento superficial de las aguas, junto con el aumento de la intensidad lumínica
(PAR) provoca el florecimiento primaveral del fitoplancton.
c) A una mayor profundidad en la columna de agua (70 m) aumenta la concentración de

los distintos pigmentos clorofilas (a, b) y β-caroteno, donde la temperatura influye en forma
directa en la distribución de las masas de agua, causando estratificación de las capas de
agua, lo cual explicaría una mayor concentración de los pigmentos estudiados.
d) Las concentraciones de la clorofila a y sus productos de degradación (feopigmentos)

dentro de la columna de agua, variaron en profundidad y estacionalidad. En la capa
superficial tanto en el estrato más superficial (0-5 m) como el intermedio (5-15 m) se
observó una mayor concentración de clorofila a respecto a los feopigmentos, debido a una
mayor irradiación solar incidente. No así a una mayor profundidad (70 m), donde quedo en
evidencia una mayor concentración de feopimentos.
e) En ambas macroalga Ulva sp. y Gracilaria chilensis las concentraciones de los

pigmentos fotosintéticos son afectados por las variaciones de las dosis de radiación a las
106
que se ven expuestos. Siendo los carotenoides (β-caroteno), respecto a las clorofilas
(a y b), menos afectados a los cambios de radiación UV-B, lo que se encuentra
relacionado con su rol fotoprotector en el aparato fotosintético.
f) Las concentración de las ficobiliproteínas, en especial en la ficoeritrina presente en la

macroalga Gracilaria chilensis, fueron fuertemente afectadas por las dosis de radiación
UV, confirmando la alta sensibilidad de estos compuestos a las condiciones de
luminosidad.
g) La intensidad de los tratamientos aplicados (UV-B y PAR) afectan a ambas especies de

macroalgas. Sin embargo no se observaron diferencias entre tratamientos con y sin UV-B,
lo cual podría ser explicado por las características intermareales de ambas especies.
107
6.- BIBLIOGRAFÍA
Anderson, J., Park, Y.I. & Chow, W.S. (1997) Photoinactivation and photoprotection of
photosystem II in nature. Physiologia Plantarum 100:214-223.
Andreo, C.S., (1984). Fotosíntesis. Secretaría general de la organización de los estados

americanos, programa regional de desarrollo científico y tecnológico.
Alvial, A., & Avaria, S. (1981) Proliferación de primavera del fitoplancton en la Bahía de
Valparaíso. I. Condiciones meteorológicas y oceanográficas. Revista Biología Marina,
17, 197-227.
Alvial, A., & Avaria, S. (1982) Proliferación de primavera del fitoplancton en la Bahía de
Valparaíso. II. Dinámica de las comunidades. Revista Biología Marina, 18, 1-56.
Arfsten, D.P., Schaeffer, D.J., & Mulveny, D.C. (1996). The effects of near ultraviolet radiation on
the toxic effects of polycyclic aromatic hydrocarbns in animals and plants: A review.
Ecotoxicol.Environ.Safety. 33: 1-24.
Barcelo, J. (2001). Fisiología vegetal. Ediciones Pirámide (Grupo Anaya, S.A). Madrid pp.165-175.
Beer, S., & Eshel, A. (1985). Determining phycoerythrin and phycocyanin concentrations in
aqueous crude extracts of red algae. Aust. J. Mar. Freshw. Res. 36: 785-792.
Bianchi, T.S., Findlay, S., & Dawson, R., (1993). Organic matter sources in the water column and
sediments of the Hudson River estuary: the use of plant pigments as tracers. Est. Coast.
Shelf. Sci. 36, 359–376.
Bianchi, T. S., Kautsky, L., & Argyrou M., (1997). Dominant chlorophylls and carotenoids in
macroalgae of the Baltic Sea (Baltic Proper): their use as potential biomarkers, Sarsia,
82, 55–62.
Bidigare, R.R, Kennicutt, II M.C, & Brooks, J.M (1985) Rapid determination of chlorophylls and
their degradation products by high-performance liquid chromatography. Limnol. Oceanogr.
30:432–435.
Bischof, K., Hanelt, D., & Wiencke, C. (1998) UV radiation can affect depth-zonation of
Antarctic macroalgae. Mar. Biol. 131: 597-605.
Björn, L.O (1999). Ultraviolet-B radiation, the ozone layer and ozone depletion. Stratospheric
ozone depletion: the effects of enhanced UV-B radiation on terrestrial ecosystems.
Rozema J (ed). Backhuys Publishers, Leiden, The Netherlands. pp 21-37.
108
Boelen, P., Obernosterer, I., Vink, A. A. & Buma, A. G. J. (1999) Attenuation of biologically
effective UV radiation in tropical Atlantic waters measured with a biochemical DNA
dosimeter. Photochem. Photobiol. 69: 34-40.
Britton G & Goodwin TW (1971). Biosynthesis of carotenoids. Methods in Enzimology XIII(C):

