Práctica No.

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ALGUNAS PROPIEDADES QUÍMICAS DE LAS PROTEÍNAS
Modificación a modalidad virtual, primer semestre 2021
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FECHA: 22-26 de febrero.

PONDERACIÓN DE LA PRÁCTICA

Actividad Modalidad Porcentaje

Prelaboratorio (cuestionario y diagrama de flujo) Individual 10
Examen corto prelaboratorio Individual 25
Reporte de laboratorio Grupal 40
Examen corto postlaboratorio Individual 25
TOTAL 100

INTRODUCCIÓN

Las proteínas se encuentran en todos los sistemas biológicos, siendo el grupo de

macromoléculas más diverso; pudiendo observarse en diferentes tamaños, localizaciones
celulares, estructuras tridimensionales y cumpliendo las más diversas funciones. Desde el
punto de vista cuantitativo, las proteínas son la clase más abundante de biomoléculas, pues
representan más del 50% del peso seco de las células (Nelson & Cox, 2017).

Todas las proteínas se construyen a partir de los mismos 20 aminoácidos, unidos

entre sí por medio de enlaces covalentes, llamados enlaces peptídicos. Los aminoácidos
tienen tres tipos de reacciones químicas importantes: (1) reacciones debido a la presencia
del grupo carboxilo (-COOH), (2) reacciones debidas al grupo amino (-NH2), y (3) reacciones
debido al grupo R. Las reacciones debidas al grupo carboxilo y al grupo amino son generales
y se dan para todos los aminoácidos. Las reacciones de la cadena lateral R son reacciones
específicas; pueden servir de base para la identificación específica de proteínas, por
ejemplo, la cisteína da una reacción para azufre, el triptófano da ciertas reacciones de color
debido a que su molécula contiene el grupo indol, la tirosina da otras reacciones de color
debido a su grupo fenólico, etc. Ya que la mayoría de las proteínas contienen uno o más
residuos de estos aminoácidos, algunas de las reacciones de color que son específicas para
aminoácidos individuales se usan como reacciones de color generales para proteínas
(Robert & White, 1990; Wilson & Walker, 2000).

La detección de proteínas, así como de aminoácidos individuales, puede llevarse a

cabo por medio de procedimientos físicos, químicos o biológicos. Por ejemplo: la presencia
de aminoácidos con un grupo aromático en su cadena lateral (Fen, Tir) o un anillo indol (Trp),
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puede ser detectada por medio de la medición de su absorbancia al ser enfrentados a luz
ultravioleta (280 nm) (Nelson & Cox, 2009).

Existen reacciones que dan positivas para todas las proteínas, por lo se pueden usar
para cuantificarlas. La reacción de Biuret permite cuantificar de forma específica la
presencia de enlaces peptídicos a través de la reacción del sulfato de cobre con el enlace
peptídico en un medio alcalino. Esta reacción produce un compuesto púrpura cuya
absorbancia máxima se observa a 540 nm. Otros métodos, como el de Folin o de Lowry et
al, y la reacción de Bradford se desarrollaron ya hace tiempo, pero se siguen utilizando para
cuantificar proteínas de manera sencilla y precisa (Cozzone, 2002; Lasseter, 2020).

Otra forma de identificar proteínas es a través de reacciones de sus grupos

prostéticos. Una importante cantidad de proteínas presentan uniones covalentes con
moléculas de carbohidratos simples o complejos (glicosilación). De esta forma, la utilización
de reacciones que permitan la identificación de carbohidratos permite, de manera indirecta,
identificar proteínas glicosiladas (Cozzone, 2002).

En la presente práctica se presentará al estudiante una serie de proteínas (albúmina

de huevo, caseína, gelatina), así como una mezcla de péptidos, producto de una hidrólisis
parcial de proteínas (peptona), y un aminoácido (glicina); con la intención de realizar en ellas
pruebas básicas de identificación y caracterización. Con los datos obtenidos a partir de cada
prueba, el estudiante estará en capacidad de proveer información específica acerca de las
características, composición y presencia / ausencia de grupos adicionales, en las proteínas
evaluadas.

