Observaciones Microscopicas

OBSERVACIONES
MICROSCÓPICAS
Conocer las técnicas de estudio de la morfología
microbiana mediante el uso del microscopio óptico y la
aplicación de tinciones.
Actividad 4 – Microscopía
Trabajo grupal de búsqueda bibliográfica según el tema asignado a cada grupo.

■ Investigar y describir cómo se realizan las observaciones microscópicas del
microorganismo asignado, si es necesario realizar tinciones, cuáles y qué se
observa.
■ Adjuntar una imagen (o dibujar) y describir.
Fecha de entrega 5 de mayo.

Introducción
■ La observación microscópica es una herramienta esencial para el estudio de la
morfología de los microorganismos.
■ Las características morfológicas observadas con ayuda del microscopio se utilizan -junto
a pruebas bioquímicas y fisiológicas, para reconocer a los microorganismos y determinar
su ubicación taxonómica.
■ El tamaño de la mayoría de las células bacterianas es tal que resultan difíciles de ver
con el microscopio óptico. La principal dificultad es la falta de contraste entre la célula y
el medio que la rodea, y la forma más simple de aumentar el contraste es la utilización
de colorantes.
■ Las técnicas de tinción pueden emplearse para distinguir entre tipos diferentes de
células o para revelar la presencia de determinados constituyentes celulares, como
flagelos, esporas, cápsulas, paredes celulares, etc.
■ La morfología de los microorganismos puede examinarse de dos formas: observando
microorganismos vivos sin colorear (en fresco) y observando células muertas teñidas
con colorantes.
■ El examen en fresco de los microorganismos permite conocer algunas de sus
características (morfología, tamaño, movimiento, etc.).
■ Como los microorganismos vivos son casi incoloros y no se pueden visualizar fácilmente
cuando se encuentran suspendidos en agua, se utilizan colorantes para incrementar su
contraste y hacerlos visibles.
Desventajas de las tinciones
■ Tienen el inconveniente de proporcionar una imagen alterada debido a la acción de

fijadores y colorantes sobre los componentes del protoplasma.
■ Deben usarse con precaución, ya que pueden conducir a errores. Las moléculas de
colorante forman en ocasiones precipitados o agregados que parecen estructuras
celulares auténticas, pero que son formaciones artificiales inducidas por el mismo
colorante. Tales estructuras se denominan artefactos.
Observación en estado vivo
Examen en fresco
■ Se coloca una gota del material en estudio sobre el portaobjetos, y si el material es
demasiado espeso para permitir la diferenciación de sus elementos puede diluirse
con igual volumen de solución salina fisiológica estéril.
■ Se deposita suavemente un cubreobjetos sobre la superficie del material y se
procede a su observación.
■ Permite estudiar movilidad y forma del microorganismo.
Coloraciones
■ COLORACIÓN SIMPLE
Aquella en la que sólo se utiliza un colorante, que generalmente tiñe a los microorganismos.
Está destinada a hacer más fácilmente visibles las células al microscopio. Permite observar
morfología celular y tamaño.
Si el colorante proporciona una coloración al fondo, sin alterar el aspecto de las células,
que permanecen sin teñir, la tinción se denomina negativa.
■ COLORACIÓN DIFERENCIAL
Destinada a ayudar en la clasificación de las bacterias, es aquella que emplea
secuencialmente dos colorantes que permiten distinguir tipos de microorganismos en
función de diferencias en su estructura y composición química. La tinción Gram basada en
las propiedades de la pared celular es una de las más utilizadas.
■ COLORACIONES ESPECIALIZADAS
Se utiliza para identificar y estudiar determinadas estructuras que pueden estar presentes
en los microorganismos.
En las tinciones estructurales se colorea únicamente una parte de la célula. Se utiliza este
tipo de tinciones para poner en evidencia la presencia de cápsulas, endosporas, flagelos o
inclusiones (almidón, polifosfato, etc.)
Preparación del extendido
■ Para obtener un extendido correcto es indispensable usar portaobjetos perfectamente limpios,