654-701.
Brotas, V., & Plante-Cuny, M.R. (2003). The use of HPLC pigment analysis to study
microphytobenthos communities. Acta Oecol. 24 109-115.
Cabrera, S., Bozzo, S., & Fuenzalida, .H (1995). Variations in UV radiation in Chile. Journal of
Photochem. Photobiol. B: Biol. 28:137-142.
Caldwell, M (1978). Ultraviolet radiation and plants. In: Plant Physiology. 2a ed. Wadsworth
Publishing Company Inc. U.S.A. pp 397-399.
Cardoso L. & Marques D. (2004) The influence of hydrodynamics on the spatial and temporal
variation of phytoplankton pigments in a large, sub-tropical coastal lake (Brazil). Braz.
Arch. Biol. Technol. 47, 587–600.
Carpenter, S. R. & A. M. Bergquist. (1985). Experimental tests of grazing indicators based on

chlorophyll a degradation products. Arch. Hydrobiol. 102: 303-317.
Carpenter, S., M. Elser & Elser, J. (1986). Chlorophyll production, degradation and sedimentation:
Implications for palaeolimnology. Limnol. Oceanogr. 31: 112–124.
Cuddington, K., & Leavitt P. R. (1999). An individual-based model of pigment flux in lakes:
Implications for organic biogeochemistry and paleoecology. Can. J. Fish. Aquat. Sci.
56: 1964–1977.
Currie, D. J. (1990). Large-scale variability and interactions among phytoplankton,

bacterioplankton,and phosphorous. Limnol. Oceanogr., 35: 1437-1455.
Damste, J. S. S. &M. P. Koopmans, 1997. The fate of carotenoids in sediments: a Review. Pure
Appl. Chem. 69: 2067–2074.
Döhler, G., & M.R. Alt, (1989). Assimilation of 15N-ammonia during irradiance with ultraviolet-B
and monochromatic light by Thalassiosira rotula, Compt. Rend., Acad. Sci. Paris, Serie D.,
308, 513-518.
Elser, J.J., Carney, H.J., & Goldman, C.R. (1990). The zooplankton-phytoplankton interface in
lakes of contrasting trophic status: an experimental comparison. Hydrobiologia 200/201:
69-82.
Falkowski, P., & Raven, J. (1997) Aquatic Photosynthesis. Ed. Blanckwell Science.
Massachusetts. 335 pp.
109
Farman, J., Gardiner, B., & Shanklin, J. (1985). Large losses of total ozone in Antartica reveal
seasonal ClOx/NOx interaction. Nature 315:207-210.
Figueroa, F.L, Salles,S., Aguilera,J., Jiménez,.C, Mercado,J., Viñegla, B., Flores-Moya, A., &
Altamirano, M (1997) Effects of solar radiation on photoinhibition and pigmentation in the
red alga Porphyra leucosticta. Mar. Ecol. Prog. Ser 151: 81-90.
Figueroa, F. L., & Gómez, I. (2001) Photosynthetic acclimation to solar UV radiation of marine red
algae from the warm-temperate coast of southern Spain: a review. J. Appl. Phycol.
13: 235-248.
Figueroa, F. L., Escassi., L., Pérez-Rodríguez, E., Korbee, N., Giles, A. D., & Johnsen, G.
(2003) Effects of short-term irradiation on photoinhibition and accumulation of
mycosporine-like amino acids in sun and shade species of red algal genus Porphyra. J.
Photochem. Photobiol. B: Biol. 69: 21-30.
Fogg G. E., Stewart, W.D.P., Fay P., & Walsby A. E. (1973). The blue- green algae, Acad. Press,
New York–London, 459 pp.
Fox, D. L., (1944). Biochemical fossils. Science 100: 111–113.
Fox, D. L., Updegraff, D. M., & Novelli, G. D. (1944). Carotenoid pigments in the ocean floor.
Arch. Biochem. 5: 1–23.
Glauser, M., Bryant, D.A,. Frank, G., Wehrli, E., Rusconi, S.S., Sidler, W., & Zuber, H.(1992)
Phycobilisome structure in the cyanobacteria M. laminosus and Anabaena sp. PCC7120.
Eur. J. Biochem 205 (3):907-915.
Glazer, A.N., (1989). Light guides. Directional energy transfer in phycobilisomes J. Biol. Chem.
264 (1): 1-4
Gómez, I., & Figueroa, F.L. (1998) Effects of solar UV stress on chlorophyll fluorescence kinetics
of intertidal macroalgae from southern Spain: a case study in Gelidium species. J. Appl.
Phycol. 10: 285-294.
Gómez, I, Lopez-Figueroa, F, Ulloa, N., Morales, V, Lovengreen, C, Huovinen, P, & Hess, S.

