INSTITUTO TECNOLÓGICO SUPERIOR DE IRAPUATO

ESTUDIOS CON RECONOCIMIENTO DE VALIDEZ OFICIAL

NÚMERO 11-00065

ASOCIACIÓN DE MICROORGANISMOS ENDÓFITOS EN Laelia autumnalis

(ORCHIDACEAE) EN FUERTE DE LOS REMEDIOS, SIERRA DE PÉNJAMO,
GUANAJUATO.

OPCION I: TESIS PROFESIONAL

QUE PARA OBTENER EL GRADO DE

LICENCIADA EN BIOLOGÍA

PRESENTA:

MENDOZA BRAVO ELIZABETH

DIRECTORES
Dr. JUAN GUALBERTO COLLI MULL

Dra. IRENE ÁVILA DIAZ

IRAPUATO, GTO. MAYO DE 2019

El presente trabajo se desarrolló en el Laboratorio de Ecología molecular y
Bioprospección, del departamento de Biología en las instalaciones del Instituto

i
Tecnológico Superior de Irapuato (ITESI). La dirección del trabajo de investigación
estuvo a cargo del Dr. Juan G. Colli Mull y la Dra. Irene Ávila Díaz.

Agradecimientos

Al Dr. JUAN G. COLLI MULL por su participación en la realización de este trabajo y por
sus sugerencias aportadas.
ii
 A la Dra. IRENE ÁVILA DÍAZ por su colaboración y asesoría al realizar esta
investigación.

A la Dra. VICTORIA HERNÁNDEZ HERNÁNDEZ por el apoyo en la realización de este

trabajo.

Al MC. XICOTENCATL CAMACHO CORONEL por su colaboración en la elaboración de

este proyecto.

Al Dr. FRANCISCO ALEJO ITURBIDE por su orientación.

Al laboratorio de Ecología molecular y Bioprospección, del departamento de Biología en

el ITESI.

A mis amigos y compañeros ANA GARCÍA, KEVIN GALVÁN, ARIADNA TENORIO y

ALEJANDRO ANDRADE por su apoyo y colaboración.

RESUMEN
La familia Orchidaceae, es uno de los grupos taxonómicos más diversos
morfológicamente con cerca de 27,135 especies a nivel mundial. En México esta familia
está representada con 1,260 especies, ocupando el tercer lugar dentro de las familias
de plantas más abundantes. La república mexicana cuenta con un 40% de endemismos
de orquídeas. Laelia autumnalis tiene un valor cultural en México, ya que se usa en
iii
festividades del día de muertos entre otras actividades socio/culturales del país. Las
orquídeas presentan una relación simbiótica con microorganismos endófitos, los cuales
les ayudan en su crecimiento, desarrollo, contra patógenos y contra herbívora. Dentro
de este grupo podemos encontrar a cianobacterias y bacterias heterótrofas que
colonizan células de velamen, y realizan la fijación de nitrógeno y producción de ácido
indol-3-acético (IAA).  En el presente estudio se realizó el aislamiento e identificación de
microorganismos endófitos en la raíz, hoja y pseudobulbo de Laelia autumnalis
colectadas en Fuerte de los Remedios, Sierra de Pénjamo, Guanajuato. En total se
aislaron 37 hongos y 79 bacterias. Algunos géneros de hongos que se identificaron,
fueron Fusarium, Alternaria, Penicillium, Curvularia y Rhizoctonia; los hongos se
localizaron en tejido fundamental y vascular. Se encontraron hongos presentes en dos
de los tres órganos tales como Rhizoctonia, Mucor, Penicillium, algunos géneros solo
en un órgano (Ulocladium, Alternaria, Rhizopus); Acremonium fue el único género
aislado de los tres órganos. En cuanto a las bacterias, se identificaron 25 grupos
ARDRA, con mayor riqueza en raíz epífita, con 14 grupos ARDRA, seguido de
pseudobulbo rupícola con 11 grupos. Lo cual demuestra que Laelia autumnalis se
encuentra asociada a una gran variedad de hongos y bacterias endófitos.

Palabras clave: Laelia autumnalis, endófitos, simbiosis.

ABSTRACT
The Orchidaceae family is one of the most diverse taxonomic groups morphologically
with about 27,135 species worldwide. In Mexico, this family is represented with 1,260
species, occupying the third place among the most abundant plant families. The
Mexican Republic has 40% of orchid endemisms. Laelia autumnalis has a cultural value
in Mexico, as it is used in Day of the Dead festivities among other socio-cultural
activities in the country. The orchids have a symbiotic relationship with endophytic
microorganisms, which help them in their growth, development, against pathogens and
iv
against herbivores. Within this group you can find cyanobacteria and heterotrophic
bacteria that colonize velamen cells, and perform a high nitrogen fixation and production
of indole-3-acetic acid (IAA). In the present study, the isolation and identification of
endophytic microorganisms in the root, leaf and pseudobulb of Laelia autumnalis
collected in Fuerte de los Remedios, Sierra de Pénjamo, Guanajuato. In total, 37 fungi
and 79 bacteria were isolated. Some genera of fungi that were identified were Fusarium,
Alternaria, Penicillium, Curvularia and Rhizoctonia; the fungi were located in
fundamental and vascular tissue. Fungis were found in two of the three organs such as
Rhizoctonia, Mucor, Penicillium, some genera only in one organ (Ulocladium, Alternaria,
Rhizopus); Acremonium was the only genus isolated from the 3 organs. Regarding the
bacterias, 25 ARDRA groups were identified, with greater richness in epiphytic root, 14
ARDRA groups, followed by rupicola pseudobulbs with 11 groups. This shows that
Laelia autumnalis is associated with a great variety of endophytes.
Keywords: Laelia autumnalis, endophytes, symbiosis.

v
Contenido

RESUMEN---------------------------------------------------------------------------------------------------iv
ABSTRACT---------------------------------------------------------------------------------------------------v
INTRODUCCIÓN--------------------------------------------------------------------------------------------1
CAPÍTULO I. Antecedentes-----------------------------------------------------------------------------3
1.1 Diversidad de plantas en México--------------------------------------------------------------------4
1.1.1 Familias principales en México--------------------------------------------------------------------5
1.2 Familia Orchidaceae----------------------------------------------------------------------------------6
1.2.1 Orquídeas en México-------------------------------------------------------------------------------7
1.2.2 Biología reproductiva--------------------------------------------------------------------------------8
1.2.3 Ecología---------------------------------------------------------------------------------------------10
1.2.4 Importancia de la familia Orchidaceae----------------------------------------------------------11
1.2.4.1 Importancia económica-------------------------------------------------------------------------11
1.2.4.2 Importancia medica-----------------------------------------------------------------------------12
1.2.4.3 Importancia cultural-----------------------------------------------------------------------------13
1.2.4.4 Importancia religiosa----------------------------------------------------------------------------13
1.2.5 Sobreexplotación----------------------------------------------------------------------------------14
1.2.6 Adaptaciones---------------------------------------------------------------------------------------14
1.3 Laelia---------------------------------------------------------------------------------------------------15
1.3.1 Ecología del genero Laelia-----------------------------------------------------------------------17
1.4 Laelia autumnalis-------------------------------------------------------------------------------------17
1.4.1 Problemática----------------------------------------------------------------------------------------19
1.5 Asociación con microrganismos-------------------------------------------------------------------20
1.5.1 Endófitos--------------------------------------------------------------------------------------------20
1.5.1.1 Bacterias endófitas------------------------------------------------------------------------------21
1.5.1.2 Hongos endófitos--------------------------------------------------------------------------------23
1.6 Área de estudio---------------------------------------------------------------------------------------24
CAPÍTULO II. Planteamiento del problema------------------------------------------------------26
2.1 Justificación-------------------------------------------------------------------------------------------27
2.2 Objetivos-----------------------------------------------------------------------------------------------28
vi
 2.2.1 Objetivo General--------------------------------------------------------------------------------------28
2.2.2 Objetivos específicos---------------------------------------------------------------------------------28
CAPÍTULO III. Metodología----------------------------------------------------------------------------29
3.1 Colecta-------------------------------------------------------------------------------------------------30
3.2 Tinción diferencial------------------------------------------------------------------------------------30
3.3 Localización de hongos endófitos a nivel de órgano-------------------------------------------31
3.4 Desinfección de órganos----------------------------------------------------------------------------31
3.5 Hongos endófitos-------------------------------------------------------------------------------------31
3.5.1 Aislamiento------------------------------------------------------------------------------------------31
3.5.2 Identificación de hongos--------------------------------------------------------------------------32
3.6 Bacterias endófitas-----------------------------------------------------------------------------------32
3.6.1 Aislamiento------------------------------------------------------------------------------------------32
3.6.2 Determinación de las Unidades Formadoras de Colonias (UFC)--------------------------32
3.6.3 Extracción de ADN genómico bacteriano------------------------------------------------------33
3.6.4 PCR--------------------------------------------------------------------------------------------------33
3.6.5 ARDRA----------------------------------------------------------------------------------------------34
3.6.6.1 Identificación de grupos ARDRA------------------------------------------------------------------34
CAPÍTULO IV. Resultados-----------------------------------------------------------------------------35
Descripción anatómica-----------------------------------------------------------------------------------36
Localización de hongos----------------------------------------------------------------------------------37
4.1 Microorganismos endófitos-------------------------------------------------------------------------38
4.2 Localización de hongos-----------------------------------------------------------------------------40
4.3 Identificación fúngica--------------------------------------------------------------------------------41
4.4 Unidades Formadoras de Colonia-----------------------------------------------------------------46
4.5 Identificación bacteriana----------------------------------------------------------------------------47
CAPÍTULO V. Discusión-------------------------------------------------------------------------------52
5.1 Anatomía----------------------------------------------------------------------------------------------53
5.2 Localización de endófitos---------------------------------------------------------------------------54
5.3 Endófitos-----------------------------------------------------------------------------------------------54
5.4 Aislados bacterianos---------------------------------------------------------------------------------55
CAPÍTULO VI. Conclusión-----------------------------------------------------------------------------57
CAPÍTULO VII. Literatura citada---------------------------------------------------------------------59
vii
ÍNDICE DE FIGURAS
FIGURA 1. DISTRIBUCIÓN DE ORCHIDACEAE (SEDANO ET AL., 2015).......................................................................7
FIGURA 2. ESQUEMA DE LAELIA ANCEPS LINDL. SUBSP. ANCEPS. (A) SÉPALO SUPERIOR, (B) PÉTALO, (C) SÉPALO
LATERAL, (D) LABELO, (E) COLUMNA, (F) PLANTA COMPLETA. (DIBUJO DE ROLANDO JIMÉNEZ MACHORRO;
ARCHILA ET AL., 2014).......................................................................................................................................9
FIGURA 3. REPRESENTANTE DEL GENERO LAELIA (L. SPECIOSA) (ÁVILA ET AL., 2013).........................................16
FIGURA 4. LAELIA AUTUMNALIS ILUSTRADA EN LA OBRA DE HERNÁNDEZ (1959)....................................................18
FIGURA 5. LAELIA AUTUMNALIS, A PLANTA SOBRE ROCA Y B FLOR (IBARRA, 2016)...............................................19
FIGURA 6. BENEFICIOS DE LA RELACIÓN SIMBIÓTICA ENTRE PLANTAS Y ENDÓFITOS (RAMÍREZ- RODRÍGUEZ,
2010)................................................................................................................................................................ 21
FIGURA 7. UBICACIÓN GEOGRÁFICA DE FUERTE DE LOS REMEDIOS, SIERRA DE PÉNJAMO (20° 32’10” N Y 101°
40’28” 40´ 28”O)............................................................................................................................................. 25
FIGURA 8. ESPÉCIMEN DE LAELIA AUTUMNALIS, A) EPÍFITA Y B) RUPÍCOLA............................................................30
FIGURA 9. ESTOMAS EN CARA ADAXIAL A) 10X, B) 40X..........................................................................................36
FIGURA 10. SECCIÓN TRANSVERSAL ÓRGANOS LAELIA AUTUMNALIS. A-C. HOJA, D-F. PSEUDOBULBO, G-I. RAÍZ.
EP= EPIDERMIS; EPD=EPIDERMIS ADAXIAL; EPB= EPIDERMIS ABAXIAL; P= MESOFILO; HV= HACES
VASCULARES; CU= CUTÍCULA; F= FLOEMA; X= XILEMA; FI= FIBRAS; EX= EXODERMIS; VE= VELAMEN ; PC=
PARÉNQUIMA CORTICAL; EN= ENDODERMIS; *=PARÉNQUIMA MEDULAR.........................................................37
FIGURA 11. LOCALIZACIÓN DE ENDÓFITOS. A-C. HOJA, D-F. RAÍZ, G-I. PSEUDOBULBO.......................................38
FIGURA 12. EVIDENCIA GRÁFICA DE INFECCIÓN POR HONGOS ENDÓFITOS EN ROSA DE BENGALA, A) BACTERIA
EN HOJA Y B) HONGO DE PSEUDOBULBO.........................................................................................................39
FIGURA 13. MORFOTIPOS Y HABITO DE LOS AISLADOS OBTENIDOS EN LOS ÓRGANOS DE L. AUTUMNALIS............39
FIGURA 14. LOCALIZACIÓN DE ENDÓFITOS. A-C. HOJA, D-F. RAÍZ, G-I. PSEUDOBULBO.......................................40
FIGURA 15. HONGOS ENDÓFITOS AISLADOS DE PSEUDOBULBO. A-B) H4-ACREMONIUM, C-D) H5-EPULORHIZA,
E-F) H6- ULOCLADIUM, G-H) H16-MUCOR, I-J) H17-SCOPULARIOPSIS, K-L) H37-ALTERNARIA...............41
FIGURA 16. HONGOS ENDÓFITOS AISLADOS DE HOJA. A-B) H10-NI, C-D) H12-NI, E-F) H13-RHIZOCTONIA, G-
H) H20-PENICILLIUM, I-J) H22-NI, K-L) H23-ACREMONIUM, M-N) H24-RHIZOPUS, Ñ-O) H26-
ACREMONIUM....................................................................................................................................................42
FIGURA 17. HONGOS ENDÓFITOS AISLADOS DE HOJA. A-B) H27-VENTURIA, C-D) H28-RHIZOCTONIA, E-F) H29-
HAPLOSPORANGIUM, G-H) H33- MUCOR, I-J) H35-EPULORHIZA, K-L) H36-NI...........................................43
FIGURA 18. HONGOS ENDÓFITOS AISLADOS DE RAÍZ. A-B) H1-MONACROSPORIUM, C-D) H2-NI, E-F) H3-
RHIZOCTONIA, G-H) H7-CURBULARIA, I-J) H8- PENICILLIUM, K-L) H9-FUSARIUM, M-N) ACREMONIUM, Ñ-
O) H15-ACREMONIUM......................................................................................................................................44
FIGURA 19. HONGOS ENDÓFITOS AISLADOS DE RAÍZ. A-B) H14-NI, C-D) H18-NI, E-F) H19-
HAPLOSPORANGIUM, G-H) H25-ACREMONIUM, I-J) H31-CLADOSPORIUM, K-L) H34-SCOPULARIOPSIS....45
FIGURA 20. UFC CON LO g 10 UFC G EN HOJA, PSEUDOBULBO Y RAÍZ.................................................................46
FIGURA 21. ELECTROFORESIS EN GEL DE AGAROSA 1% 100 VOLTS DURANTE 1H, MOSTRANDO EL AMPLIFICADO
DEL GEN 16S DE LA TALLA ESPERADA. CARRIL 5 MARCADOR MOLECULAR, CARRILES 1-4 ADN
BACTERIANO......................................................................................................................................................49
FIGURA 22. ELECTROFORESIS EN GEL DE AGAROSA 2.5% 100 VOLTS DURANTE 4H, MOSTRANDO ANÁLISIS DE
RESTRICCIÓN. CARRIL 1 MARCADOR MOLECULAR 100 PB Y 2 MARCADOR MOLECULAR 50 PB, CARRIL 3-20
BACTERIAS ENDÓFITAS.....................................................................................................................................49
FIGURA 23. GRUPOS ARDRA...................................................................................................................................50
FIGURA 24. GRUPOS ARDRA EN HOJA, RAÍZ Y PSEUDOBULBO, TANTO EPÍFITA COMO RUPÍCOLA.........................50
FIGURA 25. DENDOGRAMA BASADO EN EL ANÁLISIS DE LAS BANDAS Y EL PESO MOLECULAR QUE PRESENTAN.. .51

