Bactofilin-mediated organization of the ParABS chromosome segregation system in

Myxococcus xanthus

Organización mediada por bactofilina del sistema de segregación cromosómica

ParABS en Myxococcus xanthus
El artículo describe cómo las proteínas bactofilinas BacNOP en la bacteria Myxococcus xanthus se
ensamblan en estructuras de andamiaje alargadas que limitan la maquinaria de segregación
cromosómica ParABS a las regiones subpolares de la célula. Se muestra que la proteína ParB se asocia
con los extremos polo-distales de estas estructuras, mientras que la proteína ParA se une a lo largo de
toda su longitud utilizando la proteína PadC como adaptador. Se concluye que las bactofilinas median
un mecanismo previamente desconocido de organización subcelular que recluta proteínas a sitios
definidos dentro del citoplasma, lo que es crítico para la morfología adecuada del nucleoide y la
segregación cromosómica en la bacteria.

Aquí se presentan las principales ideas del artículo:

1. La segregación del cromosoma bacteriano es un proceso fundamental para la reproducción

celular y la supervivencia de la célula. El sistema de segregación ParABS es un mecanismo
ampliamente conservado en bacterias que ayuda a asegurar la distribución correcta del material
genético durante la división celular.
2. En Myxococcus xanthus, la proteína Bactofilin es esencial para la formación de una estructura
específica del cromosoma llamada ParB1-DNA que es necesaria para la segregación del
cromosoma.
3. Bactofilin interactúa directamente con ParB1, la proteína que se une al ADN y es necesaria para
la formación del complejo ParB1-DNA. Esta interacción promueve la formación de estructuras
filamentosas de Bactofilin que actúan como andamios para la organización del cromosoma.
4. Los experimentos realizados en este estudio muestran que las mutaciones en bactofilin afectan
la formación de la estructura del cromosoma ParB1-DNA, lo que resulta en defectos en la
segregación cromosómica y la viabilidad celular.

En resumen, este artículo describe cómo la proteína Bactofilin ayuda a organizar el sistema de
segregación cromosómica ParABS en Myxococcus xanthus y destaca la importancia de esta proteína
para la supervivencia y reproducción celular en esta bacteria.
ABSTRACT

In bacteria, homologs of actin, tubulin, and En las bacterias, los homólogos de las proteínas
intermediate filament proteins often act in de actina, tubulina y filamentos intermedios
concert with bacteria-specific scaffolding actúan a menudo en concierto con proteínas de
proteins to ensure the proper arrangement of andamiaje específicas de bacterias para
cellular components. Among the garantizar la correcta disposición de los
bacteria-specific factors are the bactofilins, a componentes celulares. Entre los factores
widespread family of polymer-forming proteins específicos de las bacterias se encuentran las
whose biology is poorly investigated. Here, we bactofilinas, una amplia familia de proteínas
study the three bactofilins BacNOP in the formadoras de polímeros cuya biología está poco
rod-shaped bacterium Myxococcus xanthus. We estudiada. Aquí estudiamos las tres bactofilinas
show that BacNOP co-assemble into elongated BacNOP en la bacteria con forma de bastón
scaffolds that restrain the ParABS chromosome Myxococcus xanthus. Demostramos que las
segregation machinery to the subpolar regions of BacNOP se coensamblan en andamiajes
the cell. The centromere (parS)-binding protein alargados que restringen la maquinaria de
ParB associates with the pole-distal ends of these segregación cromosómica ParABS a las regiones
structures, whereas the DNA partitioning ATPase subpolares de la célula. La proteína de unión al
ParA binds along their entire length, using the centrómero (parS) ParB se asocia con los
newly identified protein PadC (MXAN_4634) as extremos polo-distal de estas estructuras,
an adapter. The integrity of these complexes is mientras que la ATPasa de partición del ADN
critical for proper nucleoid morphology and ParA se une a lo largo de toda su longitud,
chromosome segregation. BacNOP thus mediate utilizando la proteína PadC (MXAN_4634)
a previously unknown mechanism of subcellular recientemente identificada como adaptador. La
organization that recruits proteins to defined sites integridad de estos complejos es crítica para la
within the cytoplasm, far off the cell poles. correcta morfología de los nucleoides y la
segregación cromosómica. Así pues, las BacNOP
median en un mecanismo de organización
subcelular desconocido hasta ahora que recluta
proteínas en lugares definidos del citoplasma,
lejos de los polos celulares.

INTRODUCTION

The function of cells critically depends on the La función de las células depende en gran
proper spatiotemporal organization of their medida de la correcta organización
components. In particular, many proteins need to espaciotemporal de sus componentes. En
be targeted to distinct subcellular positions to concreto, muchas proteínas deben dirigirse a
perform localized activities in vital processes distintas posiciones subcelulares para realizar
such as DNA segregation, cell division, cell actividades localizadas en procesos vitales como
polarity, or cell growth. Eukaryotic cells often la segregación del ADN, la división celular, la
sort proteins into membrane-bounded organelles polaridad celular o el crecimiento celular. Las
to confine their distribution and establish células eucariotas suelen clasificar las proteínas
compartments with specialized functions. en orgánulos delimitados por membranas para
Bacteria, by contrast, usually lack this confinar su distribución y establecer
compartmentalization mechanism. Nevertheless, compartimentos con funciones especializadas.
they have evolved strategies to organize their Las bacterias, por el contrario, suelen carecer de
cytoplasm into functionally distinct domains, este mecanismo de compartimentación. Sin
whose maintenance is essential for survival and embargo, han desarrollado estrategias para
fitness. organizar su citoplasma en dominios
funcionalmente distintos, cuyo mantenimiento es
esencial para la supervivencia y el buen estado
físico.

