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Vol.48, n. 1: págs. 1-6, enero de 2005

ISSN 1516-8913 Impreso en Brasil
ARCHIVOS BRASILEÑOS DE
BIOLOGIA Y TECNOLOGIA
ANUNCIO INTERNACIONAL L

La electroforesis en gel de campo pulsado revela diferencias

de longitud y número de cromosomas en Brasil y cepas de
Metarhizium anisopliae

Vanessa Kava-Cordeiro1 *, Mar isa Vieira de Queiroz2, Aline Aparecida Pizzirani-K leiner 3
y JoãoLúcio Azevedo3
1Laboratório de Genética de Microrganismos; Departamento de Genética; Universidade Federal do Paraná;
CP 19071; 81,531-990; Curiti ba - PR - Brasil.2 Departamento de Microbiología; Universidade Federal de Viçosa;
Viçosa - MG - Brasil.3 Departamento de Genética; Escola Superior de Agricultura “Luiz de Queiroz”;
Universidade de SãoPaulo; Piracicaba- SP - Brasil

ABSTRACTO

Cariotipos electroforéticos de ocho cepas tipo wil d de Metarhizium anisopliae var. anisopliae se obtuvieron mediante
electroforesis en gel de campo pulsado. Estas cepas se aislaron de insectos de seis estados brasileños diferentes. Las
moléculas de ADN cromosómico de tres tipos se separaron en siete bandas y de cinco cepas en ocho bandas. También se
observaron polimorfismos de longitud cromosómica. El tamaño del ADN cromosómico de todas las cepas varió entre 7,7 y
0,9 Mb utilizando elAspergill nosotros nidulans cromosomas como estándares de tamaño. El tamaño total del genoma de
estas cepas se estimó en al menos 29,7 Mb. Se discutieron algunas correlaciones entre las diferencias en el cariotipo y la
ocurrencia del ciclo parasexual, así como la especificidad del anfitrión.

Palabras clave: Metarhizium anisopli ae, electroforesis en gel de campo pulsado, polimorfismos cromosómicos, parasexual
ciclo, hongo entomopatógeno

INTRODUCCIÓN cromatografía de pirólisis-gases (Messias et al.,

1983); tasas de crecimiento (Huxam et al., 1989);
Metarhizium anisopli ae es un hongo hifomiceto virulencia (Daoust y Roberts, 1982); producción de
entomopatógeno, que ha sido reconocido como enzimas extracelulares (Rosato et al., 1981); RFLP,
una poderosa herramienta en el control de plagas polimorfismos de longitud de fragmentos de restricción
en la agricultura. En Brasil ,M. anisopli ae var. (Pipe et al., 1995) y RAPD, ADN polimórfico amplificado
anisopli ae se ha empleado principalmente para aleatoriamente (Bidochka et al., 1994; Fegan et al., 1993
controlar Cercopidae: Homoptera, como Mahanarva y Fungaro et al., 1996). Todos los datos mostraron una
posticata en caña de azúcar y Deois flavopicta y gran diversidad genética entre los aislamientos
Zuli a entrerianaen pastos. La naturaleza y extensión analizados. Los resultados derivados del análisis RAPD
de la variación genética en esta especie se ha (Fungaro et al., 1996) mostraron por primera vez que la
evaluado de varias formas: análisis de isoenzimas (De variabilidad genética entre los insectos aislados era
Conti, et al., 1980; St. Leger et al., 1992); mucho menor que la variabilidad genética observada.

*
Autor para correspondencia

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2 Kava-Cordeiro, V. et al.