ÍNDICE DE TABLAS
TABLA 1. DISTRIBUCIÓN TAXONÓMICA DE PLANTAS VASCULARES NATIVAS DE MÉXICO (VILLASEÑOR, 2004).........4
viii
TABLA 2. FAMILIAS DE PLANTAS CON MAYOR NÚMERO DE GÉNEROS Y ESPECIES (VILLASEÑOR, 2004)..................5
TABLA 3. ÓRGANOS EN LOS CUALES SE AISLARON CADA UNO DE LOS GÉNEROS IDENTIFICADOS..........................45
TABLA 4. OBTENCIÓN DE UFC EN HOJA, RAÍZ Y PSEUDOBULBO DE L. AUTUNALIS................................................47

ix
INTRODUCCIÓN
La familia Orchidaceae representa uno de los grupos taxonómicos más diversos
morfológicamente y más amplios en términos taxonómicos con 900 géneros y, cerca de
27,135 especies en todo el mundo (Bertolini et al., 2012), sin contar que día tras día se
encuentran nuevas especies e híbridos naturales. Las orquídeas son predominantes en
las regiones de climas tropicales y subtropicales, en zonas localizadas entre 300 y 4500
metros sobre el nivel del mar (Calderón, 2007; Karol et al., 2015).
La República Mmexicana se identifica, porque es una de las zonas florísticas más ricas
del mundo, ya que constituye el puente continental entre las dos Américas, también por
su gran variedad fisiográfica y climática (Rzedowski, 1986; Arévalo et al., 2011). Se
calcula que la flora orquideológica de México presenta más de 1,200 especies y
subespecies, en 164 géneros (Soto et al., 2007; Bertolini et al., 2012). Una
característica sobresaliente es la alta proporción de endemismos, ya que se han
registrado especies o subespecies endémicas las cuales corresponden a 40% del total
registrados en el país (Soto, 1996; Bertolini et al., 2012).
Particularmente, las orquídeas son uno de los recursos florísticos con mayor riqueza de
especies, elevado valor cultural y económico, en México han sido utilizadas para
satisfacer necesidades sociales de importancia médica, ceremonial, alimenticia y como
fuente de ingreso (Hernández, 1959; Sahagún, 1975; Flores y Valencia, 2007; Luyando
et al., 2011). Dentro de las orquídeas encontramos a Laelia autumnalis, la cual presenta
un significado cultural en México, ya que es utilizada como materia prima, en la
elaboración de productos adhesivos, curativos, aglutinantes y ha sido importante en
actividades culinarias, como condimento e incorporada en diversas ceremonias
religiosas (Salazar et al., 2007; Luyando et al., 2011).
Las orquídeas presentan una relación estrecha con microorganismos endófitos, los
cuales pasan al menos parte de su ciclo de vida dentro de las plantas. Dentro de este
grupo podemos encontrar tanto hongos como bacterias (Hardoim et al., 2015). Las
orquídeas dependen de asociaciones con hongos micorrízicos para germinar sus
semillas y muchas de las características únicas que las distinguen están asociadas con
el hongo que las coloniza (Karol et al., 2015). Estudios recientes demostraron la gran
diversidad de hongos endófitos no formadores de micorriza asociados con las raíces y
partes aéreas de orquídeas. Estos estudios resaltan el papel que cumplen los
microorganismos en la protección de la planta contra el ataque de patógenos y
resistencia a factores generadores por el estrés. (Schulz, 2006; Luyando et al., 2011).
Hay diferentes estudios dirigidos a la identificación de endófitos, sin embargo, están
orientados a otros tipos de plantas. Los estudios recientes enfocados a orquídeas son
pocos y dentro del género Laelia, el estudio más reciente es el de Ávila et al., (2013).
Por otro lado, Ibarra (2016), encontró que la mayoría de plantas de L. autumnalis en
Fuerte de los Remedios, Sierra de Pénjamo, Guanajuato son de habito rupícola, y en su
mayoría se ven asociadas a musgo, liquen y helechos, sin embargo Alcázar et al.,
(2008), mencionan que las plantas en contacto directo con las rocas, están propensas a
altas concentraciones de calcio que llega a ser toxico y las concentraciones de los
nutrientes esenciales disponibles para el desarrollo son bajas. Por lo cual, es importante
conocer la diversidad de endófitos tanto en epifita y rupícola. En este estudio se busca
llevar a cabo el aislamiento e identificación de microorganismos endófitos en Laelia
autumnalis, ya que esta es una especie endémica de México, y presenta un valor
socio/económico trascendental, es importante conocer las relaciones existentes entre
esta planta con los endófitos, con este estudio se contribuyó al conocimiento de la
biodiversidad de microorganismos endófitos asociados a L. autumnalis. Se lograron
aislar, localizar e identificar hongos y bacterias endófitos en L. autumnalis, y de esta
manera conocer la biodiversidad asociada a cada uno de sus órganos, se obtuvo que
los endófitos pueden variar de acuerdo al hábito en que la planta se encuentre, aun
siendo de la misma especie; de igual manera se encontraron hongos reportados en la
literatura como patógenos, que en el caso de esta orquídea no parecen perjudiciales.
 CAPÍTULO I. Antecedentes

1.1 Diversidad de plantas en México

México es multifacético y diverso en numerosos aspectos, debido a su gran
heterogeneidad, su posición biogeográfica, la variedad climática y su compleja
3
historia geológica (Ramamoorthy et al., 1998; Sarukhán et al., 2009; Sierra et al.,
2014). El territorio ha sido un centro de diversificación de varios grupos de plantas
y es donde se encuentra el mayor número de especies de pinos y encinos (Nixon,
1993; Styles, 1993; Challenger, 2003; Koleff et al., 2004; Challenger y Soberón,
2008; Sierra et al., 2014) magueyes (Gentry, 1998; Sierra et al., 2014) y cactáceas
(Arias, 1993; Sierra et al., 2014).
Las plantas vasculares están representadas en México por 2,804 géneros nativos
(Tabla 1). Los estados más representativos son Oaxaca, Chiapas, Veracruz,
Jalisco y Guerrero. Las dicotiledóneas son el grupo más diverso de plantas
vasculares (Villaseñor, 2004). Se dividen en 2 subclases, 75 órdenes y 248
familias, que en conjunto incluyen 22 259 especies. Por lo cual, ubican a México
como el quinto país por su riqueza florística, después de Brasil (56 000), Colombia
(35 000), China (27 100) y Sudáfrica (23 420) (Villaseñor y Ortiz, 2014).