In rod-shaped bacteria, specialized subcellular En las bacterias con forma de bastón, los
domains are In rod-shaped bacteria, specialized dominios subcelulares especializados se En las
subcellular domains are most commonly bacterias con forma de bastón, los dominios
established at the cell poles. Interestingly, the subcelulares especializados se establecen con
molecular landmarks guiding the formation of mayor frecuencia en los polos celulares.
polar domains vary significantly among different Curiosamente, los hitos moleculares que guían la
bacterial lineages. Among the best-studied formación de los dominios polares varían
determinants are the scaffolding proteins DivIVA significativamente entre los distintos linajes
and PopZ. DivIVA is a coiled-coil protein that is bacterianos. Entre los determinantes mejor
highly conserved among Gram-positive bacteria. estudiados se encuentran las proteínas de
It assembles into lattice-like oligomeric andamiaje DivIVA y PopZ. DivIVA es una
structures in vitro7 and specifically associates proteína en espiral muy conservada entre las
with negatively curved membranes at the cell bacterias Gram positivas. Se ensambla in vitro en
poles and division septa. Depending on the estructuras oligoméricas similares a celosías y se
species, these assemblies interact, directly or asocia específicamente con membranas de
indirectly, with different proteins to regulate cell curvatura negativa en los polos celulares y los
division, chromosome segregation, and/or cell septos de división. Dependiendo de la especie,
wall biogenesis. PopZ, on the other hand, is estos ensamblajes interactúan, directa o
limited to Gram negative alphaproteobacteria. Its indirectamente, con diferentes proteínas para
homolog from Caulobacter crescentus was regular la división celular, la segregación
shown to form branched oligomers in vitro and cromosómica y/o la biogénesis de la pared
to self-assemble into a dense matrix that is celular. PopZ, en cambio, se limita a las
associated with the cell poles. Apart from alfaproteobacterias Gram negativas. Se ha
mediating the polar localization of signaling demostrado que su homóloga de Caulobacter
proteins involved in cell cycle regulation, PopZ crescentus forma oligómeros ramificados in vitro
also plays a central role in chromosome y se autoensambla en una matriz densa asociada
segregation by controlling the localization and a los polos celulares. Además de mediar en la
dynamics of the chromosome segregation localización polar de proteínas de señalización
machinery. implicadas en la regulación del ciclo celular,
PopZ también desempeña un papel central en la
segregación cromosómica al controlar la
localización y la dinámica de la maquinaria de
segregación cromosómica.

Both PopZ and, in part, DivIVA affect Tanto PopZ como, en parte, DivIVA afectan a la
chromosome segregation by interacting with the segregación cromosómica al interactuar con el
ParABS DNA partitioning system, a highly sistema de partición de ADN ParABS, un
conserved module that mediates segregation of módulo altamente conservado que media en la
the chromosomal replication origin regions in a segregación de las regiones de origen de
wide variety of bacteria. ParB is a DNA-binding replicación cromosómica en una amplia variedad
protein that recognizes conserved sequence de bacterias. ParB es una proteína de unión al
(parS) motifs clustered within the origin region. ADN que reconoce motivos de secuencia
In new-born C. crescentus cells, a single conservada (parS) agrupados en la región de
ParB-ParS complex is tethered to a large origen. En las células recién nacidas de C.
assembly of PopZ that is associated with the old crescentus, un único complejo ParB-ParS está
cell pole. At the onset of S-phase, the origin unido a un gran ensamblaje de PopZ que está
region is released and duplicated. Its two copies asociado al polo antiguo de la célula. Al inicio de
immediately re-associate with ParB and then la fase S, la región de origen se libera y se
move apart, with one of them reconnecting to duplica. Sus dos copias se reasocian
PopZ at the old pole and one traversing the cell inmediatamente con ParB y luego se separan,
and attaching to a newly formed PopZ matrix at una de ellas se vuelve a conectar a PopZ en el
the opposite (new) cell pole. Origin movement is polo antiguo y la otra atraviesa la célula y se une
directed by ParA, a Walker-type ATPase that acts a una matriz PopZ recién formada en el polo
as a nucleotide-dependent molecular switch celular opuesto (nuevo). El movimiento del
cycling between an ATP-bound, dimeric and an origen está dirigido por ParA, una ATPasa de
ADP-bound, monomeric state. ParA dimers bind tipo Walker que actúa como un interruptor
non-specifically to the nucleoid and, in addition, molecular dependiente de nucleótidos que alterna
interact with the ParB-ParS complexes, thereby entre un estado dimérico unido a ATP y un
tethering them to the nucleoid surface. ParB, in estado monomérico unido a ADP. Los dímeros
turn, stimulates the ATPase activity of interacting de ParA se unen de forma inespecífica al
ParA dimers, inducing their disassembly. As a nucleoide y, además, interactúan con los
consequence, the ParB-ParS complex is loosened complejos ParB-ParS, fijándolos así a la
from the nucleoid and able to reconnect with superficie del nucleoide. ParB, a su vez, estimula
adjacent ParA dimers, thereby gradually moving la actividad ATPasa de los dímeros ParA que
across the nucleoid surface by a ratchet-like interactúan, induciendo su desensamblaje. Como
mechanism. Efficient translocation of the consecuencia, el complejo ParB-ParS se suelta
tethered complex was proposed to depend on the del nucleoide y puede volver a conectarse con los
elastic properties of the chromosome. Its dímeros ParA adyacentes, desplazándose
directionality is determined by a gradient in the gradualmente por la superficie del nucleoide
concentration of ParA dimers on the nucleoid mediante un mecanismo de trinquete. Se ha
that is highest in the vicinity of the new pole and propuesto que la translocación eficiente del
gradually decreases towards the moving complejo anclado depende de las propiedades
ParB-ParS complex. In C. cres centus, formation elásticas del cromosoma. Su direccionalidad está
of this gradient depends on the sequestration of determinada por un gradiente en la concentración
free ParA monomers by PopZ and the landmark de dímeros ParA en el nucleoide que es mayor en
protein TipN and, potentially, on localized las proximidades del nuevo polo y disminuye
dimerization of ParA within the polar PopZ gradualmente hacia el complejo ParB-ParS en
matrix40. movimiento. En el centus de C. cres, la
formación de este gradiente depende del
secuestro de monómeros libres de ParA por PopZ
y la proteína de referencia TipN y,
potencialmente, de la dimerización localizada de
ParA dentro de la matriz polar PopZ40.

