Bitácora de Práctica 4.4. Obtención de DNA Plasmídico

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INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL

INSTITUTO POLITECNICO
ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIÓLOFICAS
DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMIICA
ALUMNO: RIVERA HERNÁNDEZ JORGE ÓSCAR
GRUPO: 3IM2
NACONAL
ESCUELA NACIONAL
DE CIENCIAS BIOLOGICAS

INGENIERIA BIOQUÍMICA
“Laboratorio de Ing. Bioquímica”

BITACORA
Profesores: -Silva Elizondo
-Elizabeth Jiménez
-Sergio Meza
-Sakuntala Gozara

Alumno: Rivera Hernández Jorge Oscar

GRUPO: 3IM2
INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL
ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIÓLOFICAS
DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMIICA
ALUMNO: RIVERA HERNÁNDEZ JORGE ÓSCAR
GRUPO: 3IM2
Practica No.4.4: “AISLAMIENTO DE DNA PLASMIDICO”
 INTRODUCCIÓN:
El termino DNA recombinante significa la unión o recombinación de dos piezas de DNA de dos
diferentes especies. Esta técnica permite purificar un gen (clona) de una especie para insertarlo al
DNA de otras especies, donde se replica junto con el DNA del hospedero.
Los plásmidos, también llamados plasmodios, son moléculas de DNA extra cromosómico circular o
lineal que se replican y transcriben independientes del DNA cromosómico. Están presentes
normalmente en bacterias, y en algunas ocasiones en organismos eucariotas como las levaduras,
aparecen en el citoplasma de las bacterias. Su tamaño varía desde 1 a250pb. El número de plásmidos
puede variar, dependiendo de su tipo, desde una sola copia hasta algunos cientos por célula.
Determinan ciertos rasgos, que no son vitales, pero que de alguna manera determinan la capacidad
del organismo para adaptarse.
Estas moléculas de DNA portan solamente unos pocos genes que en
cierto modo están ligados al cromosoma bacteriano, de forma que se
replican en números fijos, junto con los cromosomas. Las moléculas de
DNA plasmídico, adoptan una conformación tipo doble hélice al igual que
el DNA de los cromosomas, aunque, por definición, se encuentran fuera
de los mismos. Se han encontrado plásmidos en casi todas las bacterias.
A diferencia del DNA cromosoma, los plásmidos no tienen proteínas
asociadas.
Pueden ser introducidos en las células bacterianas por un proceso denominado transformación.
Algunas clases de plasmidos poseen la propiedad conocida como replicación relajada, esto
es que están presentes en forma de muchas copias por célula lo que facilita su aislamiento y
purificación, los plásmidos pueden ser usados como vectores; un vector es el sistema que permite
introducir en una célula el fragmento de DNA que pretende clonarse, en esta célula se replica y se
expresa. Dependiendo de su tamaño pueden codificar pocas o cientos de proteínas. Normalmente se
encuentran en forma superenrollada pero existen otras conformaciones:
1) ADN súper enrollado (superespiral): Este tipo de ADN que se encuentra totalmente intacto con
losfilamentos sin cortar, tiene una forma de remolino por lo que es muy compacta.
Es esta la conformación en la que se encuentran normalmente.
2) Superespiral desnaturalizado: Este ADN es como el ADN superespiral o superenrollado, pero
fue desnaturalizado por lo que tiene regiones sin unir que lo vuelven un poco menos
compacto.
3) Circular relajado: Por la tensión acumulada en los súper enrollamientos, el ADN se desenrolla
para así formar esta conformación. Esta interactúa completamente con ambos filamentos sin cortar
pero está enzimáticamente “relajada” y no se puede enrollar de nuevo ya que no hay
topoisomerasas presentes.
4) Lineal: Por otro lado, si hay un corte en las dos hebras se produce esta conformación. Así el ADN
tiene terminales libres. También se da porque el ADN era linear in vivo.
5) Mellado abierto circular: Esta última confirmación del ADN tiene un solo corte
filamentario. Estos diferentes tipos de conformaciones tienen la misma (número de pb), y masa
molecular, pero distinto volumen efectivo, distinto tamaño tridimensional. Por esto avanzan a
distinta velocidad por el gel durante la electroforesis (en este caso están organizados desde el que
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ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIÓLOFICAS
DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMIICA
ALUMNO: RIVERA HERNÁNDEZ JORGE ÓSCAR
GRUPO: 3IM2
avanzaría más rápidamente al más lento, esta velocidad depende de cuán compacta es la
conformación).
 OBJETIVOS:

 Aislar DNA plasmidico bacteriano comprobar dicho aislamiento mediante electroforesis en gel
de agarosa.
 Identificar las diferentes formas de DNA plasmidico observadas en la placa de electroforesis.
INICIO 1.-

Método MINI-PREP Calentar en baño maría o microondas hasta licuefacción licuefacción.

Bacterias transformadas con un plásmido


Verter agarosa al 1% en el porta geles de la cámara de electroforesis

Crecer las bacterias en medio


Luria-ampicilina en fase logarítmica Colocar el peine esperar a que solidifique luego retirar el peine y
verificar que los pozos se encuentren bien delimitados.

Centrifugar 1.5 mL del crecimiento bacteriano Desechar el


en un tubo eppendorf, a 13,000rpmx5min sobrenadante Tomar 5-10µL del DNA plasmídico obtenido y
adicionar 5- carga mezclar.
rpm durante 5 min.
Agregar 100 L de la solución I, resuspender
con vortex e incubar 5 min en hielo. Tomar 5-10µL del DNA plasmídico obtenido mezclar.

Con cuidado de no
Agregar 200 µL de la solución II y Adicionar 5-6 µL de colorante de carga y mezclar
romper el DNA e
mezclar invirtiendo el tubo 3 o 4 veces
Incubar 5 min en
hielo. Colocar en el pozo del gel de agarosa 1% y realizar la
Agregar 150 µL de la solución III y mezclar electroforesis a 80Vlts durante 30min
invirtiendo el tubo 3 o 4 veces. Incubar 5 min
en hielo. Revelar con bromuro de etidio (10µg/mL) durante 1min
Centrifugar durante 5 min a 13,000 rpm y pasar
el sobrenadante (que contiene al plásmido)
Sumergir en agua bidestilada para eliminar el exceso de bromuro
y observar en el transiluminador.
Colocar a otro tubo eppendorf y agregar 500 µL de
solución IV y mezclar suavemente. Incubar 5 min en hielo.
FIN
Agregar 150 µL de la solución III y
mezclar invirtiendo el tubo 3 o 4 veces. BIBLBIOGRAFIA:

Centrifugar 5 min a 13,000 rpm y  Espinoza Lara A. et. Al. EXPERIMENTOS EN GENÉTICA MICROBIANA, IPN-ENCB,
desechar el sobrenadante. México 2011.
air
 González de Buitrago TÉCNICAS Y MÉTODOS DE LABORATORIO CLÍNICO, 2ª ed. Ed.
V y agregar 10 l de la solución V.
Secar el tubo con aire Masson, 2005, España.
 Molina N. et. Al. COMPARACIÓN DE MÉTODOS DE LISIS Y EXTRACCIÓN DE ADN DE
Resuspender suavemente con la micropipeta. TROFOZOÍTOS DE Giardia Lamblia. Parasitol Latinoam 61:133-137 2006, FLAP, en
http://www.scielo.cl/pdf/parasitol/v61n3-4/art06.pdf, sitio público en internet
Pesar 1 gr de agarosa y suspender en consultado el 17/12/20
100 mL regulador TB 1X
 J.G. y N. Sherman.: MICROBIOLOGY A LABORATORY MANUAL. Cappuccino
Benjamin/Cummings Inc. U.S.A. 1992.
1.-  Efecto Tyndall | La Guía de Química
http://quimica.laguia2000.com/general/efectotyndall#ixzz4eqjnVpNy

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