Tabla 1. Distribución taxonómica de plantas vasculares nativas de México

(Villaseñor, 2004).

Familias Géneros Especies

Helechos y 49 127 1,027
plantas afines
Gimnospermas 7 14 138
Monocotiledóneas 49 546 4,523
Dicotiledóneas 199 2,117 17,736
Total 304 2,804 23,424

1.1.1 Familias principales en México

Las angiospermas muestran una gran diversificación ecológica y taxonómica. Se
estima más de 250 000 especies mundialmente (Villaseñor y Ortiz, 2014). Las
dicotiledóneas constituyen el grupo más diverso de todas las plantas vasculares,
representan el 75.5% de la riqueza mexicana (Villaseñor, 2004). Un estudio de
plantas con flores en México, menciona que existen 53 órdenes, 247 familias, 2
685 géneros y 21 841 especies. En México un 50.4% de las plantas con flores son

4
endémicas. Este porcentaje es muy alto, por lo cual el país muestra condiciones
bióticas y abióticas que originan tasas de especiación muy particulares. Las
familias con mayor número de géneros y especies son Asteraceae, Poaceae,
Orchidaceae, Fabaceae y Rubiaceae (Tabla 2) (Villaseñor y Ortiz, 2014).

Tabla 2. Familias de plantas con mayor número de géneros y especies (Villaseñor,

2004).

Familia No. géneros Género Especie

representativo
Asteraceae 362 Mammillaria 306
Poaceae 166 Salvia 292
Orchidaceae 157 Euphorbia 245
Fabaceae 92 Dalea 192
Rubiaceae 92 Quercus 192
Cactaceae 72 Tillandsia 188
Scrophulariaceae 55 Verbesina 179
Malvaceae 52 Agave 173
Acanthaceae 47 Solanum 168
Brassicaceae 47 Ipomoea 162
Euphorbiaceae 44 Piper 153
Apiaceae 37 Ageratina 143
Bignoniaceae 36 Mimosa 138
Apocynaceae 34 Muhlenbergia 130
Mimosaceae 34 Croton 124
Cucurbitaceae 34 Carex 122
Solanaceae 33 Opuntia 120
Lamiaceae 31 Stevia 120
Lamiaceae 31 Desmodium 118
Rosaceae 30 Peperomia 116

1.2 Familia Orchidaceae

Las orquídeas se tienen registradas desde la antigüedad, puesto que existen
escritos en China de hace 1 500 años, en Grecia desde 375 años antes de Cristo.
La palabra “orquídea” se deriva del griego orchis, apareció por primera vez en un
manuscrito del filósofo griego Theophrastus (371-285 a. C.). El nombre significa
“testículo”, esto por los pseudobulbos de algunas especies, el uso como
5
afrodisiaco y potencial de fertilidad (Freuler, 2008; Sedano et al., 2015). La familia
Orchidaceae se encuentra dentro de la clase dicocotiledóneae, la cual se
caracteriza por su gran diversidad de flores, colores y aromas, además presentan
interacciones ecológicas con agentes polinizadores y con hongos (Lecoufle, 2005;
Sedano et al., 2015). Esta familia representa uno de los grupos taxonómicos más
diversos morfológicamente y más amplios (Dressler, 1990; Bertolini et al., 2012),
con cerca de 27,135 especies y 900 géneros a nivel mundial (Zotz, 2013; Karol et
al., 2015). Este grupo presenta cerca del 10% de diversidad florística en el planeta
(Atwood, 1986; Beltrán et al., 2012). Son cosmopolitas, ya que se encuentran en
todos los continentes, con excepción de la Antártida (figura 1) (Salazar 2005;
Hágsater et al., 2005). Los países con mayor diversidad son Ecuador, Colombia,
Brasil y Perú (Rittershausen, 2007; Sedano et al., 2015). Sin embargo, son
abundantes en zonas cálidas y húmedas del planeta, pero con gran adaptación a
condiciones ambientales diversas. Presentan grandes variaciones en sus flores,
formas de vida, distribuciones de hábitat y patrones tróficos (Gardes, 2003),
teniendo varias estrategias de vida, desde epífita, terrestres y nutricionales de
autótrofos a heterótrofos, lo cual les permite crecer en una amplia gama de
hábitats. Son plantas herbáceas, perennes, terrestres, o epífitas, a veces
trepadoras o saprófitas (Lecoufle, 2005; Sedano et al., 2015).

6
Figura 1. Distribución de Orchidaceae (Sedano et al., 2015).

1.2.1 Orquídeas en México

México se caracteriza por ser una zona florística de las más ricas mundialmente,
esto se debe a que es el puente continental entre las dos Américas, por su gran
variedad fisiográfica y climática (Rzedowski, 1986: Bertolini et al., 2012). Esta
familia presenta 1,200 especies y 164 géneros, ocupando el tercer lugar (Soto et
al., 2007; Cox y Cervantes, 2016), después de Asteráceas y Fabáceas (Villaseñor
2003; Cox y Cervantes, 2016). La república mexicana cuenta con alto
endemismos, correspondientes a 40% del total registradas en el país (Soto, 1996;
Bertolini et al., 2012), siendo el segundo grupo de plantas con más especies
protegidas (SEMARNAT, 2010; Flores y Valencia, 2007; Beltrán et al., 2012).
Estas plantas se encuentran en todo el país, sin embargo, son más abundante en
zonas cálido-húmedas (Lecoufle, 2006; Torretta et al., 2011). Los estados con la
mayor riqueza de orquídeas son Guerrero, Oaxaca, Veracruz y Chiapas
(CONABIO, 2012; Sedano et al., 2015). El estado de Oaxaca alberga la mayor

7
diversidad de orquidioflora del país con aproximadamente 700 especies y 144
géneros (Soto et al., 2007; Cox y Cervantes, 2016).

1.2.2 Biología reproductiva

Las flores de las orquídeas tienen tres sépalos y tres pétalos. El pétalo mediano es
mayor y es conocido como labelo. En el rostelo se secreta una sustancia pegajosa
que auxilia en el proceso de polinización adhiriendo las polínias al polinizador
(Singer, 2009). Las orquídeas presentan una fusión de los órganos masculinos y
femeninos, formando una estructura llamada columna. El polen se encuentra en
forma agregada, conocidos como polínios (Ffigura 2). Las flores de las orquídeas
son por lo general hermafroditas (Hágsater et al., 2005), sin embrago hay casos
en los que los sexos están separados en tiempo o espacio, en el cual las
orquídeas son protandricas.

8
Figura 2. Esquema de Laelia anceps Lindl. subsp. anceps. (A) sépalo superior, (B)
pétalo, (C) sépalo lateral, (D) labelo, (E) columna, (F) planta completa. (Dibujo de
Rolando Jiménez Machorro; Archila et al., 2014).

En la biología reproductiva es importante conocer los polinizadores. Dentro de las

orquídeas, el acceso a las especies de hábito epífito es difícil, ya que usualmente
crecen en alto de los árboles, lo cual provoca pocas visitas de polinizadores
(Tremblay et al., 2005). Sin embargo, el 60% de las especies tienen más de un
9
polinizador, los insectos son los más frecuentes. Los polinizadores registrados en
plantas cultivadas de las especies Laelia superbiens Lindl., L. anceps Lindl., L.
speciosa (Kunth) Schltr. y L. autumnalis (La Llave y Lex.) Lindl., son abejas de
género Bombus (Halbinger y Soto, 1997; Tamayo, 2016). Por otro lado, en el
estado de Morelos se realizó un estudio con Laelia autumnalis, en el cual la
principal forma de reproducción de esta planta es por medio de camote
(pseudobulbo) y solo un 9% por semillas (Beltrán et al., 2012).

1.2.3 Ecología
En su mayoría las orquídeas muestran hábito de crecimiento epífito, por lo que
han evolucionado y se han adaptado para poder sobrevivir en el medio en que se
desarrollan. Los cambios evolutivos más importantes son, el desarrollo de raíces
especializadas que desempeñan varias funciones, soporte, absorción de agua y
nutrientes del ambiente (Fiatt, 2006; Sedano et al., 2015). También las orquídeas
captan la luz durante el día, pero procesan los alimentos durante la noche, esto
para no tomar C02 en el día y evitar la deshidratación, siendo plantas de
crecimiento muy lento (Sedano et al., 2015).
Las orquídeas realizan su polinización con ayuda de vectores o agentes
polinizadores, estos llevan el polen de flor en flor y pueden ser muy específicos
(Strassburger, 1994). Más del 97% de las orquídeas necesitan de un polinizador
para que lleve a cabo la polinización para que se produzca la fecundación y la
formación de semillas en las orquídeas, y asegurar la reproducción sexual,
algunos son moscas, mosquitos, abejas, avispas, coleópteros y aves (Van, 2001).
Los polinizadores dentro de la familia se distinguen por el complejo mecanismo de
polinización, y por las recompensas que ofrecen a los polinizadores (Davies y
Stpiczynska, 2008; Torretta et al., 2011). Sin embargo, cerca de un tercio de estas
especies no ofrece recompensas (Tremblay et al., 2005; Torretta et al., 2011) y
engañan a sus polinizadores, a través de diversos mecanismos (Jersáková et al.,
2006; Torretta et al., 2011).

10
Las plantas tanto epífitas como rupícolas afrontan numerosas situaciones en el
hábitat en el que se encuentran, tales como la escasez de agua y nutrientes en lo
alto de los árboles (epífitas), y altas concentraciones de calcio (rupícolas), por tal
motivo han desarrollado modificaciones, como la retención de agua en sus hojas
gruesas y pseudobulbos, velamen en la raíz por el cual pueden absorber agua y
adherirse a las grietas de la superficie en la que se encuentren (Alcaraz et al.,
2008).
También son plantas indicadores de la estabilidad de los ecosistemas (Bennet,
2000; Velita y Vilcapoma, 2010).

1.2.4 Importancia de la familia Orchidaceae

A lo largo del tiempo las orquídeas han presentado diversos fines en medicina,
artesanía, alimento, narcótico, saborizante, veneno y como adhesivo, aunque
también han sido de gran importancia para fines ceremoniales, mágico-religiosos,
talismanes y afrodisíacos (Téllez, 2003; Beltrán et al., 2012).

