CENTRO DE CIENCIAS BÁSICAS

DEPARTAMENTO DE BIOLOGÍA

LABORATORIO DE BIOLOGÍA CELULAR

PRÁCTICA # 7

“METABOLISMO RESPIRATORIO DE LEVADURAS”

INGENIERÍA BIOMÉDICA

2° B

DRA. CLAUDIA MONTSERRAT VALLE RODRÍGUEZ

NATALIA ELOISA PÉREZ RODRÍGUEZ

ID: 244696

26 DE MAYO DEL 2021

INTRODUCCIÓN

Se conoce como metabolismo al conjunto de reacciones bioquímicas común en

todos los seres vivos, que ocurren en las células para la obtención e intercambio de
materia y energía con el medio ambiente y, a la síntesis de macromoléculas, a partir
de compuestos sencillos con el objetivo de mantener los procesos vitales y la
homeostasis. Estas reacciones están catalizadas por enzimas específicas.

El metabolismo involucra una gran variedad de procesos químicos en la célula que

son clasificados en dos grandes grupos, relacionados entre sí, y que son conocidos
como catabolismo y anabolismo. El catabolismo se define como el conjunto de todos
los procesos en los cuales ocurre la degradación o rompimiento de enlaces entre
las moléculas complejas para transformarlas en moléculas más sencillas, con la
consecuente liberación de energía.

La fermentación o respiración anaeróbica es un proceso catabólico; se realiza en

ausencia de oxígeno y cuando el último aceptor de hidrógenos o electrones es una
molécula orgánica sencilla. La fermentación tiene como último aceptor una molécula
que la misma célula produce, como es el ácido pirúvico. Este proceso se compone
de las reacciones que regeneran NAD+ el cual se usa para oxidar a la glucosa, en
ausencia de oxígeno, generando dos moléculas de ATP a partir de la fosforilación
a nivel del sustrato, esto es, a la formación de ATP mediante la transferencia directa
de un grupo fosfato al ADP, a partir de un sustrato intermedio en el catabolismo. En
síntesis, con la fermentación solamente una pequeña fracción de la energía de la
glucosa se libera en la conversión anaeróbica del ácido pirúvico en ácido láctico o
etanol. Esto habla de la ineficiencia de esta vía metabólica fermentativa, que en
consecuencia, necesita más combustible que la vía aeróbica. Es así como las
células que utilizan esta vía, necesitan degradar rápidamente muchas moléculas de
glucosa para compensar la pequeña cantidad de energía que obtiene de cada una
de ella.

(Cárdenas. R. Et al. 2014)

OBJETIVOS

o El alumno observará si a diferentes concentraciones de un substrato

conocido (sacarosa) se producen diferentes cantidades de bióxido de
carbono, por efecto de las reacciones químicas catalizadas por las enzimas
presentes en las levaduras.
o Observará de qué manera afecta la concentración de enzimas, presentes en
las levaduras, la producción de bióxido de carbono bajo una misma
concentración de substrato.
o Observará cómo afecta la presencia de un inhibidor las reacciones
catalizadas por las enzimas de las levaduras.

MATERIAL Y METODOLOGÍA

MATERIALES REACTIVOS
o 11 tubos de ensaye o Sacarosa al 20%
o 11 tubos de fermentación o Sacarosa al 10%
o 2 pipetas o Sacarosa al 5%
o Pro pipetas o Sacarosa al 2.5%
o Gasas o Sacarosa al 1%
o Vaso de precipitado o Inhibidor (NaF)
o Gradilla o Solución de levadura
o Marcador indeleble
o Regla
o Torundas de algodón
o Matraces
o Micro pipeta de 1 ml
o Puntas para macro pipetas
o Decímetro
METODOLOGÍA