entre los suelos solados, lo que sugiere que este hongo se los protoplastos se resuspendieron en tampón GMB (EDTA
desarrolló con un cierto grado de especificidad del 0,125 M pH 7,5, sorbitol 0,9 M) y se centrifugaron de nuevo
hospedador. Se utilizó una técnica eficaz denominada durante cinco minutos en las mismas condiciones. Este
electroforesis en gel de campo pulsado (PFGE) para separar procedimiento se repitió dos veces para eliminar las
moléculas de ADN del tamaño de un cromosoma de METRO. enzimas líticas utilizadas en la producción de protoplastos.
anisopli ae (Shimizu et al., 1992 y Valadares-Inglis y Peberdy, A continuación, los protoplastos se resuspendieron en
1998). Sin embargo, hasta ahora solo se han probado unos tampón GMB, para obtener una concentración final de 109
pocos aislamientos con esta técnica y la mayoría de ellos células por mL. Luego, la suspensión se colocó en 42o C y se
derivan de un hospedador de una sola especie. El presente añadió un volumen igual de agarosa al 1,4% (LGT-Low Gelli
trabajo se realizó en un intento por mejorar las condiciones ng Temperature) a la misma temperatura. La mezcla se
utilizadas en la separación cromosómica de este hongo; homogeneizó suavemente, se colocó en un molde de tapón
Estudiar las posibles diferencias de moléculas de ADN del (Bio-Rad) y se mantuvo en un baño de hielo durante diez
tamaño de un cromosoma en número y tamaño de ocho minutos. A continuación, se retiraron los tapones y se
aislamientos deM. anisopli ae incubaron en tampón NDS (EDTA 0,5 M, pH 8,0; Tris-HCl 10
var. anisopli ae de diferentes insectos hospedadores y mM, pH
regiones y encuentran alguna correlación entre la 9,5; 1% (p / v) de N-lauroilsarcosinato de sodio) que
ocurrencia del ciclo parasexual descrito por otros contiene proteinasa K (1 mg / ml) a 50oC durante la
autores y el cariotipo encontrado en el presente trabajo noche. El NDS más proteinasa K se reemplazó por
utilizando las mismas cepas. EDTA 50 mM (pH 8,0) más N-lauroilsarcosinato de
sodio al 1% (p / v) y se incubó a 50ºC.o
C durante 30 minutos. Finalmente, los tapones se
MATERIALES Y MÉTODOS lavaron tres veces en EDTA 50 mM (pH 8,0) a 50ºC.o C
con un intervalo de una hora entre cada lavado con
Son remolinos ocasionales. Los tapones se almacenaron
Cepas de M. anisopli ae utilizados en este trabajo en EDTA 50 mM (pH 8,0) a 4ºC.oC.
se obtuvieron del “Laboratório de Genética de
Microrganismos” (ESALQ / Universidad de São Condiciones de electroforesis en gel de campo pulsado
Paulo, Brasil). Las ocho cepas de tipo salvaje se La electroforesis se realizó en un sistema CHEF-DRII
aislaron de insectos de seis estados diferentes de (Bio-Rad). Se prepararon geles de agarosa de grado
Brasil y se designaron de la siguiente manera: E6 y cromosómico (Sigma) al 0,6% y 0,8% (p / v) y se
E9 (del estado de Espirito Santo), M5 procesaron en tampón TBE 0,5x (Tris 44,5 mM,
(Pernambuco), MT (Mato Grosso), RJ (Rio de Ácido bórico 44,5 mM, EDTA 1 mM). Los tapones se
Janeiro ) y AL (Alagoas), todos deDeois flavopicta. insertaron en los pocillos del gel y se sellaron con el
Las cepas A4 y A19 se aislaron del estado de Bahía, mismo agar utilizado para preparar el gel. Las
deMahanarva posticata y Deois schach, condiciones de electroforesis (intervalos de pulso y
respectivamente. La cepa MSE de duraciones) fueron: A) 50 min, 45 min y 37 min, durante
Aspergill nosotros nidulanos se utilizó como fuente de estándar 73 h, 18 hy 73 h, respectivamente, con un voltaje de 46
de tamaño de ADN cromosómico. V; B) 90 y 60 min durante 72h cada uno con un voltaje de
40V (Shimizu et al., 1992). Durante la corrida, la
Preparación de ADN cromosómico intacto temperatura se mantuvo a 12o C. Los geles se tiñeron en
Tapones de agarosa que contienen A. nidulans Se bromuro de etidio (0,5 mg / ml) durante 20 min, se
prepararon ADN de cromosomas intactos como destiñeron en agua destilada durante 20 min y se
describen Brody y Carbon (1989). Los protoplastos fotografiaron bajo iluminación ultravioleta con
delM. anisopli ae Las cepas se obtuvieron según lo transiluminación usando película Ilford 50.
descrito por Silveira y Azevedo (1987) en un
Tampón fosfato de KCl 0,7 M como estabilizador osmótico. El
ADN del tamaño de un cromosoma se preparó según los RESULTADOS Y DISCUSIÓN
procedimientos que se utilizan actualmente paraA. nidulans, con
modificaciones. Las suspensiones de protoplastos fueron El método utilizado en este trabajo para preparar moléculas
centrifugado durante 10 minutos a 4000 rpm y de ADN del tamaño de un cromosoma de ocho cepas.

