Aracouchini (Aubl.) Marchand (ANIME)

EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE Y CUANTIFICACIÓN DE LOS
COMPUESTOS FENÓLICOS, FLAVONOIDES TOTALES PRESENTES EN LOS

EXTRACTOS METANÓLICOS DE LA CORTEZA Y LAS HOJAS SECAS DE Protium
aracouchini (Aubl.) Marchand (ANIME).
HAROLD MIGUEL RECUERO PACHECO
UNIVERSIDAD DE SUCRE
FACULTAD DE EDUCACION Y CIENCIAS
DEPARTAMENTO DE BIOLOGÍA Y QUÍMICA
SINCELEJO-SUCRE
2018
EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE Y CUANTIFICACIÓN DE LOS
COMPUESTOS FENÓLICOS, FLAVONOIDES TOTALES PRESENTES EN LOS
EXTRACTOS METANÓLICOS DE LA CORTEZA Y LAS HOJAS SECAS DE Protium
aracouchini (Aubl.) Marchand (ANIME).
HAROLD MIGUEL RECUERO PACHECO
Trabajo presentado como requisito para optar al título de Biólogo
DIRECTOR (A)
RITA LUZ MÁRQUEZ VIZCAÍNO
Química Farmacéutica
M. Sc Ciencias Biológicas U.P.J.
Co-director
OSNAIDER JOSE CASTILLO CONTRERAS
Biólogo
UNIVERSIDAD DE SUCRE
FACULTAD DE EDUCACION Y CIENCIAS
DEPARTAMENTO DE BIOLOGÍA Y QUÍMICA
SINCELEJO-SUCRE
2018
NOTA DE ACEPTACIÓN
_____________________________________
_____________________________________
_____________________________________
_____________________________________
_____________________________________
____________________________________
FIRMA DEL PRIMER JURADO
____________________________________
FIRMA DEL SEGUNDO JURADO
____________________________________
FIRMA DEL TERCER JURADO
SINCELEJO 3 DE SEPTIEMBRE DEL 2018

A mis padres Betzaida Pacheco, Víctor Recuero, a mi hermana Esther, y a mi abuela Noris Marín, que son mi
motivación y fuente de inspiración para seguir luchando, creciendo, y caminando en este largo y no tan sencillo
camino al cual llamamos Vida que a pesar de las adversidades sigue siendo hermosa y siempre nos deja
enseñanzas y momentos para recordar.

AGRADECIMIENTOS
A Dios por darme el regalo de la vida, por ayudarme a cumplir cada una de mis metas y
por darme la bendición de estar rodeado de personas de buen corazón que me aprecian mucho.
A mi abuela, mis padres, mi hermana, tíos y primos, por estar pendientes de mí, darme su
apoyo incondicional para cumplir cada uno de mis sueños.
A mí amada Angels por siempre estar a mi lado brindándome todo su amor y apoyo.
“siempre serás la fuente de mi inspiración”
A la universidad de sucre por darme la oportunidad de alcanzar este logro tan importante
para mi vida.
A mi querida profesora y tutora Rita Luz Márquez Vizcaíno, por sus grandes enseñanzas,
apoyo, tiempo y por recibirme con los brazos abiertos en Gipnus, por ser un gran ser humano
ejemplo de rectitud, firmeza y cariño.
A mi tutor y gran amigo Osnaider José Castillo Contreras, por todo su apoyo y ayuda sin
condiciones, y por ser un gran ejemplo de superación.
A mí querida profesora y gran amiga María Stella Parejo Alcocer, por sus concejos,
paciencia, tiempo y dedicación.
A GIPNUS ya que al pasar del tiempo se han convertido en mi familia, les agradezco por
todos los momentos que eh hemos vivido juntos.
A mis compañeros, amigos y hermanos: Cindy Lorena Mora Herazo, Paula Andrea
Calderón Salazar, Maryuris Tuiran, Carolina Bertel, Hernando Cárcamo, José Carlos Ricardo
Molina y Carlos Mario Hernández Mendoza por su gran amistad desde el principio de nuestro
camino en la universidad de sucre y que a pesar de tomar caminos distintos aún seguimos unidos
y compartiendo grandes momentos juntos.
“ÚNICAMENTE LOS AUTORES SON LOS RESPONSABLES DE LAS IDEAS
EXPUESTAS EN EL PRESENTE TRABAJO”
(ART 12 RES. 02 - 2013)

CONTENIDO
pág.
RESUMEN ..................................................................................................................................... 1
ABSTRACT .................................................................................................................................... 2
1. INTRODUCCIÓN ............................................................................................................. 3
2. OBJETIVOS....................................................................................................................... 5
2.1 GENERAL ............................................................................................................................ 5
2.2 ESPECÍFICOS ...................................................................................................................... 5
3. MARCO REFERENCIAL ................................................................................................ 6
3.1 PRODUCTOS NATURALES .............................................................................................. 6
3.2 FAMILIA BURCERACEAE................................................................................................ 7
3.2.2 Protium aracouchini. ............................................................................................................. 8
3.3 COMPUESTOS FENÓLICOS Y FLAVONOIDES ............................................................ 8
3.4 RADICALES LIBRES ......................................................................................................... 9
3.4.1 Radical libre 2,2-difenil-1-picrilhidrazilo (DPPH). ............................................................... 9
3.4.2 Radical monocatiónico 2,2-azinobis-(ácido3-etilbenzotialzolina–6-sulfónico) (ABTS). .. 10
3.5 AGENTES ANTIOXIDANTES. ........................................................................................ 10
4. ANTECEDENTES ........................................................................................................... 11
5. DISEÑO METODOLÓGICO ........................................................................................ 15
5.1 TIPO DE INVESTIGACIÓN. ............................................................................................ 15

5.2 ZONA DE ESTUDIO ......................................................................................................... 15
5.3 PREPARACIÓN DEL MATERIAL VEGETAL. .............................................................. 15
5.4 IDENTIFICACIÓN TAXONÓMICA DEL MATERIAL VEGETAL. ............................. 16
5.5 ESTUDIO QUÍMICO ......................................................................................................... 16
5.5.1 Obtención de los extractos metanólicos ............................................................................... 19
5.5.2 Screening fitoquímico preliminar. ....................................................................................... 19
5.5.3 Cromatografía Flash............................................................................................................. 19
5.5.4 Histoquímica Vegetal........................................................................................................... 16
5.6 ENSAYOS BIOLÓGICOS. ................................................................................................ 20
5.6.1 Evaluación de la toxicidad de los extractos en Artemia salina. :........................................ 20
5.6.2 Determinación de la actividad captadora de radicales libres: ...................................... 21
5.6.3 Determinación de fenoles totales. ........................................................................................ 24
5.6.4 Determinación de flavonoides.. ........................................................................................... 24
5.6.5 Test estadístico.. ................................................................................................................... 25
6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN ..................................................................................... 26
6.1 IDENTIFICACIÓN TAXONÓMICA DEL MATERIAL VEGETAL. ............................. 26
6.2 ESTUDIO QUIMICO ......................................................................................................... 27
6.2.1 Obtención de los extractos y tamizaje fitoquímico. ............................................................. 34
6.2.2 Cromatografía flash.. ........................................................................................................... 35
6.2.3 Histoquímica. ..................................................................................................................... 27

6.3 ACTIVIDAD BIOLÓGICA. .............................................................................................. 36
6.3.1 Evaluación de la toxicidad de los extractos en Artemia salina. ........................................... 36
6.3.2 Actividad antioxidante. ........................................................................................................ 39
7. CONCLUSIONES............................................................................................................ 73
8. RECOMENDACIONES .................................................................................................... 76
9. REFERENCIAS ................................................................................................................. 77
10. ANEXOS ........................................................................................................................... 87

LISTA DE TABLAS
pág.
Tabla 1 Metabolitos secundarios presentes en órganos vegetales evaluados ............................... 28
Tabla 2 Metabolitos secundarios presentes en los extractos metanólicos evaluados ................... 35
Tabla 3 Respuesta de nauplios de Artemia salina frente al extracto total en metanol de hoja ..... 36
Tabla 4 Respuesta de nauplios de Artemia salina frente al extracto total en metanol de corteza
....................................................................................................................................................... 36
Tabla 5 Respuesta de nauplios de Artemia salina frente al extracto de la fracción metanólica de
hoja................................................................................................................................................ 37
Tabla 6 Respuesta de nauplios de Artemia salina frente al extracto de la fracción metanólica de
corteza ........................................................................................................................................... 37
Tabla 7 Concentración que actuó en la actividad antioxidante..................................................... 39
Tabla 8 Test de normalidad Shapiro-wilks .................................................................................. 41
Tabla 9 Porcentaje DPPH remanente de los distintos tratamientos ............................................. 42
Tabla 10 Porcentaje de radicales libres capturados en los distintos tratamientos......................... 43
Tabla 11 Concentración donde los extractos atrapan el 50% de los radicales DPPH .................. 45
Tabla 12 Cuadro de análisis de varianza....................................................................................... 47
Tabla 13 Test de tukey .................................................................................................................. 47
Tabla 14 Porcentaje de ABTS remanente de los distintos tratamientos ....................................... 49
Tabla 15 Porcentaje de radicales libres capturados en los distintos tratamientos......................... 50
Tabla 16 Test de Kruskal-Wallis .................................................................................................. 51
Tabla 17 Concentración efectiva para atrapar el 50% de los radicales catiónicos ABTS ............ 52
Tabla 18 Porcentaje de inhibición del decoloramiento del β-caroteno ......................................... 55

Tabla 19 Kruskal-Wallis ............................................................................................................... 56
Tabla 20 Datos para la curva de calibración con ácido gálico ...................................................... 58
Tabla 21 Concentración de compuestos fenólicos en eq g GA/g de extracto ............................... 59
Tabla 22 Test de Kruskal Wallis................................................................................................... 60
Tabla 23 Datos para la curva de calibración con quercetina. ....................................................... 65
Tabla 24 Concentración de flavonoides totales en eq g Q/g de extracto ..................................... 66
Tabla 25 Test de Kruskal-Wallis .................................................................................................. 67

LISTA DE GRÁFICAS
pág.
Gráfica 1: %DPPH remanente vs Concentración de la fracción metanólica de las hojas. ........... 44
Gráfica 2: Cinética de la CE50 de los diferentes tratamientos para el radical DPPH. .................. 46
Gráfica 3: Cinética de la CE50 de los diferentes tratamientos para el radical ABTS. .................. 53
Gráfica 4: Inhibición del decoloramiento del β-caroteno ............................................................. 56
Gráfica 5: Curva de calibración con ácido gálico. ....................................................................... 59
Gráfica 6: Contenido de fenoles totales en el extracto total en metanol de hoja vs Contenido de
fenoles totales en la fracción metanólica de la hoja en P. aracouchini. ....................................... 61
Gráfica 7: Contenido de fenoles totales en el extracto total en metanol de corteza vs Contenido
de fenoles totales en la fracción metanólica de la corteza en P. aracouchini. .............................. 61
Gráfica 8: Contenido de fenoles totales del extracto total en metanol de hoja de la especie P.
aracouchini Vs actividad antioxidante ......................................................................................... 62
Gráfica 9: Contenido de fenoles totales de la fracción metanólica de hoja de la especie P.
Gráfica 10: Contenido de fenoles totales del extracto total en metanol de corteza de la especie P.
Gráfica 11: Contenido de fenoles totales de la fracción metanólica de corteza de la especie P.
Gráfica 12: Curva de calibración con quercetina. ........................................................................ 66
Gráfica 13: Contenido de fenoles totales del extracto total en metanol de hoja vs Contenido de
flavonoides totales del extracto total en metanol de hoja de Protium aracouchini. ..................... 68
Gráfica 14: Contenido de fenoles totales de la fracción metanólica de hoja vs Contenido de
flavonoides totales de la fracción metanólica de hoja de Protium aracouchini. .......................... 68
Gráfica 15: Contenido de fenoles totales del extracto total en metanol de corteza vs Contenido de
flavonoides totales del extracto total en metanol de corteza de Protium aracouchini. ................ 69
Gráfica 16: Contenido de fenoles totales de la fracción metanólica de corteza vs Contenido de
flavonoides totales de la fracción metanólica de corteza de Protium aracouchini....................... 69
Gráfica 17: Contenido de flavonoides totales del extracto total en metanol de hoja de la especie
P. aracouchini Vs actividad antioxidante ..................................................................................... 70
Gráfica 18: Contenido de flavonoides totales de la fracción metanólica de hoja de la especie P.
aracouchini Vs actividad antioxidante. ........................................................................................ 71
Gráfica 19: Contenido de flavonoides totales del extracto total en metanol de corteza de la
especie P. aracouchini Vs actividad antioxidante. ....................................................................... 71
Gráfica 20: Contenido de flavonoides totales de la fracción metanólica de corteza de la especie
P. aracouchini Vs actividad antioxidante. .................................................................................... 72

LISTA DE IMÁGENES
pág.
Imagen 1: Hoja y tallo normal ............................................................................................... 29
Imagen 2: Celulosa con azul de toluidina. ............................................................................. 29
Imagen 3: Detección de almidón con lugol. .......................................................................... 30
Imagen 4: Detección de lípidos con sudan III ....................................................................... 30
Imagen 5: Detección de mucilago y pectina. ......................................................................... 31
Imagen 6: Detección de compuestos fenólicos FeCl3. .......................................................... 31
Imagen 7: Detección de lignina. ............................................................................................ 32
Imagen 8: Detección de taninos. ............................................................................................ 32
Imagen 9: Detección de terpenos. .......................................................................................... 33

LISTA DE ANEXOS
pág.
Anexo A. Certificado de la clasificación taxonómica de la especie en estudio. .................. 87
Anexo B. Resultados del screening de los extractos metanólicos de corteza y hoja para la especie
Protium aracouchini. ............................................................................................................. 88
Anexo C. Resultados del screening de los extractos metanólicos de corteza y hoja para la especie
Protium aracouchini .............................................................................................................. 89
Anexo D. Clasificación de la toxicidad según CYTED ......................................................... 90

LISTA DE ABREVIATURAS
ABTS = ácido 2,2'-azino-bis (3-etilbenzotiazolin-6-sulfónico)
CE50 = Concentración efectiva media
TCE50 = Tiempo necesario para que la CE50 llegue a estado estacionario
EA = Efectividad antioxidante
% DPPH REM = Porcentaje de DPPH remanente
% AAO = Porcentaje de actividad antioxidante
EPA = US Environmental Protection Agency
DPPH = 2,2-difenil –1-picrylhydrazyl
COL = Herbario Nacional Colombiano
DMSO = Dimetilsulfoxido
μL = Microlitro
mL = Mililitro
CL50 = Concentración letal media
nm = Nanometro
ac. g = Acido galico
µg = Microgramos
CYTED = Programa Iberoamericano de Ciencia y Tecnología para el Desarrollo

1
RESUMEN
En la familia de las Burseraceae se han encontrado metabolitos secundarios del tipo
triterpenoides, y fenoles “flavonoides, cumarinas y lignanos” (Ruiz y Susunaga. 2000), donde
los metabolitos pertenecientes al grupo de los polifenoles, se caracterizan por ser agentes
antioxidantes con una alta capacidad captadora de radicales libres (Flores, 2011). Es por ello que
en el presente trabajo se evaluó la actividad antioxidante de los extractos metanólicos totales y
las fracciones metanólicas de la corteza y hoja seca de la especie Protium aracouchini, donde se
encontró que la fracción metanólica de corteza presenta una CE50 de 8,07 µg/mL en la captura
del radical libre DPPH y una CE50 de 2,57 µg/mL en el ensayo con el radical ABTS. En la
acción protectora del ß-caroteno el extracto metanólico total de la hoja fue el que presentó una
mejor actividad con una CE50 de 15,63 µg/ mL. Además de medir la actividad antioxidante,
también se estimó el contenido de fenoles totales (µg GA/g de extracto) y de flavonoides totales
(µg Q/g de extracto), siendo la fracción metanólica de la corteza quien presento una
concentración de 8,71034483 eq µg GA/g de extracto, y 1,73874717 µg Q/g de extracto. De los
datos obtenidos en esta investigación, la especie Protium aracouchini (Burseraceae) reportada
por primera vez en el departamento de Sucre, Colombia, es fuente promisoria de agentes
antioxidantes.
Palabras clave: ABTS, ß-caroteno, CE50, DPPH, fenol, flavonoide.

