Determinacion de Microorganismo Enrique Garcia Morales

INSTITUTO TECNOLOGICO DE ORIZABA
Manual De Prácticas Del Laboratorio De Ing. Ambiental
Referencia a la Norma ISO
MICROBIOLOGÍA AMBIENTAL
CATEDRATICO:
PEREZ AVILA RAÚL
“DETERMINACIÓN DEL MICROORGANISMO”
Presentan:
 ENRIQUE GARCIA MORALES
HORARIO:
LUN. 13:00 PM-16:00 PM

MIER. 13:00 PM -15:00 PM
CLAVE:
7c6
GRUPO # 1
Orizaba, Ver, Agosto-diciembre de 2019
“DETERMINACIÓN DEL MICROORGANISMO”

FECHA DE REALIZACIÓN
02 DICIEMBRE 2019
1. COMPETENCIA A DESARROLLAR
Una de la tareas fundamentales del laboratorio de microbiología es la aplicación

de una metodología precisa que permita la identificación de los microorganismos
implicados en procesos clínicos asociados a infecciones o de aquellos que tienen
relación con el hombre.
Actualmente, la identificación bacteriana se realiza por medio de métodos

convencionales, basados en las características fenotípicas, puesto que su
realización y coste los hace más asequibles. Los métodos genotípicos suelen
reservarse para las bacterias que no se pueden identificar con métodos
convencionales.
Los esquemas tradicionales de identificación fenotípica bacteriana se basan en las

características observables de las bacterias, como su morfología, desarrollo, y
propiedades bioquímicas y metabólicas.
En el cultivo es esencial la correcta elección del medio de crecimiento y las

condiciones de incubación.
La identificación fenotípica bacteriana se basa fundamentalmente en la

comparación de las características fenotípicas de bacterias desconocidas con
aquellas de cultivos tipo. La fiabilidad de la identificación está en proporción
directa al número de características similares.
2. FUNDAMENTO
En el proceso de identificación bacteriana tradicional se establecen tres niveles de

procesamiento:
a) Todas las características fenotípicas conocidas son importantes y hay que

tenerlas en cuenta cuando se inicia el proceso de identificación, pero en principio
se seleccionan aquellas que se consideran pruebas primarias, que son rápidas y
sencillas de realizar, como la morfología en la tinción de Gram u otras tinciones,
crecimiento en diferentes atmosferas de incubación, crecimiento en varios tipos de
medios de cultivo, oxidasa y catalasa. Utilizando estas pocas pruebas

generalmente es posible situar a las bacterias, de manera provisional, en uno de
los principales grupos de importancia médica. A continuación se pueden
seleccionar otros métodos con mayor poder de discriminación, ya que muchos
microorganismos pueden presentar un aspecto muy similar en el examen macro y
microscópico.
b) El segundo nivel de identificación debe especificar el género al que pertenece

el microorganismo. Tanto en este nivel como en el anterior, la hipótesis sobre la
probable identidad de un microorganismo se apoya en las características del
cultivo (por ejemplo atmósfera) y en pruebas primarias, con las cuales se puede
determinar el género, grupo de géneros o en algún caso familia a la que pertenece
un aislamiento. Las pruebas primarias son: Gram, morfología, catalasa, oxidasa,
oxidación-fermentación, fermentación de glucosa, producción de esporas,
crecimiento en aerobios y anaerobios y movilidad. También deben tenerse en
cuenta los datos clínicos. Esto depender·, en gran medida, de un patrón estable
de características fenotípicas y en la experiencia del microbiólogo.
c) Por último, la conclusión debe hacerse con la identificación a nivel de especie.

