Tema 17 Reacciones multisustrato

Reacciones enzimáticas con dos sustratos

1. Introducción
2. Nomenclatura
3. Reacción enzimáticas con 2 sustratos y 2 productos.
4. Cálculo de la ecuación de velocidad de reacción:
Ecuaciones con dos substratos

4.1. Mecanismo Secuencial Bi Bi al azar.

4.2. Mecanismo Secuencial Bi Bi ordenado.
4.3.Mecanismo Bi BiPing-Pong
 1.Introducción
Hasta ahora hemos estudiado casos sencillos de transformación
enzimática de un sustrato en un único producto.

S + E <==> ES <==> EP <==> E + P

Sin embargo, en los sistemas biológicos, son casos excepcionales,
restringidos a reacciones de isomerización.

Las reacciones enzimáticas que implican a más de un sustrato,

transformándolos en varios productos son las más frecuentes.

A+BP+Q
- Por ejemplo:

- Y, a modo de ejemplo, podríamos citar las siguientes enzimas:

 Adenilato ciclasa
Citrato sintasa
Alcohol-DH
Malato-DH
Ribitol-DH
Lactato-DH
Coenzima-A transferasa
Glutamato-alanina transaminasa
Glucosa oxidasa etc. ....

v  V `max
S
K `S 
Estudio cinético:
A) Velocidad inicial
B) Depender la velocidad de la reacción de uno solo de los
reactantes (Resto saturación).
Reacción orden cero con respecto todos los substratos menos uno
 2. Nomenclatura
a) En cuanto al número de sustratos y productos:
Reacción Nombre
A -----> P Uni-Uni
A + B -----> P Bi-Uni
A + B -----> P + Q Bi-Bi
A + B + C -----> P + Q Ter-Bi
b) En cuanto al orden en que entran los sustratos y salen los
productos:
* Reacciones secuenciales:
- al azar
- ordenadas
* Reacciones de desplazamiento:
- Ping-Pong
 El trabajar con reacciones multisustrato, puede llegar a ser
bastante complicado a la hora de representar los esquemas de
las reacciones
A lo largo de la Historia se han propuesto varios sistemas, pero el
que más éxito ha tenido ha sido el propuesto por Cleland.

De acuerdo con la simbología de Cleland, el progreso de la

reacción se simboliza por una línea horizontal.

La entrada de sustratos y la salida de productos se representan

por flechas verticales que indican la dirección de entrada o
salida de la reacción.

- Para afianzar estos conceptos, veamos algunos ejemplos

concretos de reacciones en las que intervienen 2 sustratos
y se forman 2 productos:
 A B P Q

E EA EAB EPQ EQ E
Secuencial: Bi-Bi ordenada

A P B Q

E EA E EB E

Desplazamiento: Uni-Uni-Uni-Uni Ping-Pong

¿Se atreve a nombrar los siguientes mecanismos?

a) A B C P Q

E E

b) A B P C Q R

E E

c) A P B Q C R

E E
3. Reacciones enzimáticas de dos sustratos y dos productos

Reacciones bisustrato, del tipo Bi-Bi:

A + B --- P + Q

-Mecanismos secuenciales
- al azar
- ordenadas

- Mecanismo ping-pong o de doble desplazamiento

 A) Mecanismos secuenciales,
Los dos sustratos se unen al centro activo antes de que se
libere cualquiera de los productos. Es decir el complejo
ternario EAB o EBA debe formarse como requisito
indispensable antes de que se produzca la formación de
productos.
La formación del complejo ternario es independiente del
orden de unión de los sustratos.
Este tipo de reacciónes se denominan 
reacciones secuenciales al azar,

La formación del complejo ternario debe producirse en un

orden determinado para que el complejo sea productivo
desde el punto de vista catalítico.
Este tipo de reacción se denomina 
reacciones secuenciales ordenadas).
Analicemos, desde el punto de vista esquemático, estos dos tipos
de reacciones secuenciales.