2
ABSTRACT
In the Burseraceae family, secondary metabolites of the triterpenoid type and phenols
"flavonoids, coumarins and several lignans" have been found (Ruiz and Susunaga, 2000), where
the metabolites belonging to the group of polyphenols are characterized as being antioxidant
agents with a high capacity to capture free radicals (Flores, 2011). That is why in the present
work we evaluated the antioxidant activity of the methanol extracts in methanol and methanol
fractions of the bark and dry leaf of the species Protium aracouchini, where it was found that the
methanol fraction of bark has a high effectiveness free radical scavenger with an EC50 of 8.07
µg / mL, while in the test with the radical ABTS the methanol fraction presented an EC50 of
2.57 µg / mL, and in the protective action of ß-carotene the extract The total methanol content of
the leaf showed the best activity with an EC50 of 15.63 µg / mL. In addition to measuring the
antioxidant activity, the content of total phenols (eq µg GA / g of extract) and total flavonoids
(eq µg Q / g of extract) was also estimated, with the methanol fraction of the cortex showing a
concentration of 8.71034483 eq µg GA / g of acid extract, and 1.73874717 eq µg Q / g of extract.
From the data obtained in this research, the species Protium aracouchini (Burseraceae) reported
for the first time in the department of Sucre, Colombia, is a promising source of antioxidant
agents.
Key words: ABTS, ß-carotene, DPPH, EC50, flavonoid, phenol.

3
1. INTRODUCCIÓN
Las plantas se caracterizan por tener la capacidad de destinar el carbono y energía obtenida
para la síntesis de una variedad de moléculas que no tienen relación directa con sus procesos
primarios, a estas moléculas se les da el nombre de metabolitos secundarios y no todas las
especies vegetales producen el mismo tipo, estas sustancias poseen funciones ecológicas y
medicinales por lo que también se les da el nombre de productos naturales o fármacos, de estos
compuestos químicos de origen vegetal podemos destacar al grupo de los polifenoles, que se
caracterizan por ser agentes antioxidantes con una alta capacidad captadora de radicales libres
(Ávalos, 2009).
Colombia es un país que tiene una gran diversidad de especies vegetales que cuentan con
un gran potencial medicinal que puede ser usado para el control y prevención de ciertas
enfermedades cardiovasculares, trastornos neurodegenerativos, cáncer entre otras. Este tipo de
enfermedades son producto de un desequilibrio homeostático generado por la toxicidad que
provocan las altas concentraciones de radicales libres (Viada, Gómez, y Campaña, 2017), por tal
motivo se hace indispensable el estudio de nuevos fármacos de origen vegetal que ayuden a
controlar y disminuir este tipo de patologías que en la actualidad se originan por medio de la
radiación UV, la contaminación provocada por el hombre, el uso de ciertos químicos como
conservantes, los grupos hidroxilos (-OH), y súper óxidos (O-2) que provocan en los organismos
aeróbicos daños irreversibles a nivel de membrana celular (Cárdenas y Pedraza, 2006; Castillo,
2016), desestabilizando la estructura y función celular. Para contrarrestar dichos efectos, las
células sintetizan enzimas como la superóxido dismutasa, peroxirredoxina, catalasa y la
glutatión peroxidasa (antioxidantes endógenos) quienes capturan y estabilizan a los radicales

4
libres (Santa y Camargo, 2016); cuando la concentración de los agentes oxidantes supera a los
antioxidantes endógenos se genera un desequilibrio homeostático dando origen a enfermedades
degenerativas como: la arterosclerosis, daños neurológicos (Alzheimer) y cáncer (Constanza y
Muñoz, 2012). Para evitar la acción oxidativa de los radicales libres, es necesario buscar agentes
antioxidantes exógenos de origen natural, y es aquí donde encontramos la planta de anime
(Protium sp.) ubicada en el bosque de Santa Inés, San Marcos, Sucre, esta especie vegetal
pertenece a la familia de las Burseraceae dentro de la cual se han reportado una variedad de
sustancias polifenólicas entre ellos flavonoides, por esta razón se infiere que este organismo en
estudio puede ser fuente promisoria para buscar moléculas con actividad antioxidante. Es por
ello que este trabajo de investigación tiene como objetivo determinar el contenido de fenoles
totales en los extractos metanólicos de la planta de anime, con el fin de determinar la actividad
antioxidante de estos metabolitos, este trabajo de investigación se realizó en el laboratorio de
productos naturales de la Universidad de Sucre.

5
2. OBJETIVOS
2.1 General
Evaluar la actividad antioxidante y cuantificar los compuestos fenólicos presentes en los
extractos metanólicos de hojas y corteza de Protium aracouchini (Anime).
2.2 Específicos
 Establecer cualitativamente los metabolitos secundarios mayoritarios presentes en los
extractos metanólicos obtenidos de corteza y hoja.
 Evaluar la actividad antioxidante de los extractos obtenidos de corteza y hoja.
 Determinar el contenido de fenoles totales y flavonoides presentes en los extractos obtenidos
de Protium aracouchini.
6
3. MARCO REFERENCIAL
3.1 Productos naturales
Las plantas distribuyen el carbono y la energía obtenida durante el proceso de la
fotosíntesis a la producción de varias moléculas orgánicas que no tienen una función directa con
los procesos de fotosíntesis, transporte, asimilación de nutrientes, y síntesis de proteínas,
carbohidratos o lípidos, pero que le ayudan a adaptarse a los cambios que presenta el ambiente, a
dichas moléculas orgánicas se les conoce como metabolitos secundarios, y no se encuentran en
igual concentración entre una planta u otra, ya que se sintetizan en cantidades pequeñas
dependiendo de la familia, genero e incluso a nivel de especies puede variar la producción de los
metabolitos secundarios (Ávalos, 2009).
La síntesis de metabolitos secundarios está restringida a periodos de estrés o desarrollo de
la planta y se clasifican en cuatro grupos según su biogénesis o ruta metabólica de origen de los
cuales encontramos: A) alcaloides (procedentes de diversas rutas metabólicas), B) policetidos
(procedentes de la ruta del policétido), C) terpenos o terpenoides (procedentes de las rutas del
ácido mevalónico o del metileritritol fosfato), y D) los fenilpropanoides o fenoles (procedentes
de las rutas del ácido shíkimico o del malónico)(Ávalos, 2009). Muchos de los productos del
metabolismo secundario son usados en las industrias farmacéuticas y en la elaboración de
fragancia, aditivos alimentarios y como biocidas en general.

7
3.2 Familia Burceraceae
Representa un grupo que posee 20 géneros y más de 600 especies distribuidas en regiones
tropicales, con una mayor diversidad en América, el norte y sur de África y en Malasia. Desde el
punto de vista económico algunas burseráceas son importantes por las resinas y aceites
esenciales que producen, usadas por el hombre en diversas actividades ya sean medicinales o
religiosas, un ejemplo del uso de resinas de la familia Burseraceae es la especie Bursera
bipinnata (Copal) cuya resina es utilizada como incienso en ceremonias religiosas en algunas
ciudades de México, la resina también es usada en la cosmetología y en la medicina popular (De
la Cerda, 2011). La familia Burseraceae se caracteriza por poseer árboles o arbustos con
prominentes ductos de resinas. Hojas en espiral, raramente opuestas, pinnadas o trifoliadas, raras
veces presentan estipulas, inflorescencia en tirso, flores bisexuales, frutos en drupa (Pérez,
2016).
3.2.1 Género Protium. Posee 80-100 especies, este género es nativo de Sudamérica, y sur
de Asia, con centro de diversificación genética en la amazonia. A veces presentan árboles o
arbustos resiníferos, con hojas imparipinadas o unifoliadas; foliolos opuestos. Inflorescencias
axilares, raramente terminales, flores unisexuales raramente hermafrodita, de 4-5 meras, sésiles o
pecioladas, pétalos libres, frutos drupáceos indehiscentes, en ocasiones con dehiscencia septicida
(Rzedowsk y Guevara, 1992; Rüdiger, 2007). Para las especies que pertenecen al género Protium
se han reportado los siguientes compuestos: terpenos, flavonoides, lignanos. Las sustancias
químicas que han sido aisladas y caracterizadas de los aceites esenciales presentes en la resina
son: α−thujeno, α−pineno, D-limoneno, canfeno, sabineno, p-menth-3-en-1,2,3-triol, β−pineno,

8
α−felandreno, α−terpineno, p-menth-1-eno para Protium alstonii (Rüdiger, 2007; Courtois, 2009;
Olivera et al., 2014; De Amorim et al., 2016).
3.2.2 Protium aracouchini. Su distribución va desde Costa Rica hasta Bolivia, presenta
arboles resinosos de aproximadamente 20 metros de altura, hojas imparipinadas, glabras;
peciolos semi terete, delgados; hojuelas oblongo-lanceolado (oblongo-elíptico), a veces
ligeramente estrechado en el ápice, margen entero, ondulado; nervadura primaria pronunciada,
nervaduras secundarias prominentes; inflorescencia axilar, ramificada desde la base 5- 10 cm
raramente 20 cm, pedúnculos delgados en teretes, pedicelos teretes 1-2 mm, flor pentámera, cáliz
cupuliforme, pétalos oblongos; fruto en drupa glabra, ovoide, con resina muy abundante y
olorosa (Dueñas y Nieto 2010). En algunas localidades indígenas la resina de esta especie es
usada como medicina para la enfermedad de Chagas (Tripanosomiasis), de su composición
química tenemos que se ha obtenido α-amireno en extractos metanólicos de raíz, corteza y hoja
(Rodríguez et al., 2016).
3.3 Compuestos fenólicos y flavonoides
Los compuestos fenólicos o también llamados polifenoles, tienen en su estructura un anillo
aromático el cual determina la actividad antioxidante de estas sustancias gracias a la variedad de
grupos hidroxilos que poseen (Khoddamiet al., 2013), estos grupos ceden electrones o átomos de
hidrógenos para neutralizar a los radicales libres. El grupo más importante de los compuestos
fenólicos son los flavonoides, incluyendo a los flavanoles (catequinas), antocianinas, flavonoles,
flavonas e isoflavonas (Castro et al., 2015).

9
3.4 Radicales libres
Los radicales libres (RL), o especies reactivas de oxigeno (ERO), son moléculas que en su
estructura atómica presentan un electrón o varios electrones impares desapareados en el orbital
externo, ocasionándole a la molécula cierta inestabilidad, estas especies reactivas son: anión
superóxido (O2-), peróxido de hidrogeno (H2O2), radical hidroxilo (OH-), oxigeno singlete (1O2)
(Maldonado et al., 2010;Cruz et al., 2011); aunque el oxígeno es un elemento imprescindible
para la vida de todos los organismos aeróbicos, también es fuente de radicales libres, ya que
existen varias vías metabólicas donde producirlas: la mitocondria el orgánulo más importante
para la formación de RL, los peroxisomas, leucocitos polimorfonucleares, entre otras. Si los RL
y ERO no se neutralizan adecuadamente, disminuye la capacidad antioxidante (desequilibrio
entre antioxidantes y agentes oxidantes)(Constanza y Muñoz, 2012), originando un estrés
oxidativo, que posteriormente va a ocasionar lesiones en la membrana celular generando
múltiples enfermedades como el cáncer, el Alzheimer, la diabetes, etc. (Mayor, 2010).
3.4.1 Radical libre 2,2-difenil-1-picrilhidrazilo (DPPH). Es un radical libre susceptible a la
sucesión de un átomo de hidrogeno por parte de un agente antioxidante a través de una reacción
de pseudo-primer orden que se puede monitorear midiendo sus absorbancias, donde el radical
libre tendrá un color morado y posteriormente con la acción del agente antioxidante disminuirá
su absorbancia hasta obtener una coloración amarilla1. Esta medición permite observar una fase
rápida seguida de una fase lenta producto de una dimerización de los productos de la reacción
(Guija et al. 2015):
1)
[DPPH*] + [AOH] [DPPH-H] + [AO*]

10
3.4.2 Radical monocatiónico 2,2-azinobis-(ácido3-etilbenzotialzolina–6-sulfónico)
(ABTS). Es una molécula susceptible a cualquier tipo de agente oxidante (peróxidos) para
formar el catión radical1 ABTS.+, el cual presenta un color verde-azul, este radical es soluble en
medios polares y apolares, y como no es afectado por las fuerzas iónicas, mide la actividad
antioxidante de moléculas antioxidantes lipofílicas e hidrofílicas (Rodríguez, Andrade, y Díaz
2015), para el monitoreo de la actividad antioxidante se mide la absorbancia la cual pasa de un
color verde-azul a transparente2:
1) ABTS + K2S2O8 ABTS.+
2) ABTS.+ + [AOH] ABTS + AO* + H+
3.5 Agentes antioxidantes.
Un antioxidante es una sustancia que se encuentra en bajas concentraciones, con respecto a
las biomoléculas oxidables, y a su vez retarda la oxidación de estas moléculas, debido que el
agente antioxidante sede un electrón al reaccionar con un radical libre, oxidándose y de esta
forma se transforma en un radical libre débil (no toxico) (Gómez, 2014), debido a la gran
variedad de antioxidantes dietarios podemos destacar que dentro de los más importantes se
encuentran: el ácido ascórbico (vitamina C), los tocoferoles, los carotenos y sus derivados y las
sustancias fenólicas, fundamentalmente los polifenoles (Robaszkiewicz et al., 2010).