El empleo de ciertas pruebas bioquímicas permite identificar con un alto grado de
precisión la mayoría de las bacterias clínicamente significativas.
3. DETERMINACION DE PROBLEMA
Se inoculó en una caja Petri con agar nutritivo un microorganismo desconocido

para proceder a su identificación con las pruebas que se mencionarán más
adelante
4. MORFOLOGÍA DE LA COLONIA
5. DETERMINACIONES REALIZADAS AL PROBLEMA DE MICROORGANISMO
5.1 FROTIS
Se denomina frotis a la extensión que se realiza sobre un portaobjetos

de una muestra o cultivo con objeto de separar lo más posible los
microorganismos, ya que si aparecen agrupados en la preparación es
muy difícil obtener una imagen clara y nítida. Este frotis debe ser
posteriormente fijado al vidrio del portaobjetos para poder aplicar los
métodos habituales de tinción que permiten la observación al
microscopio de las bacterias sin que la muestra sea arrastrada en los
sucesivos lavados. La fijación de una extensión bacteriana hace que
las bacterias queden inactivadas y adheridas al vidrio alterando lo
menos posible la morfología y bacteriana y las posibles agrupaciones
de células que pudiera haber
FROTIS
Seco
Este frotis debe ser posteriormente fijado al vidrio
del portaobjetos para poder aplicar los métodos
habituales de tinción que permiten la observación
al microscopio de las bacterias sin que la muestra
sea arrastrada en los sucesivos lavados..
Observaciones: Se observaron microorganismos

con morfología redondeados en su superficie.
FROTIS
Húmedo
La fijación de una extensión bacteriana hace que
las bacterias queden inactivadas y adheridas al
vidrio alterando lo menos posible la morfología y
bacteriana y las posibles agrupaciones de células
que pudiera haber.
Observaciones: Se puede seguir observando

morfología redonda.
Microorganismos en formas de cocos.
5.2 TINCION DE GRAM
La tinción de Gram es un tipo de tinción que se realiza sobre las

bacterias para observarlas mejor bajo el microscopio. Según la
distribución del peptidoglicano de la pared celular que las envuelve, se
tiñen de una forma u otra. Así, las bacterias que no se tiñen mediante
esta técnica se denominan Gram negativas. Están formadas por una
pared más fina formada por menos capas de peptidoglicano y una
segunda membrana rica en lípidos (que repele la tinción Gram), al
microscopio aparecen incoloras.
Las Gram positivas tienen una pared celular mucho más gruesa,
formada por un gran número de capas de peptidoglicanos entre las
que se inserta la tinción Gram, dando un color violeta intenso al
microscopio y se clasifican como Gram +.
TINCION DE GRAM
Tinción
La tinción de Gram es la más importante de las

tinciones diferenciales. Las células Gram positivas
retienen el cristal violeta cuando se tratan con
etanol mientras que las gram negativas no lo
tienen y se tiñen entonces del color rojo de la
safranina.
Observaciones: Se puede observar que presenta

una tinción positiva, se pueden observar como
microorganismo agrupados y no presentan
motilidad.
5.3 PRUEBA DE AZÚCARES
Las bacterias anaerobias o anaerobicas facultativas a menudo

fermentan carbohidratos a ácidos orgánicos y gas (H2 o CO2). Estos
pueden detectarse incluyendo en el medio un indicador de pH y una
campana Durham. Se pueden ensayar diferentes azúcares como
sustrato para diferenciar especies sobre todo bacterias entéricas.
Se inocula la bacteria en un medio conteniendo una pequeña cantidad

de peptona, un indicador de pH y una fuente de carbono fermentable
al 1-2 % y se coloca dentro de los tubos una campana Durham.
PRUEBA DE AZÚCARES
Fructuosa: Es un tipo de glúcido encontrado en

los vegetales, las frutas y la miel. Es un
monosacárido con la misma fórmula empírica que
la glucosa, C₆H₁₂O6, pero con diferente estructura,
es decir, es un isómero de ésta. Es una
cetohexosa.
Observaciones: Hay presencia de ácidos

orgánicos, ocasionando que disminuya el pH y vire
a un color amarillento.
PRUEBA DE AZÚCARES
Maltosa: (O Azúcar de malta) Es

un Disacárido formado por dos Glucosas unidas
por un enlace glucosidico producido entre
el Oxígeno del primer carbón anomerico
(proveniente de -OH) de una glucosa y el oxigeno
perteneciente al cuarto carbón de la otra.
Observaciones: No se presenta la producción de