1.2.4.1 Importancia económica

En la actualidad, se sabe que cuando se realizan cortes a los pseudobulbos de las
orquídeas exudan mucílago, el cual se utiliza para la fabricación de instrumentos
musicales (Hágsater et al., 2005). A nivel mundial Vanilla planifolia, es una de las
más conocidas y utilizadas, ya que se utiliza para producir la vainilla (Marques,
2009).
La vainilla es el aromatizante más importante de la industria alimenticia. Su
producción genera cerca de 80 millones de dólares anuales a los países
exportadores. La vainilla se utiliza en la producción de helados, refrescos, en
repostería, en la industria del chocolate y la perfumería (Smith et al., 1992;
Hágsater et al., 2005). Otros usos de las orquídeas han sido para la confección de
masa azucarada, materia prima de los alfeñiques. Sin embargo, esta tradición ha
desaparecido de acuerdo con informantes de dulces artesanales en el sur, ya que
lo sustituyen por aglutinantes (Emeterio et al., 2016). En México, las plantas
11
ornamentales (entre las cuales se encuentran las orquídeas), tienen gran
importancia cultural, ambiental, social y económica. Se aprovechan más de 1 000
especies con una superficie de 20 000 hectáreas, generando 150 000 empleos
directos. 90% de la producción es para el mercado nacional y 10% para la
exportación, como flor de corte y esquejes (Guzmán, 2011; Sedano et al., 2015).
En la actualidad, las orquídeas son un importante artículo comercial, ya que se
exportan las flores cortadas de plantas autóctonas y la venta de plantas cultivadas
de diferentes tamaños (Téllez, 2011). Entre los géneros de orquídeas más
comúnmente cultivados como plantas ornamentales se enfatizan Cattleya,
Dendrobium, Epidendrum, Paphiopedilum, Phalaenopsis, Vanda, Brassia,
Cymbidium, Laelia, Miltonia, Oncidium, Encyclia y Coelogyne (Téllez, 2011). Por
ejemplo, los asiáticos confeccionan piezas de artesanía. Los malayos utilizan el
jugo de Dendrobium crumenatum para inflamaciones, en Ambonia utilizan los
pseudobulbos de Grammatophyllum speciosum en pasta contra parásitos
intestinales y tumores malignos.

1.2.4.2 Importancia medica

Las orquídeas son documentadas por Hernández y Sahagún para curar la
disentería, la tos, para “templar el calor” del estómago, para la mala digestión,
heridas infectadas, hemorragias, dolor de cabeza, así como desinflamatorio y
mitigador de fiebre (Emeterio et al., 2016). Los usos prehispánicos de los que se
sabe mediante documentos históricos, incluyen a L. autumnalis con atributo de
aglutinante (Shagún, 1975; Emeterio et al., 2016), y medicinal para atender
hemorragias, heridas, inflamaciones y fiebre (Hernández, 1959; Emeterio et al.,
2016) y a S. hernandezii con uso medicinal para templar el calor del estómago y
uso ornamental en jardines (Hernández, 1959, Emeterio et al., 2016). En baja
california Epipactis gigantea es usada como heleborina (sustancia usada para
alteraciones mentales y como insecticida). Vergara et al., (2008) menciona que L.
autumnalis es usada contra la hipertensión.

12
1.2.4.3 Importancia cultural
Durante el México precolombino, los géneros de orquídeas más utilizados fueron
Laelia, Prosthechea y Bletia para la obtención de un “pegamento o engrudo”,
conocido en náhuatl como tzauhtli o tzacutli (Hágsater et al., 2005; Emeterio-Lara
et al., 2016), este pegamento se extraía de los pseudobulbos deshidratados y
molidos, el cual se utilizaba para la confección de arte plumario, como mordente
de pinturas y como aglutinante de papel (Hágsater et al., 2005). Los purépechas
utilizaron el tzauhtli con medula de caña de maíz para confeccionar esculturas
religiosas. El tzauhtli y el tatzingui se utilizan para la elaboración de los alfeñiques
(Hágsater et al., 2005). Las flores de Prosthechea citrina eran utilizadas para
adornar las coronas, guirnaldas y ramilletes de los indios. En la actualidad L.
autumnalis se utiliza en las coronas para los peregrinos que visitan el santuario de
Chalma, en el Estado de México (Emeterio et al., 2016).

1.2.4.4 Importancia religiosa

Las flores del género Laelia se utilizan como adorno en festividades religiosas, por
tal motivo son “flores sagradas” (Emeterio et al., 2016). Laelia speciosa (Kunth)
Schltr., se utiliza en la celebración de La Fiesta de Corpus Christi en poblaciones
de Michoacán; o conocida por los pueblos purépechas como “La Cha´Nantscua”,
en honor a la diosa de la naturaleza y de la fertilidad “Kueraj´peri” (Kuerájpiri). Es
utilizada como ofrenda a la diosa y se usa para decorar animales, tocados,
guirnaldas, canastas y ramilletes (Cox y Cervantes, 2016)

1.2.5 Sobreexplotación
Las orquídeas se ven amenazadas por su vulnerabilidad, inestabilidad y el abuso
en su uso como recurso (Cox y Cervantes, 2016); son plantas poco frecuentes y
de difícil reproducción natural; los periodos para su establecimiento, desarrollo y
floración, son largos, por lo menos de cinco años (Nava et al., 2011); sus semillas
son muy pequeñas y poseen escasa reserva de nutrientes para germinar (Arditti y
Ghani, 2000; Karol et al., 2015), lo cual disminuye sus poblaciones. En México se
13
han extinto al menos 22 especies de orquídeas y varias especies están en peligro
de extinción, debido a la reducción de su hábitat, restricción de su área de
distribución, perturbación de desarrollo urbano y turístico (Carnevali 2010; Cox y
Cervantes, 2016), la realización de nuevos caminos y la deforestación, por efectos
del cambio climático (Soto et al., 2007), actividades agrícolas, colecta excesiva,
comercio ilegal, carencias en la legislación, política ambiental y la falta de
esquemas para la participación de las comunidades en actividades de
conservación (Menchaca y Moreno, 2011; Emeterio et al., 2016), provocando
bajas en poblaciones naturales (Sosa y Platas, 1998; Donaldson, 2003; Bertolini et
al., 2012).
Estas plantas son importantes en el aprovechamiento de especies ornamentales
en México (Ceja et al., 2008; Luyando et al., 2011), ya que su uso y demanda va
incrementando con el tiempo (Marques, 2009), lo que impulsa la colecta
clandestina y el comercio ilegal, moviendo cerca de 10 millones de plantas al año
(Bertolini et al., 2012).

1.2.6 Adaptaciones
Orchidaceae constituye el grupo más evolucionado del súper orden Liliiflorae, que
representan la cima de procesos evolutivos y ecológicos, muestra características
especializadas que facilitan su expansión, colonización y adaptación (Ramos et
al., 2007), como semillas diminutas dispersadas por viento (microspermia),
relación simbiótica con micorrizas para la germinación (micotrofía), estructura floral
modificada para polinizadores específicos (Benzing y Atwood 1984, Benzing 1986,
Goh y Kluge 1989; Arévalo et al., 2011). También son plantas con metabolismo
CAM por lo cual, cuentan con estructuras anatómicas y fisiológicas adaptadas a
ambientes epifitos, como lo son, el grosor en la cutícula para la reducción de
transpiración y almacenamiento de agua (Sinclair 1990; Arévalo et al., 2011),
paredes engrosadas como tejido de acumulación de agua (Pridgeon 1986; Arévalo
et al., 2011), idioblastos evitan el colapso del tejido en los periodos de desecación
(Olatunji et al., 1980; Arévalo et al., 2011); pseudobulbos para el balance hídrico
14
(Braga 1977, 1987; Del Carmen y Graças, 1999).
Otra adaptación es la relación simbiótica con hongos para la germinación (Otero
et al., 2004; Karol et al., 2015), y la proporción de azúcares y nutrientes a plantas
jóvenes para desarrollarse y crecer hasta fabricar sus propios nutrientes
(Rasmussen, 1995, 2002; Karol et al., 2015). Algunas conservan esta simbiosis
hasta su estado adulto (Bernard, 1909; Arditti, 1992; Otero y Bayman, 2009;
Mosquera et al., 2010).

1.3 Laelia
El género Laelia se encuentra dentro de la subfamilia Epidendroide, el cual es el
linaje más diverso en cuanto al número de especies, número de géneros, hábitos y
formas de vida. El 80% (20,000 especies) es perteneciente a esta familia
(Hágsater et al., 2005). El género contiene especies epífitas y litófitas. Muestra
flores llamativas de color rosa (figura 3) (Marques, 2009). Es uno de los géneros
de orquídeas más atractivas por la espectacular apariencia de sus flores. Por este
motivo son empleadas en varios estados de México como: Michoacán, Morelos y
Veracruz, para adornar las ofrendas y tumbas en la noche del Día de Muertos, ya
que los purépechas tienen la creencia de que, por ser una flor de campo, los
pétalos almacenan agua para saciar la sed de los muertos (Cox y Cervantes,
2016). Las plantas de este grupo muestran una amplia gama de tamaños, que se
desarrollan en diferentes hábitats. Este género es típico de México, han sido
cultivadas y apreciadas ya que son ofrecidas en celebraciones religiosas y otras
festividades (Halbinger y Soto, 1997).
Los estudios en México de las orquídeas han aumentado, se han realizado varios
estudios que nos ayudan a conocer la ecología de orquídeas. Uno de estos
estudios, fue realizado por el Parque Ecológico “José Mariano Mociño” de la
Universidad Autónoma del Estado de México, en el cual se estudió la abundancia
y densidad de orquídeas en diferentes árboles, tales como Quercus spp, Fraxinus
udhei, Pinus oocarpa, Myrcianthes fragrans, Nectandra salicifolia, Leucaena
glauca, Inga jinicuil, Plumeria sp y Acacia farrnesiana; en cuanto a los resultados,
15
Quercus spp mostro 720 individuos de orquídeas con 12 especies, por tal motivo
esta especie fue el hospedero con mayor abundancia de epífitas (Morales et al.,
2016).

Figura 3. Representante del genero Laelia (L. speciosa) (Ávila et al., 2013).

1.3.1 Ecología del genero Laelia

En México en su mayoría el género Laelia habita en montañas, crecen a altitudes
de 2000 metros, toleran heladas cortas al amanecer y la mayoría son epífitas
(Halbinger y Soto, 1997). Los estudios en México de las orquídeas han
aumentado, se han realizado varios estudios que nos ayudan a conocer la
ecología de orquídeas. Las plantas tienen diferentes funciones, una de ellas es
que algunas orquídeas se consideran indicadoras de perturbación, tales como las
especies Dactylorhiza majalis y Prasophyllum correctum las cuales se benefician
con las quemas frecuentes del área en un bosque mesófilo de montaña en el
estado de Chiapas (Almeida et al., 2014). Hay orquídeas con diferentes estilos de
vida, una de estas son las rupícolas, estas plantas utilizan las rocas que presentan
musgo o restos de hojas en descomposición para poder desarrollarse. Se
16
alimentan de los nutrientes disueltos en el agua de lluvia, partículas que arrastra el
aire y de los desechos acumulados cerca de las rocas, también pueden
alimentarse de sus propios tejidos muertos; en cuanto a las epífitas, no son
parásitas, ya que no se alimentan del árbol donde viven, solo lo usan como
soporte y para alcanzar la luz del sol (Granados et al., 2003; Ibarra, 2016).

1.4 Laelia autumnalis

El nombre de L. autumnalis era chichiltepetzacuxochitl (Ffigura 4), que en náhuatl
significa flor silvestre, roja y pegajosa. Sin embargo, en el Estado de México y
Michoacán se le conoce como ahuaxuchitl, palabra de origen náhuatl traducido
como flor de encino (Nava, 2008; Beltrán et al., 2012).