11
4. ANTECEDENTES
Las especies vegetales pertenecientes a la familia de las Burseraceae son útiles gracias a
que sintetizan un gran rango de compuestos químicos con propiedades farmacológicas, entre los
cuales podemos mencionar a los triterpenos presentes en la oleo-goma-resina que exudan la
mayoría de las plantas que se agrupan en esta familia, y los compuestos fenólicos que son otro
tipo de metabolito secundario abundante en los individuos de este taxón, de los cuales podemos
encontrar a los flavonoides, cumarinas y lignanos (Ruiz y Susunaga. 2000)
Como la familia Burseraceae posee una variedad de compuestos químicos, lo que ha
incentivado al estudio químico y dinámica que presentan los metabolitos secundarios de
individuos agrupados en este taxón.
En Colombia solamente se han reportado estudios sobre la flora de ciertas regiones del
país, dentro de estos reportes encontramos uno realizado en el 2007 por Cárdenas, donde
describe la vegetación y flora Iniridense del Guainía, Colombia, donde se reportaron 18 especies
de la familia Burseraceae, dentro de las cuales tres especies pertenecen al género Dacryodes, una
al género Trattinnickia, y catorce especies para el género Protium, donde se incluye a la especie
Protium aracouchini.
En el 2008 un estudio realizado en Venezuela por padilla y colaboradores, determinaron la
actividad antioxidante en las especies: Brosimum utile, Protium neglectum y Podocalyx
loranthoides, donde la especie P. neglectum presento mejor eficiencia captadora de radicales

12
libres y un mayor contenido de flavonoides, indicando la estrecha relación que hay entre el
contenido de flavonoides totales con la actividad antioxidante de los extractos.
En el 2009 Carvalho et al., analizaron los componentes químicos presentes en los aceites
esenciales de tres especies de Burseraceae (Crespidospermum rhoifolium, Trattinnickia rhoifolia,
Protium elegans), donde los aceites esenciales de las hojas de C. rhoifolium, ramas de T.
rhoifolia, hojas y ramas de P. elegans las obtuvieron por hidrodestilación y fueron analizadas por
GC-MS. Los componentes principales identificados en los aceites de las hojas y ramas de P.
elegans fueron trans-cariofileno (35.90% y 6.78%), óxido de cariofileno (27.09% y 55.83%), α-
humuleno (12.60% y 2.80%), respectivamente. Las hojas de C. rhoifolium fueron ricas en α-
copaeno (19.44%) y germacreno B (13.12%) y ramas de T. rhoifolia en trans-cariofileno
(29.60%), α-copaeno (16.37%) y γ-cadineno (15.07%).
Da Camara et al., en el 2011 realizaron un estudio en Pernanmbuco, Brasil, donde
analizaron la composición química de los aceites esenciales de las especies Protium giganteum y
P. aracouchini determinado por primera vez por GC-MS. De la especie P. giganteum se
encontraron 32 componentes donde el 93,6% fueron sequiterpenos, mientras que para la especie
P. aracouchini se encontraron 29 componentes donde el 95,9% fueron sequiterpenos.
Serrano et al., en el 2012 evaluaron el efecto anti-inflamatorio y antioxidante de la especie
Bursera morelensis, la cual es usada por los habitantes de puebla Coxcaltlán en México, para
tratar las heridas de la piel. Para evaluar el efecto anti-inflamatorio y antioxidante del extracto
metanólico de la corteza en esta especie vegetal, se indujo inflamación en las patas de los ratones
13
con carragenano, y como estándar se usó la indometacina, el extracto a una dosis de 50 mg/Kg
mostró un efecto anti-inflamatorio del 28,01%, esta misma dosis presento un efecto analgésico
en los ratones y una alta actividad captadora de radicales libres del tipo DPPH con una CE50 de
3,05 µg/mL similar a la quercetina. La eficiencia de las actividades biológicas fueron atribuidas a
los compuesto fenólicos del tipo fenilpropanoides y los flavonoides que están presentes en la
especie B. morelensis,
En la Amazonia brasilera Da silva et al., 2012 evaluaron la composición fisicoquímica y
antibacteriana de los aceites esenciales obtenidos de las muestras comerciales del vegetal breus
(Protium), se extrajeron los aceites esenciales por hidrodestilación usando un cleverger
modificado, y posteriormente analizado por cromatografía de gases acoplado a masas, de este
estudio p-cimeno fue el principal constituyente de todas las muestras con concentraciones que
van desde 21,9 hasta 51,9%, otros monoterpenos comunes fueron ß-felandreno, α-felandreno, ß-
pineno, trans-dihidro-α-terpineol, α-terpineol, α-terpineno, de las muestras comerciales
analizadas el aceite esencial de la variedad breu negro fue la única que presento actividad
antimicrobiana.
En la Amazonia occidental, Moreno en el 2013 evaluó la actividad antioxidante de algunas
plantas medicinales, las especies usadas para este trabajo fueron: Bertholletia excelsa,
Eleutherina bulbosa, Piper obliquum, Protium subserratum y Protium trifoliolatum, usando el
método de captura del radical libre DPPH. De este trabajo, las plantas Piper obliquum, Protium
subserratum, Protium trifoliolatum y la cáscara de la Bertholletia excelsa presentaron un
resultado cercanos a los obtenidos por el patrón (Ginkgo biloba) en la inhibición del DPPH,
14
mientras que las fracciones cloroformo de estas plantas que presentaron una CE50 por encima de
la obtenida por el patrón, en las plantas Eleutherina bulbosa y Bertholletia excelsa no
presentaron resultados significativos.
En el 2016 Tirumani, Rajashekhar y Rayu, determinaron el contenido de fenoles totales y
la actividad antioxidante de las hojas de Bursera Penicillata, para evaluar la actividad
antioxidante se usó el método de captura del radical libre DPPH, ABTS, y para determinar el
contenido fenolico total usaron el método de reducción del reactivo Folin-Ciocalteu. Las hojas de
B. penicilata mostraron una alta actividad captadora de radicales libres como lo demuestran los
bajos valores de su CE50 en DPPH 142.36 ug / mL, en ABTS 39.25 ug / mL y alto contenido de
fenoles totales 39.32 mg GAE / g.
Honorata et al., en el 2017 analizaron la composición química del aceite esencial de
Bursera graveolens y también evaluaron su actividad anti-microbiana con las especies
Staphilococcus aureus, Bacillus cereus, Listeria monocytogenes, Clostridium perfringens,
Escherichia coli, Salmonella choleraesuis y Candida albicans y su actividad antioxidante frente
al radical DPPH. Este estudio determinó que la especie B. graveolens posee propiedades
antimicrobianas significativas, mientras que su actividad antioxidante fue muy débil con una
CE50 de 545,25 µg/mL, para analizar la composición química del aceite esencial, fue sometida a
hidrodestilación y análisis por cromatografía de gases equipada con un detector de ionización de
llama (FID), donde se identificaron 26 compuestos donde el mayoritario fue el α-terpineno
(31.57%).
15
5. DISEÑO METODOLÓGICO
5.1 Tipo de investigación.
Esta investigación es del tipo experimental, debido que presenta:
 Manipulación de variables.
 Medición de las variables
 Evaluación de las variables en un ambiente controlado.
5.2 Zona de estudio
Las hojas y cortezas de la especie vegetal Protium aracouchini fueron colectadas en el mes
de Septiembre en la reserva del bosque del corregimiento de Santa Inés, Sucre (N 8º 42’ 48.9”, O
75º 3’ 35.3”), con registros de temperatura promedio mensual de 28ºC, con humedad relativa del
85% y precipitación anual de 2300 mm (Blanco et al, 2012).
5.3 Preparación del material vegetal.
Las partes colectadas para el estudio de Protium aracouchini se removió el material no
deseado como polvo, arena, entre otras, con agua destilada. Posteriormente fue sometido a
secado por un periodo de aproximadamente 8 días a temperatura ambiente. Una vez secas fueron
molidas en un molino industrial y finalmente tamizadas, el material vegetal a utilizar será el
obtenido con la maya 40.

16
5.4 Identificación taxonómica del material vegetal.
Se enviaron los ejemplares del espécimen al Herbario Nacional Colombiano del Instituto
de Ciencias Naturales de la Universidad Nacional de Colombia sede Bogotá D.C, para su
respectiva clasificación.
5.5 Estudio químico
5.5.1 Histoquímica Vegetal.
Para determinar cualitativamente en que tejidos vegetales están presentes los
metabolitos secundarios, se utilizaron cortes histológicos de hojas y tallos frescos, para cada se
hicieron réplicas de 5 de los cortes histológicos, tomando aquellos que mostraron con claridad
resultados positivos, aplicando la metodología descrita por Johansen (1940), Demarco (2015),
González (2015) y, Bertel (2017):
 Ensayo para la determinación de celulosa (Azul de toluidina). a un corte transversal de
los órganos vegetales (Hoja y Tallo), se le adicionó una gota del reactivo azul de toluidina,
pasado un minuto se removió el exceso del reactivo con agua destilada, posterior mente se
realizó el montaje con el porta y cubre objetos para luego ser observado en el microscopio.
Color azul para celulosa, azul turquesa lignina, y morado, azul-lila o rosa-violeta para
hemicelulosa.
 Detección de almidón (Lugol). Se tomó un corte transversal de los órganos vegetales (Hoja
y Tallo), y se le adicionó una gota de lugol, el exceso del reactivo fue removido con agua
17
destilada, y posterior mente se realizó el montaje con el porta y cubre objetos para luego ser
observado en el microscopio. Reacción positiva: coloración azul dentro de las vacuolas.
 Detección de lípidos. Se tomó un corte transversal de los órganos vegetales (Hoja y Tallo), y
se le adicionó una gota sudan III, pasado 3 minutos el exceso del reactivo fue eliminado con
etanol al 70%, posteriormente se hizo el montaje con el porta y cubre objetos para luego ser
observado en el microscopio. Positivo si hay presencia de gotas de grasa color rojo o
amarillo.
 Determinación de Mucilago y Pectina. Se tomó un corte transversal de los órganos
vegetales (Hoja y Tallo), y se le agrego una gota de ácido tánico, pasado 20 minutos se
removió el exceso del reactivo con agua destilada, posterior mente se adicionó una gota de
FeCl3, después de 5 minutos se eliminó el exceso del reactivo con agua destilada y se realizó
el montaje con glicerina para luego ser observado en el microscopio. Tejidos que tengan
coloración negra indican resultado positivo para este ensayo.
 Lignina. Se realizó un corte transversal del mesofilo de la hoja y del tallo, posteriormente se
le añadieron unas gotas de floroglucina en presencia de HCl, después de 3 minutos el exceso
del reactivo fue removido con agua destilada, posterior mente se hizo el montaje con agua
destilada y se realizó el montaje en el microscopio. Positivo para la presencia de color fucsia
o lila en el tejido.
 Saponinas. Se tomó un corte transversal del mesofilo de la hoja y del tallo, y le agregaron
unas gotas de H2SO4, el exceso del reactivo fue removido inmediatamente con agua
destilada, `posterior mente se hizo el montaje con agua destilada y se observó al microscopio.
Presencia de coloración amarilla indica resultados positivos.

