PCR en Tiempo Real
PCR en Tiempo Real
PCR en Tiempo Real
Variantes de PCR
• PCR Anidado
• Amplificación de una secuencia de ADN dentro de otra
previamente amplificada
• PCR Multiplex
• Detección de distintas secuencias de ADN al mismo tiempo
• PCR RFLP
• Detección de polimorfismos genéticos
• RT-PCR
• Detección de mRNA
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Variantes de PCR
• PCR en Tiempo Real
• Permite detectar secuencias de ADN amplificadas a
medida que se amplifican mediante la utilización de
sustancias fluorescents
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E= 105%
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EQUIPOS
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• CUANTIFICCION RELATIVA
CUANTIFICACION
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CUANTIFICACION ABSOLUTA
• Relaciona la señal obtenida en el PCR con el número de copias
iniciales de templado mediante curva de calibración
CUANTIFICACION ABSOLUTA
¿Cómo preparo la curva estándar?
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CUANTIFICACION ABSOLUTA
• De la reacción de PCR obtengo la curva de calibración y la
eficiencia de la reacción
CUANTIFICACION ABSOLUTA
• La muestra de concentración desconocida, se amplifica junto con la
curva de calibración o algún control
• Valores obtenidos de Ct se interpolan en el gráfico o en la ecuación
obtenida
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CUANTIFICACION RELATIVA
• Se utiliza para determinar CAMBIOS DE EXPRESIÓN de un gen en
una condición determinada, en COMPARACIÓN con los genes de
referencia o “housekeeping”
CUANTIFICACION RELATIVA
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Genes de Referencia
Genes de Referencia
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CUANTIFICACION RELATIVA
• Expresión relativa de COX-2, TNF-α y IL-1β en individuos
control vs dieta rica en grasas, normalizado en función de β-
actina
Genes de Referencia
¿Y si la eficiencia de la reacción no es 100%?
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Genes de Referencia
• Son genes que tiene una función fundamental en la célula, por eso
se expresan constantemente
Genes de Referencia
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Genes de Referencia
Genes de Referencia
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Genes de Referencia
Para identificar el mejor gen de referencia puedo buscar
información en artículos científicos o usar bases de datos
públicas para identificar la mejor opción.
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• Controles Positivos
• Control Endógeno (referencia)
• Control Positivo (mismo GOI)
• Spiking control (DNA foráneo, indica inhibidores, elimina
falsos negativos en diagnóstico)
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• Fundamental!
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https://gecftools.epfl.ch/getprime
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RIN + EFICIENCIA
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RIN + EFICIENCIA
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qPCR en Clínica
• El diagnóstico clínico requiere de protocolos de alto
rendimiento para analizar un número limitado de
blancos presentes en las muestras
• Se deben tener las mismas consideraciones que en
investigación y…
• Sensibilidad y Especificidad Analítica (positividad
de los resultados e identificación de verdaderos
negativos)
• Precisión y exactitud intra e inter laboratorios
monitereados por QC externos
• Resolución de falsos positivos/falsos negativos
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Aplicaciones qPCR
Aplicaciones qPCR
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