1. Con el marcador indeleble se rotularon los tubos de ensaye y se colocaron

en la gradilla para comenzar a agregar la cantidad indicada de cada solución.
2. Con ayuda de la pro pipeta se les agrego, a excepción del tubo no. 9, la
cantidad de solución de levadura indicada en la tabla que se adjunta debajo.
3. Posteriormente se agregaron los mililitros de agua indicados en la tabla al
tubo no. 6, que es el único que lleva H2O.
4. En seguida, se añadieron los mililitros de solución de sacarosa indicados,
para esto, primero se llenaron todos los tubos que debían llevar sacarosa en
concentración de 20%, luego los de 10%, después los de 5% y así
sucesivamente. Al tubo no. 6 no se le agregó sacarosa como es indicado.
5. Después, se colocaron los tubos de fermentación invertidamente dentro de
los tubos de ensaye, asegurándose de que no se formaran burbujas de aire,
para esto, el tubo se sujetó de manera horizontal entre las manos y se movió
de lado a lado hasta que no hubiera burbujas.
6. Posteriormente, con ayuda de la micro pipeta se les añadió a los tubos no.
10 y 11 la cantidad del inhibidor de NaF que señala la tabla.
7. En seguida, se taparon los tubos con las torundas de algodón y las gasas.
8. Finalmente, se esperó 24 horas, se observaron resultados y con ayuda del
decímetro se midió la cantidad de gas producido.

No. Del Concentración Mililitros de Mililitros de Mililitros de

tubo de sacarosa % sacarosa levadura inhibidor
1 20% 13 8 -
2 10% 13 8 -
3 5% 13 8 -
4 2.5% 13 8 -
5 1.0% 13 8 -
6 0% 13 (agua) 8 -
7 2.5% 15.5 5.5 -
8 2.5% 17 4 -
9 2.5% 21 0 -
10 2.5% 12 8 1
11 2.5% 12.5 8 0.5
RESULTADOS

No. Del tubo Concentración de sacarosa Cantidad de CO2

% producido 𝐦𝐦𝟑
1 20 74 mm3
2 10 78 mm3
3 5 55 mm3
4 2.5 73 mm3
5 1.0 29 mm3
6 0 0 mm3
7 2.5 54 mm3
8 2.5 36 mm3
9 2.5 0 mm3
10 2.5 79 mm3
11 2.5 74 mm3

Tabla 1. Se muestra la cantidad de CO2 producido en relación con la

concentración diferente de sacarosa.

Cantidad de CO2 producido por concentración de

Sacarosa
Concentración de Sacarosa % Cantidad de CO2 producido mm^3

100 74
78
90 79
73 74
80
70 55
54
60
50
36
40 29
30 20
20 10
10 5 2.5 2.5 2.5 2.5
0 2.5 2.5
1 0
0
Tubo 1 Tubo 2 Tubo 3 Tubo 4 Tubo 5 Tubo 6 Tubo 7 Tubo 8 Tubo 9 Tubo 10 Tubo 11

Gráfica 1. Por medio de una gráfica se esquematiza la relación entre la

cantidad de CO2 producido de acuerdo con la concentración de sacarosa.
Figura 1. Se muestra la
cantidad de CO2 producido
en el tubo 1, 2 y 3.

Figura 2. Se muestra la
cantidad de CO2 producido
en el tubo 4, 5 y 6.
Puede notarse que en el
tubo no. 6 no se muestra
gas (CO2) producido

Figura 3. Se muestra la
cantidad de CO2 producido
en los tubos del 1 al 10.
Se nota que en el tubo 9 no
hay CO2 producido.
DISCUSIONES

Según Curia, M. Et al. (2010) “Las levaduras son los microorganismos más
importantes y más ampliamente utilizados en la industria. Pueden llevar a cabo dos
tipos de metabolismos quimiorganotróficos: la fermentación y la respiración. Cuando
el oxigeno está presente, las levaduras crecen eficazmente sobre el azúcar
formando biomasa y C02 (respiración). Sin embargo en ausencia de oxígeno las
levaduras cambian a un metabolismo anaeróbico (fermentación) que origina
menor cantidad de biomasa celular pero cantidades notables de alcohol y
C02”. En base a lo anterior se pueden corroborar los resultados obtenidos y
mostrados en la tabla 1, gráfica 1 y figuras 1,2 y 3, sobre los tubos del 1-5, 7 y 8, en
los cuales, efectivamente se puede observar la producción notable de CO2 en forma
de burbujas.

De acuerdo con Galvis, M. (2009) “La fermentación alcohólica se define como el

conjunto de reacciones químicas que sufre una sustancia orgánica de origen vegetal
como los carbohidratos o sus derivados por medio de ciertos microorganismos
(bacterias, levaduras y mohos) y que generalmente van acompañadas de un
desprendimiento gaseoso y producción de energía. Para la fermentación, es
necesaria la presencia de una sustancia azucarada y un fermento particular de
naturaleza animal (bacterias, mohos o levaduras)”. Es posible verificar los
resultados obtenidos y mostrados en la tabla 1, gráfica 1 y figura 2, en donde puede
observarse que el tubo 6 después de 24 horas no presenta producción de CO2, esto
debido a que no fue añadida la solución se sacarosa (sustancia azucarada) que es
necesaria y, por lo tanto, no se llevó a cabo el proceso de fermentación.