18
 Determinación de compuestos fenólicos. Se tomó un corte transversal de los órganos
vegetales (Hoja y Tallo), y se adicionó una gota FeCl3, pasado un minuto el exceso del
reactivo se eliminó con agua destilada, y se realizó el montaje con el porta y cubre objetos
para luego ser observado en el microscopio. Resultado es positivo para aquellos tejidos que
toman un color castaño o negro.
 Determinación de Terpenos. a un corte transversal de los órganos vegetales (Hoja y Tallo),
se le agregó una gota de la combinación de los reactivos Baljet A y Baljet B, pasado un
minuto el exceso del reactivo se removió con agua destilada, y posterior mente se realizó el
montaje con el porta y cubre objetos para luego ser observado en el microscopio. Los tejidos
que tengan presencia de sustancia del tipo terpeno tomaran una coloración naranja o amarillo.
 Determinación de taninos. Se tomó un corte transversal de los órganos vegetales (Hoja y
Tallo), y se dejaron sumergidos en una solución que contiene 1 mL de HCl y 1 mL de n-
Butanol por 5 minutos, luego se removió el exceso de la solución con agua destilada,
posterior mente se realizó el montaje con el porta y cubre objetos para luego ser observado en
el microscopio. Coloración roja para aquellos tejidos que tengan presencia de taninos.
19
5.5.2 Obtención de los extractos metanólicos.
70 gramos de material vegetal (hoja) previamente molidos y tamizados. Fueron
sometidos a una extracción solido-liquido por el método de Soxleth utilizando metanol
(ºEMSURE) como solvente extractor, realizando cada 24 horas monitoreos del extracto para
observar el agotamiento del material vegetal, Posteriormente el extracto fue filtrado, y
concentrado a presión reducida en rota evaporador (RE 100-Pro), obteniéndose un extracto de
consistencia pastosa con el que se realizó el tamizaje fitoquímico, fraccionamiento por
cromatografía flash y ensayos biológicos en el Laboratorio de Productos Naturales de la
Universidad de Sucre. De igual manera se procedió con la corteza de Protium aracouchini.
5.5.3 Screening fitoquímico preliminar.
El tamizaje fitoquímico de los extractos obtenidos se ejecutó tomando 1 gramo de cada
extracto concentrado y seco aplicando la metodología descrita por Jimenéz y Tamara (2017).
5.5.4 Cromatografía Flash.
Los extractos de metanol de las partes investigadas para Protium aracouchini se
fraccionaron por cromatografía flash con solventes de polaridad creciente (Bencina de petróleo,
Cloroformo, Acetato de Etilo y Metanol), se prepararon 2 gramos de los extractos totales
disolviéndolos en 5mL de metanol más 5 gramos de silicagel 60 G (para cromatografía en capa
fina), seguidamente fue sembrada en una columna (diámetro: 6.5 cm, altura: 7 cm).
20
5.6 Ensayos biológicos.
5.6.1 Evaluación de la toxicidad de los extractos en Artemia salina.
Para este ensayo se siguió el protocolo descrito por Meneses y Rivera (2015):
 Preparación del montaje. Se preparó 1 litro de agua marina artificial con un pH que se
encontrara en el rango de 7-8, con temperatura de 26ºC, almacenada en una pecera con luz
blanca artificial, y una bomba con burbujeo lento, donde se adicionaron 0,041 gramos de
huevos de Artemia salina.
Una vez eclosionado los huevos de A. salina, se evaluaron las concentraciones de los
extractos metanólicos de las hojas y corteza de Protium aracouchini., a 1000, 500, 100, y 10
µg/mL, que se encontraban disueltos en dimetilsulfóxido (DMSO) cada concentración se
realizó por triplicado y se compararon con un blanco que contenía 125 µL de DMSO, cada
unidad experimental contó con 10 nauplios de Artemia salina, 50 µL de alimento (levadura),
extracto total repartido en volúmenes de 500, 250, 50, y 5 µL para cada concentración, y se
completaba con agua marina hasta obtener un volumen final de 5000 µL por vial, después de
las 24 horas de exposición se contabilizó los individuos muertos en cada unidad
experimental. La CL50 se calculó mediante el software EPA probit analisys program versión
1,5.
21
5.6.2 Determinación de la actividad captadora de radicales libres:
 Evaluación de la actividad antioxidante por el ensayo DPPH •. Siguiendo la metodología
descrita por Castillo (2016) con algunas modificaciones: Preparar una solución metanólica de
DPPH a 26 mg/L con una absorbancia mayor de 0.7 y menor que 1, posteriormente hacer una
lectura contra un blanco (metanol) a 517 nm. Las soluciones a evaluar fueron los extractos
metanólicos preparados a concentraciones de 500, 250, y 125 µg/mL. El patrón utilizado fue
el ácido ascórbico en concentraciones de 200, 100 y 50 µg/mL. La reacción para la
evaluación del ensayo inicia al incorporar directamente en la cubeta 2900 µL de DPPH y
100 µL de la muestra, se monitoreo la reacción a 517 nm, el tiempo usado para cada ensayo
depende de cada muestra en llegar a su estado estacionario. La absorbancia control
corresponde a la primera medida de absorbancia hecha antes de incorporar la muestra a la
solución DPPH. Para medir el rendimiento de los extractos se realizó un cálculo de %DPPH
remanente y % Atrapamiento con las siguientes ecuaciones:
%DPPH remanente= ( )
%Atrapamiento = ( )
Dónde:
Ass= absorbancia en el estado estacionario
A0= absorbancia del grupo control.
La CE50 (concentración de antioxidante necesario para disminuir en un 50% la
concentración inicial DPPH), se determinó gráficamente %DPPH remanente vs concentración,
posteriormente se determinó gráficamente el tiempo necesario para que la CE50 alcance su estado
estacionario (TCE50), con estos dos parámetros se determinó la eficiencia antioxidante con la
siguiente formula:
22
EA= ( )
Dónde:
CE50= concentración efectiva media
TCE50= tiempo necesario para que CE50 alcance su estado estacionario.
Todas las mediciones se realizaron por triplicado.
 Actividad captadora del catión radical ABTS•+. Aplicando la metodología descrita por
Nossa y colaboradores (2016) con algunas modificaciones: Para activar el radical se preparó
una solución de ABTS a 7 mM dejar reaccionar con persulfato de potasio a 2.45 mM por 12
horas antes de ser usada, posteriormente preparar 5 mL de este reactivo para cada ensayo,
diluyéndose con metanol hasta obtener una absorbancia a 0,7 + (0,02) a una longitud de
onda de 732 nm, en una celda de cuarzo agregar 2900 µL de la solución del radical ABTS y
una alícuota de 100 µL de las soluciones a evaluar con las concentraciones de 500, 250, y
125 µg/mL, se usó como patrón 100 µL de ácido ascórbico a concentraciones de 50, 25 y
12,5 µg/mL, cada ensayo se realizó por triplicado, la capacidad captadora de radicales libres
(%ABTS remanente y % Atrapamiento), la CE50, TCE 50 y EA se calcularon de la misma
manera que en el ensayo DPPH.
 Ensayo del blanqueamiento del β-caroteno. Se siguió la metodología descrita por Perea
(2013) con algunas modificaciones: Esta metodología se basa en la pérdida de coloración del
β-caroteno ya que este tiende a estabilizar los radicales libres que se forman gracias a la
oxidación del ácido linoleico. La velocidad de decoloración del β-caroteno dependerá de la
concentración de agentes antioxidantes que estén presentes en los extractos. Se agregan 2 mg
de β-caroteno en 20 mL de cloroformo (ºEMSURE), seguidamente tomar 4 mL de esta

23
solución y mezclar con 40 mg de ácido linoleico y 400 mg de tween 20. Remover el
cloroformo por completo, y adicionar 100 mL de agua nanopura (ºLiChrosolv) oxigenada,
agitar vigorosamente hasta obtener una emulsión. para el ensayo se usaron 1300 µL de la
emulsión añadidos en un frasco eppendorf, y 100 µL de los extractos a diferentes
concentraciones 500, 250 y 125 µg/mL, el control fue preparado con 100 µL de disolvente,
como estándar se usó una solución de α-tocoferol a 200, 100 y 50 µg/mL. Luego se incubaron
a 50ºC por 120 minutos para ser leídos posteriormente a 470 nm contra un blanco el cual fue
preparado como la emulsión, pero sin β-caroteno. El % de actividad antioxidante fue medido
en términos del blanqueamiento de β-caroteno con la siguiente formula:
% Inhibición= ( )
Dónde:
At y Ct corresponde a los valores medidos para la muestra y el control después de los 120
minutos de incubación, y C0 es el valor de la absorbancia para el control en tiempo cero, los
resultados son expresados como CE50 (concentración que evita la decoloración del β-caroteno en
un 50%).
24
5.6.3 Determinación de fenoles totales.
De acuerdo a la metodología propuesta por Tovar (2013): Para medir la concentración
total de los compuestos fenólicos presentes en los vegetales se utiliza el reactivo de Folin-
Ciocalteu que en medio básico reacciona con las sustancias fenólicas dando una coloración azul.
el reactivo de Folin-Ciocalteu se diluye con agua destilada 1:50 V/V, luego tomar 500 µL del
reactivo y 500 µL de ácido gálico para realizar una curva de calibración usando las siguientes
concentraciones: 0, 2, 4, 6, 8, 10 µg/mL, para acelerar la reacción se usó 1000 µL de NaOH (0.35
M) como medio básico y así formar el complejo coloreado, en el caso los extractos se usó una
concentración de 50 µg/mL de la cual se tomó 500 µL. Cada ensayo fue hecho por triplicado, y
dejado en oscuridad durante tres minutos, posteriormente se midió la absorbancia a una longitud
de onda de 760 nm.
5.6.4 Determinación de flavonoides.
Tovar en el 2013 designa hacer reaccionar los OH presente en los flavonoides con él
Al+3, dando como resultado un complejo rosado que es medido a una longitud de onda de 500
nm luego se hace una curva de calibración con quercetina a concentraciones de 5, 10, 20, y 40
µg/mL, para llevar a cabo esta reacción el ensayo se realizó de la siguiente manera: a 1350 µL
del estándar y las muestras adicionar 75 µL de NaNO2 al 5%, y homogenizar, dejar reaccionar
durante 5 minutos, posteriormente adicionar 300 µL de AlCl3 a 2.5%, agitar vigorosamente hasta
homogenizar y dejar reaccionar exactamente por 6 minutos e inmediatamente añadir 500 µL
NaOH 1 M y 500 µL de agua destilada, homogenizar y leer la absorbancia después de 5 minutos.

25
5.6.5 Test estadístico.
Para el análisis estadístico se usó el software estadístico InfoStat. Todos los
tratamientos se realizaron por triplicado y al ser una población menor de 50 y mayor de 10 se
utilizó el test de shapiro-wilks para determinar si los datos presentan o no una distribución
normal. Posteriormente se realizaron pruebas estadísticas para establecer si hay o no diferencias
significativas para cada tratamiento en los diferentes ensayos, se utilizó el test no paramétrico
(no asume normalidad) de Kruskal-wallis para aquellos ensayos que no presentaron normalidad,
y para aquellos datos que presentaron una distribución normal se usó la prueba paramétrica de
análisis de varianza (ANAVA).

26
6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
6.1 Identificación taxonómica del material vegetal.
El sistemático botánico Giraldo Cañas en el Herbario Nacional Colombiano, determinó
que la especie en estudio es Protium aracouchini y el número de colección es COL 583966.
Reino: Plantae.
Phylum: Magnoliophyta.
Clase: Magnoliopsida.
Orden: Sapindales.
Familia: Burseraceae.
Género: Protium.
Epíteto: aracouchini.
Autor del Epíteto específico: Marchand.
Véase Anexo A.
Es una planta que en Colombia crece normalmente en los departamentos de Amazonas,
Guainía, Antioquia, Cauca, Choco, Vaupés, Caquetá, Bolívar, Córdoba, Meta, Guaviare, y San-
tander (Herbario Nacional Colombiano), siendo este el primer reporte para el departamento de
Sucre.
27
6.2 Estudio químico
6.2.1 Histoquímica.
En los cortes histológicos de tallo y hoja en P. aracouchini se observan metabolitos
primarios: almidón (imagen 3) lo cuales se encuentran en los amiloplastos del tejido
parenquimático de las hojas y tallos, ubicándose en mayor concentración en el parénquima
medular del tallo, en las plantas también se acumula energía en forma de lípidos almacenados en
estructuras celulares como los oleosomas, estas no se encuentran en mayor proporción en los
tejidos vegetales de P. aracouchini (imagen 4), celulosa(imagen 2), mucilago y pectina(imagen
5), estos últimos metabolitos estructurales se pueden apreciar con mayor claridad alrededor de
todos los tejidos vegetales tanto en las hojas como en el tallo; el mucilago y la pectina se
encuentran distribuidos en la mayoría de los tejidos de los órganos vegetales, va desde la
epidermis, colénquima, parénquima cortical, células acompañantes de los tubos resiníferos,
células acompañantes del xilema y del floema y en el tejido del parénquima medular, esto se
debe a que la pectina es un polisacárido que está involucrado en los procesos de crecimiento,
morfología, desarrollo y defensa de las plantas (García 2013).
En la identificación de los metabolitos secundarios, podemos notar que los compuestos fe-
nólicos (imagen 6), se encuentran almacenados en los tejidos del xilema, floema, tubos resinífe-
ros y en las células acompañantes tanto en tallo como en las hojas, dándole protección a la planta
sobre agente patógenos como las bacterias, virus, hongos, y depredadores como insectos según lo
explica Tapia et al., (2014); se evidenció que no hay reacción positiva para la identificación de
saponinas; la lignina (imagen 7) se encuentra en los tejidos de la epidermis, esclerénquima, ha-
ces vasculares; en las hojas la celulosa se puede observar en el colénquima, parte del parénqui-
28
ma, y en las células acompañantes de los tubos resiníferos, en el tallo la celulosa se encuentra en
los tejidos del parénquima cortical, parénquima medular, células acompañantes de los tubos resi-
níferos; el ensayo para la identificación de terpenos (imagen 9), dio positivo en los tubos resiní-
feros para las hojas y para tallo en el cambium vascular y tubos resiníferos, estas sustancias volá-
tiles en algunas ocasiones ayudan en la polinización de las plantas, y a su vez la defienden de los
depredadores, condiciones medioambientales (adaptación) y ciertas patologías, también hacen
parte de las resinas de muchas especies vegetales como lo explican Ormeño y Fernández (2012);
en la identificación de taninos (imagen 8), observamos en la hoja una reacción positiva en los
tubos resiníferos y sus células acompañantes, en el tallo los taninos se acumulan en el parénqui-
ma medular, xilema, floema, cambium vascular, tubos resiníferos y sus células acompañantes, la
razón por la cual hay mayor concentración de taninos en el tallo es que estas moléculas forman
enlaces con la celulosa de la madera y de esta forma mejora sus propiedades físicas lo cual le da
mayor estabilidad dimensional tal como lo describe Quiroz y Magaña (2015).
Tabla 1
Metabolitos secundarios presentes en órganos vegetales evaluados
Metabolito Hoja Corteza
Celulosa + +
Lignina + +
Lipidos + +
Almidón + +
Compuestos fenólicos + +
Saponinas - -
Terpenos + +
Mucilago y pectina + +
Taninos + +
Nota: - ausente, + abundante, ++ abundancia media, +++ muy abundante
29
B
A
Imagen 1: Hoja y tallo normal
A: corte transversal del mesofilo de la hoja, B: corte transversal del tallo.
Fuente: Harold Miguel Recuero Pacheco, 2018.
A B
Imagen 2: Celulosa con azul de toluidina.
A: corte transversal del mesofilo de la hoja, B: corte transversal del tallo. P: parénquima, positivo para ligni-
na; P.A: parénquima medular, positivo para lignina; X: xilema, positivo para celulosa; C.X: células acompa-
ñantes del xilema, positivo para lignina; E: esclerénquima, positivo para lignina; C: colénquima, positivo para
celulosa; C.A: células acompañantes del tubo resinífero, positivo para celulosa.
30
A B
Imagen 3: Detección de almidón con lugol.