ácidos y gases. Dando un resultado variable.
PRUEBA DE AZÚCARES
Dextrosa: Con fórmula molecular C₆H₁₂O₆. Es una

hexosa, es decir, contiene 6 átomos de carbono, y
es una aldosa, esto es, el grupo carbonilo está en
el extremo de la molécula. Es una forma de azúcar
que se encuentra libre en las frutas y en la miel.
Observaciones: Sin presencia de gas en la

campana durham y observándose un medio ácido.
PRUEBA DE AZÚCARES
Sacarosa: Azúcar común o azúcar de mesa es un

disacárido formado por glucosa y fructosa. Su
nombre químico es alfa-D-Glucopiranosil - - beta-
D-Fructofuranósido, y su fórmula es C₁₂H₂₂O₁₁.
Observaciones: Hay presencia de ácidos

orgánicos, ocasionando que disminuya el pH y vire
a un color amarillento (fermentación) pH 6.
5.4 IMVIC
Test utilizado en microbiología para reconocer bacterias. Se compone de cuatro

pruebas: Indol, Rojo de metilo, Voges-Proskauer y Citrato. El resultado de este
test se expresa mediante cuatro símbolos de suma o resta (+ o -) según el
resultado de cada prueba, siguiendo siempre el orden establecido por las iniciales
del método
Indol (I)
Consiste en cultivar la especie en estudio en un caldo rico en triptófano; después

de 24-48 horas de crecimiento, se extrae el indol producido con un disolvente
orgánico, como xileno, y se determina su presencia con reactivos específicos
como el reactivo de Kovacs el que adquiere un color rojo en la prueba del
indol positiva.
Rojo de metilo (M)
El rojo de metilo es un indicador de pH. (Fórmula: C15H15N3O2). Actúa entre pH

4,2 y 6,3 variando desde rojo (pH 4,2) a amarillo (pH 6,3). Por lo tanto, permite
determinar la formación de ácidos que se producen durante la fermentación de un
carbohidrato. El rojo de metilo se prepara con 0,1 g de este reactivo en 300 ml de
alcohol etílico y se diluye en 500 ml de agua. Una reacción positiva indica que el
microorganismo realiza una fermentación de la glucosa por la vía ácido-mixta.
Voges-Proskauer (VI)
Permite determinar la formación de acetil metil carbinol, el que es un producto

intermediario de la fermentación que conduce a la formación de 2,3 butanodiol y
que caracteriza a ciertas especies de las Enterobacteriaceae, por lo que indicará
que la glucosa es fermentada por la vía butanodiólica.
Citrato (C)
Sirve para determinar si un microorganismo puede crecer utilizando citrato como

unica fuente de carbono. Se hace crecer la bacteria en caldo citrato. Un resultado
positivo es cuando se observa turbidez en el tubo, debido al crecimiento
bacteriano. Un resultado negativo es cuando no se observa crecimiento .
IMVIC
Indol: Uno de los test del IMVIC utilizado para

diferenciar enterobacterias.
Existen bacterias que producen triptofanasa que
convierte el triptófano en indol
La bacteria se crece en medios que contienen
triptófano (caldo de triptoma). La presencia de indol
se ensaya añadiendo dimetilaminobenzaldehído
Observaciones: Muestra la formación de un anillo

entre verde-rojizo, determinando que la prueba dio
negativo a la formación de enzimas triptofanasa.
IMVIC
Rojo de metilo: Detecta la fermentación ácido-

mixta. Se acumulan ácidos (acético, fórmico, etc.),
relativamente fuertes y bajan el pH del medio hasta
4-5. Dicho cambio de pH se detecta añadiendo un
indicador (rojo de metilo) al cultivo
Observaciones: Formación de un anillo color

rojizo, dando un resultado positivo, indicando que
cuenta con un pH <4.3, así mismo detectando la
fermentación ácido-mixta
IMVIC
Citrato: Es uno de los test del IMVIC usado para

diferenciar enterobacterias. el crecimiento consume el ácido
y como consecuencia se produce un incremento de pH en
el medio y el indicador tira de verde a azul.
El citrato es la única fuente de carbono y se realiza

sembrando la bacteria en la superficie de un agar de
Simmon's inclinando el tubo
Observaciones: Arrojó un resultado negativo, debido a

que no viró de color.
5.5 TEMPERATURA
El crecimiento de los microorganismos se encuentra influenciado por

varios factores. Entre ellos los más importantes son la aireación y la
temperatura. En cuanto a este último, la Temperatura, los
microorganismos tienen un margen de temperaturas en el cual pueden
crecer. Este margen viene delimitado por la temperatura máxima de
crecimiento, a partir de la cual no pueden vivir e incluso mueren;
la temperatura mínima por debajo de la cual no pueden crecer aunque
generalmente no mueren; y la temperatura óptima a la cual ofrecen el
mejor crecimiento.
los microorganismos se clasifican en:
Hipertermófilos: Su temperatura óptima se encuentra por encima de

los 80ºC. Muchos de ellos son arqueas.
Termófilos: Su temperatura óptima se encuentra entre 45-70ºC.

