PCR en Tiempo Real

Descargar como pdf o txt
Descargar como pdf o txt
Está en la página 1de 43

6/4/2022

PCR en Tiempo Real

Variantes de PCR
• PCR Anidado
• Amplificación de una secuencia de ADN dentro de otra
previamente amplificada

• PCR Multiplex
• Detección de distintas secuencias de ADN al mismo tiempo

• PCR RFLP
• Detección de polimorfismos genéticos

• RT-PCR
• Detección de mRNA

1
6/4/2022

Variantes de PCR
• PCR en Tiempo Real
• Permite detectar secuencias de ADN amplificadas a
medida que se amplifican mediante la utilización de
sustancias fluorescents

• Alta sensibilidad y confiabilidad para la detección de DNA


o RNA

PCR en Tiempo Real


• Detección del producto ocurre en CADA CICLO DE
AMPLIFICACIÓN, en FASE INICIAL Y EXPONENCIAL de la
reacción
• Permite CUANTIFICAR el producto amplificado
• A mayor cantidad de producto inicial, menor número de ciclos
para su detección

2
6/4/2022

PCR en Tiempo Real


• Se utiliza para:
• Genotipificación, discriminación alélica (SNP)
• Determinación de carga viral
• Cuantificación de número de copias de un gen
• Detección de patógenos
• Expresión génica (RNA)

PCR en Tiempo Real

3
6/4/2022

PCR tradicional v/s PCR


Tiempo Real

PCR tradicional v/s PCR


Tiempo Real
• PCR Tradicional
• Baja Precisión
• Baja Sensibilidad
• Bajo Rango dinámico (< 2 veces)
• Baja Resolución
• Detección Manual
• No discrimina diferencias de tamaño pequeñas
• No cuantificable

4
6/4/2022

PCR tradicional v/s PCR


Tiempo Real
Medición en tiempo
Final
(PCR convencional)

Medición en Real Time

PCR tradicional v/s PCR


Tiempo Real

5
6/4/2022

PCR en Tiempo Real

PCR en Tiempo Real


• Linea Base (Baseline)  Ruido de fondo, previo a que la
amplificación sea significativa, varía entre los ciclos 3 al 15

• Limite de deteccion (Treshold)  Se define como la


amplificación específica y significativa del fragmento, ocurre
sobre la línea base

• Ciclo sobre el límite de detección (Cycle Treshold, Ct) 


Número del ciclo de la amplificación en la que la señal es mayor
al límite de detección.
Su valor es inversamente proporcional a la cantidad de
templado inicial

6
6/4/2022

PCR en Tiempo Real


• Referencia Pasiva  Control de referencia interna que va en
cada tubo de amplificación, permite corregir las variaciones de la
amplificación por manipulación y otros

• Fluorescencia Normalizada (Rn)  Señal de fluorescencia


normalizada con el valor de la referencia pasiva

• Diferencia de la Fluorescencia Normalizada (ΔRn)  Señal de


fluorescencia normalizada a la que se le sustrae la linea base.

PCR en Tiempo Real


¿Qué vemos en el equipo?

7
6/4/2022

PCR en Tiempo Real


• Para hacer las detecciones en las ampificaciones usamos
fluoróforos que emiten energía después de ser excitados a
una longitud de onda determinada

PCR en Tiempo Real

8
6/4/2022

PCR en Tiempo Real


• DETECCIÓN DE ADN DOBLE HEBRA MEDIANTE AGENTES
INTERCALANTES
• Habitualmente se usan fluoróforos como SYBR Green I o II,
EvaGreen, SYTO 9, ETC
• EvaGreen → Mayor Sensibilidad SYBR Green (mayor intercalación
de moléculas en la 2 hebra)
• Ambos fluoróforos emiten energía en el mismo rango de longitud
de onda
• Los fragmentos a amplificar varían entre 80 a 250 pb, para evitar
errores en la detección (¿cuáles?)