Several years ago, an additional group of Hace varios años se identificó en las bacterias un
cytoskeletal proteins, called bactofilins, has been grupo adicional de proteínas citoesqueléticas,
identified in bacteria. Bactofilins are widespread denominadas bactofilinas. Las bactofilinas están
among both Gram-positive and Gram-negative muy extendidas entre las bacterias Gram
bacteria, with many species containing several positivas y Gram negativas, y muchas especies
paralogous copies. They possess a unique contienen varias copias paralógicas. Poseen una
β-helical structure and polymerize into polymeric estructura β-helicoidal única y polimerizan en
bundles or sheets in the absence of nucleotide haces o láminas poliméricas en ausencia de
cofactors in vitro. Previous studies suggest that cofactores nucleotídicos in vitro. Estudios
these polymers can act in various cellular previos sugieren que estos polímeros pueden
pathways. In C. crescentus, two bactofilin actuar en varias vías celulares. En C. crescentus,
paralogs assemble into a polar scaffold that dos bactofilinas paralogas se ensamblan en un
recruits a peptidoglycan synthase involved in andamiaje polar que recluta una peptidoglicano
pole morphogenesis. The human pathogen sintasa implicada en la morfogénesis de los
Helicobacter pylori, by contrast, employs a polos. El patógeno humano Helicobacter pylori,
single bactofilin to maintain its characteristic por el contrario, emplea una sola bactofilina para
helical cell shape, whereas two of these proteins mantener su característica forma celular
are required to ensure proper flagellar assembly helicoidal, mientras que en B. subtilis se
in B. subtilis. Finally, four bactofilin paralogs necesitan dos de estas proteínas para garantizar el
have been identified in Myxococcus xanthus, a correcto ensamblaje flagelar. Por último, se han
model bacterium that has been studied identificado cuatro bactofilinas paralogas en
intensively for its ability to translocate on solid Myxococcus xanthus, una bacteria modelo que se
surfaces and to aggregate into multicellular ha estudiado intensamente por su capacidad para
fruiting bodies under conditions of nutrient translocarse sobre superficies sólidas y agregarse
deprivation. One of them, BacM, is important for en cuerpos fructíferos multicelulares en
cell shape maintenance. Its paralog BacP, by condiciones de privación de nutrientes. Uno de
contrast, has been implicated in the subpolar ellos, BacM, es importante para el
localization of the Ras-like GTPase SofG, which mantenimiento de la forma celular. Su homólogo
mediates the proper sorting of two BacP, por el contrario, ha sido implicado en la
pole-associated ATPases responsible for the localización subpolar de la GTPasa tipo Ras
extension and retraction of the polar type IV pili. SofG, que media en la correcta clasificación de
dos ATPasas asociadas a polos responsables de la
extensión y retracción de los pili polares de tipo
IV.

Apart from its motility machineries, M. xanthus Aparte de sus maquinarias de motilidad, M.
has a variety of other intriguing cell biological xanthus tiene una variedad de otras
features, including a very particular organization características biológicas celulares intrigantes,
of its ParAB chromosome partitioning proteins. incluyendo una organización muy particular de
In this organism, the spatial organization and sus proteínas de partición cromosómica ParAB.
segregation dynamics of chromosomal DNA are En este organismo, la organización espacial y la
reminiscent of those in C. crescentus, with dinámica de segregación del ADN cromosómico
newborn cells containing a single, fully recuerdan a las de C. crescentus, con células
replicated chromosome whose origin and recién nacidas que contienen un único
terminus regions are oriented towards the old and cromosoma totalmente replicado cuyas regiones
new pole, respectively. However, rather than de origen y terminación están orientadas hacia el
being attached to the poles, the ParB-ParS polo antiguo y el nuevo, respectivamente. Sin
complexes localize to distinct sites within the embargo, en lugar de estar unidos a los polos, los
cytoplasm at a distance of about 1 µm from the complejos ParB-ParS se localizan en sitios
cell tips. ParA, on the other hand, forms distintos dentro del citoplasma a una distancia de
elongated subpolar patches that bridge the gap aproximadamente 1 µm de las puntas celulares.
between the adjacent pole and the ParA, por su parte, forma parches subpolares
origin-associated ParB protein. The molecular alargados que tienden un puente entre el polo
mechanism mediating this unique arrangement of adyacente y la proteína ParB asociada al origen.
the chromosome segregation machinery has so Hasta ahora se desconocía el mecanismo
far remained unknown. molecular que media en esta disposición única de
la maquinaria de segregación cromosómica.

In this work, we show that the three bactofilins In this work, we show that the three bactofilins
BacNOP of M. xanthus co-assemble into BacNOP of M. xanthus co-assemble into
extended scaffolds that stretch the subpolar extended scaffolds that stretch the subpolar
regions and serve to control the localization of regions and serve to control the localization of
both the ParB-ParS complex and ParA within the both the ParB-ParS complex and ParA within the
cell. ParB associates with the pole-distal ends of cell. ParB associates with the pole-distal ends of
these structures, whereas ParA binds along their these structures, whereas ParA binds along their
entire length, recruited by the newly identified entire length, recruited by the newly identified
adapter protein PadC. The integrity of this adapter protein PadC. The integrity of this
complex is critical for faithful chromosome complex is critical for faithful chromosome
segregation, indicating a close connection segregation, indicating a close connection
between ParAB localization and function. These between ParAB localization and function. These
findings reveal an additional role for bactofilins findings reveal an additional role for bactofilins
in the organization of M. xanthus cells. in the organization of M. xanthus cells.
Moreover, they provide evidence for a novel Moreover, they provide evidence for a novel
mechanism of subcellular organization in which mechanism of subcellular organization in which
a cytoskeletal element serves as a molecular ruler a cytoskeletal element serves as a molecular ruler
to position proteins and DNA at a defined to position proteins and DNA at a defined
distance from the cell poles. distance from the cell poles.

RESULTS

BacNOP form elongated structures at the cell Las bacNOP forman estructuras alargadas en
poles. los polos celulares.

