Espectro de Absorción de la Clorofila

Facultad de Ciencias Universidad Autónoma de México

Laboratorio de Física Contemporánea II 07/01/2021
Castillo​ Frasco Oscar Daniel

Resumen
Se realizaron 70 mediciones de absorbancia en un espectrofotómetro de una muestra de
clorofila (pigmento verde) obtenidas de hojas de espinaca, mediante el proceso de
destilación, se variando las longitudes de onda del espectrofotómetro desde 450 nm ±1 nm a
710 nm ±1 nm para así obtener la gráfica del espectro de absorción de la clorofila, de las
cuales se pudieron diferenciar las bandas de “Soret” y la banda “Q” y determinar la presencia
de clorofila a como de clorofila a y apreciar la fluorescencia en el intervalo de 666 nm ±1 nm
a 706 nm ±1 nm.

Introducción Niveles de energía espectro de absorción

Espectro de absorción de la clorofila de la clorofila
Cada pigmento fotosintético tiene un Cuando las moléculas interactúan con la
conjunto de longitudes de onda que luz, la energía contenida en los fotones se
absorbe, llamado espectro de absorción. puede utilizar para transferir un electrón a
Dicho espectro de absorción puede un orbital energéticamente superior,
representarse con la longitud de onda (nm) generando así una molécula en un estado
en el eje x y el grado de absorción de la luz excitado.
en el eje y. El espectro de absorción de la Todas las Chls poseen conjugados
clorofila incluye longitudes de onda de luz extendidos enlaces sistemas e interactuar
azul y rojo anaranjado, como se indica con con fotones centrados en dos longitudes de
sus picos de aproximadamente 450-475 nm onda que representan la primera y la
y 650-675 nm (Figura 1). Cabe mencionar segunda excitación del estado de la Chl.
que la clorofila absorbe longitudes de onda La banda de absorción a mayor energía es a
levemente distintas que la clorofila b. La menudo denominada "la banda de
clorofila no absorbe longitudes de onda de absorción azul", "banda B" (que consta de
luz verde y amarilla, lo cual se demuestra varios estados) o "banda de Soret",
con el grado muy bajo de absorción de la mientras que el la banda de absorción de
luz de unos 500-600 nm. [1] energía más baja puede denominarse "rojo
banda de absorción”o la “banda Q” El
segundo estado excitado de Chls es
convertido eficientemente al primer estado
excitado, y el la diferencia de energía se
libera en forma de calor. La energía del
primer estado excitado se transfiere a otro
pigmento, o convertido en: (1) calor, (2)
energía química al conducir separación de
carga, (3) un estado triplete de larga
duración a través de un inversión del espín
Figura 1. espectro de absorción de la del electrón, o (4) la emisión de un
clorofila a y b, la absorbancia es una unidad fotón.[2]
adimensional.
Ahora en un Diagrama 1 las flechas muestra de espinacas.
verticales hacia arriba representan las Maceración-destilación(BM): Se maceran
transiciones verónicas entre el estado 70 gr de hojas de espinaca fresca,
fundamental y los estados excitados. Las procurando que las hojas no tengan
bandas de Soret con longitud de onda más decoloraciones ni sequedad, después se
corta corresponden a una transición a un ponen a reposar en un frasco de vidrio con
estado excitado más alto. La banda de 250 ml de alcohol etılico de 96%,
absorción Q y con una longitud de onda posteriormente la muestra se dejará reposar
más larga de clorofilas corresponde a la luz en una caja, privando de luz dicha muestra,
que tiene la energía necesaria para se le dejará alrededor de una semana (si se
provocar la transición del estado puede mas tiempo mejor). La muestra se
fundamental al primer estado excitado. La saca de la caja donde se puso a reposar, se
flecha vertical hacia abajo indica la decanta el líquido en un matraz de 125 ml,
fluorescencia. Entre la absorción y la después en un vaso de precipitado de 1 litro
emisión de fluorescencia, se producen se vierten unos 200ml de agua, este se pone
procesos de relajación a medida que se a calentar usando una parrilla eléctrica
produce el equilibrio térmico (pérdida de sobre una rejilla de asbesto, después de que
calor) representan Chl a, Chl b.[3] el agua alcance unos 80°C, con cuidado se
introduce el matraz sosteniéndolo con unas
pinzas al interior del agua y se va midiendo
la temperatura con un termómetro de
100°hasta que la muestra alcance de 76°C a
78°C (temperatura de ebullición del
alcohol).
Medición del Espectro de Absorción
Colocar en un matraz de 100 mL, 100 mL
de solución de pigmento de clorofila, agitar
y luego esperar 10 minutos, en otro matraz
de 100 ml se vierte alcohol a 96°, a cabo el
espectro de absorción de dicho complejo
como se indica a continuación:
1-Encender el espectrofotómetro.
2-Seleccionar el modo de trabajo espectro
y el rango de barrido entre 450 y 710 nm.
3-Colocar en el espectrofotómetro una
cubeta con alcohol, para que el equipo
pueda hacer una corrección de la línea de
base o lo que es lo mismo, llevar a cero de
absorbancia
Diagrama 1. podemos apreciar una
representación de los estados excitados (mayor 4-Finalizada la corrección de la línea de
y menor), así como los proceso de absorción base, colocar la muestra de clorofila en la
de luz azul y roja así como la fluorescencia que que se realizó el desarrollo de color e
va del estado de menor excitación al estado iniciar el barrido hasta obtener suficientes
fundamental. mediciones.