Suelen ser microorganismos de vida libre
Mesófilos: Su temperatura óptima se encuentra entre los 25-45ºC.

Incluye microorganismos patógenos y comensales del hombre
y animales de sangre caliente y algunos de vida libre.
Psicótrofos: La temperatura óptima de los microorganismos de este

grupo está por debajo de los 25 – 30°C incluye
microorganismos de vida libre.
Psicrófilos: Su temperatura óptima de desarrollo se encuentra entre los

12 – 15°C
TEMPERATURA
Temperatura: Se siembran tres tubos de agar nutritivo con el

microorganismo.
Se llevan a incubar a temperatura ambiente 25ºC

aproximadamente,(gaveta) 5ºC, (refrigerador) y 36°C (estufa)
Tras la incubación se observa que los tubos que estuvieron a

5ºC no presentan crecimiento alguno, mientras que los dos
tubos incubadas una a temperatura ambiente y otra a 36ºC,
ambas presentan crecimiento aunque este es mayor en la que
se incubó a 36ºC.
Observaciones: la conclusión es que los microorganismos

presentes en el cultivo son mesófilos, ya que crecen
óptimamente a 36ºC, mientras que la temperatura ambiente, de
entre 22-25ºC, se encuentra dentro de su rango de crecimiento
ya que han crecido pero menos.
RESULTADOS
Determino que mi microorganismo problema es Staphylococcus aureus,

basándome en las siguientes pruebas
Prueba lectura resultados
Tinción de gram + +
Fructuosa acido acido
Sacarosa acido acido
Maltosa varibae acido
Dextrosa acido acido

Indol + +
Rojo de metilo + -
Temperatura 37°c 37°c
-ACERCA DE STAPHYLOCOCCUS AUREUS
Clasificación científica
Reino Bacteria
Clase Bacilli
Orden Bacillales
Familia Staphylococcaceae
Género Staphylococcus
Especie S. aureus
Nombre binomial Staphylococcus aureus
Staphylococcus aureus se destaca como un importante patógeno humano,

produce infecciones tanto en la comunidad como a nivel hospitalario. En la
comunidad, las infecciones por S. aureus son a menudo agudas, piogénicas y
superficiales, aunque también puede producir, con menor frecuencia, infecciones
profundas como osteomielitis, neumonía y endocarditis aguda. A nivel nosocomial
S. aureus es un importante agente de infecciones de herida quirúrgica, de prótesis
y otras. También S. aureus es causa de una serie de infecciones producidas por
toxinas como el síndrome del shock tóxico, la intoxicación alimentaria y el
síndrome de piel escaldada.
Historia
El nombre de Staphylococcus proviene de la palabra griega Staphule que significa

uva por lo tanto se hace la analogía con un racimo de uvas que es la agrupación
observada para esta bacteria en una tinción de GRAM.
En 1880, Staphylococcus fue visto por primera vez en la pus de infecciones

pirogénicas, Alexander Ogston determinó que estas bacterias eran cocos
Grampositivos.
En 1884, S. aureus fue identificado por Rosenbach, como la bacteria causante de

infecciones en heridas, así como la forunculosis.
En 1928, Alexander Fleming descubre que el hongo penicillium contamina medios

de cultivos con cepas de Staphylococcus aureus, y observa la inhibición de la
bacteria evidenciando de esta manera una nueva sustancia (antibiótico) la
penicilina.
Hábitat
Staphylococcus epidermidis es integrante de la flora normal de la superficie