The M. xanthus genome contains four bactofilin El genoma de M. xanthus contiene cuatro genes
genes, named bacN, bacO, bacP, and bacM, de bactofilina, denominados bacN, bacO, bacP y
respectively. Whereas bacM lies immediately bacM, respectivamente. Mientras que bacM se
downstream of the parAB operon, the bacNOP encuentra inmediatamente aguas abajo del
genes are located in a separate putative operon operón parAB, los genes bacNOP se localizan en
with two uncharacterized open reading frames un operón putativo separado con dos marcos de
(Fig. 1a). The corresponding products show the lectura abiertos no caracterizados (Fig. 1a). Los
typical architecture of bactofilins, comprising a productos correspondientes muestran la
central bactofilin (DUF583) domain that is arquitectura típica de las bactofilinas, que
flanked by short, unstructured N- and C-terminal comprende un dominio central de bactofilina
regions (Fig. 1b). Notably, BacP has a longer (DUF583) flanqueado por regiones N- y
C-terminal region than its paralogs, suggesting a C-terminales cortas y no estructuradas (Fig. 1b).
distinct functional role for this protein. En particular, BacP tiene una región C-terminal
más larga que sus paralogos, lo que sugiere un
papel funcional distinto para esta proteína.
Previous studies have shown that BacM has a Estudios previos han demostrado que BacM tiene
variable localization pattern, forming either un patrón de localización variable, formando
helical cables that extend throughout the cell or cables helicoidales que se extienden por toda la
rod-like filaments originating at the cell poles. célula o filamentos en forma de varilla que se
By contrast, BacP consistently assembles into originan en los polos celulares. Por el contrario,
extended subpolar patches at one or both ends of BacP se agrupa sistemáticamente en parches
the cell. The clustering of bacNOP suggested a subpolares extendidos en uno o ambos extremos
functional relationship between the three gene de la célula. La agrupación de bacNOP sugería
products. To test whether BacNOP co-assembled una relación funcional entre los tres productos
into a single polymeric structure in vivo, we first génicos. Para comprobar si BacNOP se
reanalyzed the localization pattern of BacP using coensamblaba en una única estructura polimérica
immunofluorescence microscopy (Fig. 1c, upper in vivo, primero volvimos a analizar el patrón de
panels). We observed that the shortest cells only localización de BacP mediante microscopía de
contained a single full-sized subpolar patch of inmunofluorescencia (Fig. 1c, paneles
1–2 µm length, whereas no or only faint superiores). Observamos que las células más
fluorescence was observed on the opposite side cortas sólo contenían una única mancha subpolar
of the cell. Longer cells displayed signals in both de tamaño completo de 1-2 µm de longitud,
subpolar regions, which tended to differ slightly mientras que en el lado opuesto de la célula no se
in dimension and intensity. Moreover, they observaba fluorescencia o ésta era muy débil.
frequently displayed an additional BacP patch at Las células más largas mostraban señales en
their center, the size of which increased with ambas regiones subpolares, que tendían a diferir
increasing cell length. Because the length of cells ligeramente en dimensión e intensidad. Además,
closely correlates with their cell cycle stage, con frecuencia mostraban una mancha BacP
these results indicate that cells are born with one adicional en su centro, cuyo tamaño aumentaba
mature and one nascent BacP patch, the latter of con la longitud de la célula. Dado que la longitud
which gradually grows to full size as the cells de las células está estrechamente relacionada con
elongate. In parallel, a new patch starts to su fase del ciclo celular, estos resultados indican
assemble at midcell, which is then split during que las células nacen con una mancha BacP
cytokinesis, explaining the asymmetric madura y otra naciente, esta última crece
distribution of BacP immediately after fission. gradualmente hasta alcanzar su tamaño completo
Analyzing the localization patterns of BacO and a medida que las células se alargan.
a BacN derivative tagged with a hemagglutinin Paralelamente, en la mitad de la célula comienza
epitope (BacN-HA), we observed very similar a formarse un nuevo parche, que se divide
localization patterns (Fig. 1c, middle and lower durante la citocinesis, lo que explica la
panels). The three proteins thus appear to occupy distribución asimétrica de BacP inmediatamente
the same subcellular sites, suggesting that they después de la fisión. Analizando los patrones de
could indeed co-assemble into a joint structure. localización de BacO y de un derivado de BacN
marcado con un epítopo de hemaglutinina
(BacN-HA), observamos patrones de
localización muy similares (Fig. 1c, paneles
central e inferior). Así pues, las tres proteínas
parecen ocupar los mismos sitios subcelulares, lo
que sugiere que podrían coensamblarse en una
estructura conjunta.

To determine whether BacP, BacO, and BacN in Para determinar si BacP, BacO y BacN se unen
fact bind to each other, we performed entre sí, realizamos análisis de colocalización en
colocalization analyses in the heterologous host el hospedador heterólogo Escherichia coli, una
Escherichia coli, a species lacking endogenous especie que carece de homólogos endógenos de
bactofilin homologs. When produced together, bactofilina. Cuando se produjeron
mCherry-BacP, CFP-BacO, and YFP-BacN conjuntamente, mCherry-BacP, CFP-BacO y
formed extended subpolar or midcell patches YFP-BacN formaron parches subpolares o
whose signals were perfectly superimposable mediocelulares extendidos cuyas señales eran
(Fig. 1d). perfectamente superponibles (Fig. 1d).

These assemblies did not colocalize with the Estos ensamblajes no se colocalizaban con la
inclusion body associated chaperone IbpA chaperona IbpA asociada a cuerpos de inclusión
(Supplementary Fig. 1a) and were permeable to (Fig. suplementaria 1a) y eran permeables a la
freely diffusible YFP (compare Supplementary YFP libremente difusible (comparar Fig.
Fig. 5a). In addition, they were able to suplementaria 5a). Además, eran capaces de
specifically recruit interacting proteins (see reclutar específicamente proteínas interactuantes
below), suggesting that they represent loose (véase más adelante), lo que sugiere que
networks of BacNOP polymers rather than representan redes sueltas de polímeros BacNOP
compact aggregates of misfolded protein. en lugar de agregados compactos de proteína mal
Additional support for a close association plegada. La observación de que era posible
between the three bactofilins came from the co-purificar BacP y BacO con BacN-HA a partir
observation that it was possible to co-purify de lisados celulares de M. xanthus usando perlas
BacP and BacO with BacN-HA from M. xanthus de afinidad anti-HA (Fig. 1e) proporcionó un
cell lysates using anti-HA affinity beads (Fig. apoyo adicional a la estrecha asociación entre las
1e). Moreover, localization studies showed that tres bactofilinas. Además, los estudios de
in M. xanthus BacP patches were fragmented and localización mostraron que en M. xanthus los
less organized in the absence of BacO. parches de BacP estaban fragmentados y menos
Conversely, BacO localization was severely organizados en ausencia de BacO. Por el
impaired in a bacP mutant, with filaments of contrario, la localización de BacO se vio
varying length projecting from only one of the gravemente afectada en un mutante de BacP, con
cell poles (Supplementary Fig. 1b). Loss of BacN filamentos de longitud variable que se
or BacM, by contrast, had no effect on the proyectaban desde uno solo de los polos
positioning of the remaining bactofilin homologs celulares (Fig. suplementaria 1b). La pérdida de
(Supplementary Fig. 1c). Immunoblot analysis BacN o BacM, por el contrario, no tuvo ningún
confirmed that BacNOP accumulated efecto sobre la localización del resto de
independently of each other (Supplementary Fig. homólogos de bactofilina (Fig. suplementaria
1d). Together, these findings strongly suggest 1c). El análisis de inmunoblot confirmó que
that the three bactofilins interact directly to form BacNOP se acumulaba de forma independiente
a single heteropolymeric scaffold, with BacP (Fig. 1d). En conjunto, estos hallazgos sugieren
constituting its core and BacO contributing to its que las tres bactofilinas interactúan directamente
positioning and integrity. BacN, by contrast, does para formar un único andamio heteropolimérico,
not seem to have a significant role in the con BacP constituyendo su núcleo y BacO
assembly process. contribuyendo a su posicionamiento e integridad.
BacN, por el contrario, no parece tener un papel
significativo en el proceso de ensamblaje.

