Extraccion y Purificacion de Enzimas

EXTRACCIÓN Y PURIFICACIÓN
DE ENZIMAS
Por: Maday Rivera, Camila Tacuri, Gabriela Minchala,
Daniela Cervantes, Rossana Zaldua y Maria Mayancela
En el proceso de producción enzimática hay una relación desfavorable
entre la entrada de materia cruda salida del producto, por ello se
requiere la instalación de procedimientos concentrados.
Ej: productos enzimáticos usados en detergentes llevan del 5-10% de
proteasa, mientras que preparaciones para tratamiento con Flúor llevan
0,1% de a-amilasa pura.
Casi todas las operaciones de los procesos de obtención de
enzimas se llevan a bajas temperaturas (0-10 grados
centigrados) a excepción del secado.
Metodos de
extraccion
Para el aislamiento de enzimas se necesita
extracción. Las técnicas que se explican a
continuación son las separación de sustrato
sólido o liberación de enzimas del interior de
células microbianas.
Extracción de cultivos de sustrato sólido
● Enzimas producidas por cultivo de sustrato sólido son extracelulares, por ello es
concebido que la extracción de salvado de moho es más un proceso de lavado.
● En muchos casos el salvado de moho es secado antes.
● Los cultivos pueden producirse con un equipo muy pequeño todo el año, mientras
que la extracción depende de la demanda de enzima.
● Por otro lado, es notorio que que la extracciòn de salvado de moho seco va a
producir soluciones con enzimas màs concentradas.
● El secado nos permite evitar interferencias causadas por células vivas en el medio
de cultivo.
● En todos los casos el extractante es agua, el cual, podría contener àcidos
inorgànicos u orgánicos, sales, u otras sustancias que facilitan la solubilidad de la
enzima o mejora su estabilidad en soluciones; o minimiza efectos indeseados por
contaminantes de microorganismos.
Extracción de células
● Existen muchos metodos quimicos y
bioquimicos (ruptura celular) cuya
desventaja es que su conducta no se
pueden estandarizar, por ello se
recomiendan las técnicas mecánicas. ● R: cantidad de proteína soluble
● EL homogeneizador suelta en g/kg por masa
APV-Manton-Gaulin es el más versátil celular.
para este tipo de desintegración celular, ● Rm: cantidad máxima de
en esta máquina las fuerzas de proteína soluble suelta.
cizallamiento combinadas con la ● K: constante dependiente de
descompresión llevan a la ruptura de la temperatura.
● N: numero de veces que la
pared celular.
suspensión celular pasa por el
homogenizador
● P: presion operacional.
Metodo de
purificacion
Métodos de baja resolución:
-Precipitación con sales
-Precipitación de temperatura y pH.
Métodos de alta resolución:

-Métodos Cromatográficos: Filtracion en gel,
intercambio iónico y afinidad
-Métodos Electroforéticos: Electroforesis no
desnaturalizante y desnaturalizante.
Microfiltración y ultrafijación
Antes de la microfiltración se
La microfiltración es el proceso de separación debe tomar en cuenta algunas
de partículas de tamaño inferior a 10 µm en características como tamaño de
un fluido mediante el uso de membranas temperatura y así:
poliméricas, termoplásticas o tipo tamiz. La
presión de trabajo se encuentra en el rango ● Seleccionar el diámetro de
de 0,5 a 4 atm poro
● Influencia de la velocidad
de flujo
● Influencia de la presión
La microfiltración se basa en impulsar el flujo a una velocidad relativa de
la suspensión, bien sea en movimiento lineal o rotativo respecto a la
superficie del medio filtrante.
La ultrafiltración es la
continuación de la microfiltración,
se utiliza cuando se quiere
detener fragmentos de materia
con tamaño menor a 0,1 µm.
Precipitaciones de
proteínas
Involucra la adición de sales, solventes polares no polares o la variación de
la temperatura y pH.
Si en una disolución de proteínas interviene estos factores, la solubilidad de

las proteínas puede verse reducida hasta el punto de producirse su
precipitación.
● Adicion de sales
La solubilidad de una proteína en una solución acuosa es sensible a

la concentración de sales disueltas , esta concentración se traduce
como fuerza iónica.
A fuerzas iónicas elevadas se reduce la solubilidad de las proteínas,

produciendo un efecto conocido como ‘’Salting out’’
Precipitación por salado
o “salting-out”
El “salting-out” de enzimas usualmente se usa sulfato de amonio, se
usa mas comunmente porque:
● Es muy soluble en agua
● No tiene efectos dañinos en proteínas
● Tiene libertad relativa de efectos de temperatura.
Este contiene la precipitacion de proteinas/enzimas, eliminación de

residuos del medio y otros productos biológicos.
● Adición de solventes
polares
Este procedimiento suele llevarse a cabo a temperaturas cercanas a los