(2004). Patterns of photosynthesis in 18 species of intertidal macroalgae from southern
Chile. Mar. Ecol. Prog. Ser, 270: 103-116.
Gómez, I., Figueroa, FL., Huovinen, P., Ulloa, & N., Morales, V. (2005) Photosynthesis of the red
alga Gracilaria chilensis under natural solar radiation in an estuary in southern Chile.
Aquaculture, 244 (1-4): 369-382.
Gotz, T., Windhovel, P & Sandman, G. (1999). Protection of photosynthesis against ultraviolet-B
radiation by carotenoids in transformants of the cyanobacterium Synechococcus
PCC7942. Plant Phyiol. 120: 599-604.
110
Greenberg, B.M., Wilson M.J., Huang, X.D., Duxbury, C.L., Gerhardt, K.E., & Gensemer, R.W
(1997). The effects of ultraviolet-B radiation on higher plants. In: Plants for Environmental
Studies (Edited by Wang W, Gorsuch JW & Hughes JS). Lewis Publishers, NY. pp 1-35.
Grossman, A., Schaefer, M.R., Chiang, G.G. & Collier, J.L. (1993) The phycobilisome, a light-
harvesting complex responsive to environmental conditions. Microbiol. Rev. 57, 725±749.
Häder, D.-P., Worrest, R. S., Kumar, H. D., & R.C., Smith. 1995. Effects of increased solar
ultraviolet radiation on aquatic ecosystems. Ambio. 24:174.
Häder, D.-P (1995): Effects of UV radiation on aquatic ecosystems. In: Hagen, U., Harder, D.,
Jung, H. and Streffer, C.: Radiation Research 185-195, Congress Proceedings. Vol. 2:
Congress Lectures. Tenth Intern. Congress of Radiation Research, Würzburg, Germany.
Aug. 27-Sept. 1, pp. 1053-1056.
Häder, D.-P. & Figueroa, F.L (1997): Photoecophysiology of marine macroalgae. Photochem.
Photobiol. 66, 1-14.
Häder, D.-P. (2001). Adaptation to UV stress in algae. In Rai, L. C. & Gaur, J. P. [Eds.] Algal
Adaptation to Environmental Stresses Springer, Berlin, pp. 173–202.
Hanelt D (1996) Photoinhibition of photosynthesis in marine macroalgae. Scientia Marina 60
(Supplement 1): 243-248.
Hanelt, D (1998). Capability of dynamics photoinhibition in Artic macroalgae is related to their
depth distribution. Mar. Biol. 131: 361-369.
Helbling, E.W,. Villafañe, V., Ferrario, M., & Holm-Hansen, O. (1992). Impact of natural
ultraviolet radiation on rates of photosynthesis and on specific marine phytoplankton
species. Mar. Ecol. Prog. Ser. 80: 89-100.
Henley, W. J., Levavasseur, G., Franklin, L. A., Lindley, S. T, Ramus, J., & Osmond C. B.
(1991) Diurnal responses of photosynthesis and fluorescence in Ulva rotundata acclimated
to sun and shade in outdoor culture. Mar. Ecol. Prog. Ser. 75: 19-28.
Herman, R., & McKenzie, R (1998). Ultraviolet radiation at the Earth´s surface. Scientific
Assesment of Ozone World Meteorological Organization, Global Ozone Research and
Monitoring Project. UNEP Report 9:9.25-9.32.
Hodgson, D.A.S., Wright, W., Tyler, P.A., & Davies, N (1998) Analysis of fossil pigments from
algae and bacteria in meromictic Lake Fidler,Tasmania, and its application to lake
management. J.Paleolimnol. 19: 1-22.
Hoffmann, A. & Santelices, B. (1997) Flora Marina de Chile Central. Facultad de Ciencias
Biológicas. Ediciones Universidad Católica de Chile 68p, 260p 1ª Edidición.
111
Holm-Hansen, O., Lubin, D., & Helbling, E.W. (1993a). Ultraviolet radiation and its effects on
organisms in aquatic environments. In: Young, A.R., Björn, L.O., Moan, J. & Nultsch, W.
(eds), Environmental UV photobiology. Plenum Press, New York. pp 379-425.
Holm-Hansen, O., Helbling, E.W., & Lubin, D. (1993b). Ultraviolet radiation in Antarctica:
inhibition of primary production. Photochem. Photobiol. 58: 567-570.
Huovinen, P., Gómez, I., & Lovengreen, C. (2006). A five-year study of solar ultraviolet radiation I
southern Chile (39° S): potential impact on physiology of coastal marine algae?
Photochem. Photobiol. 82: 89-96.
Hurley, J. P., & Armstrong, D. E. (1990). Fluxes and transformations of aquatic pigments in Lake
Mendota, Wisconsin. Limnol. Oceanogr. 35: 384–398.
Hurley, J. P. & Garrison, P. J. (1993) Composition and sedimentation of aquatic pigments