In an attempt to study BacNOP dynamics in live En un intento de estudiar la dinámica de

cells, we replaced individual bactofilin genes in BacNOP en células vivas, sustituimos genes
M. xanthus with hybrids encoding N- or individuales de bactofilina en M. xanthus por
C-terminal fluorescent protein fusions. However, híbridos que codifican fusiones N- o C-terminal
in all cases, the products formed only a single de proteínas fluorescentes. Sin embargo, en todos
filament per cell that was detached from the cell los casos, los productos formaban un único
poles, suggesting that modification of the termini filamento por célula que se desprendía de los
interfered with the proper localization of polos celulares, lo que sugiere que la
BacNOP. Notably, however, fusion of BacN to modificación de los terminales interfería con la
the small HA affinity epitope had no effect on the localización adecuada de BacNOP. No obstante,
positioning or biological activity of the structures cabe destacar que la fusión de BacN con el
(as shown below). pequeño epítopo de afinidad HA no tuvo ningún
efecto sobre la localización o la actividad
biológica de las estructuras (como se muestra a
continuación).

BacNOP mediate the subpolar localization of BacNOP median la localización subpolar de

ParABS in M. xanthus. ParABS en M. xanthus.

In M. xanthus, ParA and ParB display unique En M. xanthus, ParA y ParB muestran patrones
localization patterns, with ParA forming de localización únicos, con ParA formando
elongated subpolar patches whose distal ends are parches subpolares alargados cuyos extremos
associated with the origin-bound ParB-ParS distales están asociados con el complejo
complex (as verified in Fig. 2a). Moreover, ParB-ParS unido al origen (como se verifica en
additional ParA patches are observed at the cell la Fig. 2a). Además, se observan parches ParA
center during later stages of the cell cycle. The adicionales en el centro celular durante etapas
striking similarity between the subcellular posteriores del ciclo celular. La sorprendente
distributions of ParA and BacNOP, together with similitud entre las distribuciones subcelulares de
the proximity of the bacM and parAB genes (Fig. ParA y BacNOP, junto con la proximidad de los
1a), raised the possibility that bactofilins were genes bacM y parAB (Fig. 1a), planteó la
functionally associated with the ParABS system. posibilidad de que las bactofilinas estuvieran
Consistent with this idea, we observed that a asociadas funcionalmente con el sistema
ParA-mCherry fusion failed to form subpolar ParABS. En consonancia con esta idea,
patches in cells lacking the whole bacNOP observamos que una fusión ParA-mCherry no
cluster or only the bacP gene (Fig. 2b). In the formaba parches subpolares en células que
bacP mutant, the typical bipolar pattern of ParA carecían de todo el clúster bacNOP o sólo del
was restored by ectopic expression of a gen bacP (Fig. 2b). En el mutante bacP, el patrón
complementing bacP copy (Supplementary Fig. bipolar típico de ParA se restauró mediante la
2a), excluding polar effects of the mutation. expresión ectópica de una copia complementaria
Deletion of bacO, on the other hand, still allowed de bacP (Fig. 2a), excluyendo los efectos polares
for the formation of sub polar ParA-mCherry de la mutación. La deleción de bacO, por otro
patches (Supplementary Fig. 2b), which however lado, todavía permitía la formación de parches
were highly irregular and reminiscent of the subpolares ParA-mCherry (Fig. suplementaria
BacP structures observed in the ΔbacO 2b), que sin embargo eran muy irregulares y
background (compare Supplementary Fig. 1b). In recordaban a las estructuras BacP observadas en
the absence of BacN, ParA localization was only el fondo ΔbacO (comparar Fig. suplementaria
slightly altered, whereas deletion of bacM had no 1b). En ausencia de BacN, la localización de
significant effect (Supplementary Fig. 2b). Based ParA sólo se vio ligeramente alterada, mientras
on these results, we conclude that bactofilins are que la deleción de bacM no tuvo ningún efecto
necessary for maintaining the proper subcellular significativo (Fig. suplementaria 2b).
arrangement of ParA, with BacP playing a Basándonos en estos resultados, concluimos que
central role in this process. las bactofilinas son necesarias para mantener la
 correcta disposición subcelular de ParA,
desempeñando BacP un papel central en este
proceso.

Next, we analyzed the positioning of ParB in A continuación, analizamos el posicionamiento

different bactofilin mutants. As previously de ParB en diferentes mutantes de bactofilina.
reported, wild-type cells generally showed one or Como se informó anteriormente, las células de
two ParB-YFP foci that were placed at a distance tipo salvaje generalmente mostraban uno o dos
of about 15–25% of the cell length from the focos ParB-YFP que se situaban a una distancia
nearest cell pole (Fig. 2c). In cases with two foci, de alrededor del 15-25% de la longitud celular
the signals were typically arranged desde el polo celular más cercano (Fig. 2c). En
symmetrically within the cell, indicating that los casos con dos focos, las señales se disponían
origin replication and segregation had finished normalmente de forma simétrica dentro de la
successfully (Fig. 2c–f). However, in the célula, lo que indicaba que la replicación y
ΔbacMNOP mutant, this highly regular pattern segregación del origen habían finalizado con
was severely disturbed, as indicated by a éxito (Fig. 2c-f). Sin embargo, en el mutante
significantly lower segregation symmetry ΔbacMNOP, este patrón altamente regular se vio
coefficient and a considerable increase in the gravemente alterado, como indica un coeficiente
distance (Dmin) of foci from the nearest cell de simetría de segregación significativamente
pole. Similar defects were observed when only menor y un aumento considerable de la distancia
bacP or bacO was deleted. Other bactofilin (Dmin) de los focos al polo celular más cercano.
single-mutants, by contrast, showed only minor Se observaron defectos similares cuando sólo se
(ΔbacN) or no (ΔbacM) changes in ParB-YFP suprimió bacP o bacO. Por el contrario, otros
localization (Fig. 2d–f). Thus, formation of mutantes únicos de bactofilina mostraron
subpolar BacNOP assemblies is critical for cambios menores (ΔbacN) o ningún cambio
proper positioning of the ParB-ParS complexes. (ΔbacM) en la localización de ParB-YFP (Fig.
2d-f). Así pues, la formación de ensamblajes
BacNOP subpolares es crítica para el correcto
posicionamiento de los complejos ParB-ParS.