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 Electroforesis en gel de campo pulsado que revela diferencias de longitud y número de cromosomas 3

de M. anisopli ae var. anisopli ae resultó ser eficiente 2,8 Mb; El Grupo II tenía tres bandas correspondientes a
considerando que se obtuvieron buenas bandas de moléculas entre 3,6 y 4,9 Mb y el Grupo III tenía de dos a
resolución para todas las cepas analizadas. Utilizando tres bandas correspondientes a moléculas entre 6,0 y
los parámetros descritos por Shimuzi et al. (1992) no 7,7 Mb (Tabla 1 y Fig. 1). Tres bandas en el Grupo III se
pudimos resolver los ADN cromosómicos en siete resolvieron únicamente usando condiciones de
bandas como lo describen estos autores. Tres cepas electroforesis B (Shimizu et al., 1992) (datos no
deM. anisopli ae aislados en Japón fueron del suelo y mostrados). Estos parámetros fueron útiles para
dos de insectos (Bombyx mori y mostrar que algunas bandas simples mostradas en el
Anomala cuprea). Cada una de estas cepas mostró un Grupo III con la condición A eran dobletes. En el Grupo I
perfil de bandas único. Valadares-Inglis y Peberdy y Grupo III se observaron polimorfismos en la longitud y
(1998) utilizando cuatro cepas deM. anisopli ae, en el número de ADN cromosómico mientras que en el
aislado de Deois sp. en Brasil, pudieron resolver el Grupo II solo se detectaron polimorfismos de longitud.
ADN cromosómico en ocho bandas para una cepa y El tamaño total del genoma de estas cepas se estimó en
siete bandas para otras. Utilizaron longitudes de al menos 29,4 Mb. Los tamaños moleculares de los ADN
pulso inicial y final con rampa lineal de 3000 y 1300, cromosómicos se estimaron con referencia a los
respectivamente, durante 167 horas. Entre tres estándares de tamaño, utilizando el software Kodak 1D
grupos deM. anisopli ae ADN cromosómico, el Grupo ImagingAnalysis.
I mostró de dos a tres bandas
correspondiente a moléculas entre 0,9 y

tabla 1 - Tamaño estimado (Mb) y número de M. anisopli ae ADN cromosómico según lo determinado por CHEF
análisis.
Grupo y Cepa
Nº de banda E6 E9 RJ A4 A19 M5 MONTE Alabama

III 3 7,6 7,6 7,6 7,6 7.2 7.7 7.7 7,6

III 2 6,7 - 6,8 6,9 6.6 6,7 6,9 7.3
III 1 6.1 6.2 - - 6.1 - 6.0 7.0
II 3 4,7 4.5 4.6 4,7 4.5 4,7 4.5 4.9
II 2 4.3 3.8 4.2 4.3 3.8 4.4 3.8 4.3
II 1 3.8 3.6 3.6 3.6 3,7 3.6 3,7 3.6
Yo 3 2.5 2.3 2.5 2.0 2.4 1,5 2.4 2.8
Yo 2 1,5 1.4 1.4 1,5 1.4 1.4 1.4 1.4
Yo 1 - - 0,9 - - - - -
Total 37,2 (8) 29,4 (7) 31,6 (8) 30,6 (7) 35,7 (8) 30,0 (7) 36,4 (8) 38,9 (8)