Figura 4. Laelia autumnalis ilustrada en la obra de Hernández (1959).

Laelia autumnalis es endémica de México y se encuentra en las montañas del

centro de México, en los estados de Nayarit, Jalisco, Colima, Michoacán,
Guanajuato, México, Morelos, Guerrero, Puebla y en el Distrito Federal. Las
plantas crecen principalmente en robles y casualmente en rocas a una altitud de
17
1,800- 2,700 m, se localizan en bosques de pino-encino, caducifolios y
frecuentemente abiertos (figura 5) (Halbinger, 1993; Ramírez, 1996 y Halbinger y
Soto, 1997; Beltrán et al., 2012). L. autumnalis es epífita, con pseudobulbos
alargados, longitudinalmente arrugados; presentan de 1-3 hojas oblongas, agudas,
de 17 cm de largo y 3.8 cm de ancho; flores de 40-70 cm de largo en racimo de 5
a 12 flores. Con sépalos lanceolados y pétalos oblongo-lanceolados de color rosa-
púrpura o lila; flores vistosas y que duran de 10 a 15 días (Halbinger, 1993;
Halbinger y Soto, 1997; Beltrán et al., 2012).
Esta especie tiene un alto valor en México, es conocida como flor de muerto y se
usa en festividades del día de muertos, ya que su floración coincide con esta
celebración. Esta especie además de adornar altares religiosos es utilizada de
diversas formas, desde la época precolombina como materia prima, para la
elaboración de productos adhesivos, curativos, aglutinantes y ha sido importante
en la actividad culinaria, como condimento e incorporada en la actualidad en
diversas ceremonias religiosas (Salazar et al., 2007; Luyando et al., 2011).

Figura 5. Laelia autumnalis, A planta sobre roca y B flor (Ibarra, 2016).

1.4.1 Problemática
En un estudio realizado por Emeterio et al., (2016), en el estado de México,
menciona que Tenancingo fue el municipio con mayor número de especies y
18
ejemplares de orquídeas comercializadas, con valores promedio de seis veces
más que Malinalco y Santiago Tianguistenco. La especie L. autumnalis, en los
cinco municipios, fue la especie más comercializada al representar el 44% del total
de ejemplares ofrecidos por día. Por lo cual hay una mayor intensidad de
extracción para L. autumnalis, posiblemente por su mayor número de formas de
uso, tamaño y atracción de sus flores. Esta orquídea fue mencionada por los
vendedores como la más colectada en los municipios. La gran mayoría de
orquídeas conocidas por las comunidades pertenecen al género Laelia, en
particular L. speciosa, L. autumnalis y L. gouldiana. Las flores de esas plantas aún
se utilizan durante las fiestas religiosas que coinciden con su etapa de floración
(respectivamente mayo y octubre, noviembre) (Bertolini et al., 2012).

1.5 Asociación con microrganismos

Las relaciones simbióticas son transcendentales para la evolución y conservación
de muchos organismos (Thompson, 1994; Ordoñez, 2012). La simbiosis es un
proceso que favorece la diversificación de la vida en la Tierra y contribuye en la
dinámica de los nutrientes en la biosfera (Lane y Archibald, 2008). Evolutivamente,
las plantas requieren de la asociación con organismos especializados que
favorecen su adaptación a ciertos nichos ecológicos, y a la vez, mantienen un
crecimiento y desarrollo adecuado (Yuan et al., 2010; Ordoñez, 2012). Las plantas
pueden beneficiarse indirectamente de estos microrganismos, por la producción
de metabolitos de defensa contra patógenos (Bayman et al., 1997; Gao et al.,
2010; Fiorella et al., 2012), la secreción de fitohormonas que aumentan las tasas
de crecimiento, la movilización de nutrientes para la planta hospedera (Yuan et al.,
2009; Ovando et al., 2005; Ordoñez, 2012) y la tolerancia al estrés (Brundrett,
2006; Gamboa-Gaitán, 2006; Ordoñez, 2012). También algunos endófitos influyen
en el crecimiento y desarrollo de especies que crecen a su alrededor y que
usualmente son competidores por el espacio y nutrientes (Sánchez et al., 2013).

19
1.5.1 Endófitos
La palabra endófito se deriva del griego endon=dentro y phyte=planta. De Barry en
1866, fue el primero en utilizar el término, al describir a hongos viviendo dentro de
plantas (Petrini 1986; Ramírez, 2010). Hoy en día este término define a los
organismos que viven asintomáticamente dentro de tejidos aéreos vegetales,
pueden colonizar tanto espacios intercelulares como vasculares en tejidos de las
plantas, los cuales pueden permanecer dentro de la planta sin hacerle daño
(Carroll, 1986; Gamboa, 2006). Wilson (1995) presenta a los organismos endófitos
como hongos o bacterias, que están parte o todo su ciclo de vida en tejidos
vegetales vivos y causan infecciones asintomáticas completamente dentro del
tejido vegetal (Gamboa-Gaitán, 2006). Estos microorganismos protegen a su
hospedador contra patógenos o ayudan a crear resistencia a factores generadores
de estrés (figura 6) (Ordoez et al., 2012). Algunos endófitos se encuentran en la
planta desde la semilla, pero otros tienen mecanismos para colonizar las plantas
en posterior desarrollo (Rosenblueth et al., 2006; Ramírez, 2010).

Figura 6. Beneficios de la relación simbiótica entre plantas y endófitos (Ramírez-

Rodríguez, 2010).

20
1.5.1.1 Bacterias endófitas
La mayoría de bacterianas son epífitas y colonizan la rizosfera, aunque algunas
también pueden entrar y proliferar dentro de las plantas como endófitos (Compant
et al., 2011), penetran principalmente espacios intercelulares, intracelulares y
dentro de tejidos vasculares (Bacon y White, 2000; Pérez, 2010). La penetración
se puede originar por medio de estomas, heridas, áreas de emergencia de raíces
laterales, siendo que estas bacterias pueden producir enzimas hidrolíticas capaces
de degradar la pared celular (Macculley, 2002; Pérez, 2010). Recientemente se
han realizado estudios moleculares sobre diversidad de bacterias endofíticas y
han revelado que existe una gran riqueza de géneros y especies (Rosenblueth et
al., 2006; Ramírez, 2010). Se ha reportado que incrementan la capacidad de las
plantas para absorber los nutrientes del suelo, mediante el incremento y desarrollo
de raíces, ayudando a la solubilización de los fosfatos y la fijación biológica del
nitrógeno (Li et al., 2007; Ramírez, 2010). Ramos et al., (2007) aislaron e
identificaron bacterias endófitas con pruebas bioquímicas, en pseudobulbo, hoja y
raíz asociadas a Laelia furfurácea. El género bacteriano con mayor frecuencia fue
Enterobacter. De igual manera, Jiménez et al., (2015), aislaron una bacteria
endófita de una planta de vainilla, la cual presentara una capacidad
biocontroladora de Fusarium. Aunque la planta muestre enfermedad, con la
bacteria endófita genera mecanismos de defensa contra el microorganismo
invasor. Por su parte, Esposito et al., (2017), en Oncidium flexuosum con
microscopía electrónica de barrido vieron la presencia de bacterias endófitas en
espacios intracelulares en las hojas, espacios intercelulares en raíces y en los
tejidos de xilema. Encontraron comunidades bacterianas endófitas que habitan en
las microplantas antes del inicio del cultivo in vitro. En cuanto a Faria et al., (2013),
aislaron doce cepas bacterianas de los tejidos de meristemo de Cymbidium
eburneum. Se inocularon a plántulas de Cattleya, todas las cepas bacterianas
promovieron el crecimiento de las plantas y aumentaron la supervivencia durante
la aclimatación, también aumentaron significativamente la biomasa en brotes y
raíces. Por otra parte, White et al., (2014), aislaron Bacillus amyloliquefaciens
21
en orquídeas de vainilla (Vanilla phaeantha) y vainilla híbrida cultivada (V.
planifolia × V. pompona) como un endófito bacteriano. En los estudios histológicos
se pudo observar que la bacteria puede penetrar profundamente en los tejidos
vegetales en desarrollo en el meristemo de los brotes. En plántulas de Gloria
matutina, la bacteria promovió el crecimiento de las plántulas y redujo la necrosis
de las plántulas debido a patógenos. Li et al., (2017), mencionan que las células
de velamen, pueden proteger a las bacterias de diversos factores bióticos y
abióticos. Dentro de este grupo se encuentran cianobacterias, las cuales tienen
una alta actividad fijadora de nitrógeno y las bacterias heterótrofas que producen
ácido indol-3-acético (IAA). La relación de cianobacterias con sus anfitriones crea
una simbiosis única, que garantiza una estabilidad ecológica y un suministro de
nutrientes para ambos socios.

1.5.1.2 Hongos endófitos

Los hongos endófitos son un grupo muy diverso que habita en diversas partes de
las plantas. La mayoría corresponden al phylum Ascomycota (Sánchez et al.,
2013). Se han encontrado hongos endófitos en todos los tipos de plantas (pastos,
algas, musgos y plantas vasculares), desde las que habitan en el ártico hasta los
trópicos, también en campos agrícolas (Sánchez et al., 2013). Los endófitos
fúngicos tienen efectos profundos en la ecología de las plantas, el estado físico, la
evolución e incluso la diversidad y estructura de las comunidades de plantas (Li et
al., 2017), Por tal motivo se han realizados diversos estudios entre los cuales se
encuentra el estudio de Lara (2006), realizado en orquídeas epífitas, en el cual se
aislaron hongos y bacterias endófitos; los identificaron por métodos moleculares y
bioquímicos. Por otro lado, Valdés et al., (2011) identificaron los hongos que
colonizan la raíz de la orquídea terrestre Cypripedium irapeanum por medio de
fragmentos de la restricción; localizaron pelotones e hifas en segmentos de raíces
teñidas. Corrêa et al., (2015), trabajaron con endófitos de orquídeas epífitas, y
rupícolas nativas. La identificación la realizaron mediante la extracción de DNA y
la amplificación del ITS. Por su parte, Fiorella et al., (2012), realizaron el
22
aislamiento de endófitos de Vanilla silvestre, para inocularlo en el sustrato de
Vanilla planifolia, lo cual ayudo al crecimiento, aumentando la biomasa aérea,
longitud de raíces y altura de la planta. Sim embrago, también se han realizado
estudios relacionados, usando otras familias, como lo es el estudio de Leone et
al., (2014), consiguieron caracterizar la anatomía de la raíz y los endófitos
radicales en P. parlatorei, aplicaron técnicas histológicas y tinción convencionales.
Se observó la presencia de hongos micorrícicos arbusculares y de septados
oscuros y se describe la morfología de ambos endófitos radicales en P. parlatorei.
Rodríguez y Lora (2016), describieron mediante caracterización taxonómica la
micobiota endófita en plantas del género Maxillaria. Encontrando Rhizoctonia,
Tullasnela y Ceratobasidium. Así mismo encontraron diferencias en el número de
plantas colonizadas por especie vegetal y por zona de muestreo.
Lizarazo et al., (2014), obtuvieron hongos endófitos de hojas y raíces de Cattleya
percivaliana y Cattleya trianaei en condiciones de invernadero. Se obtuvieron 323
hongos. Se identificaron géneros que colonizaron exclusivamente un tejido, o
ambos tejidos. Por otro lado, Herrera et al., (2017), Encontraron que
Tulasnella sp., aislado de Chloraea gavilu induce la germinación de semillas de
diferentes especies de plantas. Los hongos endofíticos septados oscuros (DSE)
no mostraron ningún efecto sobre el desarrollo de las semillas; pero su presencia
generalizada en orquídeas sugiere un papel putativo en el establecimiento de
plantas.