Hagámoslo primero de acuerdo con un esquema clásico:

Bi-Bi al azar

EQ <=> E + Q
E + A <=> EA B P

EAB <=> EPQ

E + B <=> EB
A Q
EP <=> E + P
Bi-Bi ordenado

E + A <==> EA + B <==> EAB <=> EPQ <==> EQ + P <==> E + Q

Utilicemos ahora la simbología o nomenclatura de Cleland:
Bi-Bi al azar

A B P Q
EA EQ
E EAB EPQ E
EB EBA EQP EP

B A Q P

Bi-Bi ordenada

A B P Q

E EA EAB EPQ EQ E
 - Un caso especial, es el siguiente:

A B P Q

E EA EQ E

- Este mecanismo se conoce como “Mecanismo de Theorell-Chance”, y en realidad es

un mecanismo Bi-Bi ordenado, para el que no existe el complejo ternario EAB ni
EPQ

La alcohol deshidrogenasa es una metaloenzima tetrámeroque contiene zinc en el

centro activo y que cataliza la oxidación de etanol) por el coenzima
nicotinamina adenina dinuclótido (NAD+) produciendo NADH y acetaldehido
 B) Mecanismo “ping-pong” o de doble desplazamiento

En este tipo de mecanismo, tras la unión del primer sustrato se

libera uno de los productos, en una reacción parcial en la que se
genera una forma modificada de la enzima.
(acil enzimas, fosforil enzimas)

Esta forma une al siguiente sustrato, catalizando la formación del

segundo producto con regeneración de la forma nativa de la
enzima.

E + A <=> EA <=> E + P +B <=> EB <=>EQ <==> E + Q

- Este tipo de mecanismo es muy común en las reacciones en las

que un grupo químico se transfiere desde el sustrato A al B, es
decir en reacciones de transferencias.
* Utilizando la simbología de Cleland, en el caso de reacciones
Ping-Pong, tenemos:

A P B Q

E EA E EB E

Uni-Uni-Uni-Uni Ping-Pong,
o tetra-Uni Ping Pong
¿De acuerdo con la nomenclatura de Cleland, cómo nombraría la
siguiente reacción?
Succinil-CoA

Succinato
HSCoA

GDP

GTP
Pi
Succinil-E E-P
E E
 4. Cálculo de la ecuación de velocidad de reacción:
Ecuaciones con dos substratos
Las condiciones de partida para derivar la ecuación de velocidad con dos o
más sustratos son las mismas que hemos utilizados para la derivación de la
ecuación de velocidad en un sistema sencillo: S --> P

a) Supondremos la formación de un equilibrio rápido:

entre la E y los S
b) La ec. de conservación nos dice que (Eo) = al sumatorio de
todas las especies químicas en las que pueda encontrarse la

(Eo) = (EXi)
enzima:

c) Supondremos la existencia de condiciones de estado

estacionario
 4.1 Mecanismo Secuencial Bi Bi al azar.
A B A+B P +Q

KA EA KMAB v = kcat [EAB=EBA]

E EAB kcat
E + P+ Q
EB EBA
KB
KMBA

E A E B 
B A

KA  KB 
EA EB  
KA KM BA

EAB  EB B 

AB
KB KM
KM  KM 
EAB  EBA
AB BA

ET   E   EA  EB   EAB 

KM
es la concentración de Substrato
en el cual v=1/2 Vmax cuando
el otro substrato está saturante
 EAB 
EAB

A B
KM AB

EAB 
KA KMAB

EAB 
EA kcat
E EAB

 AB
E + P+ Q

EAB [ E ] AB
KM AB EB EBA
KB

ET  E  EA EB EAB

KMBA
KM KA

ET  E  E A E B [ E ] AABB

v = kcat [EAB]
KA KB KM KA v  kcatE 
AB

AB
KAKM AB

v  kcatET 
KAKM AB
  A KM  BKM
AB BA
 AB
Ecuación de velocidad para un mecanismo secuencial al azar
v  kcatET 
AB
KAKM AB   A KM  BKM
AB BA
 AB
Vmax = kcat [ET] Concentraciones saturante de A y B

ECUACIÓN DE VELOCIDAD PARA

Mecanismo Secuencial Bi Bi al azar

v  V max
AB
KAKM AB
  A KM  BKM
AB BA
 AB
 AB
Un substrato constante pero no saturante Constante [A]

v  V max
  A KM  BKM  AB

B
AB AB BA
KAKM

v  V ´max
K´B
V max A
V ´max  Ver anexo 1
KM BA   A
KM AB  KA   A 
K ´
KM BA   A
 Constante [B]