Las diferencias en el número y la longitud de los cromosomas polimorfismo en F. oxysporum y concentraciones de

son comunes no solo en Metarhizium anisopli ae elementos transponibles (TE), pero estos elementos
(Shimizu et al., 1992, Valadares-Inglis y Peberdy, no fueron detectados en M. anisopli ae. EnM. anisopli
1998) sino también en otros hongos como ae, los recombinantes se obtuvieron por
Cladosporium fulvum (Talbot y col. 1991), parasexualidad (Bagagli et al., 1991; Messias y
Neurospora crassa (Orbach et al., 1988), Azevedo, 1980; Valadares-Inglis y Azevedo,
Coll etotrichum gloeosporioides (Masel y col., 1997) pero, en algunos casos, fue extremadamente
1990), Hace Ustil hordei (McCluskey y Mill s, difícil producir heterocariones y recombinantes estables
1990), Fusarium solani (Bruschi y Nazareth, entre algunas cepas. Silveira y Azevedo (1987)
1994; Suga y col. 2002) yFusarium oxysporum obtuvieron recombinantes entre E6 y RJ solo por fusión
(Davière et al., 2001). Estas diferencias se de protoplastos e incluso entonces, los productos de
atribuyeron principalmente a translocaciones fusión eran muy inestables pero producían sectores más
(Orbach et al., 1988 y Talbot et al. 1991) y otros estables que demostraron ser cepas recombinantes.
reordenamientos cromosómicos (Masel et al., Estos resultados concuerdan con las diferencias
1990). Davière y col. (2001) observaron una encontradas entre los cariotipos monogelectroforéticos
correlación entre el alto nivel de cromosomas de las cepas E6 yRJ en este estudio.

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4 Kava-Cordeiro, V. et al.

Aparte de las translocaciones, otros factores presente trabajo, parcialmente de acuerdo con los
pueden explicar el grado de incompatibilidad resultados de otros autores. DeConti y col. (1980),
entre las cepas RJ y E6. Pamphile (1992) no pudo utilizando el análisis del perfil de esterasa, distinguieron
producir recombinantes entre diferentes cepas tres grupos de cepas, el primero que incluía las cepas E6
como E6 y MT, las cuales mostraron un cariotipo y E9, un segundo que comprendía la cepa A19 y un
muy similar. tercero que incluía la cepa A4. En el presente trabajo, no
Las similitudes y diferencias encontradas en los fue posible comparar E9 con otros, pero E6, A4 y A19
cariotipos moleculares de las cepas estudiadas en el mostraron cariotipos diferentes.

megabyte Un. E6 E9 RJ A4 A19 M5 MT AL

III
5,0
4.5
4.2 II

2.9

Figura 1 - Separación de Metarhizium anisopli ae ADN cromosómico intacto en un gel CHEF.

Se sometió a electroforesis gel (0,6% p / v) en condición A. Grupo I) dos a tres bandas
correspondientes a moléculas entre 0,9 y 2,8 Mb; Grupo II) tres bandas
correspondientes a moléculas entre 3.6 y 4.9 Mb y, Grupo III) con estos parámetros
presenta dos bandas correspondientes a moléculas entre 6.0 y 7.7 Mb.
Un muestra el Aspergill nosotros nidulanos estándares de tamaño de cromosomas.