Desarrollo Experimental. Resultados.

Método para extraer clorofila de una tenemos 70 mediciones de las cuales se
usaron para graficar absorbancia vs también llamada banda de Soret.
longitud de onda y obtuvimos la gráfica 1.

Gráfica 1. se pueden observar las mediciones

tomadas con ayuda del espectrofotómetro
graficadas en formato absorbancia vs longitud
de onda. Diagrama 2 se pueden ver los niveles de
Graficando desde 550 nm ±1 nm a los 700 energía al lado izquierdo y de lado derecho el
nm ±1 nm podemos obtener la banda Q de espectro de absorción obtenido colocado de
absorción en el rojo como podemos ver en manera vertical para apreciar la absorción de
la Gráfica 2. luz azul y roja y determinar los estados de
mayor o menor excitación.
ahora podemos ver los niveles de energía
en el diagrama 2 junto con el espectro de
absorción.que es juntando nuestra gráfica 1
así ver que en 452 nm ± ​ 1 nm ​está el punto
máximo de absorbancia y hasta donde llega
el estado de mayor excitación.
Discusión.
Tenemos que en la gráfica 1 se puede
Gráfica 2. se puede observar las mediciones apreciar la silueta de lo que normalmente
que se hicieron desde desde 550 nm ±1 nm a es el espectro de absorción de la clorofila
los 700 nm ±1 nm, longitudes de onda pero de la silueta mezclada de las clorofilas
asociadas al espectro de absorción de luz roja a y b como podemos ver en la Figura 1, por
de la clorofila a, también llamada banda Q.
lo que si lo vemos de una forma “separada”
como en las gráficas 2 y 3 podemos ver
que se descomponen como banda de Soret
y banda Q, pero si analizamos la gráfica 2
detenidamente podemos apareciar que hay
espectro entre los 600nm ± 1 nm y 550 nm
± 1 nm, las cuales son logitudes de onda
del amarillo y verde, las cuales sabemos
por la literatura no absorbe la clorofila a y
no entran dentro de la banda Q y son
Gráfica 3​. ​son las mediciones que se hicieron propras de clarofilas b y otras moleculas
desde desde 450 nm ±1 nm a los 550 nm ±1 que absoben luz como el B-caroteno, por lo
nm, longitudes de onda asociadas al espectro que no tenemos de todo la banda Q. ahora
tenemos que el los 666 nm ± 1 nm tiene el
de absorción de luz azul de la clorofila b,
punto máximo de absorción en el rojo con
0.794 ± 0.0005 por lo que partir de ahí 20verde.&text=El%20espectro%20de%20a
podemos decir que empieza el proceso de bsorci%C3%B3n%20de,nm%20y%20650
fluorescencia hasta 706 nm ±1 nm con una %2D675%20nm.> [Accessed 23 December
absorbancia de 0.012 ± 0.0005. Ahora si 2020].
analizamos de igual manera la Gráfica 3 [2]J.J. LAMB, G. RØKKE, and M.F.
tenemo 5 crestas entre los 450 nm y 500 HOHMANN-MARRIOTT, (2018, febrero
nm lo cual por lo que sabemos de la 08) Chlorophyll fluorescence emission
literatura no son propios de una sola spectroscopy of oxygenic organisms at 77
clorofila sino de varias como la clorofila b K​ PHOTOSYNTHETICA 56 (1):​ 107-109p.
y B-caroteno, por lo que tenemos varios
puntos de absorbancia máximos de [3] Li, Yaqiong & Chen, Min. (2015).
espectros de distintas moléculas que Novel chlorophylls and new directions in
absorben luz de la cuales desconocemos photosynthesis research. ​Functional Plant
que contenga la muestra medida, por lo que Biology. 42.​ 493. 10.1071/FP14350.
no tenemos del todo la banda de Soret.

Conclusión
La muestra de pigmento verde contiene
tanto clorofila a, clorofila b, como otras
moléculas que absorben luz en distintas
longitudes de onda lo cual afecta el
espectro de absorción obtenido.
El estado de mayor excitación ocurre
cuando hay absorción de luz azul y así ves
el menor excitación ocurre cuando hay
absorción de luz azul.
la fluorescencia ocurre en el momento en
que se alcanza el punto máximo de
absorbancia en el rojo hasta llegar al
mínimo, lo que es igual a pasar del estado
de menor excitación al estado fundamental.
Con el proceso seguido hasta ahora
podemos decir que tenemos buenas
aproximaciones en cuanto a la obtención
del espectro de absorción de la clorofila, ya
que podemos distinguir mediante partes de
la “banda de Soret” y la “banda Q”.

Referencias
[1]khanacademy. 2016. Luz Y Pigmentos
Fotosintéticos. [online] Available at:
<https://es.khanacademy.org/science/biolo
gy/photosynthesis-in-plants/the-light-depen
dent-reactions-of-photosynthesis/a/light-an
d-photosynthetic-pigments#:~:text=Por%2
0ejemplo%2C%20percibimos%20las%20p
lantas,b%2C%20que%20reflejan%20luz%