1.6 Área de estudio

La Sierra de Pénjamo está situada en la zona del Bajío, en parte de los municipios
de Cuerámaro, Pénjamo y Manuel Doblado, y se encuentra al suroeste del estado
de Guanajuato entre las coordenadas 20°24’30” y 20°40’00” N, 101°38’12” y
101°57’20” O (figura 7). Este lugar presenta diferentes tipos de vegetación, como
lo son bosque de encino, bosque de pino, bosque espinoso, bosque tropical
caducifolio, bosque de galería y pastizales.
La Sierra de Pénjamo forma parte de una región hidrológica de gran importancia
23
como lo es la Cuenca Lerma-Chapala, que genera una significativa recarga de los
acuíferos Río Turbio y Pénjamo-Abasolo. Esta región cuenta con una amplia
riqueza biológica representada en sus suelos, arroyos y cuerpos de agua. Está
constituida tanto al sur como en el norte, de lomeríos volcánicos, al suroeste por
una depresión de depósitos perennes y al sureste se ubican las elevaciones más
altas de la región (Guadián, 2012a, 2012b; Hernández et al., 2014).

Figura 7. Ubicación geográfica de fuerte de los Remedios, Sierra de Pénjamo (20°

32’10” N y 101°40’28” 40´ 28”O).

24
CAPÍTULO II. Planteamiento del
problema

25
2 Planteamiento del problema

Las orquídeas son plantas de difícil reproducción natural, la cual puede tardar por
lo menos cinco años (Nava et al., 2011). Estas plantas producen flores que tardan
largo tiempo en desarrollarse, además, sus semillas son muy pequeñas y poseen
escasa reserva de nutrientes para germinar (Arditti y Ghani, 2000; Luyando et al.,
2011). Por lo cual, requieren una relación simbiótica con organismos endófitos que
les proporcionan azúcares y nutrientes necesarios para desarrollarse, crecer lo
suficiente y reproducirse (Rasmussen, 1995, 2002; Luyando et al., 2011). Los
estudios sobre endófitos de orquídeas son escasos y generalmente se centran
en los hongos (Faria et al., 2013). En cuanto a la investigación de la biología
orquídeas, la mayoría de los trabajos prestan atención a las micorrizas, se sabe
relativamente poco de la naturaleza de los endófitos en tejidos aéreos de la planta
y su papel en el establecimiento y crecimiento de orquídeas (Yuan et al., 2010).
Para conservar estas plantas se requiere que conozcamos, comprendamos y
conservemos a los microorganismos con los cuales se asocian (Zettler et al.,
2017).

2.1 Justificación
Las orquídeas son un elemento importante en el aprovechamiento de las especies
ornamentales en México (Ceja et al., 2008; Luyando et al, 2011). Estas plantas
muestran características avanzadas desde el punto de vista evolutivo, ya que
presenta notables especializaciones de polinización, sistemas de almacenamiento
de agua (pseudobulbos), tienen una particular complejidad floral y establecen
estrechas relaciones simbióticas con ciertos hongos (Téllez, 2011). Los
organismos endófitos son un grupo muy diverso, que habitan en diferentes partes
de las plantas. Estos organismos usualmente obtienen nutrientes y protección de
su hospedador y algunos en retribución desempeñan un papel mutualista,
induciendo su crecimiento, aumentando su tolerancia al estrés y brindando
protección y resistencia contra herbívoros y/o microorganismos fitopatógenos
(Sánchez et al., 2013), teniendo importancia en el papel ecológico, ya que
26
contribuyen a la conservación de la población de orquídeas y por ende a la de la
biodiversidad (Dearnaley, 2007; Mosquera et al., 2010). Sin embargo, son muy
pocos los estudios relacionados con endófitos de orquídeas (Díaz et al., 2000;
Mosquera, 2010). Por lo anterior es importante realizar un análisis de estos
organismos presentes en Laelia autumnalis, para llevar a cabo una identificación.

2.2 Objetivos

2.2.1 Objetivo General

Aislar e identificar microorganismos endófitos y la descripción anatómica de Laelia
autumnalis.

2.2.2 Objetivos específicos

 Descripción anatómica de L. autumnalis.

 Aislar e identificar bacterias endófitas en raíz, hoja y pseudobulbo.
 Aislar e identificar hongos endófitos en raíz, hoja y pseudobulbo.
 Localizar a nivel celular hongos endófitos.

27
 CAPÍTULO III. Metodología

3.1 Colecta
En Fuerte de los Remedios, Sierra de Pénjamo, Guanajuato se colectaron plantas
pertenecientes a Laelia autumnalis (Fig. 8), para la identificación de
microorganismos endófitos. Se seleccionaron plantas epífitas y rupícolas, con un
correcto desarrollo y que no mostraran enfermedades ni síntomas visuales de
deficiencias nutritivas. Se utilizó como referencia la metodología utilizada por
Otero et al., (2002) modificando algunos aspectos. Las hojas, raíces y
pseudobulbos se almacenaron en bolsas herméticas y se transportaron en nevera

28
hasta el Laboratorio de Ecología molecular y Bioprospección, del departamento de
Biología en las instalaciones del Instituto Tecnológico Superior de Irapuato (ITESI).

Figura 8. Espécimen de Laelia autumnalis, A) epífita y B) rupícola.

3.2 Tinción diferencial

Se realizaron cortes a mano alzada, se deshidrataron con alcohol al 50, 70 y 95%
por 10 minutos cada uno. Se tiñeron con safranina alcohólica por 20 min. Se
enjuagó con alcohol al 95%, se agregó verde rápido por 10 seg, se dio un
enjuague con alcohol al 100%, se colocó en xileno por 30 minutos y se montó en
resina sintética (Sandoval, 2005).
3.3 Localización de hongos endófitos a nivel de órgano
Las raíces, tallos y hojas se examinaron para la visualización de hifa fúngica que
habita tejidos internos por el método de Phillips y Hayman, 1970. Clareo. Los
órganos se colocaron en solución de KOH al 10% y se dejaron en autoclave a 115
libras por 10 min. Acidificación. Se añadió HCl al 1N durante 10 min a 115 libras.
El clareo y la acidificación se realizaron 3 veces. Tinción. Se agregó Azul de
algodón al 0.05% en lactoglicerol y se calento a 115 libras por 1 min, se retiró el
colorante, se lavó con agua destilada y lactoglicerol al 50% para eliminar el
exceso de colorante, y se conservaron en lactoglicerol al 50%.

29
3.4 Desinfección de órganos
Los órganos se lavaron con agua corriente, luego se desinfectaron
superficialmente con etanol a 70% por 5 min, hipoclorito de sodio a 3% por 2 min,
etanol al 70% por 5 min y, finalmente se enjuagó tres veces con agua destilada
estéril (Otero et al., 2002; Fiorella et al., 2012). En paralelo, la esterilización de las
superficies se comprobó mediante la siembra tres veces 100 μl de la última
solución de lavado (de cada uno de los órganos), no hubo crecimiento de
microorganismos después de 5 días de incubación a temperatura ambiente (28 °
C).

3.5 Hongos endófitos

3.5.1 Aislamiento
Se sembraron 6 secciones de 0.5 cm en medio PDA, Sabouraud y Rosa de
Bengala con antibiótico (cloranfenicol 500 mg/L) (Salgado y Cepero, 2005). Se
incubó a 28 °C, hasta obtener crecimiento del micelio. Los microorganismos se
aislaron en sus correspondientes medios, para obtener cultivos puros y facilitar la
identificación. Las hifas emergentes a partir de segmentos se subcultivaron (en el
mismo medio en el que se obtuvieron) fresco para la purificación. Las cepas
purifica fúngicas se mantuvieron a 4℃ después de ser cultivadas a 28 ℃ durante
7 días.
3.5.2 Identificación de hongos
Para la identificación se utilizaron características microscópicas de los
aislamientos obtenidos. La identificación se realizó por la técnica de Ridell
(microcultivo). Para la cual, se preparó medio de cultivo con PDA y Agar
bacteriológico (3.9 g y 1.5 g respectivamente para 100 ml). En cajas Petri se
colocó un círculo de papel filtro, encima de estos dos palillos, se añadieron 3 ml de
agua destilada, un portaobjeto con un cubo de medio, encima de los palillos; se
inocularon los cuatro lados del cubo. Se incubaron a 28 ℃ hasta obtener
crecimiento micelial (Iturbide, 2017 plática personalizada). Las cepas fúngicas
aisladas fueron identificadas a género por rasgos morfológicos (taxonomía
30
clásica). Las muestras se tiñeron con azul de algodón. Las características
microscópicas de las cepas se basaron en observaciones con un microscopio
óptico.

3.6 Bacterias endófitas

3.6.1 Aislamiento
Se siguió la misma técnica utilizada para los hongos; se sembraron 6 secciones de
0.5 cm en medio R2A (Salgado y Cepero, 2005). Se incubó a 28 °C, hasta obtener
crecimiento. Los microorganismos se aislaron en sus correspondientes medios.

3.6.2 Determinación de las Unidades Formadoras de Colonias (UFC)

Se maceró 1 g de cada uno de los órganos con 1 ml de PBS. Se realizaron
diluciones seriadas (101 , 10 2), se sembraron en los cuatro medios. Se incubó a 28
°C, por 72 horas. Cada microorganismo se aisló en sus correspondientes medios,
para obtener cultivos puros. El número de bacterias cultivables asociados con
diferentes partes de la planta se contaron y se calcularon los números de unidades
formadoras de colonias (log10 UFC) por gramo de peso fresco. Todos los aislados
obtenidos en placas se purificaron adicionalmente antes de su almacenamiento en
- 80 ° C en LB estéril modificado con 50% de glicerol.
3.6.3 Extracción de ADN genómico bacteriano
La extracción de ADN se realizó mediante la técnica de lisis alcalina, mediante el
método de Birnboim (1983). Se utilizó como solución de lisis Buffer Tris HCl pH8 1
M y Buffer EDTA 0.1 M. Para realizar la digestión del RNA se añadió RNAasa al
lisado celular y se incubó a 37°C por 10 min. Después para la desnaturalización se
agregó Acetato de sodio. Se añadió un volumen de fenol-cloroformo-isomilico
(fenol 25 ml/ cloroformo 24 ml/ isomilico 1 ml). Se centrifugó a 10000 rpm/ 10
minutos, se colectó la parte orgánica y se colocó en otro tuvo. A lo que se
recuperó se le agregaron 2 volúmenes de Etanol absoluto, se centrifugó
nuevamente a 12000 rpm durante 30 min, se decantó, se añade 1 ml de Etanol al
75%. Se volvió a centrifugar a 12000 rpm por 10 minutos, se decanta. Se dejó
31
secar a temperatura ambiente por 15 minutos. Por último, se agregan 30 µL de
agua Mili-Q, para la hidratación de DNA y se almacena a -20°C hasta su uso.
Para evaluar la calidad del DNA extraído primero se realizó una electroforesis
colocando 5 μl del DNA con 1 μl de colorante, en un gel de agarosa al 1% (w/v)
que corrió a 100 volts durante 40 minutos y se observó bajo luz azul.