corporal donde sobrevive gracias a sus lipasas, mientras S .aureus se encuentra
habitualmente a nivel de la nasofaringe y de zonas húmedas como pliegues
inguinales y axilas.
Se estima que el índice de portación nasal en los adultos es de alrededor del 20-
30%. Expresado longitudinalmente, cerca del 30% de la población puede ser
portador permanente, el 50% portador intermitente y el 20% no es colonizado.
Algunas poblaciones pueden tener una tasa de colonización mayor como el
personal de salud, los pacientes en hemodiálisis, diabéticos, adictos a drogas
intravenosas, etc. A pesar que S. aureus posee numerosos factores de virulencia,
puede convivir con el huésped humano formando parte de su flora normal sin
causar ningún daño. Existen ocasiones en que este equilibrio se puede romper.
Desde las narinas, los portadores pueden transferir bacterias a diferentes sectores
de la piel, aunque habitualmente existe resistencia a la colonización de la piel
intacta
Morfología microscópica
Se trata de cocos Gram positivos que poseen tendencia a agruparse en racimos.

Tienen una forma esférica y un diámetro de alrededor de una micra.
Morfología macroscópica
Para apreciarla debemos contar con un aislamiento de la cepa a estudiar en una

placa de Petri. El aislamiento nos permitirá observar las características de las
colonias. En medios no selectivos, S. aureus presenta colonias de 1 a 3 mm de
diámetro, lisas, levemente elevadas, de bordes enteros, levemente convexas y
generalmente pigmentadas con un color que puede ir desde el crema al amarillo.
La producción de pigmento se ve favorecida si se incuban los cultivos por 24 a 48

horas adicionales a temperatura ambiente.
Metabolismo
En cuanto a su forma de obtener energía es tanto a través de la fermentación

como de la respiración. En cuanto a los requerimientos de cultivo, son no
exigentes desde el punto de vista nutricional, creciendo en medios pobres y
simples. En su relación con el oxígeno son aerobios-anaerobios facultativos.
Resistencia a agentes físicos y químicos
Es muy resistente a las condiciones ambientales normales. Es capaz de sobrevivir

hasta tres meses en un cultivo a temperatura ambiente. Muere expuesto a
temperaturas mayores de 60 °C por una hora. En cuanto a los agentes químicos,
es sensible a la mayoría de los desinfectantes y antisépticos, que lo matan en
pocos minutos.
Resistencia antibiótica
S. aureus puede poseer resistencia para diferentes antimicrobianos. En general

los estafilococos aislados de infecciones comunitarias, hasta hace poco tiempo, no
poseían muchos genes de resistencia salvo por la producción de penicilinasa. Sin
embargo, actualmente asistimos a la emergencia de cepas comunitarias
resistentes a meticilina u oxacilina (ver más adelante). En cuanto a los
aislamientos de origen nosocomial, un elevado porcentaje de los mismos tienen
varios determinantes de resistencia y fundamentalmente resistencia a meticilina,
asociada a resistencia a aminoglucósidos, macrólidos y quinolonas.
Medios de cultivo comunes donde crece Staphylococcus sp.
1. Agar sangre
2. Agar chocolate.
3. Agares nutritivos: como BHI(Brain, Heart, Infusión), AST( Agar Soya
Tripticasa), Agar nutritivo, etc.
4. Agar Sales y Manitol.
5. Agar Baird-Parker.
6. Agar sangre con ácido nalidixico.
Disposición final y tratamiento de residuos
Los residuos son tratados con cuidado teniendo las precauciones de usar
cubrebocas, guardapelo, etc. al final de la práctica se esterilizo el material utilizado
para evitar la propagación del microrganismo.
Referencias electrónicas
https://microbiologyinfo.com/biochemical-test-and-identification-of-staphylococcus-
aureus/
http://edicionmicro.usal.es/web/identificacion/AyudaPruebas.html https://
docplayer.es/76846033-Carpeta-de-mesa-area-microbiologia.html
https://www.uv.mx/personal/sbonilla/files/2011/06/Staphylococcus-aureus.pdf
http://depa.fquim.unam.mx/amyd/archivero/
patogNOMStaphylococcusaureus_17365.pdf
LISTA DE COTEJO PARA EL REPORTE DE LA PRÁCTICA DE