PCR en Tiempo Real

9
6/4/2022

PCR en Tiempo Real


• Para VALIDAR resultados se deben hacer dos cosas:
• Determinar eficiencia de la reacción mediante la curva de
calibración
• Realizar curva de Melting para verificar especificidad de la
reacción

PCR en Tiempo Real


• Determinar eficiencia de la reacción mediante la curva de
calibración
• Estandarizar amplificación del gen de interés en un PCR tradicional
• Hacer diluciones seriadas del producto de PCR amplificado
previamente. Si el fragmento está clonado mejor

1/10 1/10 1/10 1/10 1/10

10
6/4/2022

PCR en Tiempo Real


• ¿Cómo hacer la rección de PCR en tiempo real?:
1. Hacer mezcla reacción PCR en tiempo real (condición inicial)
Mix Reacción (para 25 ul)
Agua 10 - x
SYBR Green I 12,5
Partidores (c/u) (100 a 500nM)
ROX 1/500 0,375 (30 nM) *
cDNA x

2. Determinar la cantidad de cDNA o DNA que hay que usar en cada


reacción (probar varias diluciones como 1/10, 1/5 o sin diluir)
3. La temperatura de hibidación debe estandarizarse

PCR en Tiempo Real

¿QUE PODEMOS OBTENER?

11
6/4/2022

PCR en Tiempo Real

PCR en Tiempo Real


• Y= -3,348 Log (x) +16,73
• Eficiencia?

12
6/4/2022

PCR en Tiempo Real


• La Eficiencia de la reacción de PCR se determina con el
valor de la pendiente de la curva de calibración

Eficiencia (E)= (10 (-1/m)-1)*100

• El rango válido varía entre el 90-110% o valores de


pendiente entre -3,1 y -3,6

SEPARACION ENTRE AMPLIFICADOS DE 3,32 CICLOS DA


100% EFICIENCIA

PCR en Tiempo Real


• Y= -3,348 Log (x) +16,73
• Eficiencia? Eficiencia (E)= (10 (-1/m)-1)*100= 98,9%

13
6/4/2022

PCR en Tiempo Real


• Realizar curva de Melting para verificar especificidad de la
reacción
• Es un paso extra que se programa después de la reacción de
amplificación.
• La curva de melting o de disociación se obtiene denaturando el
producto amplificado (T=95°C), y la variación de la temperatura
varía en 0,3°C.

SE USA PARA AGENTES INTERCALANTES, SONDAS Y MULTIPLEX AL


ESTANDARIZAR TÉCNICA!

PCR en Tiempo Real

14
6/4/2022

PCR en Tiempo Real


• Realizar curva de Melting para verificar especificidad de la
reacción

PCR en Tiempo Real

15
6/4/2022

PCR en Tiempo Real


• Realizar curva de Melting para verificar especificidad de la
reacción

¿Por qué debemos hacerla?

E= 105%

PCR en Tiempo Real

16
6/4/2022

PCR en Tiempo Real


• ¿Cuándo más puedo usar las curvas de Melting?

• Cuando utilizamos agentes intercalantes para determinar la presencia de:


• mutaciones puntuales (SNP, inserciones/deleciones)
• análisis de metilación
• caracterización de haplotipos
• estudios de compatibilidad

• La variación de temperatura es de 0,1°C

• Para estos ensayos, los amplicones deben ser menores a 300 pb

• Esta curva se conoce como High Resolution Melting o HRM

PCR en Tiempo Real


• Ejemplos de HRM

17
6/4/2022

PCR en Tiempo Real


• DETECCIÓN DE FRAGMENTOS ESPECÍFICOS UTILIZANDO
SONDAS
• SONDAS DE HIDRÓLISIS
• SONDAS DE HIBRIDACIÓN

PCR en Tiempo Real


• SONDAS DE HIDROLISIS
TAQMAN
• Temperatura hibridación 60°C
• El fluoróforo del extremo 5’ de la
sonda se libera por acción
5’exonucleasa de la polimerasa.
• Relación equimolar sonda-partidor

18
6/4/2022

PCR en Tiempo Real


• SONDAS DE HIDROLISIS TAQMAN/ TAQMAN- MGB

PCR en Tiempo Real


• SONDAS DE HIBRIDACIÓN SONDAS DUALES O FRET

• Son dos sondas específicas con un fluróforo y un quencher.

• Las sondas hibridan una al lado de la otra, en la secuencia blanco.

• La sonda que se une río arriba, tiene el fluoróforo en el extremo 3’


(donor) y la sonda que se une río abajo, en el extremo 5’ (aceptor)

• Cuando ocurre la hibridación se produce la fluorescencia por


transferencia de energía desde el fluróforo donor al fluróforo aceptor

• Se utilizan para genotipificación, detección de SNP y detección de


mutaciones.