3.6.4 PCR
El gen 16S se amplificó utilizando los siguientes oligos F27 y I492. Incluir la
secuencia de los oligos La reacción de PCR se llevó a cabo en un volumen de
reacción de 25 μL, los cuales contenían 12.5 µL de Supermix (polimerasa, buffer,
cofactor MgCl_2, DNTP´S), 1 µL de Oligo directo F27, 1 µL de Oligo reverso I492,
1 µL de extracción de ADN y 9.5 µL de agua Mili-Q. Después los tubos se dejaron
en un termociclador. Con el programa 16 bacteria, bajo los siguientes ciclos y
temperaturas primer ciclo de 5 min a 95ºC, 35 ciclos de desnaturalización (2 min a
94ºC), alineamiento (1 min a 53ºC), y extensión (2 min a 72ºC) y una extensión
final (10 min a 72ºC) Los productos de PCR se visualizaron mediante una
electroforesis en gel de agarosa 1%.
3.6.5 ARDRA
Para el análisis de restricción se llevó a cabo en un volumen de reacción de 20 μL,
el cual contiene 10 µL de producto de PCR, 0.3 µL de RSA I, 0.3 µL de Hind III, 2
µL de Buffer Tango 10x y 7.4 µL de agua Mili-Q. Se incubaron a 37 ℃ por 3 horas,
posteriormente se dio un choque térmico por 10 minutos a 65℃. Se preparó gel de
agarosa al 2.5 % con TAE 1X (base tris, ácido acético y EDTA). Los posos se
cargaron con una mezcla de 20µL de muestra de DNA y 2µL de buffer de carga
para DNA. En el primer pozo del carril se colocaron un marcador de peso
molecular. La electroforesis se realizó por 3 horas a 90 Voltios. Las fotografías se
leyeron con el programa llamado CLIQS 1D Pro. La finalidad del programa es
detectar los carriles y las bandas, dando como resultado un árbol filogenetico.

32
3.6.6.1 Identificación de grupos ARDRA
Los grupos se formaron con el análisis de restricción, los cuales se basaron en las
bandas y su peso molecular (gen 16S DNAr) (Compant et al., 2011).

33
 CAPÍTULO IV. Resultados

Descripción anatómica
La anatomía de la hoja de Laelia autumnalis en corte transversal muestra estomas
(Ffigura 9), tiene cutícula gruesa y ondulada en la cara abaxial y lisa en la cara
adaxial; presentó dos hileras de hipodermis; contó con mesófilo homogéneo.
Haces vasculares mayores y menores, los mayores se encuentran dispersos en el
eje central de la hoja, en cuanto a los menores se sitúan dispersos. En el tejido
vascular, se mostraron elementos de vaso, al igual que metaxilema y protoxilema,
los cuales se encontraron rodeados de esclerénquima (figura 10 A-C).
En cuanto al pseudobulbo, se observó epidermis lisa, seguida de 5 hileras de
células de hipodermis; células de mesófilo; los haces vasculares mayores
contorneando la orilla y los menores dispersos en el centro, el xilema rodeado de
fibras y elementos de vaso, el floema se encuentra en diferenciación (figura 10 D-
F).
Para la raíz se vieron de 5-7 líneas de células de velamen, seguido de exodermis
uniseriada; se pudieron apreciar 4 hileras de parénquima cortical, en la cual se
puede ver la presencia de dos engrosamientos alrededor del haz vascular, el cual
34
está rodeado por una endodermis uniseriada; el floema se encuentra en pequeños
grupos alrededor de la endodermis, seguido de xilema (figura 10 G-I).

Figura 9. Estomas en cara adaxial A) 10x, B) 40x.

35
Figura 10. Sección transversal órganos Laelia autumnalis. A-C. Hoja, D-F.
Pseudobulbo, G-I. Raíz. ep= epidermis; epd=epidermis adaxial; epb= epidermis
abaxial; p= mesofilo; hv= haces vasculares; cu= cutícula; f= floema; x= xilema; fi=
fibras; ex= exodermis; ve= velamen; pc= parénquima cortical; en= endodermis;
*=parénquima medular.

Localización de hongos
Se encontraron hongos endófitos en los órganos de Laelia autumnalis y se
corroboró su presencia mediante análisis microscópico.
Se localizaron hongos endófitos a nivel celular. En la hoja y pseudobulbo (figura
11, A-C y G-I respectivamente) se localizaron tanto en tejido fundamental como en
vascular. Por otro lado, en la raíz (figura 11, D-F), se localizaron en su mayoria en
el velamen, tambien se encontraron en tejido fundamental.
36
Figura 11. Localización de endófitos. A-C. Hoja, D-F. Raíz, G-I. Pseudobulbo.

4.1 Microorganismos endófitos

Se aislaron 37 hongos y 79 bacterias (imagen representativa figura 12). De los
cuales se obtuvieron 15, 15, 7 hongos en hoja, raíz y pseudobulbo
respectivamente; en cuanto a bacterias 24, 28, 27 respectivamente. La figura 13,
muestra mayor número de aislados bacterianos obtenidos de raíz epífita, seguido
de pseudobulbo epifita y hoja rupícola; la raíz rupícola fue de los órganos que tuvo
menos. En cuanto a los hongos hubo mayor presencia de hongos en raíz rupícola
y pseudobulbo epífita; la hoja epífita fue el órganos con menos aislados.

37
Figura 12. Evidencia gráfica de infección por hongos endófitos en Rosa de
Bengala, A) bacteria en hoja y B) hongo de pseudobulbo.

25

20
Morfotipos

15

10

0
Hábito

Hongos Bacterias

Figura 13. Morfotipos y habito de los aislados obtenidos en los órganos de L.

autumnalis.
4.2 Localización de hongos
Se encontraron hongos endófitos en los órganos de Laelia autumnalis y se
corroboró su presencia mediante análisis microscópico.
Se localizaron hongos endófitos a nivel celular. En la hoja y pseudobulbo (figura
14, A-C y G-I respectivamente) se localizaron tanto en tejido fundamental como en

38
vascular. Por otro lado, en la raíz (figura 14, D-F), se localizaron en su mayoria en
el velamen, tambien se encontraron en tejido fundamental.

Figura 14. Localización de endófitos. A-C. Hoja, D-F. Raíz, G-I. Pseudobulbo.

4.3 Identificación fúngica

Se obtuvieron 37 hongos cultivables con características macroscópicas y
microscópicas diferentes (figura 15-19). En algunos casos no se identificaron los
hongos, incluso cuando se utilizaron diferentes guías de identificación. Entre los
que se lograron identificar se encontraron: 6 Acremonium, 1 Ulocladium, 2 Mucor,
1 Alternaria, 3 Rhizoctonia, 2 Penicillium, 1 Rhizopus, 1 Venturia, 2
Haplosporangium, 1 Monacrosporium, 1 Curbularia, 1 Fusarium, 1 Cladosporium,
2 Scopulariopsis, 2 Epulorhiza y 8 que no se lograron identificar.

39
En la tabla 3, se puede observar los géneros de hongos identificados. El género
más abundante fue Acremonium; Penicillium y Haplosporangium solo se
encontraron en rupícola; Rhizopus y Venturia se encontraron solo en epífita;
Mucor, Epulorhiza y Rizoctonia encontraron en ambos hábitos; Fusarium fue el
único género que se pudo identificar para raíz epífita.

Figura 15. Hongos endófitos aislados de pseudobulbo. A-B) H4-Acremonium, C-

D) H5-Epulorhiza, E-F) H6- Ulocladium, G-H) H16-Mucor, I-J) H17-Scopulariopsis,
K-L) H37-Alternaria.

40
Figura 16. Hongos endófitos aislados de hoja. A-B) H10-NI, C-D) H12-NI, E-F)
H13-Rhizoctonia, G-H) H20-Penicillium, I-J) H22-NI, K-L) H23-Acremonium, M-N)
H24-Rhizopus, Ñ-O) H26- Acremonium.

41
Figura 17. Hongos endófitos aislados de hoja. A-B) H27-Venturia, C-D) H28-
Rhizoctonia, E-F) H29-Haplosporangium, G-H) H33- Mucor, I-J) H35-Epulorhiza,
K-L) H36-NI.

42
Figura 18. Hongos endófitos aislados de raíz. A-B) H1-Monacrosporium, C-D) H2-
NI, E-F) H3- Rhizoctonia, G-H) H7-Curbularia, I-J) H8- Penicillium, K-L) H9-
Fusarium, M-N) Acremonium, Ñ-O) H15-Acremonium.

43
Figura 19. Hongos endófitos aislados de raíz. A-B) H14-NI, C-D) H18-NI, E-F)
H19- Haplosporangium, G-H) H25-Acremonium, I-J) H31-Cladosporium, K-L) H34-
Scopulariopsis.

Tabla 3. Órganos en los cuales se aislaron cada uno de los géneros identificados.

Hábito Rupícola Epífita

Pseudobulb Pseudobulb
Órgano Hoja Raíz Hoja Raíz
o o
Penicillium x x
Haplosporangium x x
Mucor x x
Epulorhiza x x
Ulocladium x
Scopulariopsis x x
Alternaria x
Monacrosporium x
Rhizoctonia x x
Curbularia x
Acremonium     x x x  
Cladosporium     x      
Rhizopus       x    
Venturia       x    

44
Fusarium           x

4.4 Unidades Formadoras de Colonia

En la figura 20 se puede apreciar que los organos con menor numero de
organismos fueron el pseudobulbo rupícola con 3 lo g10 UFC g , seguido por hoja
rupícola con 3.3 lo g10 UFC g. Los aislaron fueon mayores en raíz con 3.5 lo g10
UFCg epífita y 3.7 lo g10 UFC g rupícola. Lo cual se puede verificar en la Tabla 4,
se observa que la raíz rupícola tuvo un promedio 6000 UFC, seguido por
pseudobulbo epífita 3700 UFC. En la raíz y hoja la mayoría se obtuvieron de
plantas rupícolas, en cambio la mayoria de pseudobulbo por fueron las epífitas,
también se considera el medio R2A como el más óptimo para la obtención de
UFC.

4
3.5
3
2.5
Log 10

2
1.5
1
0.5
0
Organos

Figura 20. UFC con lo g10 UFC g en hoja, pseudobulbo y raíz.

Tabla 4. Obtención de UFC en hoja, raíz y pseudobulbo de L. autunalis.