Según Vázquez, H. (2007) “La fermentación alcohólica es una bioreacción que

permite degradar azúcares en alcohol y dióxido de carbono. Las principales
responsables de esta transformación son las levaduras. La Saccharomyces
cerevisiae, es la especie de levadura usada con más frecuencia. A pesar de parecer,
a nivel estequiométrico, una transformación simple, la secuencia de
transformaciones para degradar la glucosa hasta dos moléculas de alcohol y dos
moléculas de bióxido de carbono es un proceso muy complejo, pues al mismo
tiempo la levadura utiliza la glucosa y nutrientes adicionales para reproducirse”.
Dado lo anterior, los resultados mostrados en la tabla 1, gráfica 1 y figura 3 pueden
ser verificados al observar que no se produjo CO2 en el tubo 9 debido a la ausencia
de la levadura (principales responsables de la fermentación).

De acuerdo con López. P. Et al. (2013) “En esta experiencia, el inhibidor elegido del
proceso catabólico es el fluoruro de sodio. Esta molécula en disolución acuosa y en
el interior de la célula es capaz de formar un complejo con el catión magnesio y el
anión fosfato inhibiendo a la enzima enolasa, responsable de la reacción de
formación de 2-fosfoenolpiruvato a partir de 2-fosfoglicerato (desprendiéndose una
molécula de agua). En presencia de elevadas concentraciones del inhibidor fluoruro,
éste compite activamente con el sustrato propio de la enzima por el centro activo,
reduciéndose la producción de piruvato y restringiéndose el proceso catabólico de
respiración/fermentación. La inhibición del catabolismo de la levadura se pone
de manifiesto por una reducción drástica en la formación de dióxido de
carbono. A mayor concentración de fluoruro la producción de gas es mínima,
indicativo de su poder inhibitorio del proceso catabólico”. Es posible deducir
que los resultados presentados en la tabla 1 y gráfica 1 respeto a los tubos 10 y 11
son incorrectos ya que no presentan los resultados esperados al añadir el inhibidor
de NaF con el que la presencia de CO2 debería ser mínima, al contrario, se muestra
una producción notable de CO2, por lo que puede inferirse la posibilidad de que la
concentración del fluoruro de sodio (2%) fuera demasiado baja para realizar el
efecto inhibidor en la levadura, o probablemente el lapso de 24 horas no fue
suficiente para determinar un parámetro útil que con el que se pudiera identificar un
efecto inhibidor mayor que habría arrojado el resultado correcto o esperado, de igual
manera, existe la posibilidad de que hayan existido errores en la forma en que se
agregó el inhibidor durante la metodología.
CONCLUSIONES

o El alumno fue capaz de observar como las diferentes concentraciones de

sacarosa produjeron diferentes cantidades de bióxido de carbono, por efecto
de las reacciones químicas catalizadas por las enzimas presentes en las
levaduras.
o El alumno fue capaz de reconocer el resultado de la presencia de un inhibidor
en las reacciones catalizadas por las enzimas de las levaduras.
o Se adquirió conocimiento sobre el manejo de nuevo material de laboratorio
como micro pipetas y tubos de fermentación, así como las “maniobras”
aplicadas para cumplir con una metodología correcta.

BIBLIOGRAFÍA

o Cárdenas, R.; Ojea, N. (2014). “Biología celular y humana”. Ecoe Ediciones.

Colombia. Pp. 99
o Curia, M. Et al (2010). “La Enseñanza de Conceptos en Biotecnología a
través de un Experimento Sencillo y Económico”. Formación Universitaria.
3(1), 27-30. http://dx.doi.org/10.4067/S0718-50062010000100005
o Galvis M. (2009). “Estudio del proceso de fermentación de glucosa para la
producción de bioetanol a partir de levaduras nativas”. Universidad Industrial
de Santander. Colombia. Pp. 5
o Vázquez, H.; Dacosta, O. (2007). “Fermentación alcohólica: Una opción para
la producción de energía renovable a partir de desechos
agrícolas”. Ingeniería, investigación y tecnología. 8(4), 249-259.
o López, P. Et al (2013). “Estudio de la inhibición de la respiración/fermentación
en células de levadura por fluoruro de sodio”. Revista Eureka sobre
Enseñanza y Divulgación de las Ciencias. 10(1),133-138
CUESTIONARIO

1. ¿Cuál es la concentración óptima del substrato?