19
6/4/2022

PCR en Tiempo Real


• SONDAS DE HIBRIDACIÓN SONDAS DUALES O FRET

PCR en Tiempo Real


• SONDAS DE HIBRIDACIÓN SONDAS DUALES O FRET

20
6/4/2022

PCR en Tiempo Real


• DETECCIÓN DE FRAGMENTOS ESPECÍFICOS UTILIZANDO
SONDAS
• Utilización sondas específicas
• Taqman, FRET
• Molecular Beacons
• Scorpions Busquen como funcionan estas
• LUX probes sondas para la deteccion de
• LNA Probes fragmentos de interes. Consideren
• Amplifluor fluoróforo
En grupos de 3. Tienen 30 minutos
• MGB Eclipse probe
• Q-zyme probe
• Plexor System

EQUIPOS

21
6/4/2022

PCR en Tiempo Real


• CUANTIFICACION ABSOLUTA

• CUANTIFICCION RELATIVA

CUANTIFICACION

22
6/4/2022

CUANTIFICACION ABSOLUTA
• Relaciona la señal obtenida en el PCR con el número de copias
iniciales de templado mediante curva de calibración

• Las curvas de calibración deben estar VALIDADAS, ya que los


resultados finales dependen de la precisión de los datos utilizados

• Se usa para determinar NÚMERO DE COPIAS DE VIRUS, BACTERIAS


o algún gen de interés

• Muy importante en clínica

CUANTIFICACION ABSOLUTA
¿Cómo preparo la curva estándar?

Muestra patrón de concentración conocida, a


partir de la que se hacen diluciones seriadas

23
6/4/2022

CUANTIFICACION ABSOLUTA
• De la reacción de PCR obtengo la curva de calibración y la
eficiencia de la reacción

CUANTIFICACION ABSOLUTA
• La muestra de concentración desconocida, se amplifica junto con la
curva de calibración o algún control
• Valores obtenidos de Ct se interpolan en el gráfico o en la ecuación
obtenida

24
6/4/2022

CUANTIFICACION RELATIVA
• Se utiliza para determinar CAMBIOS DE EXPRESIÓN de un gen en
una condición determinada, en COMPARACIÓN con los genes de
referencia o “housekeeping”

• En este tipo de cuantificación es muy importante la ELECCIÓN DEL


GEN DE REFERENCIA, para que los resultados sean viables

• La curva estándar que se utiliza no es necesario que sea realizada


con concentraciones conocidas de templado

• Determino VECES DE CAMBIO O “FOLD CHANGES”, entre a una


condición inicial y una final

CUANTIFICACION RELATIVA

25
6/4/2022

Genes de Referencia

Genes de Referencia

26
6/4/2022

CUANTIFICACION RELATIVA
• Expresión relativa de COX-2, TNF-α y IL-1β en individuos
control vs dieta rica en grasas, normalizado en función de β-
actina

Genes de Referencia
¿Y si la eficiencia de la reacción no es 100%?

Unknown = (1+E target) -∆Ct target


Control (1+E norm) -∆Ct norm

∆Ct target= Ct Tratamiento GOI – Ct Control GOI

∆Ct target = Ct Tratamiento HK – Ct Control HK

27
6/4/2022

Genes de Referencia
• Son genes que tiene una función fundamental en la célula, por eso
se expresan constantemente

• Son genes que SE EXPRESAN EN FORMA ESTABLE en la célula, sin


verse afectados por los tratamientos o condiciones del medio (en
teoría)

Genes de Referencia

28
6/4/2022

Genes de Referencia

Genes de Referencia

29
6/4/2022

Genes de Referencia
 Para identificar el mejor gen de referencia puedo buscar
información en artículos científicos o usar bases de datos
públicas para identificar la mejor opción.

 RefGenes: utiliza información obtenida de ensayos de


microarrays (humanos y rata)

 Si tengo RNA, lo mejor es transformarlo a cDNA

Tips para normalizar los resultados de


qRT-PCR usando genes de referencia

30
6/4/2022

Utilización de múltiples genes de


referencia para resultados + precisos
• Se recomienda usar entre 2 a 5 genes de referencia con
expresión estable

• Se obtienen resultados significativos estadísticamente y


permite detectar variación de la expresión muy pequeñas

• Se puede utilizar un software para evaluar los genes de


referencia (geNorm, NormFinder, BestKeeper)

Se pueden hacer reacciones separadas

• No es necesario correr genes de referencia y GOI en la


misma reacción o equipo

• Deben estar estandarizados previamente

• Incluso si unas reacciones son con agente intercalante y


otras con sondas.

• Lo importante es que todas las muestras sean


tratadas igual!!!

31
6/4/2022

Gen Referencia y GOI no necesitan


tener rango de expression similar
• Si el gen de referencia se expresa más que el GOI no
importa, ya que el rango dinámico del equipo permite
medir esas diferencias.

