S5 - Bioq 1 UNAJ 2021

BIOQUIMICA 1
SEMINARIO 5: Enzimas-Cinética enzimática

Temario. Aspectos moleculares de las reacciones enzimáticas: sustrato, centro activo, enzimas como
proteínas complejas, grupos prostéticos, coenzimas. Medida de la actividad enzimática: definición de
unidades y métodos de medida. Cinética de las reacciones enzimáticas: velocidad inicial de reacción
(v0), dependencia de la velocidad inicial con la concentración de enzima y sustrato. Ecuación de
Michaelis-Menten. Representaciones gráficas. Número de recambio, kcat. Constante efectiva o
especificiedad kcat/Km. La constante de Michaelis (kM): supuestos fundamentales, ecuación y
significado físico de los distintos parámetros cinéticos. Transformaciones de la ecuación de Michelis-
Menten; representaciones gráficas.
Inhibición de las reacciones enzimáticas. Inhibición reversible: modelos competitivo, no
competitivo, acompetitivo y mixto. Cinéticas en presencia de inhibidores. Representaciones
gráficas. Inhibición irreversible. Inhibidores como análogos al estado de transición y al sustrato.
Regulación de la actividad enzimática. Mecanismos generales. Cooperativismo positivo y negativo.
Modelos de Hill, Koshland, Nemethy y Filmer y el de Monod, Whyman y Changeux. Ecuación de Hill.
Coeficiente de Hill aparente y teórico. Alosterismo. Efectores positivos y negativos. Fundamentos
mecanísticos del cooperativismo y del alosterismo.
Bibliografía General
“Principios de Bioquímica”, Lehninger, 5da Ed.
“Cálculos de Bioquímica” – Segel 2ª Ed.
“Physical Biochemistry” - Freifelder 2ª Ed.
“Structure and mechanism in protein science. A Guide to enzyme catalysis and protein folding”. Alan
Fersht, W. H. Freemand an Company. 1999
“Protein Structure and Function”. Gregory Petsko and Dagmar Ringe. Capitulo 2. New Science Press with
Biomed Central. 2004
“Biochemistry” (Zubay, 4ta Ed.)
“Biochemistry” (Mathews y Van Holde, 2da Ed., 3rd Ed)
Cuestionario para resolver antes de concurrir a la clase:

1. ¿Cuáles son los aspectos característicos de las reacciones enzimáticas? ¿Qué propiedades presentan
las enzimas que las diferencian de otros catalizadores?
2. ¿Es cierto que todas las enzimas conocidas son de naturaleza proteica?
3. ¿Cuál es la diferencia entre el complejo activado y el complejo enzima-sustrato?
4. ¿Qué tipo de interacciones se ejercen entre la enzima y el sustrato para formar el complejo ES?
5. ¿Qué es la constante de Michaelis? Porque es importante medirla?
6. Definan Ks y kcat.
7. Para una reacción monosustrato A B, defina las condiciones en que kM=Ks. Describa condiciones
en las cuales esto no sea cierto.
8. ¿Cuál es la aproximación del estado estacionario y bajo qué condiciones es válido?
9. ¿Cuál es el orden de reacción, con respecto al sustrato, de una reacción enzimática monosustrato?
10. ¿Bajo qué condiciones podemos asegurar que medimos velocidades iniciales? ¿Puede medirse
velocidad inicial fuera de estas condiciones?
11. Qué representa el cociente Vo/Vmáx.
12. Qué es el cooperativismo? Cuál es su principal evidencia cinética?
13. Qué es el alosterismo? Cuál es su principal evidencia cinética?
14. Qué significado tiene el coeficiente de Hill?
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15. Porque cree que la mayoría de las enzimas regulatorias son alostéricas? Justifique en términos
cinéticos y metabólicos.
16 Cuales son las principales formas de inhibición de enzimática? Describa cada una de ellas con gráficos
y ecuaciones.
17 Que características tendría un inhibidor competitivo? Y uno no-competitivo?
18 Mencione la importancia biológica del fenómeno de la inhibición enzimática.
19 Esquematice un protocolo para evaluar a) la presencia de un inhibidor reversible/irreversible, b)
determinar el tipo de inhibición reversible.
Problemas
Problema 1: La Quimotripsina es una endopeptidasa que reconoce a aminoácidos aromáticos (Phe, Tyr y
Trp). Se estudiaron distintos parámetros cinéticos de la quimotripsina en función de distintos sustratos.
A continuación se muestran los resultados:
a) Explique claramente el significado de los siguientes parámetros.