A: corte transversal del mesofilo de la hoja (haces vasculares y parénquima), B: corte transversal del tallo
(parénquima medular).
A B
Imagen 4: Detección de lípidos con sudan III

A: corte transversal del mesofilo de la hoja (tubo resinífero), B: corte transversal del tallo (parénquima medu-
lar).

31
A B
:
Imagen 5: Detección de mucilago y pectina.

A: corte transversal del mesofilo de la hoja (xilema), B: corte transversal del tallo. P.A: parénquima medular;
X: xilema; C.V: cambium vascular; F: floema; C: Colénquima.
A B
Imagen 6: Detección de compuestos fenólicos FeCl3.

A: corte transversal del mesofilo de la hoja, B: corte transversal del tallo. P: parénquima; P.A: parénquima
medular; X: xilema; C.V: cambium vascular; F: floema; C.A: células acompañantes del tubo resinífero; P.C:
parénquima cortical; C: colénquima; EP: epidermis.
32
B
A
Imagen 7: Detección de lignina.

medular; C.X: células acompañantes del xilema; E: esclerénquima.
A B
Imagen 8: Detección de taninos.

medular; X: xilema; C.V: cambium vascular; F: floema; C.R: tubo ó conducto resinífero; C.A: células acom-
pañantes del tubo resinífero; C: colénquima; EP: epidermis.
33
A B
Imagen 9: Detección de terpenos.

A: corte transversal del mesofilo de la hoja, B: corte transversal del tallo. C.V: cambium vascular; C.R: tubo
o conducto resinífero

34
6.2.2 Obtención de los extractos y tamizaje fitoquímico.
En el proceso de extracción de los extractos totales de corteza y hoja de la especie en
estudio se logró obtener un rendimiento del 7.5% para la corteza y un 14.10% para las hojas. En
la caracterización in situ de los metabolitos presentes en P. aracouchini se validaron los
resultados obtenidos en la histoquímica fitoquímico (Tabla 1). Las pruebas realizadas para la
determinación cualitativa de los metabolitos secundarios nos indican que hay presencia de
sustancias del tipo polifenoles (taninos, flavonoides, cumarinas), terpenos (Tabla 1),
confirmando lo reportado por la literatura para la familia Burseraceae con los estudios realizados
por Kubmarawa et al,. (2007), Aliyu (2007), Sarfaraz et al,. (2009), Beltrán, Díaz, y Gómez
(2013), Siraj et al. (2016), para esta especie la presencia de alcaloides no fue notoria, esto se
puede presentar porque la concentración a la cual esta especie sintetiza estas moléculas es muy
baja para la época en las que fueron colectadas y por eso el kit de reactivos no fue tan sensible al
momento de hacer el ensayo para la detección de alcaloides, Álvarez y Pava (2010) encontraron
quinonas y un resultado positivo para alcaloides en la especie Protium ecuadorense.
Hay una mayor manifestación de las sustancias polifenólicas y de terpenos en la corteza
donde la especie acumula resina rica en este tipo de metabolitos; esta resina es usada como pro-
tección de la planta frente al ataque de insectos que lesionan sus tejidos, la resina actúa como
barrera para evitar infecciones de patógenos o parásitos fitófagos (Sepúlveda, Porta, y Rocha.
2004).
35
Tabla 2
Metabolitos secundarios presentes en los extractos metanólicos evaluados
Compuestos fenólicos +++ +++
Flavonoides +++ +++
Cumarinas ++ ++
Cardenolidos + +
Terpenos / esteroles + +
Quinonas - -
Saponinas - -
Alcaloides - -
Nota: - ausente, + poco abundante, ++ abundancia media, +++ muy abundante.
6.2.3 Cromatografía flash.
En la búsqueda del objetivo de esta investigación fue necesario realizar el
fraccionamiento del extracto total para obtener una subfracción rica en compuestos fenólicos y
flavonoides, y determinar las pruebas de toxicidad en Artemia salina, actividad antioxidante,
contenido de compuestos fenólicos y flavonoides totales.

36
6.3 Actividad biológica.
6.3.1 Evaluación de la toxicidad de los extractos en Artemia salina.
Para este bioensayo se utilizó el extracto metanólico y las subfracciones metanólicas de
corteza y hoja de P. aracouchini, y se determinó la toxicidad de los extractos metanólicos
obtenidos de la especie vegetal en estudio sobre los nauplios de A. salina calculándose la CL50
tal como se muestra en las tablas (Tabla 3, Tabla 4, Tabla 5, Tabla 6).
Tabla 3
Respuesta de nauplios de Artemia salina frente al extracto total en metanol de hoja
Número de individuos
Concentración Población expuesta
afectados
0 µg/mL 30 0
10 µg/mL 30 3
100 µg/mL 30 6
500 µg/mL 30 10
1000 µg/mL 30 14
Concentración letal 50 1907,720
Tabla 4
Respuesta de nauplios de Artemia salina frente al extracto total en metanol de corteza
afectados
0 µg/mL 30 0
37
10 µg/mL 30 6
100 µg/mL 30 10
500 µg/mL 30 14
1000 µg/mL 30 17
Tabla 5
Respuesta de nauplios de Artemia salina frente al extracto de la fracción metanólica de
hoja
afectados
0 µg/mL 30 3
10 µg/mL 30 3
100 µg/mL 30 4
500 µg/mL 30 12
1000 µg/mL 30 19
Tabla 6
Respuesta de nauplios de Artemia salina frente al extracto de la fracción metanólica de
corteza
afectados
38
0 µg/mL 30 3
10 µg/mL 30 4
100 µg/mL 30 11
500 µg/mL 30 13
1000 µg/mL 30 19
El extracto total de hoja mostró una concentración letal 50 (CL50) de 1907,720 µg/mL co-
locando lo en categoría VI según el CYTED (Anexo D) lo que quiere decir que los metabolitos
presentes en las hojas son relativamente inocuos, para el extracto total de corteza, fracción meta-
nólica de corteza y hoja se obtuvieron CL50 de 703,980 µg/mL, 707,927 µg/mL, 739,820 µg/mL
respectivamente ubicándolos en la categoría IV donde se considera que son ligeramente tóxicos,
esto nos permite trabajar cómodamente con márgenes amplios de los extracto de esta especie,
ya que estas no afectarían la salud de organismos de estructura celular compleja. Al compararlo
con un estudio para esta misma especie realizado por Jacques et al.,(2004) en el Amazonas, Bra-
sil, tenemos que la CL50 para el extracto metabólico de la raíz es de 36 µg/mL, la CL50 para el
extracto acuoso de la raíz 393 µg/mL, y para la corteza dio una CL50 de 310 µg/mL, esto nos
muestra que la toxicidad es más alta en este órgano vegetal, además las altas concentraciones de
letalidad se pueden presentar por las condiciones a la que esta especie se encuentra en Brasil, lo
que puede aumentar la síntesis de ciertos metabolitos que sean tóxicos, otro factor seria el tipo
de extracción empleado, ya que esto también influye en la obtención, concentración y el compor-
tamiento de los metabolitos en estudio, Tanamatayarat (2016) realizo un estudio de toxicidad
para la especie Protium serratum, tiene una CL50 de 108 para el extracto obtenido de las hojas, lo
39
que indica que los extractos de algunas especies de la familia Burseraceae deben ser usadas en
concentraciones moderadas.
6.3.2 Actividad antioxidante.
Para determinar la actividad captadora de radicales libres en P. aracouchini, se usaron
pruebas espectrofotométricas que fueron más reproducibles, precisos y accesibles. Debido a que
se tomaron pequeños volúmenes de las concentraciones preparadas de los extractos totales, frac-
ciones y patrón, dichas concentraciones no fueron las que actuaron sobre los radicales libres en
estas pruebas, ya que estos pequeños volúmenes fueron diluidos en una celda de cuarzo. En la
tabla 7 se muestran las concentraciones que realmente actuaron en la captación de los radicales
libres.
Tabla 7
Concentración que actuó en la actividad antioxidante
Concentración que actuó en la actividad antioxidante
Concentraciones madres Concentración que interactuó en la acción

Muestra
(µg/mL) antioxidante (µg/mL)
125 4.17
Extractos vegetales
250 8.33
40
500 16.67
50 1.67
100 3.33
Ácido ascórbico DPPH
200 6.67
12.5 0.417
Ácido ascórbico para el ensayo 25 0.833

de ABTS
50 1.67
50 3.57
α-Tocoferol 100 7.14
200 14.28
125 8.93
Extractos vegetales para el ensayo

250 17.86
de protección del β-caroteno
500 35.71
Los resultados que se muestran a continuación son el primer reporte de la actividad atrapa-
dora de radicales libres y cuantificación de compuestos fenólicos y flavonoides para P. aracou-
chini en Colombia.
Para dar soporte y corroborar los resultados de los ensayos de las actividades antioxidantes
se tuvo en cuenta los resultados de las CE50, la concentración de fenoles totales y flavonoides
41
totales, realizó el test de shapiro-wilks (tabla 8), con un nivel de significancia p < 0,05; siendo la
hipótesis nula H0= la distribución es de tipo normal y como hipótesis alternativa Hi= la distribu-
ción de los datos no es normal.
Tabla 8
Test de normalidad Shapiro-wilks
Variable N Media Desviación Estándar W* p (unilateral D)

DPPH 12 7,45 2,41 0,92 0,4636
β-caroteno 12 32,70 18,47 0,81 0,0133
ABTS 12 6,77 2,44 0,82 0,0270
Fenoles totales 12 8,34 2,58 0,84 0,0008
Flavonoides totales 12 33,67 2,44 0,78 0,0013
Las variable analizadas del ensayos DPPH tienen valores > a 0.05, aceptándose la H0 para
dichos ensayos, donde la distribución de los datos es del tipo normal, se utilizara el test de análi-
sis de varianza (ANAVA) para expresar si entre los tratamientos de dichos ensayos existe o no
diferencias significativas, mientras que los ensayos de ABTS, β-caroteno y flavonoides totales al
presentar un valor de significancia < 0,05 se acepta la Hi ya que todos sus tratamientos no pre-
sentan una distribución normal, y para expresar las diferencias que tiene cada uno de los trata-
mientos se aplicó un test de Kruskal-wallis.
 Evaluación de la actividad antioxidante por el ensayo DPPH+ (2,2-difenil-1-
picrilhidrazilo)
42
Murillo et al. (2007) describe que el rango de absorción para el DPPH va de 515 – 540 nm.
Para este ensayo se utilizó una longitud de onda de 517 nm donde el DPPH presento su máxima
absorción en el espectrofotómetro, y así determinar mediante la cinética de atrapamiento de los
radicales libres el porcentaje de DPPH remanente (tabla 9) y porcentaje de atrapamiento (tabla
10) en los diferentes extractos evaluados y el patrón. Se usó como patrón el ácido ascórbico por
ser una molécula reductora gracias a la presencia de dos grupos donadores de protones (grupos
hidroxilo), y al encontrarse al 99% de pureza le confiere una mayor efectividad en la disminu-
ción del DPPH remanente y una mayor captación de los radicales libres a bajas concentraciones.
De los extractos evaluados el extracto total de corteza y la fracción metanólica de la corteza tie-
nen un óptimo rendimiento que está por encima del 80% en la captura del radical DPPH, Mous-
tapha et al. (2014), tuvieron un bajo rendimiento en la actividad antioxidante asociado con la
poca concentración de los compuestos fenólicos encontrados en los extractos de metanol y he-
xano para la especie Bursera simabura, esto indica que la especie P. aracouchini si podría con-
siderarse como fuente promisoria de metabolitos secundarios captadores de radicales libres.
Tabla 9
Porcentaje DPPH remanente de los distintos tratamientos
Ext. Tot.
Concentración Ext. Tot. Met. Frac. Met. Frac. Met. Ácido as-
Met. Hoja
(µg/mL) Corteza (%) Hoja (%) Corteza (%) córbico (%)
(%)
1,61 ----------------- ------------------- --------------- ---------------- 69,58
3,22 ---------------- ------------------ -------------- -------------- 50,06
4,03 78,94 52,81 72,18 64,79 ----------

43
6,45 ---------------- ------------------ --------------- ------------- 2,11
8,33 51,67 33,11 49,93 47,87 -----------
16,67 23,04 11,49 17,40 19,62 ------------

Nota: Ext. Tot. Met. Hoja (Extracto total en metanol de hoja), Ext. Tot. Met. Corteza (Extracto total en metanol de corteza), Frac Met.
Hoja (Fracción metanólica de hoja), Frac Met. Corteza (Fracción metanólica de corteza)
El % de DPPH remanente indica la cantidad de DPPH presente en cada extracto, estos re-
sultados muestran una relación inversamente proporcional entre las concentraciones de los ex-
tractos y la cantidad de DPPH presente en cada prueba, ya que al aumentar la concentración de
los extractos disminuye la cantidad de DPPH que se encuentra en cada ensayo.
Tabla 10
Porcentaje de radicales libres capturados en los distintos tratamientos
Frac. Met. Ácido

Concentración Ext. Tot. Met. Ext. Tot. Met. Frac. Met.
Corteza Ascórbico
(µg/mL) Hoja (%) Corteza (%) Hoja (%)
(%) (%)
1,61 -------------------- -------------------- --------------- --------------- 30,41
3,22 ---------------- ------------------ -------------- -------------- 49,93
4,03 21,06 47,19 27,82 35,21 -------------
6,45 ---------------- ------------------ ---------------- ------------- 97,89
8,33 48,33 66,89 50,07 52,13 -----------
16,67 76,96 88,51 92,49 80,38 ------------

44
Hoja (Fracción metanólica de hoja), Frac Met. Corteza (Fracción metanólica de corteza).
El % de radicales libres capturados indica la efectividad de los agentes antioxidantes pre-
sente en los extractos para atrapar los radicales libres que se encuentran en el medio, estos resul-
tados muestran una relación directamente proporcional entre las concentraciones de los extractos
y la cantidad de radicales libres presente en cada prueba, ya que al aumentar la concentración de
los extractos aumenta la efectividad atrapadora de radicales libres presentes en cada ensayo.
Se calculó la CE50 por regresión lineal utilizando la ecuación de la formula Y=mx + b para
los extractos y patrón graficando el % de DPPH remanente vs la concentración (gráfica 1)
90
80
70
% DPPH REMANENTE
60
50
40
30
20
10
0
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18
CONCENTRACIÓN (µg/mL) y = -4,323x + 93,251
R² = 0,9691
Gráfica 1: %DPPH remanente vs Concentración de la fracción metanólica de las hojas.
Un vez calculada la CE50, se determinó el tiempo donde las muestras llegan a su estado es-
tacionario (grafica 2) y posteriormente la eficiencia antioxidante de todas las muestras evaluadas