4ºC, ya que a temperaturas más elevadas, los solventes orgánicos
tienden a denaturar las proteínas
● Efecto de la variación
del pH.
Las proteínas contiene numerosos grupos ionizables con distintos

valores de pK, a un pH característico para la proteína de interés las
cargas positivas y negativas se equilibran con exactitud, este punto es
denominado como isoeléctrico, donde la molécula proteica no tiene
carga neta y es inmovil en un campo electrico.
Precipitación por
punto isoeléctrico
Proceso en el que se ajusta el pH de la solución a
uno cercano o igual al punto isoeléctrico de la
enzima de interés.
La superficie de las proteínas está cubierta por

grupos cargados positiva y negativamente;
-Cargada negativamente - encima del punto

isoeléctrico.
-Cargada positivamente- debajo del punto

isoeléctrico.
Sistema acuoso
de dos fases (ATP)
Es un sistema de extracción usado para la separación y purificación de

biomoléculas en soluciones cuyas fases presentan de un 70 a un 80 % de agua.
El ATP se basa en la transferencia de masa entre dos fases líquidas inmiscibles

que ocurre cuando dos polímeros y una sal son añadidos y resulta en la partición
de un específico grupo de moléculas formando dos fases inmiscibles.
La ubicación del compuesto de interés en las moléculas está influenciada por los
enlaces iónicos, pH, temperatura, peso molecular del polímero y tipo de sal.
Al existir las mejores condiciones de estos factores se separa en dos fases,

situando al compuesto de interés en la parte superior de la muestra para
posteriormente ser separada mediante centrifugación.
Cromatografia
Método de separación que se basa en el
reparto de especies entre una fase ● Cromatografía de exclusión
estacionaria y una fase móvil. Conjunto de molecular (o filtración en gel)
técnicas basadas en el principio de ● Cromatografía de intercambio iónico
retención selectiva, cuyo objetivo es ● Cromatografía de interacción
separar los distintos componentes de una hidrofóbica
mezcla, permitiendo identificarlos. ● Cromatografía de afinidad
Pasos para purificar
enzimas por cromatografía
•Empacar la columna
• Equilibrar la columna
• Aplicar la muestra
• Lavado (no en todos los casos)
• Eluir la muestra
• Colectar el eluato
• Detectar y cuantificar proteínas
Cromatografía de exclusión molecular (Filtración en gel): Permite la
separación de moléculas en función de su tamaño.
Cromatografía de intercambio iónico:
-Separación de moléculas con base en su carga neta
-La muestra se aplica en una matriz de carga opuesta a la carga neta
de la proteína que se quiere purificar
-Se debe tener un pH determinado en el buffer de elución
Cromatografía de Afinidad: Se
Cromatografía de interacción
basa en la afinidad específica de
hidrofóbica: La interacción
una proteína por un ligando en
hidrofóbica es dependiente de la
particular:
fuerza iónica del amortiguador
Enzima- sustrato (análogo)
utilizado como eluyente. La unión
Enzima-cofactor o coenzima
es mayor a altas concentraciones
Enzima-inhibidor
de sales. Para eluir a la proteína se
Hormona-receptor
utilizan concentraciones
Anticuerpo-antígeno
decrecientes de sales.
Conclusiones
● La extracción por sustrato sólido es la más usada, ya que los cultivos se pueden dar
todo el año y que los cultivos en moho seco dan mayores concentraciones enzimáticas.
● La extracción desde células es más compleja ya que necesita de un equipo especial,

pero es más estandarizable que otros métodos bioquímicos o químicos.
● La precipitación es utilizada como un paso de separación durante las primeras etapas

de un proceso de purificación, y normalmente es seguida por otro tipo de separaciones,
como la cromatografía.
● La concentración de sales requerida para alcanzar el efecto de salting out varía de

acuerdo a las características de la enzima.
Referencias
VÍCTOR RENÉ ROJAS MUÑOZ. (2009). EVALUACIÓN DE MÉTODOS DE EXTRACCIÓN Y PURIFICACIÓN DE
ENZIMAS PECTINOLÍTICAS OBTENIDAS POR FERMENTACIÓN EN ESTADO SEMISÓLIDO DEL Aspergillus niger.
UNIVERSIDAD EAFIT.
https://repository.eafit.edu.co/bitstream/handle/10784/373/VictorRene_RojasMu%C3%B1oz_2009.pdf?sequence=1&is
Allowed=y
Monika, B. (s. f.). Enzyme Production and Purification: Extraction & Separation Methods | Industrial
Microbiology. Biology discussion. Recuperado 21 de junio de 2021, de
https://www.biologydiscussion.com/industrial-microbiology-2/enzyme-production/enzyme-production
-and-purification-extraction-separation-methods-industrial-microbiology/86646

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Si en una disolución de proteínas interviene estos factores, la solubilidad de

La solubilidad de una proteína en una solución acuosa es sensible a

A fuerzas iónicas elevadas se reduce la solubilidad de las proteínas,

Este contiene la precipitacion de proteinas/enzimas, eliminación de

Este procedimiento suele llevarse a cabo a temperaturas cercanas a los

Las proteínas contiene numerosos grupos ionizables con distintos

La superﬁcie de las proteínas está cubierta por

-Cargada negativamente - encima del punto

-Cargada positivamente- debajo del punto

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El ATP se basa en la transferencia de masa entre dos fases líquidas inmiscibles

Al existir las mejores condiciones de estos factores se separa en dos fases,

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