associated with deep plankton in lakes. Can. J. Fish. Aquat. Sci. 50, 2713-2722.
Jeffrey,S.W, Mantoura R.F.C, & Wright S.W (1997). Phytoplankton pigments in oceanography:
guidelines to modern methods. UNESCO, Paris
Jeffrey, S. W., Wright, S. W. & Zapata, M. (1999). Recent advances in HPLC pigment analysis of
phytoplankton. Mar. Freshwater Res. 50: 879–896.
Jerlov, N.G (1950) Ultra-violet radiation in the sea. Nature 166: 111–112.
Karentz, D., & Lutze, L.H. (1990). Evaluation of biologically harmful ultraviolet radiation in
Antarctica with a biological dosimeter designed for aquatic environments, Limnol.
Oceanogr., 35, 549-561.
Karentz, D., Cleaver, J.E, & Mitchell, D.L. (1991a.).DNA damage in the Antarctic, Nature, 350,
28,
Kerr, J.B., & McElroy, C.T. (1993). Evidence for large upward trends of ultraviolet-B radiation
linked to ozone depletion. Science 262: 1032-1034.
Kiørboe, T., Lundsgaard, C., Olesen, M., & Hansen, J.L.S (1994) Aggregation and
sedimentation processes during a spring phytoplankton bloom: A field experiment to test
coagulation theory. J. Mar. Res 52:297-323.
Kirk, J.T.O (1994) Light and photosynthesis in aquatic ecosystems. Cambridge University
Press, United Kingdom.
Klisch, M., & Häder, D.P (2000) Mycosporine-like amino acids in the marine dinoflagellate
Gyrodinium dorsum: induction by ultraviolet irradiation. J. Photochem. Photobiol
55:178-182.
112
Krause, G.H. (1988) Photoinhibition of photosynthesis. An evaluation of damaging And protective

mechanisms. Physiol. Plant 74: 566-574.
Kulandaivelu, G., Lingakumar, K., & Premkumar, A. (1996). UV-B Radiation. In: Plant
Ecophysiology. (ed). Prasad, M. John Wiley and Sons, Inc. India. pp 41-60.
Leavitt, P.R., & Carpenter, S. R. (1989) Effects of sediment mixing and benthic algal production
on fossil pigment stratigraphies. J. Paleolimnol. 2 , 147-158.
Leavitt, P.R. (1993). A review of factors that regulate carotenoid and chlorophyll deposition and
fossil pigment abundance. J. Paleolimnol. 1: 215–227.
Letelier, R.M., Bidigare, R.R., Hebel, D.V., Ondrusek, M., Winn, C.D., & Car, D.M (1993)
Temporal variability of phytoplankton community structure based on pigment analysis.
Limnol Oceanogr 38:1420-1437.
Liaaen-Jensen S., & Andrewes, A.G., (1985), Analysis of carotenoids and related polyene
pigments, [in:] Methods in microbiology, G. Gottschalk (ed.), Acad. Press, New York,
London, pp 235–283.
Lissy, E., & Sanhuesa, E. (1996). Radiación Solar y Fotoprocesos Atmosféricos. Santiago, Chile.
Lorenzen, C.J. (1967). Determination of chlorophyll and phaeopigments by spectrophotometric