AB
Igual se hace para [B] constante pero no saturante

v  V max
  A KM  BKM  AB

 A
AB AB BA
KAKM

v  V ´max
K´A
V max B 
V ´max 
KM AB   B 
KM BA  KB   B  
K ´
KM AB   B 
Representación gráfica: Obtención de las constantes cinéticas
[A] cte Vmax Vmax [B] cte
B
V`max V`max
v  V ´max
K´B v  V ´max
A
K´A
KMBA KMAB

V max A V max B

V ´max 
[A] [B]
KM BA   A V ´max 
KM AB   B 
KMAB KMBA
K` K`
[A] =0 KB KA

[A]
KM AB  KA   A 
[B]
KM BA  KB   B  
K ´ 
K ´
KM BA  

A KM AB 
 

B 
Análisis de la ecuación: Un substrato constante y saturante

[B] se hace muy grande, -->  , condición de saturación

v  V max
AB
KAKM AB   A KM  BKM
AB BA
 AB
V max B  V max B 
V ´max  V ´max   
 V max
KM BA   B 
[B] Muy  B 

KM AB   A 

KA  A
grande
   K ´  KM AB
K ´
    
A

AB
KM 

KM BA   A

v  V max
A
KM AB  A
Comportamiento queda reducido a las expresiones de Michalis-Menten
Análisis de la ecuación: Un substrato constante y saturante

[A] se hace muy grande, -->  , condición de saturación

v  V max
AB
KAKM AB   A KM  BKM
AB BA
 AB
V max A V max A
V ´max  [A] Muy V ´max   V max
KM BA   A
 
 A
grande
KM AB  KA   B  
KM BA   B  
K ´  KM BA
K ´

 B 
KM BA   B 

v  V max
B
KM BA  B
Comportamiento queda reducido a las expresiones de Michalis-Menten
 4.2. Mecanismo secuencial Bi-Bi ordenado

E  A  EA  B  EAB  E  P  Q
KA KmAB kcat

V=kcat[EAB]
E A
 AB
v  kcatET 
KA 
EA
KAKM   A KM  AB
v

EAB 
AB AB

Km 
EAB 
AB

E   E   EA  EAB 
AB
T

v  V max
KAKM  A KM  AB
AB 



AB
 v  V max
AB
KAKM AB   A KM AB  AB
Constante B

V max B  A
V `max  v  V `max
KM AB   B  K `A

K `
KAKM AB Determinar K`y V`max a diferentes concentraciones de B
KM AB   B 

Vmax Regresión No-linear

V`max
Vmax
KMAB

[B]
K` KA

[B]
 v  V max
AB
Constante A KAKM   A KM AB  AB

V `max  V max B

AB

v  V `max
K `B
K `  KM AB
KAKM AB
Pendiente es igual:
A KA KAB
K`
KMAB

[A]
ORDEN DE UNÓN DE SUBSTRATOS EN UN MECANISMO
BIBI ORDENADO:
Cálculo de la Velocidad máxima haciendo constante un substrato:
Una relación de substrato concentración idependiente frente a valor
de Vmax indica que es el primer substrato que se une a la enzima
 4.3. Mecanismo Bi Bi Ping-Pong
No hay complejo ternario

k1 k2 k3 k4
E +A EA P + E* + B E*B E+
Q k -1 k-3

KMA KMB

O con la nomenclatura de Cleland:

A P B Q

E EA E* E*B E

- Consideraremos velocidades iniciales unidireccionales.

 k1 k2 k3 k4
E +A EA P + E* + B E*B E+Q
k -1 k-3
KMA KMB

kcat  k 4
La velocidad de reacción es la descomposición del complejo EB

v = k4 [E*B]

k  1  k 2 E A
Las constantes de Michaelis y el balance de masas en el estado estacionario

K  
EA
A

k  3  k 4 E *B 
M
k1

KM  
E´B
B

ET   E   EA  E *  E * B
k3
 Despejando [E*B]de las ecuaciones anteriores

ECUACIÓN DE VELOCIDAD EN MECANISMO

V max AB
BI BI PING PONG

v
  K M B  K M A  AB1  
 k4  A  k4 
 k2   k2 
B

V max AB
kcat  k 4
k 2  k 4
Paso limitante

v

k4 K M B  K M A  AB
A B

k2
 v  V max
AB
Constante B 
B   KM BA  A  AB

 A


V max B 
AB
KM

V `max  v  V `max
K `A
KM B   B 
KM  B 
K `
A

Determinar K`y V`max a diferentes concentraciones de B


KM B


B 

Vmax Regresión No-linear

V`max
Vmax
KMB KMB

[B]
K` KMA

KMB

[B]
 v  V max
AB
Constante A B   KM BA  A  AB

V max A


AB
KM

V `max 
KM A  A
v  V `max
 A
K `
KM B A K `A
KM A  A
Regresión No-linear
Vmax
V`max Vmax