Órgano Habito UFC Medio Promedio Lo g10
Epífita 1000 R2A 1000 3
Rupícola 5000 R2A
Hoja
Rupícola 400 R2A 1833.3333 3.26
Rupícola 100 PDA
45
 Rupícola 1000 R2A
1000 3
Pseudobulb Rupícola 1000 R2A
Epífita 8000 R2A
o Epífita 2000 Sabouraud 3700 3.56
Epífita 1100 R2A
Epífita 13000 R2A
Epífita 200 PDA
Raíz Epífita 200 Sabouraud 3020 3.48
Epífita 1000 Sabouraud
Epífita 700 R2A
Rupícola 6000 R2A 6000 3.77

4.5 Identificación bacteriana

En la figura 21, amplificación del gen 16S de las bacterias endófitas aisladas, se
muestra un gel representativo donde se obtuvo un amplificado específico de 1500
pares de bases (pb) el cual corresponde al gen 16S rDNA. La figura 22, muestra el
análisis de restricción, en el cual se pueden apreciar distintas bandas,
relacionadas con los fragmentos de DNA y su peso molecular. Los perfiles de las
bandas confirmaron la presencia de una diversa comunidad bacteriana
endofítica. Se obtuvieron 25 grupos ARDRA, de los cuales los grupos con mayor
abundancia fueron el 17, 4 y 14, con 8, 7 y 5 organismos respectivamente (figura
23).
En la raíz epífita se encontró mayor número de grupos ARDRA (14 grupos),
seguido de pseudobulbo rupícola (11 grupos) y hoja rupícola (10). El órgano con
menos grupos ARDRA fue hoja epífita, ya que mostró 6 diferentes grupos ARDRA
(figura 24).
El análisis filogenético del gen 16S de bacterias endófitas asociadas a Laelia
autumnalis se muestran en la figura 25. Se puede ver que la bacteria B73 se
comporta como grupo externo. El árbol filogenético permitió verificar la variabilidad
en el gen ADNr 16S, lo cual justifica la separación en dos linajes separados (A y
B). En el grupo B, se encuentran los aislados B67, B69, B70, B71, B72, que
provienen de plantas epífitas y B76 de rupícola. B69 y B71 muestran una gran
probabilidad de similitud, encontrados en raíz y bulbo respectivamente.
46
Adicionalmente, en el grupo A, se observaron dos grupos: uno que incluye las
bacterias B62 y B77, de igual forma con alta similitud, aunque sean de raíz epífita
y hoja rupícola respectivamente; el segundo grupo se organiza en dos grupos: uno
con B65, B66, B74 y B75, de bulbo y hoja rupícolas. De igual forma B65 y B66
presentan mayor similitud.
El resto se encuentran en el grupo más numeroso, el cual contiene organismos
obtenidos de diferentes órganos con diferente hábito (B26-B31, B42-B48, B35-
B34, B56-30, B55-B24); diferente órgano con mismo hábito (B38-11, B03-B02,
B53-B13); mismo órgano y diferente hábito (B46-B27, B49-B01, B63-B59, B32-
B23).

Figura 21. Electroforesis en gel de agarosa 1% 100 Volts durante 1h, mostrando
el amplificado del gen 16S de la talla esperada. Carril 5 marcador molecular,
carriles 1-4 ADN bacteriano.

47
 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20

Figura 22. Electroforesis en gel de agarosa 2.5% 100 Volts durante 4h, mostrando
análisis de restricción. Carril 1 marcador molecular 100 pb y 2 marcador molecular
50 pb, Carril 3-20 bacterias endófitas.

9
8
7
6
# bacterias

5
4
3
2
1
0

grupos ARDRA

Figura 23. Grupos ARDRA.

48
 16
14
12
grupos ARDRA 10
8
6
4
2
0
organos de los aislados

Figura 24. Grupos ARDRA en hoja, raíz y pseudobulbo, tanto epífita como
rupícola.

49
 A

Figura 25. Dendograma basado en el análisis de las bandas y el peso molecular

que presentan.

50
 CAPÍTULO V. Discusión

5.1 Anatomía
Los estudios anatómicos de órganos vegetales son importantes, ya que estos nos
hablan de las condiciones de las plantas y el lugar en el que se encuentran. La
reducción de transpiración y almacenamiento de agua, son estrategias que tienen
las orquídeas para tolerar sequías. Dentro de la hoja hay caracteres que permiten
51
reducir la pérdida de agua los cuales son: el grosor de la cutícula, la densidad y
distribución de los estomas y la presencia de pelos superficiales (Sinclair 1990;
Arévalo et al., 2011).
Arévalo et al., (2011), mencionan que las orquídeas que presenten tallo, muestran
vacuolas que abarcan la mayoría de las células, hojas suculentas y una cutícula
gruesa. Por otro lado, las especies con pseudobulbo, ya que éste es un órgano de
se reserva, no muestran las características antes mencionadas, con lo cual se
concuerda con los autores, ya que en Laelia autumnalis, mostró vacuolas
pequeñas, hojas y cutículas delgadas. Del Carmen y Gracas, (1999) indica que los
especímenes con cutícula delgada se encuentran en lugares sombreados. Por tal
motivo, en este estudio se pudo evidenciar que Laelia autumnalis en Fuerte de los
Remedios, es una especie que se encuentra en un lugar sombreado, y con las
condiciones requeridas para su crecimiento.
En el estudio realizado por Marques et al., (2012), indica que Laelia purpurata al
igual que Laelia autumnalis en este estudio, en sección transversal de las hojas,
mostraron epidermis uniseriada en ambos lados y mesófilo homogéneo en el cual
se observan variaciones en el tamaño y forma de las células.
Las plantas con mesófilo homogéneo muestran haces vasculares mayores y
menores Del Carmen y Gracas, (1999).
Laelia anceps en el trabajo realizado por Noguera- y Jáuregui, (2011), muestra
estomas tetracíticos, estomas en cara abaxial; diez capas de mesófilo
heterogéneo con células voluminosas y de paredes delgadas; cutícula lisa; haces
vasculares mayores organizados en una hilera central, intercalados con haces
vasculares menores, fibras en haces vasculares. Sin embargo, Laelia autumnalis
muestra estomas en la cara abaxial; 13 capas de mesófilo homogéneo con pared
delgada; cutícula abaxial ondulada y adaxial lisa; haces vasculares mayores en el
eje central, haces menores dispersos, fibras rodeando haces vasculares.

5.2 Localización de endófitos

Los organismos endófitos viven asintomáticamente dentro de raíz y tejidos aéreos
52
vegetales, pueden localizarse en espacios intercelulares y vasculares (Carroll,
1986; Gamboa, 2006). Lo cual se pudo demostrar en este trabajo, ya que en los
tres órganos los hongos endófitos se localizaron tanto en tejido fundamental como
en vascular, y las plantas colectadas no mostraron signos visibles de enfermedad.
Lara (2006), realizó la tinción de raíces de Trichocentrum oerstedii, se pudieron
observar hifas dentro de las células corticales en raíz, algunas formando
pelotones. En cuanto a L. autumnalis se localizaron hifas en células corticales y en
las células de velamen; no se encontraron pelotones.

5.3 Endófitos
Hay estudios sobre la diversidad de endófitos de orquídeas, sin embargo, son
pocos. En este estudio los microorganismos endófitos, tanto hongos como
bacterias se encontraron en los tres órganos de la planta. De estos dos grupos la
mayoría se aisló de raíz. Estudios previos demuestran que las poblaciones de
endófitos disminuyen de la raíz a las partes aéreas (Hallmann, 2001). Los
resultados obtenidos se compararon con Otero (2015), ya que en ambos se
utilizó el método de Otero et al., (2002). Dicho autor aisló de Stanhopea tricornis,
hongos endófitos de los géneros Fusarium, Curvularia, Stemphyllum y
Rhizoctonia, los cuales en este trabajo se obtuvieron Fusarium, Curvularia y
Rhizoctonia. A pesar de ser orquídeas de diferente género y que muchas de las
características ortológicas que las distinguen están asociadas con el hongo que
las coloniza (Karol et al., 2015), mostraron similitudes en cuanto a los hongos
aislados.
Por otro lado, los resultados también se confrontaron con la publicación de Ávila
et al., (2013), a pesar de que se basan en la amplificación de extracción de ADN
de los tejidos. En Laelia speciosa se identificaron 8 géneros, Alternaria,
Curvularia, Cylindrocarpon, Fusarium, Myrmecridium, Neonectria, Penicillium y
Tetracladium. De los cuales en este trabajo se lograron aislar Alternaria,
Curvularia, Fusarium, Penicilium.
El género Fusarium se reporta en la literatura como patógeno de plantas,
53
causando pudrición en la raíz. Curvularia es considerado como fitopatógeno,
produciendo clorosis y necrosis. Rhizoctonia es formador de micorrizas (Otero,
2015). Petrini, (1991), nos dice que el término endófito puede cobijar tanto
hongos saprófitos como hongos patógenos latentes (Petrini, 1991). Sin embargo,
en la actualidad son organismos que viven asintomáticamente (Gamboa, 2006)
y/o con relación mutualistas dentro de tejidos (Ordoez et al., 2012).

5.4 Aislados bacterianos

Los resultados del conteo de Unidades Formadoras de Colonias (UFC), se
comparó con Ramírez (2010) con arroz y Compant et al., (2011) con uva, ya que
en ambos estudios se realizó el aislamiento de bacterias endófitas cultivables con
tejido fresco. Las bacterias endofíticas en reportes de poblaciones de organismos
en cultivo de arroz se encuentran de 1 02 a 103 UFC g-1 de raíces y tejidos
(Gyaneshwar et al., 2001; Ramírez, 2010), también en las partes aéreas se ha
reportado de 103 UFC g (Araújo et al., 2002; Ramírez, 2010). En este caso, los
aislados se obtuvieron de 101 y 102 , indicando una menor abundancia de
microorganismos. La mayor cantidad de bacterias endófitas se obtuvo de las
raíces, esto puede ser debido a que las raíces están en contacto directo con el
sustrato.
En cuanto a Compant et al., (2011), En flores 2.77 lo g10 UFC g fueron detectados
como bacterias endofíticas, 6.89 lo g10 UFC g en el interior de la raíz, y 3.43 lo g10
UFC g bacterias de tallos. Al igual que los autores, en este proyecto se aisló
mayor número de UFC en la raíz, seguido del pseudobulbo. Lo cual nos muestra
que el gradiente de concentración de bacterias disminuye a los órganos aéreos
(Hallmann, 2001).
Compant et al., (2011), en base a los grupos ARDRA, detectaron una diversidad
mayor de bacterias endofíticas en la raíz. De igual forma en este trabajo se
detectaron más grupos en la raíz epífita. Sin embargo, los grupos fueron menos
en la raíz rupícola.

54
55
 CAPÍTULO VI. Conclusión

Se obtuvieron endófitos de raíz, pseudobulbo y hoja de Laelia autumnalis. Se

aislaron 37 hongos y 79 bacterias. Dentro de los géneros de hongos que se
encontraron estuvieron Curvularia, Fusarium, Penicillium, Alternaria los cuales son
fitopatógenos y Rhizoctonia como formador de micorrizas. Se aislaron más hongos
en orquídeas rupícola y más bacterias en epífita. Los hongos se localizaron
fundamental y vascular, en raíz se observaron su mayoría en células del velamen.
El género Acremonium fue el más abundante, en 3 órganos. Mucor y Penicillium
se encontraron en dos órganos. El genero Alternaria solo en 1 órgano. En cuanto
a las UFC se aislaron más en raíz rupícola, pero menos en raíz epífita. Se
encontraron 25 grupos ARDRA, el mayor con 8 morfotipos; la raíz epífita fue el
órgano que tuvo mayor número de grupos ARDRA.
56
57
 CAPÍTULO VII. Literatura citada

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