equations. Limnol. Oceangr. 23:11 -52.
MacColl, R. (1998) Cyanobacterial phycobilisomes. J. Struct. Biol. 124, 311±334.
Mackey, D.M , Mackey D.j., Higgins H.W., & Wrigth, S.W (1996).CHEMTAX: A program for
estimating class abundante from chemival markers. Application to HPLC measurements
phytoplankton. Mar.Ecol.Prog.Ser., 114: 265-283.
Mackey, D.J., Blanchot, J., Higgins, W.W., & Neveux, J., (2002).
Phytoplankton abundances and community structure in the equatorial
Pacific. Deep-Sea Research II 49, 2561–2582.
Maclntyre, H.L., Kana, T.M., & Geider, R.J (2000). The effect of water motion on the short-term
rates of photosynthesis by marine phytoplankton. Trends Plant Sci. 5: 12-17.
Madronich, S. (1992). Implications of recent total atmospheric ozono measurements for

biologically active ultraviolet radiation reaching the Earth 's surface. Geophys.Res.Lett.
19, 37-40.
Mantoura, R.F.C, & Llewellyn, C.A (1983). The rapid determination of algal chlorophyll and
carotenoid pigments and their breakdown products in natural waters by reverse-phase
high-performance liquid chromatography. Anal Chim. Acta 151:297–314.
113
Mantoura, R.F.C, & Repeta, D.J (1997) Calibration methods for HPLC. In: Jeffrey SW, Mantoura
RFC, Wright SW (eds) Phytoplankton pigments in oceanography: guidelines to modern
methods. UNESCO, Paris, pp 407–428.
Margalef, R. (1958) Temporal succession and spatial heterogeneity in phytoplankton. En: A.A.
Buzzati-Traverso. Perspectives in marine biology, 323-349. Univ. Calif. Press. Berkeley,
Los Angeles, California.
Mercado, J. M., Jiménez, C. Niell, F. X. & Figueroa, F. L. (1996) Comparison of methods for
measuring light absorption by algae and their application to the estimation of package
effect. Sci. Mar. 60: 39-45.
Mitchell, D.L, & Karentz, D. (1993) The induction and repair of DNA photodamage in the
environment. En: Young AR, LO Björn, J Moan & W Nultsch (eds) Environmental UV
photobiology: 345-377. Plenum Press, New York, New York, USA.
Moon, R. W. & Dawes, C. J. (1976). Pigment changes and photosynthetic rates under selected
wavelengths in the growing tips of Eucheuma isiforme (C. Agardh) var denudatum Cheney
during vegetative growth. Br. Phycol. J. 11: 165-174.
Muñoz, P., & Alvial, A. (1986a) Proliferación de microalgas: origen, mecanismo e impacto sobre la
piscicultura. Universidad de Valparaíso. Valparaíso. 42 pp.
Neshyba, S. (1987). Oceanography: perspectives on fluid earth. John Wiley and Sons, Nueva
York. 506 pp.
Palenik, B., Price, N.M, & Morel, F.M.M (1991) Potential effects of UV-B on the chemical
environment of marine organisms: a review. Environ Poll 70:117-130.
Obayashi, Y., Tanoue E., Suzuki K., Handa N., Nojiri Y., & Wong C. S., (2001), Spatial and
temporal variabilities of phytoplankton community structure in the northern North Pacific as
determined by phytoplankton pigments, Deep Sea Res. I, 48, 439–469.
Orce, L. & Helbling, W. (1997) Latitudinal UVR-PAR measurements in Argentina: extent of the
‘ozone hole’. Global and Planetary Change., 15: 113-121.
Ormrod, D., & Hale, B. (1995). Physiological Responses and crops to Ultraviolet-B radiation
stress. In: Pessarakli M (ed). Handbook of plant and crop physiology. Marcel Dekker, Inc.
U.S.A. pp 761-770.
Ostrovsky, I., & Yacobi, Y. (1999) Organic matter and pigments in surface sediments: possible
mechanism of their horizontal distributions in a stratified lake. Can. J. Fish. Aquat. Sci.
56, 1001–10.
Puentes, P. (2004). Introducción a la Cromatografía de Líquidos de Alto Performance. Curso para

Universidad Austral de Valdivia, Instituto de Farmacia.
114
Raymont, J. (1980). Plankton and productivity in the oceans. Phytoplankton. 2ª ed. Grant Britian.
Rowan, K. S., (1989). Photosynthetic pigments of algae, Cambridge Univ. Press, Cambridge, 317
pp.
Santelices, B. (1989) Algas Marinas de Chile. Facultad de Ciencias Biológicas. Pontificia

