3BM2 MC Ejp P12

Práctica 12.
Evaluación de la calidad de los alimentos mediante la

identificación y cuantificación de HMF por HPLC.
Actividades previas.
El siguiente cromatograma se obtuvo con una columna de las siguientes características 0.25
cm de diámetro interno, 5 cm de longitud y 5 μm de tamaño de partícula. La velocidad de
flujo de la fase móvil fue de 1.0 mL/min.
Figura 1. Señal del lector contra el tiempo, con escala de 0.22 cm igual a 1 segundo.
• Definir tiempo muerto, escribir su ecuación y calcularlo.
Es el tiempo que transcurre desde que se introduce a la columna cromatográfica una
sustancia no retenida hasta que alcanza el detector. (𝑡𝑀 )
𝜋𝑟 2 𝐿
𝑡𝑀 = 0.6
𝐹
𝜋(0.125𝑐𝑚)2 (5𝑐𝑚)
𝑡𝑀 = 0.6
𝑐𝑚3
0.016 𝑠
𝑡𝑀 = 8.87 𝑠
• Estimar el tiempo de retención para cada pico (emplear el cromatograma, usar regla
o escalímetro y la equivalencia de centímetros a segundos).
tR1= 17 s
tR2= 24 s
• Definir el factor de capacidad, escribir su ecuación y calcularlo para los dos picos.
Cociente de la cantidad de soluto en fase estacionaria entre la cantidad en fase móvil.
El factor de capacidad es un parámetro para describir las velocidades de migración
de los solutos en las columnas. Para una especie A, el factor de retención k’A se define
como:
𝑡𝑅 − 𝑡𝑚
𝑘 ′𝐴 =
𝑡𝑚
17 𝑠 − 8.87 𝑠
𝑘 ′𝐴 =
8.87 𝑠
𝑘 ′𝐴1 = 0.92
24 𝑠 − 8.87𝑠
𝑘 ′𝐴 =
8.87 𝑠
𝑘 ′𝐴2 = 1.705
• Estimar el ancho de banda de la base para cada pico (emplear el cromatograma, usar
regla o escalímetro y la equivalencia de centímetros a segundos)
𝜔1 = 2𝑠
𝜔2 = 2.5𝑠
• Definir el plato teórico, escribir su ecuación y calcularlo para los dos picos.
La teoría del plato explica con éxito la forma gaussiana de los picos cromatográficos
y su velocidad de desplazamiento a través de la columna.
𝑡𝑅 2
𝑁 = 16 ( )
𝑊
17𝑠 2
𝑁1 = 16 ( )
2𝑠
𝑁1 = 1156
24𝑠 2
𝑁2 = 16 ( )
2.5𝑠
𝑁2 = 1474.56
• Definir altura de plato, escribir su ecuación y calcularlo para los dos picos.
Medida del grado de ensanchamiento de una banda cromatográfico.
𝐿
𝐻=
𝑁
17 𝑐𝑚
𝐻1 =
1156
𝐻1 = 0.014 𝑠
24 𝑠
𝐻2 =
1474.56
𝐻2 = 0.016 𝑠
• Definir factor de separación, escribir su ecuación y calcularlo.
El factor de separación es la retención relativa calculada para dos picos adyacentes.
𝑘′𝐵
𝛼=
𝑘′𝐴
1.705
𝛼=
0.92
𝛼 = 1.85739441
• Definir resolución, escribir su ecuación y calcularla.
La resolución Rs de una columna constituye una medida cuantitativa de su capacidad
para separar dos analitos.
2[(𝑡𝑅 )𝐵 − (𝑡𝑅 )𝐴 ]
𝑅𝑠 =
𝑊𝐴 + 𝑊𝐵
2[24 − 17]
𝑅𝑠 =
2 + 2.5
𝑅𝑠 = 3.11
• Diagrama de bloques.
Purgar el equipo Por lo menos 60 mL de
Filtrar la fase móvil a
Desgasificar la fase haciendo fluir a través fase móvil o hasta que
Un día antes. través de membranas
móvil. 𝑚𝐿 desaparezcan las
de 0.45 μm. de la columna 1.2
𝑚𝑖𝑛 burbujas.
Con siete puntos, construir una

Se debe de inyectar 1 mL de cada
curva tipo de calibración
disolución patrón de modo de Cada punto de la curva se deberá Graficar el área del pico en función
empleando las disoluciones de
saturar y limpiar el leer por triplicado. de la concentración.
HMF de 0.02 a 0.5 y de 0.5 a 5
loop del inyector
mg/L.
Mediante regresión lineal se

deberán obtener dos ecuaciones,
Con una soluciones patrón realizar variaciones en la longitud
una para cada rango de
empleada para la curva de de onda del detector. Discutir la
concentración, del tipo: Y = m X +
calibración. longitud de onda de trabajo
b, donde Y es la altura del pico y X
es la concentración de HMF
Adicionar 7 mL de agua
Pesar 0.4 g de muestra molida La muestra puede ser La determinación de HMF se
desionizada, agitar
en tubos de centrífuga de 10 cornflakes, pan casero o pan puede realizar en la superficie
vigorosamente con el vortex
mL. tostado comercial. y/o en el cuerpo del pan.
durante 1 minuto
Antes de inyectar al
Mezclar y centrifugar 10
cromatógrafo, filtrar 2 mL de
Centrifugar durante 10 min a Recuperar el sobrenadante y minutos a 5000 rpm.
la muestra anterior a través
5000 rpm. Repetir los paso clarificar agregando 1 mL de Recuperar el sobrenadante y
de un filtro de membrana de
anteriores una vez mas cada solución Carrez I y II. didluirlo con agua desionizada
acetato de celulosa o de
hasta 25 mL.
Nylon de 0.22-0.45 μm.
Esperar la aparición del pico y

registrar el tiempo de
retención
Bibliografía.
• Skoog, D., Holler, F. y Nieman, T. (2001). Principios de análisis instrumental.
España: Mc Graw Hill.
• Castaños, E. (2015). Parámetros Cromatográficos. 10 de diciembre de 2020, de
Cienciaonthecrest Sitio web: https://cienciaonthecrest.com/2015/08/04/parametros-
cromatograficos/

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