El análisis RAPD entre las cepas E6, E9 M5, AL y RJ de cada cepa y sus huéspedes o la localización
mostró un perfil distinto para cada cepa, excepto geográfica. Utilizando datos derivados de AFLP,
para E6 y E9 que mostraron el mismo perfil. Los polimorfismo de longitud de fragmento
datos del dendrograma UPGMA mostraron que E6 / amplificado, Muro et al. (2003) no pudieron hacer
E9 y M5 eran los más similares a AL en el mismo alguna correlación entre 50 aislamientos del
grupo y la cepa RJ era la menos similar (Fungaro et al., hongo entomopatógenoBeauveria bassiana y
1996). En el presente trabajo, se encontraron distintos anfitriones u orígenes geográficos.
cariotipos electroforéticos a partir de estas cepas, Los datos aquí mostrados indicaron que esta especie
derivadas del mismo hospedador,D. flavopicta, y RJ fue presentaba una amplia diversidad genética. El genero
la única cepa que mostró una pequeña banda Metarhizium podría dividirse básicamente en tres
cromosómica (0,9 Mb). especies: M. anisopli ae, M. flavoviride y M. albus,
Estos resultados fueron en parte de acuerdo con con algunas variedades descritas dentro de estas
el trabajo de Fungaro et al. (1996). La cepa A19 especies. Se debe realizar un estudio más
aislada de otra especie deDeois (D. schach) detallado que incluya el cariotipo electroforético, y
mostraron casi el mismo cariotipo electroforético puede resultar valioso para una mejor definición
de MT y E6. Estas cepas se aislaron de diferentes de laMetarhiziumtaxonomía de género.
regiones muy alejadas entre sí. Con base en los
datos actuales, no es posible hacer alguna
correlación entre el cariotipo electroforético

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 Electroforesis en gel de campo pulsado que revela diferencias de longitud y número de cromosomas 5

EXPRESIONES DE GRATITUD Davière, JM; Langin, T. y Daboussi, MJ (2001), Papel

potencial de los elementos transponibles en la rápida
reorganización delFusarium oxysporum genoma.
El presente trabajo fue apoyado por Capes
Fung. Gineta. Biol., 34177-192.
(beca a VKC) y CNPq.
De Conti, E .; Messias, CL; De Souza, HML y
Azevedo, JL (1980), Variación electroforética en
esterasas y fosfatasas en once cepas tipo wil d de
RESUMO Metarhizium anisopli ae. Experientia,
36, 293-294.
Cariótipos de oito linhagens selvagens do fungo Fegan, M .; Modales, JM; MacLean, DJ; Irwin, J.
entomopatogênico Metarhizium anisopli ae var. AG; Samuels, KDZ, Holdom, DG y Li, D.
anisopli ae foram obtidos em gel, por eletroforese P. (1993), Polimórfico amplificado aleatoriamente
em campo pulsado. As linhagens foram isoladas de Los marcadores de ADN revelan un alto grado de
diversidad genética en el hongo entomopatógeno
insetos provenientes de seis estados brasileiros.
Metarhizium anisopli ae var. anisopli ae. J. Gen.
Como moléculas de ADN cromosómico de três
Microbiol., 139, 2075-2081.
linhagens foram separadas em sete bandas e, de
Fungaro, MHP; Vieira, MLC; Pizzirani-Kleiner,
cinco linhagens, em oito bandas. Polimorfismo de AA y Azevedo, JL (1996), Diversidad entre aislamientos
tamanho cromossômico também foi observado. O de suelo e insectos de Metarhizium anisopli ae
tamanho do DNA cromossômico de todas as var. anisopli ae detectado por RAPD. Letón. Apl.
linhagens variou de 7,7 a 0,9 Mb, utili zando-se DNA Microbiol., 22, 389-392.
cromossômico deAspergill nosotros nidulanos como Huxam, MI; Samuels, KDZ; Heale, JB y McCorkindale,
padrão. O tamanho dogenoma total foi estimado em Nueva Jersey (1989),En vivo y in vitro
pelo menos 29,7 Mb. Algumas correlações entre ensayos de patogenicidad de cepas mutantes y de tipo
salvaje de Metarhizium anisopli ae para tres especies de
semelhanças e diferenças no cariótipo eletroforético
insectos. J. Invertebr. Pathol., 53143-151.
ea ocorrência do ciclo parassexual como também a
Masel, A .; Braithwaite, K .; Irwin, J. y Manners, J.
especificidade com insetos hospedeiros foram
(1990), Cariotipos moleculares altamente variables en el
discutidas. patógeno vegetal Coll etotrichum gloeosporioides.
Curr. Gineta., 18, 81-86.
McCluskey, K. y Mill s, D. (1990), Identificación y
REFERENCIAS caracterización de la longitud de los cromosomas
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Recibido: junio de 2006 de 2003;

Revisado: 30 de enero de 2004;
Aceptado: 07 de julio de 2004.

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