45
(tabla 11), en la gráfica 2 se observa la actividad atrapadora de los radicales libres de la CE50 de
los extractos evaluados para llegar a su estado estacionarios es similar a la del patrón pero en un
tiempo más prolongado.
Tabla 11
Concentración donde los extractos atrapan el 50% de los radicales DPPH
Muestras CE50 (µg/mL) TCE50 (min) EA
Extracto metanólico total de

10,00 119,33 8,38E-4
hojas
Extracto metanólico total de

4,25 118 1,99 E-3
corteza
Fracción metanólica de hojas 8,41 120 9,91E-4
Fracción metanólica de corteza 8,07 118 1,05E-3
Ácido ascórbico 3,197 18 1,74E-2
Como se observa el ácido ascórbico tiene mayor efectividad antioxidante y un tiempo muy
corto para estabilizar a las moléculas de DPPH gracias a que es una molécula que presenta dos
grupos donadores de protones, y se utiliza a bajas concentraciones porque se encuentra en un alto
nivel de pureza.
46
La grafica 2 muestra que la efectividad de los extractos en disminuir la cantidad de los ra-
dicales libres del tipo DPPH es ≥ que el del patrón, pero que lo único que los diferencia es el
tiempo de acción, ya que el ácido ascórbico al ser una molécula que presenta grupos hidroxilos
con propiedades reductoras, permitiéndole ceder fácilmente electrones y estabilizarse mediante
el sistema conjugado que presenta dicha molécula (Betancourt, 2013.), dándole un rendimiento
mayor en un tiempo más corto en comparación con los extractos de la especie Protium aracou-
chini.
0,9
0,8
0,7
Absorbancia
0,6
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0
0 20 40 60 80 100 120 140
Tiempo (min)
F. M. H. E. T. H. E. M. C F. M. C. Ac As
Gráfica 2: Cinética de la CE50 de los diferentes tratamientos para el radical DPPH.
F.M.H. (fracción metanólica de hojas), E.T.H. (extracto total de hojas en metanol), E.M.C. (extracto total d
corteza en metanol), F.M.C (fracción metanólica de corteza), Ac As (Ácido ascórbico).
El análisis estadístico de la tabla 12 y 13 muestra que hay diferencias significativas para
los extracto total metanólico y la fracción metanólica de corteza y a su vez indica que el extracto
47
metanólico total de la corteza tiene mejor efecto antioxidante, lo cual indica que los metabolitos
presentes en la corteza de la especie P. aracouchini son los que poseen mayores características
reductoras de los radicales tipo DPPH, un estudio realizado por Tafurt, Jiménez y Calvo en el
2015, nos muestra que en dos especies de Burseraceae (Trattinnickia. rhoifolia y Trattinnickia
panamensis) los extractos de corteza presentaron mejor captación de DPPH* ya que en este ór-
gano vegetal es donde se almacenan la mayoría de estos metabolitos secundarios, además, en la
gráfica 2 muestra como los extractos de la especie en estudio tiene una captación de los radicales
libres similar a la sustancia patrón pero en un tiempo de acción más prolongado.
Tabla 12
Cuadro de análisis de varianza
F.V. SC gl CM F p-valor
Modelo 60 3 20 42,86 < 0,0001
Tratamientos 60 3 20 42,86 < 0,0001
Error 3,73 8 0,47 - -
Total 63,73 11 - - -
Tabla 13
Test de tukey
Tratamientos Medias N E.E.
E.M.C 4,17 3 0,39 A
F.M.C 6,95 3 0,39 B

48
F.M.H 8,40 3 0,39 B
E.T.H 10,29 3 0,39 C
Medias con una letra común no son significativamente diferentes (p > 0,05).
F.M.H. (fracción metanólica de hojas), E.T.H. (extracto total de hojas en metanol), E.M.C. (extracto total de corteza en metanol), F.M.C
(fracción metanólica de corteza) D.E. (desviación estándar).
 Actividad captadora del catión radical ABTS•+.
Una de las pruebas para medir y determinar la capacidad antioxidante (captadora de radi-
cales libres) es el uso de catión radical ABTS.+ al ser un método de alta sensibilidad, reproduci-
ble, rápido y estable, Kuskoski et., al (2005) describen que el tiempo de ejecución para este en-
sayo dependerá de la actividad antioxidante de los extractos en estabilizar el radical, variando de
1-7 minutos. Para determinar el tiempo requerido para neutralizar el radical libre (estabilización
del radical ABTS.*) se monitoreo el ensayo haciendo mediciones de absorbancia cada 30 segun-
dos, obteniendo que en un tiempo aproximado de 60 – 90 segundos la absorbancia del radical
disminuía hasta llegar a cero. Luego de obtener los datos de la cinética de atrapamiento, los re-
sultados fueron expresados en función del porcentaje de ABTS.+ remanente y porcentaje de atra-
pamiento. Se usó como patrón el ácido ascórbico. Para este ensayo se obtiene un mayor rendi-
miento en la captura de los radicales libres del ABTS en un tiempo aproximado de 60 segundos
49
(tabla 13) y una menor concentración tanto del patrón como del radical ABTS (tabla 14). En este
ensayo estadísticamente no existen diferencias significativas para ningún extracto así como lo
muestra la tabla 16.
A pesar que los ensayos de DPPH y ABTS miden la actividad antioxidante, sus condicio-
nes de reacción y cinética son diferentes, debido que el radical DPPH.es estable para su forma-
ción y solo necesita ser disuelto en metanol y no requiere ser activado, además los extractos ne-
cesitan de 30-120 minutos para alcanzar su estado estacionario, mientras que el catión ABTS+.
debe ser creado a partir de la reacción del ABTS con el oxidante persulfato de potasio, haciéndo-
lo menos estable y más transitorio, provocando que el tiempo en el que los extractos alcancen su
estado estacionario sea más rápido (Tovar 2013).
Tabla 14
Porcentaje de ABTS remanente de los distintos tratamientos
Ácido
Concentración Ext. Tot. Met. Ext. Tot. Met. Frac. Met. Frac. Met.
ascórbico
(µg/mL) Hoja (%) Corteza (%) Hoja (%) Corteza (%)
(%)
1,61 -------------------- -------------------- --------------- ---------------- 87,2
3,22 ---------------- ------------------ -------------- -------------- 58,38
4,03 64,01 63,84 77,33 47,46 -------------
6,45 ---------------- ------------------ --------------- ----------- 20,57
8,33 44,13 33,43 34,57 28,93 -----------
16,67 10,64 5,66 6,7 8,21 ------------
El % de ABTS remanente indica la cantidad de ABTS.+ presente en cada extracto, indican-
do una relación inversamente proporcional entre las concentraciones de los extractos y la canti-
50
dad de ABTS presente en cada prueba, ya que al aumentar la concentración de los extractos dis-
minuye la cantidad de ABTS que se encuentra en cada ensayo, también podemos observar que
en los extractos hay menor concentración del radical libre que en el patrón, indicando que la es-
pecie vegetal en estudio tiene metabolitos secundarios con una alta capacidad en la captura de los
radicales libres.
Tabla 15
Porcentaje de radicales libres capturados en los distintos tratamientos
Frac. Met. Ácido

Concentración Ext. Tot. Met. Ext. Tot. Met. Frac. Met.
Corteza ascórbico
(µg/mL) Hoja (%) Corteza (%) Hoja (%)
(%) (%)
1,61 -------------------- -------------------- --------------- --------------- 12,8
3,22 ---------------- ------------------ -------------- -------------- 41,62
4,03 35,99 36,06 22,67 52,54 -------------
6,45 ---------------- ------------------ ---------------- ------------- 79,43
8,33 55,87 66,57 65,43 71,07 -----------
16,67 89,36 94,34 93,3 91,79 ------------
El % de radicales libres capturados indica una relación directamente proporcional entre las
concentraciones de los extractos y el % de radical libre atrapado en cada prueba, ya que al au-
mentar la concentración de los extractos aumenta la captura del radical ABTS que se encuentra
en cada ensayo, también podemos observar que en los extractos tienen mejor rendimiento para
atrapar los radicales libres que los capturados por el patrón, indicando que la especie P. aracou-
51
chini tiene metabolitos secundarios con una alta capacidad en la captura de los radicales libres
del tipo ABTS.+.
Tabla 16
Test de Kruskal-Wallis
Variable Tratamientos N Medias D.E. Medianas H P
ABTS F.M.C. 3 5,92 5,17 8,20 2,38 0,4965
ABTS T.M.C. 3 6,15 1,10 5,61 - -
ABTS F.M.H. 3 7,75 0,76 7,69 - -
ABTS E.M.H. 3 7,26 0,96 6,96 - -
Medias con una letra común no son significativamente diferentes (p > 0,05).
(fracción metanólica de corteza) D.E. (desviación estándar).
Al igual que en el ensayo de DPPH, se hace el cálculo de la CE50 por regresión lineal
(Castillo, 2016.) de los extractos evaluados y se graficó su acción anti-radicalaria (tabla 17),
(grafica 3)
52
Tabla 17
Concentración efectiva para atrapar el 50% de los radicales catiónicos ABTS
Muestras CE50 (µg/mL) TCE50 (min) EA
Extracto metanólico total de hojas 7,26 119,33 1,15E-3
Extracto metanólico total de corteza 6,22 119 1,35 E-3
Fracción metanólica de hojas 7,76 119,33 1,08E-3
Fracción metanólica de corteza 2,57 119,5 3,26E-3
Ácido ascórbico 3,27 7.11 4.36E-3
En la tabla 17 se observa claramente como los extractos de la especie P. aracouchini tienen
una mejor efectividad en el atrapamiento del radical libre (ABTS) sobre pasando por poco a la
efectividad antioxidante del ácido ascórbico, contrario a lo sucedido con el radical DPPH, este
comportamiento se presenta porque el radical tipo ABTS no reacciona únicamente con el com-
puesto principal de la reacción, sino que también es susceptible a los productos de la reacción
(Mogana, Teng-Jin, y Wiart, 2013).

53
0,8
0,7
0,6
Absorbancia
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0
0 20 40 60 80 100 120 140
Tiempo (min)
E. M. H. E. M. C. F. M. H. F. M. C. Ac As
Gráfica 3: Cinética de la CE50 de los diferentes tratamientos para el radical ABTS.
F.M.H. (fracción metanólica de hojas), E.T.H. (extracto total de hojas en metanol), E.M.C. (extracto total d
corteza en metanol), F.M.C (fracción metanólica de corteza), Ac As (Ácido ascórbico).
El rendimiento para el deceso o captura de los radicales libres tipo ABTS en los extractos
de P. aracouchini, mostraron una mejor reducción del ABTS+. que el ácido ascórbico, pero en un
periodo de tiempo mayor, esto nos confirma que los extractos evaluados de la especie en estudio
si tienen efecto antioxidante frente a este tipo de radical libre, y además de esto nos muestra que
los metabolitos presentes en la especie en estudio tiene un rendimiento similar al ácido ascórbi-
co, Mogana,Teng-jin y Wiart (2013) encontraron que el extracto etanólico de la corteza en la
especie Canariun pantentinervium Miq. (Burseraceae Kunth.) muestra una alta actividad capta-
dora del radical ABTS.+ que el obtenido por el ácido ascórbico.