The involvement of BacNOP in ParAB La implicación de BacNOP en el

positioning pointed to an interaction between posicionamiento de ParAB apuntaba a una
these proteins. Colocalization analysis revealed interacción entre estas proteínas. El análisis de
that ParB-YFP was indeed consistently detected colocalización reveló que ParB-YFP se detectaba
at the pole-distal ends of the BacNOP structures de forma consistente en los extremos polo-distal
(Supplementary Fig. 2c and d). Moreover, when de las estructuras BacNOP (Fig. suplementaria
cells were treated with the division inhibitor 2c y d). Además, cuando las células fueron
cephalexin, they formed extensive non-polar tratadas con el inhibidor de división cefalexina,
BacNOP assemblies with ParB-YFP foci formaron extensos ensamblajes BacNOP no
positioned at both of their ends (Supplementary polares con focos ParB-YFP posicionados en
Fig. 2e). These findings suggested that ParB ambos de sus extremos (Supplementary Fig. 2e).
specifically associates with the terminal regions Estos resultados sugieren que ParB se asocia
of the bactofilin structures. To further test this específicamente con las regiones terminales de
possibility, we performed pull down experiments las estructuras de bactofilina. Para comprobar
on crude cell extracts of M. xanthus wild-type aún más esta posibilidad, realizamos
cells using purified StrepII-ParB as a bait. We experimentos de pull down en extractos celulares
found that BacP was retained on affinity beads crudos de células de tipo salvaje de M. xanthus
loaded with ParB but not on control beads utilizando StrepII-ParB purificado como cebo.
lacking immobilized protein (Supplementary Fig. Descubrimos que BacP quedaba retenida en las
2f), supporting a role of BacP in ParB perlas de afinidad cargadas con ParB, pero no en
recruitment. However, subsequent in vitro las perlas de control que carecían de la proteína
analyses did not provide any evidence for a inmovilizada (Fig. suplementaria 2f), lo que
direct association between the two proteins apoya el papel de BacP en el reclutamiento de
(Supplementary Fig. 2g). Similarly, bactofilin ParB. Sin embargo, posteriores análisis in vitro
polymers did not appear to bind directly to ParA no aportaron pruebas de una asociación directa
(see below). These results implied the existence entre ambas proteínas (Fig. 2g). Del mismo
of additional, as-yet unknown factors that modo, los polímeros de bactofilina no parecían
mediate the recruitment of ParAB to the BacNOP unirse directamente a ParA (véase más adelante).
patches. Estos resultados implican la existencia de
factores adicionales, aún desconocidos, que
median en el reclutamiento de ParAB a los
parches BacNOP.

BacNOP structures interact with the novel Las estructuras de bacNOP interactúan con la
ParB-like protein PadC. nueva proteína PadC, similar a ParB.

In search of a potential adapter protein, we En busca de una posible proteína adaptadora,

turned our attention to MXAN_4634, an dirigimos nuestra atención a MXAN_4634, un
uncharacterized open reading frame located marco de lectura abierto no caracterizado situado
immediately downstream of bacNOP (Fig. 1a). inmediatamente aguas abajo de bacNOP (Fig.
Its predicted gene product features a long 1a). Su producto génico predicho presenta una
disordered N-terminal region and a C-terminal larga región N-terminal desordenada y un
segment that includes a ParB-like nuclease segmento C-terminal que incluye un dominio
(ParBC) domain (Fig. 3a). ParBC domains are ParB-like nuclease (ParBC) (Fig. 3a). Los
typically found in chromosome partitioning dominios ParBC se encuentran típicamente en
proteins of the ParB family, where they mediate proteínas de partición cromosómica de la familia
the interaction with the centromeric parS sites, ParB, donde median la interacción con los sitios
lacking nuclease activity. The clustering of parS centroméricos, careciendo de actividad
bacNOP and MXAN_4634, hereafter referred to nucleasa. La agrupación de bacNOP y
as padC (ParBC domain containing protein), is MXAN_4634, en lo sucesivo denominada padC
conserved among various members of the (ParBC domain containing protein), se conserva
Myxococcales, suggesting a functional entre varios miembros de las Myxococcales, lo
connection between these genes (Supplementary que sugiere una conexión funcional entre estos
Fig. 3). To test for a role of PadC in bac tofilin genes (Fig. suplementaria 3). Para comprobar el
function, we first determined the subcellular papel de PadC en la función bac tofilina, primero
localization of the protein. Intriguingly, in a determinamos la localización subcelular de la
merodiploid strain, PadC-mCherry showed the proteína. Curiosamente, en una cepa
same bipolar distribution as BacNOP and ParA merodiploide, PadC-mCherry mostró la misma
(Figs. 3b and c). Colocalization studies verified distribución bipolar que BacNOP y ParA (Figs.
that the signals produced by PadC-YFP and 3b y c). Los estudios de colocalización
ParA-mCherry are indeed perfectly verificaron que, efectivamente, las señales
superimposable, suggesting that PadC could be producidas por PadC-YFP y ParA-mCherry son
part of the bactofilin-ParA complex (Fig. 3d). To perfectamente superponibles, lo que sugiere que
test this possibility, we determined the PadC podría formar parte del complejo
subcellular distribution of PadC in various bactofilina-ParA (Fig. 3d). Para probar esta
bactofilin mutant backgrounds, using strains that posibilidad, determinamos la distribución
carried a padC-mCherry fusion in place of the subcelular de PadC en varios fondos mutantes de
wild-type padC gene (Fig. 3e and Supplementary bactofilina, utilizando cepas que portaban una
Fig. 4a and b). Of note, in the absence of the fusión padC-mCherry en lugar del gen padC de
wild-type protein, the fusion often formed polar tipo salvaje (Fig. 3e y Fig. suplementarias 4a y
or sub-polar foci (instead of coherent patches) b). Cabe destacar que, en ausencia de la proteína
that were localized to the ends of the bac tofilin de tipo salvaje, la fusión a menudo formaba
structures, in line with the finding that the tagged focos polares o subpolares (en lugar de parches
protein is only partially functional (see Fig. 4c–e coherentes) que se localizaban en los extremos
and below). Importantly, however, upon deletion de las estructuras de tofilina bac, en consonancia
of the whole bacNOP cluster (Supplementary con el hallazgo de que la proteína marcada es
Fig. 4a) or only the bacP gene (Fig. 3e), sólo parcialmente funcional (véase la Fig. 4c-e y
PadC-mCherry lost this localization pattern and más adelante). Sin embargo, es importante
became evenly distributed within the cell. This destacar que al eliminar todo el clúster bacNOP
effect was fully reversed by expression of a (Fig. Suplementaria 4a) o sólo el gen bacP (Fig.
complementing copy of bacP in the ΔbacP 3e), PadC-mCherry perdió este patrón de
mutant, excluding any polar effects of the localización y se distribuyó uniformemente
mutation. In the absence of bacO, PadC mCherry dentro de la célula. Este efecto se invirtió
still formed foci, which were however completamente mediante la expresión de una
mislocalized, whereas no major changes were copia complementaria de bacP en el mutante
observed in ΔbacN cells (Supplementary Fig. ΔbacP, excluyendo cualquier efecto polar de la
4b). Western blot analysis showed that mutations mutación. En ausencia de bacO, PadC mCherry
in the bacNOP genes did not affect the level of seguía formando focos, que sin embargo estaban
PadC (Supplementary Fig. 4c). These results mal localizados, mientras que en las células
suggest that PadC is recruited to the bactofilin ΔbacN no se observaron cambios importantes
patches through interaction with BacP. (Fig. suplementaria 4b). El análisis de Western
blot mostró que las mutaciones en los genes
bacNOP no afectaban al nivel de PadC (Fig.
suplementaria 4c). Estos resultados sugieren que
PadC se recluta a los parches de bactofilina a
través de la interacción con BacP.