Universidad Católica de Chile. Santiago, Chile. 382 pp.
Schluter, L., & Havskum, H., (1997), Phytoplankton pigments in relation to carbon content in
phytoplankton communities, Mar. Ecol. Prog. Ser., 155, 55–65.
Schreiber, U., Schliwa, U., & Bilger, W. (1986) Continuous recording of photochemical and non-
photochemical chlorophyll fluorescence quenching with a new type of modulation
fluorometer. Photosynth. Res. 10: 51-62.
Schreiber, U., Bilger, W., & Neubauer, C. (1994) Chlorophyll fluorescence as a non-intrusive
indicator for rapid assessment of in vivo photosynthesis. Ecol. Stud. 100: 49-70.
Schreiber, U., Endo, T., Mi H, & Asada K (1995) Quenching analysis of chlorophyll fluorescence
by the saturation pulse method: Particular aspects relating to the study of eukaryotic algae
and cyanobacteria. Plant Cell Physiol 36: 873-882.
Scully, N. M., Vincent, W. F. , Lean, D. S. & Cooper, W. J. (1997) Implications of ozone

depletion for surface water photochemistry: sensitivity of clear lakes, Aquat. Sci., 59,
20–274.
Sinha, R. P., Kumar H. D., Kumar A., & Häder, D.-P. (1995) Effects of UV-B irradiation on
growth, survival, pigmentation and nitrogen metabolism enzymes in cyanobacteria. Acta
Protozool. 34: 187-192.
Sinha, R. P., Singh, N., Kumar, A., Kumar, H. D., & Häder, D. P. (1997). Impacts of
ultraviolet-B irradiation on nitrogen-fixing cyanobacteria of rice paddy fields. J. Plant
Physiol. 150:188-193.
Skoog, D.A., & Leary, J.J. (2001). Análisis instrumental. McGraw-Hill. España, 935 p. 4ª edición.
Smith, R. C., & Baker, K. S. (1979). “Penetration of UV-B and biologically effective dose-rates in
natural waters.” J. Photochem. Photobiol. B: Biol. 29: 311-323.
Smith, R. C., Prezelin, B. B., Baker, K. S. , Bidigare, R. R., Boucher, N., Coley, T., Karentz,
D., MacIntyre, S., Matlick, H. A., Menzies, D., Ondrusek, M. E., Wan, Z. & Waters,
K.. (1992). Ozone depletion: Ultraviolet radiation and phytoplankton biology in Antarctic
waters. Science 255: 952-959.
Steinman, A.D., Havens, K.E., Louda, J.W., Winfree, N.M., & Baker, E.W.,
(1998).Characterization of the photoautotrophic algal and bacterial communities in a large,
115
shallow, subtropical lake using HPLC–PDA based pigment analysis, Can. J. Fish. Aquat.
Sci., 55, 206–219.
Sterner, R.W., Elser, JJ., Fee, E.J Guildford, S.J., & Chrzanowski, T.H. (1997) The light:nutrient
ratio in lakes: the balance of energy and materials affects ecosystem structure and
process. American Naturalist 150: 663-684.
Ston, J., & Kosakowska, A. (2000). Qualitative and quantitative analysis of Baltic phytoplankton
pigments. Oceonologia, 42 (4), 449-471.
Ston, J., Kosakowska, A. M., Łotocka ,E., & Łysiak –Pastusza, K. (2002) Pigment composition
in relation to phytoplankton community structure and nutrient content in the Baltic Sea.
Oceonologia, 44 (4), 419-437.
Strasburger, E., Noll, F., Schenck, H., & Schimper, A. (1994) Fisiología del metabolismo material
y energético. 8º ed. En: Tratado de Botánica. (ed) Omega 252:320.
Strickland, J.D.H., & Parsons, T.R. (1972). A practical handbook of seawater analysis. Fish. Res.
Board Can. Bull. 167, 2nd ed. 310pp.
Stryer, L., Berg, J., & Tymoczko, J. (2002). Biochemistry. Freeman, NewYork, 974 p. 5ª edición.
Sverdrup, H.U. (1953). On conditions for vernal blooming of phytoplankton. J. Cons. perm. int.
Explor. Mer., 18: 287-295.
Vallentyne, J. R., (1954). Biochemical limnology. Science 119: 605–606.