54
Para confirmar los datos obtenidos para el rendimiento de la CE50, se sometieron dichos re-
sultados a un test de Kruskall-Wallis, ya que estos no presentan una distribución normal. En el
test estadístico que nos muestra la tabla 16 no existen diferencias significativas en los extractos
obtenidos y que dichos valores de CE50 son muy parecidos entre sí.
 Ensayo del blanqueamiento del β-caroteno. Perea (2013) describe que el proceso de oxida-
ción del β-caroteno hace que este disminuya su coloración (absorbancia) debido a la acción
de los radicales libres formados por la oxidación del ácido linoleico en presencia del agua
nano pura oxigenada. En presencia de agentes antioxidantes el efecto del blanqueamiento del
β-caroteno puede ser reducido ya que estos capturan a las moléculas oxidativas que causan la
perdida de color en él. Se evaluó el efecto antioxidante de los extractos %AAO (tabla 18)
mediante la perdida de absorción a una longitud de onda de 470 nm. Al ser el α-tocoferol una
molécula pura de naturaleza lipofílica, presenta un mayor rendimiento frente a la inhibición
de la perdida de coloración del β-caroteno, ya que dona un H de su grupo OH, lo que le per-
mite detener la reacción en cadena de oxidación provocada por la peroxidación lipídica resul-
tante de la oxidación del ácido linoleico con el peróxido de hidrogeno (Izquierdo et al.,
2009), contrario a lo que sucede con el ácido ascórbico quien se comporta como un agente
pro-oxidante frente al sistema β-caroteno/ácido linoleico, esto ocurre porque el ácido ascór-
bico, después de donar los dos hidrógenos reductores, puede recibir electrones, debido al ra-
dical ascorbila formado, que es un agente oxidante (Duarte, Dos Santos, Genovese, y Lajolo,
2006 ). Como podemos observar en la tabla 18, todos los extractos metanólicos de P. ara-
couchini presentan acción protectora de radicales libres, ya que estas inhibieron el blanquea-
miento de la molécula diana para este ensayo, también podemos apreciar que todas las con-
55
centraciones altas de los extractos muestran resultados muy cercanos a los de su CE50, esto
puede deberse a que el efecto antioxidante se da en presencia de metabolitos con polaridad
baja, porqué el medio de acción es de naturaleza lipídica y por eso observamos que el -
tocoferol es más efectivo para evitar la pérdida de color en el β-caroteno. Para determinar si
la actividad antioxidante depende de los metabolitos con polaridades bajas, se recomienda
evaluar las fracciones de mediana y baja polaridad.
Tabla 18
Porcentaje de inhibición del decoloramiento del β-caroteno
Concentración Ext. Tot. Met. Ext. Tot. Met. Frac. Met. Hoja Frac. Met. Cor-
α-tocoferol (%)
(µg/mL) Hoja (%) Corteza (%) (%) teza (%)
3,57 ------------------- -------------------- --------------- ---------------- 30,25
7,24 ---------------- ------------------ -------------- -------------- 45,33
8,93 5,33 21,33 12,67 4,17 -------------
14,28 ---------------- ------------------ ---------------- ------------- 100
17,86 6,95 25,17 23,50 17,50 -----------
35,71 58,10 29,39 30,00 51,17 ------------
Hoja (Fracción metanólica de hoja), Frac Met. Corteza (Fracción metanólica de corteza).
56
120
105,49
100
80
66,89
60
40 33,48 35,08
20
7,09
0
α-Tocoferol T. M. H T. M. C F. M. H F. M. C
CE 50 [ug/mL]
Gráfica 4: Inhibición del decoloramiento del β-caroteno
F.M.H. (fracción metanólica de hojas), T.M.H. (extracto total de hojas en metanol), T.M.C. (extracto total d corteza en metanol),
F.M.C (fracción metanólica de corteza).
Para calcular la CE50 de cada extracto evaluado a través de regresión lineal como lo indica
Castillo (2016.), y los datos obtenidos se utilizaron para realizar la gráfica 4 donde aquellos
extractos con menor concentración en µg/mL son los que presentan mayor efecto protector del β-
caroteno frente a la oxidación lipídica del ácido linoleico, como el extracto total de corteza
presento un bajo rendimiento en la acción protectora del β-caroteno, esto no quiere decir que no
tenga una actividad captadora de radicales libres, sino que el extracto total de corteza debe estar
a concentraciones por encima de 105,49 µg/mL para poder capturar el 50% o más de este tipo de
radical libre, además si se compara este resultado con el obtenido en los ensayos de DPPH y
ABTS podemos inferir que la acción antioxidante de la corteza se debe a la presencia de
sustancias polares, tal y como lo explican Ribeiro et al, 2011 en un estudio donde analizaron la
actividad antioxidante DPPH y acción protectora del β-caroteno de los extractos de hojas de 5
especies del genero Protium, en el cual se observó una baja concentración de la CE50 en el
57
radical DPPH, mientras que en la protección del β-caroteno se obtuvieron CE50 altas, como es el
caso de la especie Protium apiculatum que presento una CE50 de 2,986 µg/mL en el ensayo del
radical DPPH, y una CE50 de 35,236 µg/mL para la inhibición del blanqueamiento del β-
caroteno, este comportamiento se debe a que las sustancias que tienen efectos antioxidantes en
estas 5 especies estudiadas tienen naturaleza polar (flavonoides y taninos).
Tabla 19
Kruskal-Wallis
Variable Tratamientos N Medias D.E. Medianas H P
β-caroteno T.M.C. 3 101,50 5,97 104,68 4,44 0,2181
β-caroteno E.M.H. 3 56,69 50,82 28,74 - -
β-caroteno F.M.C. 3 35,33 3,19 36,55 - -
β-caroteno F.M.H. 3 86,67 44,76 89,61 - -
F.M.H. (fracción metanólica de hojas), T.M.H. (extracto total de hojas en metanol), T.M.C. (extracto total d corteza en metanol),
F.M.C (fracción metanólica de corteza).
De la gráfica anterior podemos inferir que de los extractos evaluados, estadísticamente no
existen diferencias significativas (p > 0.05) en cada uno de los ensayos evaluados (tabla 19), pero
los metabolitos que presentaron mejor actividad protectora fueron los presentes en los extractos
metanólico total de la hoja y la subfracción metanólica de la corteza.

58
6.3.3 Determinación de fenoles totales. Villanueva y Zeballos (2017) describen el méto-
do de Folin-Ciocalteu como el más óptimo para la cuantificación de fenoles totales ya que permi-
te hacer varias replicaciones convirtiéndolo en el método más usado en el mundo. Las absorban-
cias usadas para realizar la curva de calibración se muestran en la tabla 21 que fueron grafica-
dos (gráfico 5), obteniéndose un coeficiente de determinación de 0,979 indicando la linealidad y
el grado de confianza para la aplicación del método y así obtener por regresión lineal la estima-
ción de los compuestos fenólicos totales que se encuentran en los extractos y fracciones evalua-
das de P. aracouchini y cuyos resultados se encuentran expresados en equivalente gramos de ácido
gálico tabla 21.
Tabla 20
Datos para la curva de calibración con ácido gálico
[Concentración µg/mL acido gálico] Absorbancia
0 0
2 0,107
4 0,229
6 0,333
8 0,402
10 0,454
59
0,6
0,5
0,4
ABSORBANCIA
0,3
0,2
0,1
0
0 2 4 6 8 10 12
y = 0,0466x + 0,0214
CONCENTRACIÓN (µg/mL) R² = 0,9796
Gráfica 5: Curva de calibración con ácido gálico.
Tabla 21
Concentración de compuestos fenólicos en eq µg GA/g de extracto.
Extractos Concentración(eq µg GA/g de extracto)
Metanólico total hoja 100,325926
Metanólico total corteza 66,6262626
Fracción metanólica hoja 6,344827586
Fracción metanólica corteza 8,71034483
Nota: eq µg GA/g = microgramos equivalente de ácido gálico por gramos de extracto.
Se observa que el extracto metanólico total de la hoja es quien presenta una alta concentra-
ción (eq µg GA/g de extracto) de fenoles totales, también se puede considerar que en la corteza
60
se encuentra un alto contenido de compuestos fenólicos totales, lo que corrobora los resultados
obtenidos en el tamizaje fitoquímico y la histoquímica realizada en P. aracouchini.
Tabla 22
Test de Kruskal Wallis
Variable Tratamientos N Medias D.E. Medianas H p Ranks
Fenoles
F.M.C. 3 8,71 0,10 8,71 10,38 0,0156 5,00 A B
totales
Fenoles
E.M.C. 3 66,63 0,78 66,63 - - 8,00 A
totales
Fenoles
totales
F.M.H. 3 6,34 0,07 6,34 - - 2,00 B C
Fenoles
totales
E.T.H. 3 100,33 3,44 99,87 - - 11,00 C
Medias con una letra común no son significativamente diferentes (p > 0,05)
F.M.H. (fracción metanólica de hojas), E.T.H. (extracto total de hojas en metanol), E.M.C. (extracto total de corteza en metanol),
F.M.C (fracción metanólica de corteza) D.E. (desviación estándar).
El análisis estadístico kruskal wallis, muestra que no existen diferencias significativas entre
las fracciones metanólicas de corteza y hoja, los extractos metanólicos totales presentan diferen-
cias significativas (P > 0,05). En la especie P. aracouchini hay presencia de compuestos fenóli-
cos que le ayudan al sistema protector y a su vitalidad en condiciones de estrés.

61
6,44
6,42
Fenoles totales hoja fracción (eq µg

6,4
6,38
GA/g extracto)
6,36
6,34
6,32
6,3
6,28
6,26
96 97 98 99 100 101 102 103 104 105
Fenoles totales hoja total (eq µg GA/g extracto) R² = 1
Gráfica 6: Contenido de fenoles totales en el extracto total en metanol de hoja vs
Contenido de fenoles totales en la fracción metanólica de la hoja en P. aracouchini.
eq µg GA = microgramos equivalente de ácido gálico.
8,85
Fenoles totales corteza fracción (eq µg
8,8
8,75
GA/g extracto)
8,7
8,65
8,6
8,55
65,5 66 66,5 67 67,5
Fenoles totales corteza total (e µg GA/g extracto) R² = 0,998
Gráfica 7: Contenido de fenoles totales en el extracto total en metanol de corteza vs
Contenido de fenoles totales en la fracción metanólica de la corteza en P. aracouchini.
eq µg GA/g = microgramos equivalente de ácido gálico por gramos de muestra.

62
Las gráficas 6 y 7 muestran una correlación 1 y 0.9193 respectivamente, entre el contenido
de los fenoles presentes en el extractos metanólicos totales de la hoja y corteza vs sus fracciones
metanólicas, en estas graficas observamos una relación directa en el contenido de fenoles totales
presentes en las fracciones metanólicas, corroborando la presencia de este tipo de metabolito
secundario en la especie P. aracouchini.
60
50 DPPH R² = 0,8324
40
CE 50 μg/mL
ABTS R² = 0,9735
30
20 BETA- R² = 0,8614
CAROTENO
10
0
96 98 100 102 104 106
FENOLES TOTALES EXTRACTO TOTAL HOJA (µg GA/ g EXTRACTO)
Gráfica 8: Contenido de fenoles totales del extracto total en metanol de hoja de la especie
P. aracouchini Vs actividad antioxidante

63
70
60 DPPH R² = 0,9837
CE 50 μg/mL 50
40 ABTS R² = 0,9968
30
20 BETA-
CAROTENO R² = 0,9709
10
0
6,25 6,3 6,35 6,4 6,45
FENOLES TOTALES FRACCIÓN HOJA (µg GA/ g EXTRACTO)
Gráfica 9: Contenido de fenoles totales de la fracción metanólica de hoja de la especie P.
aracouchini Vs actividad antioxidante
60
50 DPPH R² = 0,9689
40
CE 50 μg/mL
ABTS R² = 0,8139
30
BETA-
20 CAROTENO R² = 0,7816
10
0
65,5 66 66,5 67 67,5
FENOLES TOTALES EXTRACTO TOTAL CORTEZA (µg GA/ g EXTRACTO)
Gráfica 10: Contenido de fenoles totales del extracto total en metanol de corteza de la
especie P. aracouchini Vs actividad antioxidante
eq µg GA/g = microgramos equivalentes de ácido gálico por gramos de muestra.

64
20
18
DPPH R² = 0,9824
16
14
CE 50 μg/mL ABTS R² = 0,821
12
10
BETA-
8 CAROTENO R² = 0,8611
6
4
2
0
8,6 8,65 8,7 8,75 8,8 8,85
FENOLES TOTALES FRACCIÓN CORTEZA (µg GA/ g EXTRACTO)
Gráfica 11: Contenido de fenoles totales de la fracción metanólica de corteza de la especie
P. aracouchini Vs actividad antioxidante
Se estimaron las correlaciones de las gráficas de la 8 hasta la 11 (con una correlación R2
cercano a 1) de las CE50 obtenidas de la actividad antioxidante de DPPH. , ABTS.+ y β-caroteno,
para determinar la relación de la actividad antioxidante con el contenido de fenoles totales obte-
nidos en los extractos. De los resultados obtenidos en las gráficas anteriores se puede observar
una relación directa en el contenido de fenoles totales y su actividad antioxidante ya que todos
los niveles de correlación son mayores de 0, confirmando que la presencia de los compuestos
fenólicos presentes en los extractos de la especie P. aracouchini son estabilizadores de los radi-
cales libres. Tafurt et al., (2015) realizaron un estudio donde evaluaron la actividad antioxidante
y su correlación con el contenido fenólico obtenido de los extractos de ciertas especies de la fa-
milia Lamiaceae, Lauraceae y Burseraceae, donde las especies de la familia Burseraceae: Tetra-
gastris panamensis y Trattinnickia rhoifolia presentaron una elevada capacidad captadora de

65
radicales libres los cuales son atribuidos a su alto contenido de sustancias polifenólicas encontra-
das en sus extractos.
6.3.4 Determinación de flavonoides. De acuerdo con Gómez et al., (2011) la importancia
del estudio de los flavonoides, se debe a su amplio nivel de acción en la farmacología, además de
presentar diversas propiedades como la regulación del crecimiento celular, destoxificación por
inducción de enzimas como la monooxigenasa, y a su vez la capacidad de inhibición in vitro de
la oxidación de las lipoproteínas de baja densidad (LDL) producida por macrófagos, y reducción
de la citotoxicidad de las LDL oxidasas. Para determinar si la actividad antioxidante está relacio-
nada con la presencia de estos metabolitos, se realizó una curva de calibración con quercetina
(tabla 23 y grafico 12), de la cual se obtuvo un coeficiente de correlación de 0,983 entre la con-
centración de esta sustancia y su absorbancia, y se determinó el contenido de flavonoides totales
como se muestra en la tabla 23.
Tabla 23
Datos para la curva de calibración con quercetina.
[Concentración µg/mL quercetina] Absorbancias
5 0,037
10 0,056
20 0,113
40 0,177
66
0,2
0,18
0,16
0,14
Absorbancia
0,12
0,1
0,08
0,06
0,04
0,02
0
0 10 20 30 40 50
CONCENTRACIÓN (µg/mL) y = 0,004x + 0,02
R² = 0,9833
Gráfica 12: Curva de calibración con quercetina.

eq µg Q/g: equivalente n microgramos de quercetina/g de muestra.
Tabla 24
Concentración de flavonoides totales en eq µg Q/g de extracto
Extractos Concentración(eq µg Q/g extracto)
Metanólico total hoja 29,05666678
Metanólico total corteza 17,2144956
Fracción metanólica hoja 2,75638602
Fracción metanólica corteza 1,73874717

Nota: eq µg Q/g: equivalente en microgramos de quercetina/g de muestra.
67
Tabla 25
Test de Kruskal-Wallis
Variable Tratamientos N Medias D.E. Medianas H p Ranks
Flavonoides
F.M.C. 3 1,74 0,18 1,65 10,38 0,0156 2,00 A
totales
Flavonoides
E.M.C. 3 17,21 0,49 17,00 - - 8,00 B C
totales
Flavonoides
F.M.H. 3 2,76 0,03 2,75 - - 5,00 A B
totales
Flavonoides
E.T.H. 3 29,06 0,48 29,21 - - 11,00 C
totales
Nota: Medias con una letra común no son significativamente diferentes (p > 0,05), alfa= 0,05 DMS= 4,96034. Error: 3,5990 gl: 8
(fracción metanólica de corteza)
De igual manera que en la cuantificación de fenoles totales, se observa que la especie en
estudio presenta una concentración de flavonoides totales ligeramente alta, en la tabla observa-
mos que estadísticamente no existen diferencias para las fracciones metanólicas de corteza y ho-
ja, y tampoco existen diferencias entre los extractos totales de las mismas, con un nivel de signi-
ficancia de (p > 0,05) en la cantidad de flavonoides totales encontrados en los diferentes extrac-
tos obtenidos de P. aracouchini

68
29,6
29,4
eq µg Q/g extracto
29,2
29
28,8
28,6
28,4
96 98 100 102 104 106
eq µg GA/g extracto R² = 0,8512
Gráfica 13: Contenido de fenoles totales del extracto total en metanol de hoja vs
Contenido de flavonoides totales del extracto total en metanol de hoja de Protium
aracouchini.
eq µg GA/ g = microgramos equivalente de ácido gálico por gramo de extracto; eq µg Q/ g = microgramos
equivalente de quercetina por gramo de extracto.
2,8
2,79
eq µg Q/g extracto
2,78
2,77
2,76
2,75
2,74
2,73
2,72
6,25 6,3 6,35 6,4 6,45
Gráfica 14: Contenido de fenoles totales de la fracción metanólica de hoja vs Contenido de
flavonoides totales de la fracción metanólica de hoja de Protium aracouchini.