desengrasados y secos.
■ Si la preparación se realiza a partir de un cultivo en medio líquido se toma material con el ansa o
pipeta y se lo deposita sobre el portaobjetos extendiéndolo en forma pareja.
■ Si el extendido se realiza a partir de un cultivo en medio sólido se usa el ansa ojal o aguja, para
sacar una pequeña porción de cultivo y diluirla sobre el portaobjetos en el cual se coloca
previamente una gota de agua o solución fisiológica.
■ Con el ansa se hace un extendido lo suficientemente grande de manera que las bacterias no
queden aglomeradas.
■ La cantidad de líquido debe ser pequeña para que se evapore fácilmente al terminar el
extendido.
■ En todos los casos es necesario llevar a cabo la desecación del preparado dejándolo secar
espontáneamente o bien, calentando suavemente la parte inferior del portaobjeto por
desplazamiento rápido del mismo sobre la llama de un mechero.
Tinción de Gram
1. Se coloca un colorante violeta (violeta de metilo, cristal violeta, violeta de genciana)
que reacciona con todas las células bacterianas coloreándolas de azul oscuro.
2. Se remueve el exceso de colorante con agua.
3. Se cubre el extendido con Lugol (solución diluida de yodo), un mordiente que
incrementa la afinidad entre el primer colorante y las células. El mordiente se
combina con el colorante y forma un compuesto coloreado (complejo cristal violeta-
yodo) en el interior de la célula. Este complejo es insoluble en agua, pero soluble en
solventes orgánicos.
4. Se elimina el exceso del mordiente con agua.
5. Se realiza la decoloración del complejo cristal violeta-yodo de aquellas bacterias
que por las características de su pared son incapaces de retenerlo. Como
decolorante se puede usar etanol, una mezcla de etanol y acetona o acetona.
6. Se lava para eliminar el decolorante
7. Se coloca un colorante de contraste, que teñirá sólo a las bacterias decoloradas en
el paso anterior. Generalmente se suele utilizar la fucsina o la safranina, de color
rosa, que contrastan con el color violeta del primer colorante.
Gram + y Gram -
■ Los organismos que resisten la decoloración y retienen el complejo cristal violeta-yodo
aparecerán de color violeta oscuro al microscopio y se denominan Gram positivos.
■ Estas bacterias tienen una pared gruesa formada por varias capas interconectadas de
peptidoglucano (mureína) con ácido teicoico. En general, el 90% de la envoltura o pared
de estas células Gram (+) es peptidoglucano.
■ Al deshidratarse por acción del alcohol se cierran los poros provocando que el complejo
cristal violeta-yodo quede atrapado dentro de la pared celular y las bacterias quedan
teñidas de color violeta.
■ Las bacterias que pierden el color inicial del cristal violeta tras la decoloración, se
clasifican como Gram negativos y toman el color rosa debido al segundo colorante.
■ La pared de la célula Gram (-), contiene una capa mucho más delgada (sólo el 10% de la
pared es peptidoglucano), y está rodeada por una membrana exterior de
lipopolisacáridos y proteínas, que no constituyen una barrera para el pasaje de los
solventes orgánicos.
■ El alcohol desorganiza y disuelve la capa lipídica más externa penetrando fácilmente, y
disuelve el complejo violeta-yodo. La delgada capa de peptidoglucano es incapaz de
retener el complejo cristal violeta-yodo y la célula se decolora.
Gram + y Gram -
Tinción de esporas
■ Esta es una coloración especializada.
■ Las endosporas son estructuras que se forman en el interior de ciertos tipos de
bacterias, entre los que se destacan los géneros Clostridium y Bacillus.
■ A diferencia de la célula vegetativa de la que procede, la endospora es resistente a
factores ambientales adversos: altas temperaturas, compuestos químicos tóxicos y
también a los colorantes.
■ Sin embargo, existen colorantes como el verde malaquita que, con ayuda del calor,
pueden penetrar en ella. Una vez teñidas, no perderán el colorante en el lavado con
agua debido a las características de su envoltura, y sí lo harán las formas vegetativas,
que quedarán teñidas con el colorante de contraste.
■ La posición y morfología de las esporas en el interior de la bacteria tiene interés
taxonómico, ya que es de utilidad para diferenciar especies dentro de un mismo género.
Otras tinciones
■ Con azul de lactofenol (en mohos tiñe el micelio y las esporas de color azul)
■ Con azul de metileno (levaduras muertas)

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■ Con azul de metileno (levaduras muertas)

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