3-Curso HPLC-COLUMNAS Y RELLENOS Actualizado

HPLC:
Columnas y
Rellenos
Columnas y soportes más utilizados.
Proceso de separación:
B A
Columnas y soportes mas utilizados.
Material de relleno:
• Fase Normal (NP):
- Fase sólida de sílica gel o sílica gel de polaridad
modificada (CN, NH2, Diol, Etc).
- Como fase móvil se emplea heptano, hexano,
acetato de etilo, isopropanol.
• Fase Invertida (Reversa, RP):
- Fase sólida de sílica gel modificada apolar
monomérica o polimérica.
- Como fase móvil se emplea isopropanol, metanol,
agua, acetonitrilo, THF.
- La fases típicas son C8 y C18 (cadenas carbonadas
con 8 y 18 átomos de carbono respectivamente)
Ejemplos de fases estacionarias-Fase Normal
Ejemplos de fases estacionarias-Fase Invertida
Estructura básica de una
columna
Estructura normal
Procedimiento de Endcapping
El procedimiento de Endcapped consiste en hacer reaccionar la
columna con trimetilclorosilano (ClSi(CH3)3)para bloquear los
grupos silanoles libres. Permite mejorar las separaciones y los
factores de cola, especialmente a pHs elevados.
Permite trabajar con compuestos muy polares (Ácidos

carboxílicos y aminas) mejorando sus factores de cola.
Diámetro del Metales
macroporo y residuales
Tipos de fases mesoporo Platos teóricos
estacionarias
% de Carbono
Tamaño y Características de las Tamaño de las

Diámetro partículas
interno columnas
Grupos silanoles
bloqueados
Área superficial (encapped) o no
específica
Forma de las partículas Capacidad Volumen muerto

Clasificación según la cantidad de sustancia
• HPLC Analítica : Columnas con pequeño diámetro (2-8 mm) y diminutas
partículas (3-5-10µm) para identificar y cuantificar sustancias (desde
pequeñas cantidades hasta trazas) en el orden de mg-µg-ng-pg inyectados.
• HPLC Preparativa : Columnas con mayor diámetro (8-50 mm) y partículas
más grandes (5 µm) para separar y purificar sustancias.
Tamaño de partícula (µm)
>15 10 7 5 3 1,8
Preparativa Semipreparativa-Analíticas Analítica Microanalítica
- Sensibilidad +
- Resolución +
+ Carga -
+ Consumo (mL) -
+ Tamaño -
Tamaño de partícula (µm). Influencia.
Forma de las partículas
Esféricas Irregular Monolítica y porosa

-Spherisorb -Lichrosorb -Chromolith
-Lichrospher -Onix
-Luna
-Nucleosil
Forma de las partículas
103 A°
Luna
(Phenomenex)
Symmetry
(Waters) Porousgel
Zorbax
(Agilent
Technologies) 106 A°
Tamaño del poro. Influencia en Separaciones por
Adsorción/Partición.
Menor poro Mayor poro

-Mayor Área específica -Menor Área específica
-Mayor capacidad -Menor capacidad
-Mayor tiempo de equilibrio -Menor tiempo de equilibrio
-Moléculas más pequeñas -Útiles para gradientes
Tamaño del poro. Influencia en SEC/GPC
Tamaño del Poro. Influencia
% de Carbono
% elevado % bajo
-Alta capacidad -Baja capacidad.
-Mayor hidrofobicidad -Menor hidrofobicidad
-Mayor resolución -Menor resolución
-Mayor TR -Menores TR
- Mayor consumo de solvente -Menor consumo solvente
% de Carbono: Fases Mono y poliméricas
Fases monoméricas Fases Poliméricas

-Alta eficiencia -Alta estabilidad a pHs
Extremos
-Alta transferencia de masa
Comparación entre los niveles de metales en
diferentes columnas.
Tamaño de las columnas (longitud).
Influencia en el cromatograma
Volumen Muerto
Volúmenes estimados
1-Columna 250 x 4 mm Vm=2,0410 mL
2-Columna 150 x 4mm Vm=1.2246 mL
3-Columna 100 x 4mm Vm=0,8164 mL 4,0
4-Columna 250 x 2mm Vm=0,5103 mL

Propiedades fïsicas de algunos materiales de relleno
Columnas Chromolith
Chromolith® HPLC
Son columnas altamente porosas que permiten la separación en tiempos
mucho menores que las de partículas pudiendo utilizarse varias columnas en
serie para mejorar una separación. Se pueden trabajar a elevados flujos sin
generar altas presiones, Su red cristalina es monolítica presentando
Macroporos que permiten los elevados flujos y Mesoporos de 13 nm
distribuidos sobre toda la superficie porosa que proporcionan una gran
superficie activa.
Chromolith
Comparación de la
selectividad de dos
columnas de alta
calidad : Chromolith y
Purospher Endcapped
ambas RP 18
Chromolith
Elevados Flujos no
incrementan
apreciablemente la presión
Tanaka* test
Este Test se utiliza para evaluar diferentes parámetros de las columnas.
Para Este ensayo se emplean diferentes sustancias con las que se
conforma un resultado hexagonal cuya simetría es indicativo de la
excelencia de una columna en particular
A: k’ (Pentylbenzene) 8.00
B: α (Pentyl-/ Butylbenzene) 1.52
C: α (Triphenylene/ o-Terphenyl) 2.08
D: α (Caffeine/ Phenol) 0.48
E: α (Benzylamine/ Phenol; pH7.6) 0.35
F: α (Benzylamine/ Phenol; pH2.7) 0.08
Purospher® STAR RP-18 endcapped
Tiempo de equilibrio
Regeneración de las columnas según la FE
Estrategia de la cromatografía
Si
CN, NH2, DIOL
C18, C8, Fenilo,

ODS1, ODS2
Geles
C18, C8, Fenilo,

ODS1, ODS2
C18, C8, Fenilo,

ODS1, ODS2
SCX, SAX
C1, Poliméricas
Guía para el uso de flujos y valores de capacidad de
diferentes tipos de
columnas
Guía para el uso de flujos y valores de capacidad de diferentes
tipos de columnas
Sensibilidad:
Ejemplo: Cuál es la sensibilidad de un análisis al cambiar una

columna de 4 mm ID por una de 2 mm ID o por una de 1 mm ID.
1er caso 2do caso
Tamaño de las columnas (Diámetro Interno).
Influencia en la sensibilidad
Causas y síntomas de “muerte de las Columnas”
-Incremento de la presión. -Variaciones en los Tiempos de retención.

-Formación de colas. -Reducción del número de platos teóricos.
-Disminución de la selectividad. -Desarrollos de microorganismos.
Especificaciones de las farmacopeas
Especificaciones de columnas con FE polar
Especificaciones de columnas con FE de mediana polaridad
Especificaciones de columnas con FE apolar

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Permite trabajar con compuestos muy polares (Ácidos

Tamaño y Características de las Tamaño de las

Forma de las partículas Capacidad Volumen muerto

Preparativa Semipreparativa-Analíticas Analítica Microanalítica

Esféricas Irregular Monolítica y porosa

Menor poro Mayor poro

Fases monoméricas Fases Poliméricas

4-Columna 250 x 2mm Vm=0,5103 mL

C18, C8, Fenilo,

C18, C8, Fenilo,

C18, C8, Fenilo,

Ejemplo: Cuál es la sensibilidad de un análisis al cambiar una

-Incremento de la presión. -Variaciones en los Tiempos de retención.

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