69
18
17,8
eq µg Q/g extracto
17,6
17,4
17,2
17
16,8
16,6
65,5 66 66,5 67 67,5
eq µg GA/g extracto
R² = 0,8547
Gráfica 15: Contenido de fenoles totales del extracto total en metanol de corteza vs
Contenido de flavonoides totales del extracto total en metanol de corteza de Protium
aracouchini.
2,5
2
eq µg Q/g extracto
1,5
0,5
0
8,6 8,65 8,7 8,75 8,8 8,85
Gráfica 16: Contenido de fenoles totales de la fracción metanólica de corteza vs Contenido
de flavonoides totales de la fracción metanólica de corteza de Protium aracouchini.

70
De las gráficas anteriores se observa un coeficiente de correlación> 0.5 indicando que
existe una relación directa en la cantidad de compuestos fenólicos totales con la concentración de
flavonoides totales encontrados en los extractos de P. aracouchini, puesto que los flavonoides
son un subgrupo de los compuestos fenólicos (Valenzuela et al, 2014).
60
DPPH R² = 0,9993
50
40
CE 50 μg/mL
ABTS R² = 0,7182
30
20
BETA- R² = 0,5079
10 CAROTENO
0
28,4 28,6 28,8 29 29,2 29,4 29,6
FLAVONOIDES TOTALES EXTRACTO TOTAL HOJA (µg Q/ g EXTRACTO)
Gráfica 17: Contenido de flavonoides totales del extracto total en metanol de hoja de la
especie P. aracouchini Vs actividad antioxidante
eq µg Q/ g = microgramos equivalente de quercetina por gramo de extracto.

71
70
60 DPPH R² = 0,9592
50
CE 50 μg/mL
40 ABTS R² = 0,9828
30
BETA-
20 R² = 0,9403
CAROTENO
10
0
2,72 2,74 2,76 2,78 2,8
FLAVONOIDES TOTALES FRACCIÓN HOJA (µg Q/ g EXTRACTO)
Gráfica 18: Contenido de flavonoides totales de la fracción metanólica de hoja de la
especie P. aracouchini Vs actividad antioxidante.
60
50 R² = 0,955
DPPH
40
CE 50 μg/mL
R² = 0,997
30 ABTS
20
10 BETA- R² = 0,4085
CAROTENO
0
16,8 17 17,2 17,4 17,6 17,8 18
FLAVONOIDES TOTALES EXTRACTO TOTAL CORTEZA (µg Q/ g

EXTRACTO)
Gráfica 19: Contenido de flavonoides totales del extracto total en metanol de corteza de la

72
20
18
DPPH R² = 0,7328
16
14
CE 50 μg/mL
12 ABTS R² = 0,4386
10
8
BETA-
6 CAROTENO R² = 0,4935
4
2
0
1,6 1,7 1,8 1,9 2
FLAVONOIDES TOTALES FRACCIÓN CORTEZA (µg Q/ g EXTRACTO)
Gráfica 20: Contenido de flavonoides totales de la fracción metanólica de corteza de la
En las gráficas anteriores se muestran que los niveles de correlación obtenidos son mayores
a 0, indicando que existe una relación directa en el contenido de flavonoides de los diferentes
extractos con la actividad antioxidante obtenida en cada uno de ellos. Esto nos confirma que el
poder captador de los radicales libres se debe en parte al alto contenido de los polifenoles
presentes en P. aracouchini, y además que los flavonoides de esta especie presentan un rol
importante para la captura de los radicales libres (Garrido, Ortiz, y Pozo. 2013), la correlación
mayor de 0 y menor de 0.5 solo nos indica que el efecto antioxidante está asociada a más de un
solo componente químico presente en los extractos de la especie en estudio.

73
7. CONCLUSIONES
 Este estudio es el primer reporte botánico de la especie Protium aracouchini en el
departamento de Sucre y pionero en evaluar la actividad antioxidante y determinar la
histoquímica vegetal, contenido fenólico total y de flavonoides totales presentes en los
órganos vegetales de las hojas y la corteza en Colombia, y del cual se puede concluir:
 La especie Protium aracouchini presente en el bosque de Santa Inés presenta metabolitos
secundarios tipo fenólicos como: flavonoides, cumarinas, terpenos y leucoantiocianinas, que
le otorgan la actividad antioxidante a los extractos de esta especie vegetal.
 Este es el primer estudio histoquímico realizado en Colombia para la especie Protium
aracouchini, donde encontramos que la mayoría de los metabolitos secundarios se
encuentran acumulados en las células del xilema y floema (tejidos vegetales de transporte de
nutrientes), lo que le permite a la planta llevar dichas moléculas a sitios específicos donde
esta lo requiera.
 El extracto total de la hoja en metanol de la especie en estudio es letal a una concentración de
1907,720 (µg/mL) frente a la especie Artemia salina, mientras que el extracto total de corteza
presenta una letalidad a una concentración de 703,980 (µg/mL). De las fracciones
metanólicas de hoja y corteza tenemos que ambas son letales frente a A. salinas a 707,927
(µg/mL), lo que nos permite trabajar cómodamente con esta especie vegetal a altas
concentraciones.
74
 Los extractos metanólicos de corteza y hoja secas, junto con sus fracciones metanólicas
exhiben un alto poder anti-radicalario, siendo la corteza el órgano vegetal con mejor
captación de radicales libres para los ensayos de DPPH y ABTS, mientras que para la acción
protectora del beta-caroteno quienes presentaron mejor actividad antioxidante fue el extracto
total metanólico de la hoja y la fracción metanólica de la corteza de la especie P.
aracouchini.
 Este es el primer estudio de la actividad antioxidante y el contenido de fenoles y flavonoides
totales reportado en Colombia para la especie Protium aracouchini, mostrando una relación
directa de la cuantificación de estos metabolitos y la actividad antioxidante que presento cada
extracto.
 El extracto metanólico total de la hoja presento una concentración de 100,325926 eq µg
GA/g de extracto, lo que le da una mayor versatilidad en la captación de diferentes tipos de
radicales libres gracias a la diversidad de compuestos fenólicos que están presentes en este
órgano vegetal.
 La especie Protium aracouchini es fuente promisoria de metabolitos secundarios del tipo
polifenoles los cuales se encuentran en las siguientes concentraciones: 100,325926 eq µg
GA/g para el extracto total en metanol de hoja, 66,6262626 eq µg GA/g para el extracto total
en metanol de la corteza, para las fraccione metanólica de hoja se obtuvo 6,344827586 eq
µg GA/g, y en la fracción metanólica de corteza 8,71034483 eq µg GA/g.

75
 En los extractos totales en metanol se evidencian concentraciones de 29,05666678 eq µg Q/g
para los flavonoides totales en la hoja, mientras que en la corteza se encuentran una
concentración de 17,2144956 eq µg Q/g, y en sus respectivas fracciones se obtuvieron
concentraciones de 2,75638602 eq µg Q/g para la hoja, mientras que la corteza tiene
1,73874717 eq µg Q/g.
 La actividad antioxidante de la especie Protium aracouchini está relacionada directamente
con el contenido de fenoles totales y flavonoides presentes en los extractos obtenidos de esta
planta.
 Los resultados obtenidos en esta investigación son de vital importancia para que esta especie
vegetal pueda ser conservada, y utilizada para el control de los radicales libres causantes de
enfermedades degenerativas en los seres humanos.

76
8. RECOMENDACIONES
 Evaluar la actividad antioxidante de los metabolitos presentes en extractos con polaridades
bajas.
 Realizar un estudio químico para determinar los tipos de compuestos fenólicos, y flavonoides
presentes en la especie Protium aracouchini.
 Evaluar la actividad anticancerígena de los metabolitos presentes en la especie P.
aracouchini.
77
9. REFERENCIAS
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exxtrac on Rat Liver Functions. Asian journal of biochemestry. 2 (5), 359-363.
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aptitud pesticida en dos ecosistemas diferentes. (Tesina de seminario previo a la obtención
del título de: ingenieros agropecuarios). Escuela superior politécnica del litoral. Guayaquil,
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87
10. ANEXOS
Anexo A. Certificado de la clasificación taxonómica de la especie en estudio.

88
Anexo B. Resultados del screening de los extractos metanólicos de corteza y hoja para
la especie Protium aracouchini.
Metabolito
Hoja Corteza
Secundarios
Compuestos fenólicos
Flavonoides
Cumarinas
Cardenolidos
89
Anexo C. Resultados del screening de los extractos metanólicos de corteza y hoja para
la especie Protium aracouchini
secundario
Terpenos / esteroles
Quinonas - -
Saponinas - -
Alcaloides -
90
Anexo D. Clasificación de la toxicidad según CYTED
Clasificación toxicidad según CYTED
I Extremadamente toxico >1-10 µg/mL
II Altamente toxico >10-100 µg/mL
III Moderadamente toxico >100-500 µg/mL
IV Ligeramente toxico >500-1000 µg/mL
V Prácticamente no toxico >1000-1500 µg/mL
VI Relativamente inocuo >1500 µg/mL

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EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE Y CUANTIFICACIÓN DE LOS

COMPUESTOS FENÓLICOS, FLAVONOIDES TOTALES PRESENTES EN LOS

HAROLD MIGUEL RECUERO PACHECO

HAROLD MIGUEL RECUERO PACHECO

Trabajo presentado como requisito para optar al título de Biólogo

SINCELEJO 3 DE SEPTIEMBRE DEL 2018

enseñanzas y momentos para recordar.

EXPUESTAS EN EL PRESENTE TRABAJO”

(ART 12 RES. 02 - 2013)

2.1 GENERAL ............................................................................................................................ 5

2.2 ESPECÍFICOS ...................................................................................................................... 5

3. MARCO REFERENCIAL ................................................................................................ 6

3.1 PRODUCTOS NATURALES .............................................................................................. 6

3.2 FAMILIA BURCERACEAE................................................................................................ 7

3.2.2 Protium aracouchini. ............................................................................................................. 8

3.3 COMPUESTOS FENÓLICOS Y FLAVONOIDES ............................................................ 8

3.4 RADICALES LIBRES ......................................................................................................... 9

3.4.1 Radical libre 2,2-difenil-1-picrilhidrazilo (DPPH). ............................................................... 9

3.4.2 Radical monocatiónico 2,2-azinobis-(ácido3-etilbenzotialzolina–6-sulfónico) (ABTS). .. 10

3.5 AGENTES ANTIOXIDANTES. ........................................................................................ 10

5. DISEÑO METODOLÓGICO ........................................................................................ 15

5.1 TIPO DE INVESTIGACIÓN. ............................................................................................ 15

5.3 PREPARACIÓN DEL MATERIAL VEGETAL. .............................................................. 15

5.4 IDENTIFICACIÓN TAXONÓMICA DEL MATERIAL VEGETAL. ............................. 16

5.5 ESTUDIO QUÍMICO ......................................................................................................... 16

5.5.1 Obtención de los extractos metanólicos ............................................................................... 19

5.5.2 Screening fitoquímico preliminar. ....................................................................................... 19

5.5.3 Cromatografía Flash............................................................................................................. 19

5.5.4 Histoquímica Vegetal........................................................................................................... 16

5.6 ENSAYOS BIOLÓGICOS. ................................................................................................ 20

5.6.1 Evaluación de la toxicidad de los extractos en Artemia salina. :........................................ 20

5.6.2 Determinación de la actividad captadora de radicales libres: ...................................... 21

5.6.3 Determinación de fenoles totales. ........................................................................................ 24

5.6.4 Determinación de flavonoides.. ........................................................................................... 24

5.6.5 Test estadístico.. ................................................................................................................... 25

6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN ..................................................................................... 26

6.1 IDENTIFICACIÓN TAXONÓMICA DEL MATERIAL VEGETAL. ............................. 26

6.2 ESTUDIO QUIMICO ......................................................................................................... 27

6.2.1 Obtención de los extractos y tamizaje fitoquímico. ............................................................. 34

6.2.2 Cromatografía flash.. ........................................................................................................... 35

6.2.3 Histoquímica. ..................................................................................................................... 27

6.3.1 Evaluación de la toxicidad de los extractos en Artemia salina. ........................................... 36

6.3.2 Actividad antioxidante. ........................................................................................................ 39

10. ANEXOS ........................................................................................................................... 87

Tabla 1 Metabolitos secundarios presentes en órganos vegetales evaluados ............................... 28

Tabla 2 Metabolitos secundarios presentes en los extractos metanólicos evaluados ................... 35

Tabla 5 Respuesta de nauplios de Artemia salina frente al extracto de la fracción metanólica de

Tabla 6 Respuesta de nauplios de Artemia salina frente al extracto de la fracción metanólica de

Tabla 7 Concentración que actuó en la actividad antioxidante..................................................... 39

Tabla 8 Test de normalidad Shapiro-wilks .................................................................................. 41

Tabla 9 Porcentaje DPPH remanente de los distintos tratamientos ............................................. 42

Tabla 10 Porcentaje de radicales libres capturados en los distintos tratamientos......................... 43

Tabla 12 Cuadro de análisis de varianza....................................................................................... 47

Tabla 13 Test de tukey .................................................................................................................. 47

Tabla 14 Porcentaje de ABTS remanente de los distintos tratamientos ....................................... 49

Tabla 15 Porcentaje de radicales libres capturados en los distintos tratamientos......................... 50

Tabla 16 Test de Kruskal-Wallis .................................................................................................. 51

Tabla 18 Porcentaje de inhibición del decoloramiento del β-caroteno ......................................... 55