Vallentyne, J. R., (1956). Epiphasic carotenoids in postglacial lake sediments. Limnol. Oceanogr.
1: 252–262.
Vidussi F., Claustre H., Manca B.B., Luchetta A.,Marty J.C., (2001), Phytoplankton pigment
distribution in relation to upper thermocline circulation in eastern Mediterranean Sea during
winter, J. Geophys. Res., 106 (C9), 19939–19956.
Villafañe, V., Sunfbäck,C., Figueroa, F.L., & Helbling, W.E (2003) Photosynthesis in the aquatic
environment as affected by ultraviolet radiation. En: Helbling EW & H Zagarese (eds) UV
effects in aquatic and Ecosystems: 357-397.
Vincent, W.F., & Roy, S (1993) Solar ultraviolet-B radiation and aquatic primary production:
Damage,protection, and recovery. Environm Rev 1: 1-12.
Vollenweider, R.A. (1968). Scientific fundamentals of the eutrophication of lakes and flowing
waters, with particular reference to nitrogen and phosphorus as factors in eutrophication.
OECD, Paris. Tech. Rpt. DA 5/SCI/68.27. 250 pp.
Webb, K., & D`Elia, C. (1980) Nutrient and oxygen redistribution during a spring neap tidal cycle in
a temperatura estuarine. Science, 207:983-985.
Wetzel, R. G., (1975). Limnology. Saunders Publ. Co. Philadelphia, 716 pp.
116
Winfree, N. M., J. W. Louda, E. W. Baker, A. D. Steinman & K. E. Havens, (1997). Application of

chlorophyll and carotenoid pigments for the chemotaxonomic assessment of seston,
periphyton, and cyanobacterial mats of Lake Okeechobee. Florida. Molec. Mark. Environ.
Geochem. 671: 77–91.
Wiencke, C., Gómez, I., Pakker, H., Flores-Moya, A., Altamirano, M., Hanelt, D., Bischof, K.,
& Figueroa, F.L. (2000) Impact of UV-radiation on viability, photosynthetic characteristics
and DNA of brown algal zoospores: implications for depth zonation. Mar. Ecol. Prog. Ser.
197, 217–229.
Williamson, C.E., & Zagarese, H.E. (1994). "lmpact of UV-B Radiation on Pelagic Freshwater
Ecosystems", Archiv fuer Hydrobiologie, Vol. 43, E. Schweizerbartsche
Verlagsbuchhandlung, Stuttgart.
Wood ,E.J. (1967). Microbiology of oceans and estuarines. Elsevier Oceanography series,
Ámsterdam.319 pp.
Woźniak, B., Dera, J., Ficek, D., Majchrowski, R., Kaczmarek, S., Ostrowska, M., Koblentz-
Mishke, O (2000) Model of the in vivo spectral absorption of algal pigments. Part 1.
Mathematical apparatus .Oceanologia 42 (2), pp. 177-190.
Wright, S.W, Jeffrey, S.W, Mantoura, R.F.C, Llewellyn, C.A, Bjornland, T., Repeta, D., &
Welschmeyer, N. (1991) Improved HPLC method for the analysis of chlorophylls and
carotenoids from marine phytoplankton. Mar. Ecol. Prog. Ser. 77:183–196.
Wright, S.W., & Jeffrey, S.W (1997) High-resolution HPLC system for chlorophylls and
carotenoids of marine phytoplankton. In: Jeffrey S.W, Mantoura, R.F.C, Wright, S.W (eds)
Phytoplankton pigments in oceanography: gu,idelines to modern methods. UNESCO,
Paris, pp 327–342.
Wright., S.W., & Enden, R.L. (2000).Phytoplankton community structure and stocks in the eastern
Antartic marginal ice zone (BROKE survey, January-March 1996) detremined by
CHEMTAX analysis of HPLC pigments signatures. Deep-Sea Res II 47: 2363-2400.
Yacobi,Y., Eckert, Z.W., Trüper, H. G., & Berman, T (1990). High Performance Liquid
Chromatography detection of phototrophic bacterial pigments in aquatic environments.
Microb. Ecol, 19: 127-136.
Yost, R.W., Ettre L.S., & Conlon, R.D. (1980). Introducción a la cromatografía líquida práctica.
Perkin-Elmer Corporation. Norwalk. USA. pp 29-82.
Zepp, R.G., (1982) Experimental approaches to environmental photochemistry. In: Hutzinger B0

(ed) The handbook of environmental chemistry, Vol 2/PartB. Springer-Verlag, Berlin,
p 19-41.