i. kcat
ii. Km
iii. Kcat/Km
b) Qué conclusiones puede sacar de tal estudio?
Problema 2: Se realizó un estudio cinético de una enzima proteolítica, cuya actividad se siguió utilizando
como sustrato un compuesto sintético, que al ser hidrolizado libera un producto coloreado, que absorbe
a una longitud de onda determinada. Se obtuvieron los resultados que se muestran en la Tabla:
Estime los valores solicitados a continuación sin realizar cálculos analíticos. Qué suposiciones debe
realizar.
a) ¿Cuál es la Vmáx de la reacción?
b) ¿Cuál es el Km de la enzima? Estime el valor sin realizar cálculos analíticos
c) Cómo demostraría si esta reacción sigue la cinética de Michaelis Menten.
Utilizando los parámetros cinéticos estimados anteriormente calcule:
d) ¿Cuál es la velocidad utilizando una concentración de sustrato de 0,05 mM y 15 mM?
e) Calcular la cantidad de producto formado, durante los primeros cinco minutos de reacción a S =
5 mM.
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f) Defina una unidad enzimática arbitraria y calcule cuantas unidades por mililitro utilizó para el
ensayo si se agregaron 2,5ml del stock enzimático en 10 ml de reacción. A cuantas UI/ml
corresponderían.
Problema 3: La arginina sintetasa (AS) cataliza la reacción:
Arginilsuccínico Arginina + Ac. Fumárico

AS
En un experimento se midió la cantidad de arginina producida en función del tiempo, a diferentes
concentraciones iniciales de sustrato. En todas las mezclas de incubación las condiciones de reacción
fueron las mismas, y en cada mezcla de incubación se adicionó 5 ml de una preparación de enzima. El
volumen final de cada mezcla de reacción fue de 10 ml. Los resultados obtenidos se muestran en la
Tabla1
[S] (mM) Vo (mol de Arg/min x 10 ml)
0.020 0.0537
0.036 0.0876
0.048 0.1075
0.083 0.1560
0.200 0.2417
a) ¿Por qué las velocidades que se determinan deben ser valores iniciales?
b) Esquematice brevemente un protocolo que permita obtener los valores de Vo de la tabla (en
forma cualitativa).
c) Sabiendo que una unidad enzimática se define como: la cantidad de enzima que cataliza la
producción de 1 mmol de Arg/10 min, en las condiciones de reacción del ensayo, y a concentración de
sustrato saturante, ¿cuál es la actividad de la preparación de enzima, en UE/ml?
d) ¿Qué datos requeriría para calcular la actividad específica de la preparación de enzima? ¿Qué
datos para calcular el número de recambio?
e) Calcule el Km. ¿Cuál es el significado físico del parámetro Km? ¿Considera posible disminuir el
Km para este par enzima-sustrato?
Problema 4: La tripsina es una proteasa digestiva que actúa a pH neutro o alcalino. Con el objeto de
utilizar dicha enzima con fines industriales se estudió el comportamiento cinético de la tripsina de
sardina. En 10 mezclas de reacción conteniendo la misma concentración de enzima y distintas
concentraciones de sustrato, se determinaron las velocidades iniciales:
Sustrato (M) vo (umoles/min)