To determine whether PadC can directly bind to Para determinar si PadC puede unirse
bactofilin complexes, we analyzed the ability of directamente a complejos de bactofilina,
PadC-YFP to associate with a complex of analizamos la capacidad de PadC-YFP para
mCherry-BacP and CFP-BacO in E. coli. A PadC asociarse a un complejo de mCherry-BacP y
YFP fusion indeed perfectly colocalized with the CFP-BacO en E. coli. En efecto, una fusión
bactofilin structures (Fig. 3f), whereas YFP alone PadC-YFP se colocalizó perfectamente con las
did not show any apparent affinity for them estructuras de bactofilina (Fig. 3f), mientras que
(Supplementary Fig. 5a). A similar result was la YFP sola no mostró ninguna afinidad aparente
obtained for a truncated variant of PadC lacking por ellas (Fig. suplementaria 5a). Un resultado
the disordered N-terminal region similar se obtuvo para una variante truncada de
(Venus-PadCΔ1-239), suggesting that PadC may be PadC que carecía de la región desordenada
recruited to the bactofilin patches through its N-terminal (Venus-PadCΔ1-239), lo que sugiere
C-terminal ParBC domain (Supplementary Fig. que PadC puede ser reclutado a los parches de
5b). This notion is supported by the finding that bactofilina a través de su dominio C-terminal
BacO and BacP can be pulled down from ParBC (Supplementary Fig. 5b). Esta noción se
whole-cell extracts of M. xanthus wild-type cells ve apoyada por el hallazgo de que BacO y BacP
using affinity beads loaded with pueden ser arrastrados desde extractos de células
hexahistidine-tagged PadCΔ1-239 (Fig. 3g). To enteras de M. xanthus wild-type usando perlas de
verify the interaction between bactofilins and afinidad cargadas con PadC marcado con
PadC, we aimed to perform in vitro binding hexahistidinaΔ1-239 (Fig. 3g). Para verificar la
studies with purified components. The above interacción entre las bactofilinas y PadC, nos
results indicated that BacP was necessary and propusimos realizar estudios de unión in vitro
sufficient to recruit PadC. However, due to its con componentes purificados. Los resultados
tendency to ​form large polymeric assemblies, the anteriores indicaron que BacP era necesaria y
full-length protein was not amenable to suficiente para reclutar a PadC. Sin embargo,
quantitative biochemical analyses. A distinctive debido a su tendencia a formar grandes
feature of BacP is its unusually long C-terminal ensamblajes poliméricos, la proteína completa no
extension (Fig. 1b). As the bactofilin domains of era susceptible de análisis bioquímicos
BacNOP are highly similar, we hypothesized that cuantitativos. Una característica distintiva de
the determinants specifically recognized by PadC BacP es su extensión C-terminal inusualmente
may be located in this unique, disordered region. larga (Fig. 1b). Dado que los dominios de
To test this idea, we purified a C-terminal bactofilina de BacNOP son muy similares,
fragment of BacP (BacPC) and analyzed it for its nuestra hipótesis era que los determinantes
binding to an N-terminally truncated variant of reconocidos específicamente por PadC podrían
PadC (PadCΔN) using bio-layer interferometry estar localizados en esta región única y
(Fig. 3h and Supplementary Fig. 5c and d). desordenada. Para probar esta idea, purificamos
Titration experiments revealed that the two un fragmento C-terminal de BacP (BacPC) y
fragments indeed interacted with high affinity analizamos su unión a una variante N-terminal
(KD = 340 nM). Collectively, these results truncada de PadC (PadCΔN) utilizando
demonstrate that PadC associates with bactofilin interferometría de biocapa (Fig. 3h y Fig.
complexes both in vivo and in vitro. suplementaria 5c y d). Los experimentos de
titulación revelaron que los dos fragmentos
interaccionaban con gran afinidad (KD = 340
nM). En conjunto, estos resultados demuestran
que PadC se asocia con complejos de bactofilina
tanto in vivo como in vitro.