LABORATORIO
El reporte es un recuento breve de las actividades realizadas en la práctica, identificando los pasos
del método científico que se hayan aplicado, incluyendo los resultados y las conclusiones, junto con
las respuestas a las preguntas que se hayan planteado
Competencias Estándares Sí No Observaciones
1) Empleo adecuado del material de vidrio
2) Empleo adecuado del instrumental

electrónico o mecánico
Científico
3) Utilizó la ropa de trabajo
Técnicas
adecuadamente.
4) Cuidado y limpieza del instrumental
Metodológicas 5) Sigue las indicaciones del docente al

respecto del manejo de algunos productos
peligrosos o delicados.
6) Secuencia lógica de los pasos a seguir
7) Capacidad de análisis e interpretación

de resultados
8) Correcta expresión, redacción y

ortografía; elaboración de un informe final
conforme a los pasos del método
científico; cuestionario contestado
correctamente.
9) Empleo de vocabulario técnico

adecuado
10) Cumplimiento de la tarea en el tiempo

asignado
11) Consulta sus dudas de forma clara y

concisa
12) Mantenimiento del orden en el lugar

de trabajo
13) Comunicación con los integrantes del

Sociales
grupo de trabajo
14)Respeto por las normas de seguridad e

higiene

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“DETERMINACIÓN DEL MICROORGANISMO”

LUN. 13:00 PM-16:00 PM

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“DETERMINACIÓN DEL MICROORGANISMO”

Una de la tareas fundamentales del laboratorio de microbiología es la aplicación

Actualmente, la identificación bacteriana se realiza por medio de métodos

Los esquemas tradicionales de identificación fenotípica bacteriana se basan en las

En el cultivo es esencial la correcta elección del medio de crecimiento y las

La identificación fenotípica bacteriana se basa fundamentalmente en la

En el proceso de identificación bacteriana tradicional se establecen tres niveles de

a) Todas las características fenotípicas conocidas son importantes y hay que

Referencia a la Norma ISO

medios de cultivo, oxidasa y catalasa. Utilizando estas pocas pruebas

b) El segundo nivel de identificación debe especificar el género al que pertenece

c) Por último, la conclusión debe hacerse con la identificación a nivel de especie.

Se inoculó en una caja Petri con agar nutritivo un microorganismo desconocido

Referencia a la Norma ISO

5. DETERMINACIONES REALIZADAS AL PROBLEMA DE MICROORGANISMO

Se denomina frotis a la extensión que se realiza sobre un portaobjetos

Observaciones: Se observaron microorganismos

Referencia a la Norma ISO

Observaciones: Se puede seguir observando

5.2 TINCION DE GRAM

La tinción de Gram es un tipo de tinción que se realiza sobre las

Referencia a la Norma ISO

La tinción de Gram es la más importante de las

Observaciones: Se puede observar que presenta

5.3 PRUEBA DE AZÚCARES

Las bacterias anaerobias o anaerobicas facultativas a menudo

Se inocula la bacteria en un medio conteniendo una pequeña cantidad

Referencia a la Norma ISO

Fructuosa: Es un tipo de glúcido encontrado en

Observaciones: Hay presencia de ácidos

Maltosa: (O Azúcar de malta) Es

Observaciones: No se presenta la producción de

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Dextrosa: Con fórmula molecular C₆H₁₂O₆. Es una

Observaciones: Sin presencia de gas en la

Sacarosa: Azúcar común o azúcar de mesa es un

Observaciones: Hay presencia de ácidos

Test utilizado en microbiología para reconocer bacterias. Se compone de cuatro

Referencia a la Norma ISO

Consiste en cultivar la especie en estudio en un caldo rico en triptófano; después

Rojo de metilo (M)

El rojo de metilo es un indicador de pH. (Fórmula: C15H15N3O2). Actúa entre pH

Permite determinar la formación de acetil metil carbinol, el que es un producto

Sirve para determinar si un microorganismo puede crecer utilizando citrato como

Referencia a la Norma ISO

Indol: Uno de los test del IMVIC utilizado para

Observaciones: Muestra la formación de un anillo

Rojo de metilo: Detecta la fermentación ácido-

Observaciones: Formación de un anillo color

Referencia a la Norma ISO

Citrato: Es uno de los test del IMVIC usado para

El citrato es la única fuente de carbono y se realiza

Observaciones: Arrojó un resultado negativo, debido a