OBJETIVOS

Al finalizar la práctica, el estudiante deberá estar en capacidad de:

● Establecer la relación existente entre los aminoácidos que constituyen una proteína
y las características químicas de las mismas.
● Determinar la diferencia entre reacciones generales y específicas de las proteínas.
● Realizar una clasificación de proteínas con base a diferentes reacciones químicas.
● Determinar la concentración de una muestra de proteína

MATERIAL Y EQUIPO

● Tubos de ensayo
● Pipetas volumétricas
● Micropipetas (5-50 ul; 50-100 ul; 500-1,000 ul)
● Puntas para micropipetas

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● Beaker o baño de agua

● Gradilla
● Pinzas
● Estufa
● Vórtex
● Espectrofotómetro

REACTIVOS

● Glicina, peptona, caseína, gelatina y albúmina de huevo al 5%

● Hidróxido de sodio 6 N
● Sulfato de cobre al 0.5%
● Ácido nítrico concentrado
● α-naftol al 5% en etanol al 95% (preparar antes de su uso)
● Ácido sulfúrico concentrado
● Ácido tricloroacético al 10%
● Ácido clorhídrico concentrado
● Agua destilada
● Solución de albúmina sérica bovina (BSA) 1 mg/mL
● Reactivo de Bradford (Sigma-Aldrich o BioRad)
● Muestra de concentración desconocida de proteína

PROCEDIMIENTO

1. REACCIÓN DE BIURET

1.1 Fundamento

El ión cobre formará un complejo con las proteínas de una manera similar al que
forma con el amonio. El complejo en el caso de las proteínas es rojo o violeta, y
azul en el caso del amonio. Los aminoácidos libres y los dipéptidos no dan el color
rojo o violeta, pues se necesita al menos dos uniones peptídicas para obtener dicha
coloración. La sustancia más simple que tiene esa estructura requerida es Biuret
(NH2CONH2)2 y esta es la razón por la cual la reacción lleva ese nombre (Cozzone,
2002; Nelson & Cox, 2009).

1.2 Parte experimental

Llevar a cabo la reacción de Biuret en las soluciones de glicina peptona, caseína,

gelatina y albúmina de huevo al 5%. A 2 mL de cada una de las soluciones
anteriores agregar 2 mL de hidróxido de sodio 6 N y una gota de solución de sulfato

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de cobre al 0.5%, mezclar bien y agregar más sulfato de cobre gota a gota hasta
distinguir un color rosado o violeta, si el color no aparece luego de agregar 15 gotas
dejar reposar el tubo durante 10 ó 15 min. Anotar cualquier diferencia en el color
obtenido de las diferentes soluciones.

1.3 Descarte de cobre

2. REACCIÓN XANTO PROTEICA

2.1 Fundamento

Esta reacción es específica para proteínas que contienen aminoácidos aromáticos,

especialmente triptófano. Si se le agrega hidróxido de sodio al ácido nítrico la
fenilalanina dará positiva a esta reacción (Cozzone, 2002).

2.2 Parte experimental

Hacer la reacción en las soluciones de glicina, peptona, gelatina, caseína y albúmina

al 5%. Colocar 2 mL de cada una de las soluciones en tubos de ensayo previamente
identificados y agregar 2 mL de ácido nítrico concentrado a cada tubo. Calentar a
ebullición muy lentamente o hasta que se disuelva el precipitado que se formó al
agregar el ácido, enfriar la solución y agregar 4 mL de hidróxido de sodio 6 N. El
color amarillo cambia a naranja.

2.3 Desechos básicos

3. REACCIÓN DE MOLISCH

3.1 Fundamento

La reacción de Molisch es general para carbohidratos. Como consecuencia, las

glicoproteínas dan positiva esta reacción, por ser proteínas conjugadas que
contienen carbohidratos como grupo prostético. En esta reacción los carbohidratos
son deshidratados por ácidos fuertes a furfural o derivados de furfural el cual se
condensa con el α-naftol para formar un producto coloreado rojo violeta (Cozzone,
2002; Nelson & Cox, 2017).

3.2 Parte experimental

A 2 mL de las soluciones de glicina, caseína, albúmina, gelatina y peptona al 5%

agregar 2 gotas de solución de α -naftol al 5% en etanol al 95% (NO MEZCLAR), y
cuidadosamente agregar ácido sulfúrico concentrado resbalándolo por las paredes
del tubo para formar dos capas. En la unión de las dos capas aparecerá un anillo
rojo violeta, el cual indica la presencia de carbohidratos.

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3.3 Desechos de α-naftol

4. PRECIPITACIÓN DE PROTEÍNAS POR REACTIVOS ALCALOIDALES

4.1 Fundamento

A esta clase de reactivos se les llama de esa forma porque tienen la propiedad de
precipitar a los alcaloides, aunque se utilicen en cantidades pequeñas. Como
ejemplo de estos reactivos tenemos: ácido tricloroacético, ácido tánico, ácido
pícrico, ácido salicílico y ácido metafosfórico. Los ácidos se combinan con las
proteínas (las cuales tienen una carga positiva neta en el lado ácido del punto
isoeléctrico), para formar complejos insolubles en los cuales la proteína y los
aniones están unidos por uniones electrostáticas. Estas reacciones son muy usadas
para separar a las proteínas de fluidos biológicos (Cozzone, 2002).

4.2 Parte experimental

Colocar en tubos de ensayo distintos 2 mL de las soluciones de glicina, caseína,

albúmina, gelatina y peptona al 2 %, y agregar 2 mL de ácido tricloroacético al 10
% (v/v). Observar la presencia de precipitado.