1,0.10-3 65
5,0.10-4 63
1,0.10-4 51
5,0.10-5 42
3,0.10-5 33
2,0.10-5 27
1,0.10-5 17
5,0.10-6 9,5
1,0.10-6 2,2
5,0.10-7 1,1
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Utilizando la ecuación de Lineweaver-Burk, determine gráficamente Km y Vmáx. Tenga en cuenta que
uno de los factores críticos en la seguridad de esta determinación es la escala elegida para ordenada y
abscisa. ¿Qué rango de concentración de sustrato es más útil para estas determinaciones?.
Problema 5: En un experimento en el que se midió la velocidad inicial de reacción (usando

concentración constante de enzima y concentraciones variables de sustrato), tanto en presencia
como en ausencia de un inhibidor, se obtuvieron los resultados que se muestran en la tabla.
a. Con estos datos determine kM, vmáx en ausencia y presencia de inhibidor. Cuál es el valor de
Ki.
b. ¿Qué clase de inhibidor se habría utilizado?¿puede asegurarlo con los ensayos realizados?
Problema 6: Se estudió la respuesta cinética de una enzima a diferentes concentraciones de

sustrato, en presencia y ausencia de un inhibidor I presente en concentración 2.0x10-3 M. En la
tabla se muestran los resultados obtenidos.
a. ¿Cuáles son los valores de vmáx y kM en ausencia y en presencia de I?.

b. ¿Qué tipo de inhibidor es? ¿Puede asegurarlo?
c. ¿Cuál sería la constante de disociación KI del inhibidor?
Problema 7: La enzima glucógeno sintasa cataliza la extensión de moléculas de glucógeno, según la

reacción:
UDP-Glc + (Glc)n UDP + (Glc)n+1.
Se puede seguir el curso de la reacción mediante la medida de UDP liberado. Se realizó una serie de
mezclas de reacción (10 ml volumen final) con distintas concentraciones de UDP-Glc, obteniéndose
los siguientes resultados de V0 en cada mezcla:
Cuando se repitió el experimento en presencia de ATP (2.5 mM), se obtuvieron los siguientes resultados:
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¿Cuál es el efecto del ATP? ¿Cómo lo expresaría en forma cuantitativa? Fundamente con un modelo de
acción del ATP.
Problema 8: Usando el gráfico que se muestra a continuación explique y discuta los siguientes puntos.
a. En general se observa que las enzimas regulatorias posee cooperativismo.

b. Porque una enzima no-regulatoria tiene en general una cinética michaeliana?
c. Para qué sirve el cooperativismo negativo? Cuál es la razón para que este fenómeno no inhiba
completamente a la enzima?
Problema 9: Para la ATCasa participa en una serie de reacciones que finalizan con la síntesis de CTP
(citidín trifosfato). La enzima es alostérica y cooperativa, está formada por 6 unidades catalíticas
idénticas más 6 unidades regulatorias también idénticas entre sí. Se realizaron distintos estudios
cinéticos con supuestos activadores o inhibidores. Los resultados de dichos estudios se muestran en la
tabla
La actividad de la enzima se midió en micromoles de fosfato producido por hora.
En base a estos datos

a. Obtenga un gráfico de la actividad en función de [S].
b. Cuál es el efecto del CTP y del ATP?
c. Cuál es el efecto del calentamiento sobre la cinética de la enzima? Para que se realiza este
calentamiento?
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SEMINARIO 5: Enzimas-Cinética enzimática

Cuestionario para resolver antes de concurrir a la clase:

a) Explique claramente el significado de los siguientes parámetros.

Problema 3: La arginina sintetasa (AS) cataliza la reacción:

Arginilsuccínico Arginina + Ac. Fumárico

Sustrato (M) vo (umoles/min)

Problema 5: En un experimento en el que se midió la velocidad inicial de reacción (usando

Problema 6: Se estudió la respuesta cinética de una enzima a diferentes concentraciones de

a. ¿Cuáles son los valores de vmáx y kM en ausencia y en presencia de I?.

Problema 7: La enzima glucógeno sintasa cataliza la extensión de moléculas de glucógeno, según la

a. En general se observa que las enzimas regulatorias posee cooperativismo.

La actividad de la enzima se midió en micromoles de fosfato producido por hora.

En base a estos datos

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