• Solo importa la estabilidad en la expresión del


gen

¿Qué parámetros pueden afectar la


amplificacion de un GOI o gen de
referencia?

32
6/4/2022

• Siempre debemos considerar la INTEGRIDAD DEL


RNA (RIN) y EFICIENCIA DE LA REACCIÓN al hacer
estudios de expresión.

33
6/4/2022

Integridad del RNA


• El tipo de tejido que se utiliza como Fuente de
ADN/ARN (Células epiteliales ≠ glóbulos blancos ≠
tejido intestinal)

• Tipo de muestra (tejido fresco ≠ Biopsia ≠ Muestras


hueso ≠ tejido antiguo)

Integridad del RNA

34
6/4/2022

Integridad del RNA (RIN)

Integridad del RNA (RIN)

• RNA Integro: RIN >8  Disponible para


cualquier uso

• RNA Semi íntegro: 8 > RIN >5  Disponible para


análisis de gene array y RT-qPCR

• RNA Degradado: RIN <3  No utilizable

35
6/4/2022

Eficiencia de la Reacción: Síntesis cDNA

Eficiencia de la Reacción: ¿Qué controles


debo agregar a la reacción?
• Controles Negativos
• Sin templado
• Sin Transcriptasa Reversa (s/RT)

• Controles Positivos
• Control Endógeno (referencia)
• Control Positivo (mismo GOI)
• Spiking control (DNA foráneo, indica inhibidores, elimina
falsos negativos en diagnóstico)

36
6/4/2022

Eficiencia de la Reacción: Diseño de


partidores

• Fundamental!

• Se relaciona directamente con la eficiencia de la


reacción

37
6/4/2022

Eficiencia de la Reacción: Diseño de


partidores
• Detección Producto Específico (BLAST)

• Condiciones del partidor:


• Tamaño menor a 200 bp
• contenido GC 50-60%
• TM 60,
• Sin complementariedad en 3’
• Sin dímeros entre partidores

• Programas web: Primer3Plus


http://primer3plus.com/primer3web/primer3web_input.htm
• IDTDNA, Primer3
http://www.idtdna.com/scitools/Applications/RealTimePCR/

BASE DE DATOS PARA PARTIDORES


• GETPrime (gene- or transcript-specific primer
database for quantitative real-time PCR)
• Considera variantes génicas de genes y transcritos, de
perfiles de expresión, validación de partidores, elección
del mejor set de partidores

• Diseño de partidores de alta calidad y alta especifidad

• Partidores para Homo sapiens, Mus musculus,


Caenorhabditis elegans, Drosophila melanogaster, Danio
rerio

https://gecftools.epfl.ch/getprime

38
6/4/2022

BASE DE DATOS PARA PARTIDORES

RIN + EFICIENCIA

39
6/4/2022

RIN + EFICIENCIA

Fleige at al, 2006, Biotechnol Lett. 28:1601

¿Qué puede afectar la eficiencia de la


reacción?
• Almacenamiento inadecuado del material de trabajo
(DNA o RNA)
• Baja calidad de los ácidos nucleicos
• Mal diseño de partidores y/o sondas (baja eficiencia y
poca reproducibilidad)
• Mal análisis de los datos obtenidos, sobre todo en
ensayos de expresión

40
6/4/2022

CONSIDERACIONES PARA qPCR

MIQE: Minimum Information for


Quantitative qPCR Experiments

41
6/4/2022

Investigación v/s Diagnóstico


Investigación Diagnóstico

Sensibilidad Analítica # mínimo de copias que % de individuos con


v/s Sensibilidad Clínica se puede medir con alguna patología
exactitud en el ensayo identificados como
positivos

Especificidad Analítica Detección del blanco Detección válida de los


v/s Especificidad buscado verdaderos negativos
Diagnóstica
Exactitud Diferencias entre condiciones expresadas en veces
de cambio o número relativo
Repitibilidad Precisión intra-ensayos
Reproducibilidad Precisión inter-ensayos

qPCR en Clínica
• El diagnóstico clínico requiere de protocolos de alto
rendimiento para analizar un número limitado de
blancos presentes en las muestras
• Se deben tener las mismas consideraciones que en
investigación y…
• Sensibilidad y Especificidad Analítica (positividad
de los resultados e identificación de verdaderos
negativos)
• Precisión y exactitud intra e inter laboratorios
monitereados por QC externos
• Resolución de falsos positivos/falsos negativos

42
6/4/2022

Aplicaciones qPCR

Aplicaciones qPCR

43

También podría gustarte