4.3 Desechos de ácido tricloroacético

5. PRECIPITACIÓN DE PROTEÍNAS POR ÁCIDOS MINERALES FUERTES

5.1 Fundamento

Los ácidos minerales fuertes desnaturalizan ciertas proteínas y causan que ellas se
vuelvan insolubles en soluciones acuosas. Esta propiedad de las proteínas es usada
frecuentemente en la clínica, para determinar si la albúmina está presente en la
orina (Cozzone, 2002).

5.2 Parte experimental

Colocar 3 mL de las soluciones de albúmina de huevo, peptona y gelatina al 5%, en

distintos tubos de ensayo, agregar ácido nítrico concentrado resbalando éste por
las paredes, para formar una capa abajo de la solución de la proteína. Observar el
precipitado que se forma en la unión de las dos capas. En otra serie de tubos,
repetir la reacción con ácido clorhídrico concentrado.

5.3 Desechos ácidos

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6. CUANTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS POR EL MÉTODO DE BRADFORD

6.1 Fundamento

El colorante Coomassie Azul Brillante G-250 convierte su forma roja en la forma

azul cuando se adsorbe a una proteína, con lo cual modifica su espectro de
absorción. La unión con la proteína estabiliza la forma azul del colorante
Coomassie, por lo que la cantidad de complejo de la solución es proporcional a la
cantidad de proteína presente en la muestra, y se puede estimar por
espectrofotometría. El aumento de la absorbancia a 595 nm es proporcional a la
cantidad de colorante unido, y por lo tanto a la cantidad de proteína presente en la
muestra (González et al, 2014).

6.2 Parte experimental

Preparar una serie de tubos de ensayo con distintas concentraciones conocidas de

albúmina de suero de res (bovino), con el siguiente esquema de pipeteo:

Tubo No.
1 2 3 4 5 6 7 8
Volumen de solución
ul de albúmina sérica bovina 1 mg/ml 0 5 20 35 50 65 80 100
ul de H2O destilada 100 95 80 65 50 35 20 0

A cada tubo (1-8) agregar 1 mL del reactivo de Bradford y mezclar. Dejar reposar
por al menos 5 minutos. Leer la absorbancia a 595 nm de los tubos 2 al 8, usando
el tubo No. 1 como blanco. Trazar una gráfica con la concentración de proteína
(albúmina sérica bovina) en el eje horizontal (x) y las respectivas absorbancias en
el eje vertical (y). Calcular la ecuación de la recta de esta “curva patrón”. Medir la
absorbancia de 100 ul de la muestra desconocida, y usar la ecuación de la “curva
patrón” para calcular la concentración de proteína de la muestra desconocida.

6.3 Desechar la mezcla de análisis

DIAGRAMA DE FLUJO

Esquematice el procedimiento a emplear en la realización de la práctica.

ANOTACIONES

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RESULTADOS

Tabla de resultados:
Algunas propiedades químicas de las proteínas (experimentos de 1-5)

Proteínas
Reacción Glicina Peptona Caseína Gelatina Albúmina

Biuret

Xantoproteíca

Molisch
Precipitación de
proteínas por reactivos
alcaloidales
Precipitación
HNO3 NA NA
de proteínas
por ácidos
minerales
HCl NA NA
fuertes

Tabla de resultados:
Cuantificación de proteínas (experimento 6)
Concentración BSA Absorbancia
Tubo No. (mg/ml) (595 nm)
1
2
3
4
5
6
7
8

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CUESTIONARIO

Reacción de Biuret
1. Describa las bases químicas de la reacción.
2. ¿Por qué debe ser alcalina la solución?
3. ¿Cuál es el mínimo de aminoácidos que deben estar presentes para que la reacción
resulte positiva?
4. Escriba la fórmula del complejo que se forma.
5. ¿Dan todas las proteínas positiva la reacción? Explique.
6. Explique por qué el amonio interfiere en la reacción de Biuret.
Reacción xanto proteica:
7. ¿Por qué el ácido nítrico colorea la piel de amarillo?
8. ¿Todas las proteínas dan positiva la reacción xanto proteica?
9. Describa las bases químicas de la reacción.
Reacción de Molish
10. Describa las bases químicas de la reacción de Molish.
11. Mencione al menos 5 proteínas que tienen carbohidratos como grupo prostético.
Reacción de Bradford
12. Describa las bases químicas de la prueba de Bradford.
13. Explique las similitudes y diferencias entre la cuantificación de proteínas por el método
de Bradford y el de Lowry (Folin).

BIBLIOGRAFÍA

Guatemala, febrero 2021

Departamento de Bioquímica
Versión 2021 Dr. Rubén Velásquez