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Universidad Austral de Chile

“PIGMENTOS FOTOSINTÉTICOS EN LA COLUMNA DE AGUA DETERMINADOS

MEDIANTE TÉCNICAS ESPECTROSCÓPICAS Y CROMATOGRÁFICAS (HPLC-RP):

VARIABILIDAD ESPACIO-TEMPORAL Y EFECTOS DE RADIACIÓN UV”

Tesis de Grado presentada como

CONSTANZA DANIELA ROSAS RIEDEL

2.1. Aspectos generales de los pigmentos fotosintéticos 05

2.1.1. Estructuras de los pigmentos fotosintéticos 06

2.2. Pigmentos fotosintéticos en la columna de agua 11

2.2.1. Dinámica espacial y temporal de los pigmentos 12

2.2.2. Técnica para la determinación de pigmentos fotosintéticos 13

2.3. Efecto de la radiación solar sobre los pigmentos fotosintéticos 14

2.3.1. El espectro de radiación solar incidente 14

2.3.2. Penetración de la radiación UV-B en la columna de agua 15

2.3.3. Efecto de la radiación UV-B en los ecosistemas acuáticos 16

2.3.4. Efecto de la radiación UV sobre los pigmentos fotosintéticos 18

2.4. Comunidades de algas 18

2.5. La situación en los ambientes costeros del Sur de Chile 21

2.6. Hipótesis de Trabajo 22

2.7. Objetivo General 22

2.8. Objetivos Específicos 22

3.- MATERIALES Y MÉTODOS 24

3.1. Área de estudio y recolección de muestras 24

3.2. Diseño experimental exposición a radiación UV 25

3.3.3 Determinación de pigmentos fotosintéticos por HPLC de 33

4.1.2.2. Clorofila a, b, c y carotenoides 48

4.1.2.1. Clorofila “a” y feopigmentos 62

4.1.2.2. Clorofila a, b, c y carotenoides 69

4.2.2.1. Pigmentos fotosintéticos en macroalgas 79

ÍNDICE DE FIGURAS Pág

Figura 1. (A) Estructura molecular y (B) espectro de absorción de la molécula de clorofila. 7

Figura 2. (A) Estructura molecular y (B) espectro de absorción de lamolécula de carotenoide. 8

Figura 3. (A) Estructura molecular y (B) espectro de absorción de las moléculas de 10

Figura 4. Muestra de Fitoplancton de la zona cercana a Puerto Montt indicando los 19

Figura 6. Ubicación geográfica de los sitios de colecta de fitoplancton y macroalgas. A) 24

Figura 7. Esquema del sistema de incubación termorregulado, donde se indica la disposición 26

Figura 8. Espectrofotómetro SCINCO UV/Visible utilizada para la medición de las 29

Figura 12. Condiciones oceaonográficas de la zona de Coihuin (Puerto Montt). A) perfiles de 43

determinada mediante el espectrofotómetro UV/Visible SCINCO en muestras

Figura 14. Concentraciones de la clorofila y feopigmentos medidas en extractos de 47

Figura 15. Concentraciones de clorofilas a, b, c y carotenoides medidos en extractos de 51

Figura 16. Concentraciones de clorofilas a, b, c y carotenoides medidos en extractos de 51

Figura 17. Cromatogramas de los estándares de los pigmentos fotosintéticos: A) β-caroteno B) 54

Figura 19. Concentraciones de pigmentos fotosintéticos medidas en extractos de fitoplancton 59

Figura 20. Concentraciones de pigmentos fotosintéticos medidas en extractos de fitoplancton 59

Figura 21. Cromatogramas de pigmentos fotosintéticos en extractos de fitoplancton, muestras 60

de 450 nm con detector UV-visible, a temperatura ambiente.

Figura 22: Cromatogramas de pigmentos fotosintéticos en extractos de fitoplancton, muestras 61

Figura 23. Concentraciones de clorofila “a” y feopigmentos medidas en extractos macroalga, 67

Figura 24. Concentraciones de clorofila “a” y feopigmentos medidas en extractos macroalga, 68

Figura 25. Concentraciones de clorofila a, b y carotenoides medidas en extractos macroalga, 74

Figura 26. Concentraciones de clorofila a, b y carotenoides medidas en extractos macroalga, 75

Figura 27. Concentración de ficoeritrina (R-PE) en extractos de macroalga Gracilaria chilensis 79

Figura 28. Concentraciones de pigmentos fotosintéticos medidas en extractos de macroalga, 85

Figura 29. Concentraciones de pigmentos fotosintéticos medidas en extractos de macroalga,

en 30 mg de muestra peso seco, según los tratamientos de radiación. En 86

Figura 30. Cromatogramas de los pigmentos fotosintéticos en extractos de macroalga A) Ulva 87

Figura 31. Cromatogramas de los pigmentos fotosintéticos en extractos de macroalga A) Ulva 88

Figura 32. Parámetros de fluorescencia (Fv/Fm: rendimiento cuántico máximo) medidos en 92