La concentración óptima del sustrato fue en donde se agregó la de
2.5%, dejando de lado la posibilidad de que la concentración del inhibidor o
el lapso de tiempo fueran un factor para que el resultado no fuera del todo
correcto.
2. De acuerdo con los resultados obtenidos, ¿qué tipo de inhibidor es que uso
en la práctica y por qué?
El inhibidor usado fue fluoruro de sodio (NaF), ya que la fermentación no
se llevara a cabo por la presencia del NaF el cual frena el proceso de
reacciones de la glucolisis, en donde inhibe la enzima denominada
enolasa, evitando la transformación de fosfoenolpiruvato en piruvato.
3. ¿En qué parte de la célula se llevó a cabo la descarboxilación?
En la matriz mitocondrial. El piruvato generado en la etapa de glucólisis
sale del citoplasma y atraviesa la membrana externa mitocondrial.
Posteriormente, ingresa a la matriz mitocondrial en donde el piruvato sufre
una descarboxilación oxidativa que comienza con la acción del Piruvato
Deshidrogenasa que se encuentra exclusivamente en la matriz mitocondrial,
es transformada en una molécula de 2 carbonos llamada GRUPO ACETILO
por la remoción de una molécula de dióxido de carbono, también se oxida la
enzima NAD+ se reduce a NADH+H luego el grupo Acetil formado se uno a
una CoA para producir ACETIL CoA.
4. ¿Qué otros factores además de la concentración del substrato y de la
concentración de enzimas, intervienen en la cinética de la reacción?
Existen efectos internos y externos que pueden modificar el rendimiento
global del proceso. Por un lado, haciendo referencia al comportamiento de
un microorganismo en crecimiento, los efectos internos estarán relacionados
con su genética y sus mecanismos de regulación metabólica. Estos
mecanismos pueden ser transformados por los efectos externos de
naturaleza física que están vinculados con las condiciones de operación que
se utilizan en los reactores como puede ser la temperatura, el pH, la
 agitación, la aireación, entre otros. Para dar un ejemplo, la temperatura es
importante para el caso de la Saccharomyces Cerevisiae en donde la
velocidad de fermentación aumenta con la temperatura entre los 18 y los
35ºC. Por encima de los 35ºC se corre el riesgo de la proliferación de
bacterias, ya que a estas temperaturas las membranas celulares de las
levaduras dejan de ser tan selectivas y emiten sustratos muy adecuados para
el desarrollo bacteriano.
5. Investigue otro método de laboratorio para observar respiración anaerobia.
Un método que si bien, no es tan utilizado en laboratorio, es útil para la
comprender y observar la respiración anaerobia, es la vinificación por
maceración carbónica, que implica la capacidad de la uva para evolucionar
rápidamente desde un metabolismo respiratorio a un metabolismo de tipo
fermentativo en el momento en que las uvas se colocan a una atmósfera
extremadamente pobre en oxígeno y enriquecida con dióxido de carbono

Otro método que puede ser usado para observar respiración anaerobia es:
1. Llenar a la mitad un tubo de ensayo con suspensión de levadura.
2. Agregar 5 gotas de azul de metileno y agitar hasta obtener un color azul
claro.
3. Dejarlo reposar 5 minutos, observar y anotar.
4. Agregar 3 ml de formol al 10% sin dejar de agitar y dejar reposar hasta
observar cambios
5. En otro tubo de ensayo agregar 3 ml de jugo de naranja y 4 gotas de
reactivo de Benedict.
6. Calentar el tubo ligeramente en el mechero sin que hierva el líquido.
7. En el equipo de fermentación colocar 100 ml de jugo de naranja y agregar
un poco de levadura.
8. Dejar reposar 5 minutos y agregar reactivo de Benedict.
9. Calentar el envase que contenga la solución en el mechero sin que hierva
el jugo y comparar lo que sucede en el tubo anterior. Observar y analizar.