KMA
KMA

[B]
KMB
K`
KMA
 DIFERENCIACIÓN MECANISMOS
Al azar

K` Ping-Pong

Ordenada

[B]
Al azar

K` Ping-Pong

Ordenada

[A]
Mecanismo Enzima

Bi-Bi al azar Adenilato quinasa (EC 2.2.4.3)

Creatin quinasa (EC 2.7.3.2)
Citrato sintasa (EC 4.1.3.7)
Bi-Bi ordenado Alcohol deshidrogenasa (EC 1.1.1.1)
Malato deshidrogenasa (EC 1.1.1.37)
Ribitol deshidrogenasa (EC 1.1.1.56)
Lactato deshidrogenasa (EC1.1.1.27)
Bi-Bi Ping Pong Coenzima-A transferasa (EC 2.7.8.7)
Glutamato-alanina transaminasa (EC 2.6.1.2)
Glucosa oxidasa (EC 1.1.3.4)
 Inhibición por productos
Diferentes tipos de inhibición por producto en las reacciones
que transcurren con dos substratos y dos productos
A + B --- P + Q
Mecanismo Inhibidor Substrato Substrato
A B
(B saturante) (A saturante)

Bi-Bi ordenado P Acompetitiva No competiva

Q Competitiva ------------------

Ping Pong P Competitiva ------------------

Q ----------------- Competitiva

Bi-Bi al azar P No competitiva No competitiva

Q No Competitiva No competitiva
 RESUMEN
Los conceptos utilizados para la obtención de datos cinéticos en reacciones monosubstratos
,son útiles para el estudio de las reacciones más complejas, con más de un substrato y más
de un producto de reacción, si se hace depender la reacción de un solo reactante y los
demás permanecen a concentraciones saturantes, es decir, la reacción será de orden cero
con respecto a todos los reactantes menos uno.

En el caso de reacciones bisustratos puede distinguirse si la reacción tiene lugar mediante

un complejo ternario, o si el enzima queda modificado al reaccionar con el primer substrato
(mecanismo Ping Pong). En el caso de formación de un complejo ternario puede obtnerse
al azar (mecanismo BiBi al azar) o de manera ordenada (mecanismo Bi-Bi ordenado).

Se han deducido la s ecuaciones de velocidad y la forma de obtener las constantes

cinéticas que describen el proceso enzimático.

La inhibición por los productos P y Q puede servir para discriminar mecanismos

probables de reacción.

En general la información cinética puede ayudarnos para comprender propiedades

locales de las enzimas, necesarias parea entender el control de la actividad enzimática y
el papel de una enzima en el proceso de metabolismo celular.
 AB
Anexo 1 A constante

v  V max
KAKM AB   A KM  BKM
AB BA
 AB

v  V max
AB
KAKM   A KM  B KM  AB 
B
AB AB BA
Se divide

KM  A KAKM   A KM  B KM  AB 

v
V max

KM  A
BA AB AB BA

V max A
B
BA

V ´max 
KM  A KAKM   A KM  ( KM  A)B 
v KM BA   A
V max

KM  A
KM AB  KA   A 
BA AB AB BA

K ´
B
B
KM BA   A
BA

v
KM  A KAKM   A KM
V max

 B 
v  V ´max
KM  A

K´B
BA AB AB

B
BA

v
KM  A KM ( KA   A )
V max

 B 
KM  A
BA AB

BA
 PROBLEMAS.

1. Una enzima cataliza la siguiente reacción de la forma

AX +B Bx + A
Fue investigada a temperatura, pH y concentración de enzima constante
dejando constante la concentración de B, y variando la concentración de
substrato AX. Los resultados obtenidos.

INICIAL [AX] [B]=2.0mM 4.0 mM 6.0 mM

2.0 250 286 300
2.5 278 323 341
3.3 313 371 395
5.0 357 435 469
10.0 417 526 577

¿Qué tipo de mecanismo cursa esta reacción bisustrato?