PadC is required for proper ParABS PadC es necesaria para el correcto

positioning. posicionamiento de ParABS.

Having identified PadC as a new interactor of the Una vez identificado PadC como un nuevo
BacNOP complex, we explored whether this interactor del complejo BacNOP, exploramos si
protein could serve as an adapter recruiting ParA esta proteína podría servir como adaptador para
to the bactofilin patches. In support of this reclutar ParA a los parches de bactofilina. En
notion, ParA mCherry lost its typical bipolar apoyo de esta idea, ParA mCherry perdió su
distribution in a ΔpadC mutant and instead típica distribución bipolar en un mutante ΔpadC
accumulated over the nucleoids, often forming y en su lugar se acumuló sobre los nucleoides, a
distinct foci that could reflect its interaction with menudo formando focos distintos que podrían
ParB·parS complexes (Fig. 4a). This phenotype reflejar su interacción con los complejos
was reversed by expressing a complementing ParB-parS (Fig. 4a). Este fenotipo se invirtió
copy of padC, excluding any polar effects of the expresando una copia complementaria de padC,
mutation (Fig. 4a). Prompted by this finding, we excluyendo cualquier efecto polar de la mutación
further tested for a role of PadC in ParB (Fig. 4a). A raíz de este hallazgo, comprobamos
localization. Quantitative analysis of the el papel de PadC en la localización de ParB. El
positions of ParB-YFP foci in ΔpadC cells análisis cuantitativo de las posiciones de los
revealed a severe defect in the positioning of the focos de ParB-YFP en células ΔpadC reveló un
chromosomal origin region (Fig. 4b–e), similar grave defecto en el posicionamiento de la región
to that observed in the ΔbacP background de origen cromosómico (Fig. 4b-e), similar al
(compare Fig. 2e and f). Importantly, observado en el fondo ΔbacP (comparar Fig. 2e y
concomitant deletion of padC and bacNOP did f). Es importante destacar que la deleción
not produce a synthetic phenotype (Fig. 4d and concomitante de padC y bacNOP no produjo un
e). These results indicate that PadC cooperates fenotipo sintético (Fig. 4d y e). Estos resultados
with bactofilin complexes to properly localize indican que PadC coopera con complejos de
the ParABS chromosome partitioning machinery. bactofilina para localizar adecuadamente la
Of note, we observed that deletion of padC maquinaria de partición cromosómica ParABS.
appeared to affect the integrity of the bactofilin Cabe destacar que observamos que la deleción de
patches (Supplementary Fig. 5e). PadC may thus PadC parecía afectar a la integridad de los
mediate the positioning of ParB both by parches de bactofilina (Fig. suplementaria 5e).
controlling the subcellular arrangement of ParA Por tanto, PadC puede mediar en el
and by ensuring the correct assembly of posicionamiento de ParB controlando la
bactofilin patches at the two cell poles. disposición subcelular de ParA y asegurando el
correcto ensamblaje de los parches de bactofilina
en los dos polos celulares.

PadC interacts with ParA. PadC interactúa con ParA.

Because PadC was colocalized with ParA and Dado que PadC se colocaliza con ParA y es
required for the recruitment of ParA to the necesario para el reclutamiento de ParA en los
BacNOP complexes, we aimed to test for a direct complejos BacNOP, nos propusimos comprobar
interaction between the two proteins in vitro la existencia de una interacción directa entre las
(Fig. 5a). As observed for other ParA dos proteínas in vitro (Fig. 5a). Como se observó
orthologs38, ParA from M. xanthus was only para otros ortólogos de ParA38 , ParA de M.
soluble in the presence of ATP, which restricted xanthus sólo era soluble en presencia de ATP, lo
biochemical analyses to the dimeric form of the que restringió los análisis bioquímicos a la forma
protein (see also Fig. 5b). Bio-layer dimérica de la proteína (ver también Fig. 5b). El
interferometry analysis showed that PadCΔN and análisis de interferometría de biocapa mostró que
purified ParA·ATP indeed tightly binds to each PadCΔN y ParA-ATP purificada se unen
other (KD = 0.9 µM), supporting a direct role of estrechamente (KD = 0.9 µM), apoyando un
PadC in regulation of ParA localization. To papel directo de PadC en la regulación de la
further investigate the interplay between these localización de ParA. Para investigar más a
two proteins, we turned to in vivo interaction fondo la interacción entre estas dos proteínas,
studies. Interestingly, when produced recurrimos a estudios de interacción in vivo.
heterologously in E. coli, PadC-YFP associated Curiosamente, cuando se produjo
with the chromosomal DNA, leading to strong heterólogamente en E. coli, PadC-YFP se asoció
nucleoid condensation, whereas no such effect con el ADN cromosómico, provocando una
was observed upon synthesis of YFP alone (Fig. fuerte condensación de nucleoides, mientras que
5c). This observation is consistent with the no se observó tal efecto en la síntesis de YFP
presence of a potential, although low-scoring, sola (Fig. 5c). Esta observación es coherente con
helix-turn-helix motif in the conserved ParBC la presencia de un motivo potencial, aunque de
domain of PadC (amino acids 346–367). Upon baja puntuación, de hélice-giro-hélice en el
co production of PadC-YFP and ParA-mCherry, dominio ParBC conservado de PadC
the two fusions colocalized on the condensed (aminoácidos 346-367). Tras la coproducción de
nucleoids (Fig. 5d). However, due to the PadC-YFP y ParA-mCherry, las dos fusiones se
non-specific DNA-binding activity of ParA colocalizaron en los nucleoides condensados
(Supplementary Fig. 6a; wild type), it was (Fig. 5d). Sin embargo, debido a la actividad
difficult to draw conclusions on the ability of the inespecífica de unión al ADN de ParA (Fig.
proteins to interact with each other. To solve this suplementaria 6a; tipo salvaje), fue difícil sacar
issue, we generated ParA-mCherry variants with conclusiones sobre la capacidad de las proteínas
substitutions (R209A and R238E) in conserved para interactuar entre sí. Para resolver este
residues shown to be involved in DNA binding52 problema, generamos variantes de ParA-mCherry
(Fig. 5b). These variants are no longer associated con sustituciones (R209A y R238E) en residuos
with the chromosome in E. coli (Supplementary conservados que se ha demostrado que participan
Fig. 6a). en la unión al ADN52 (Fig. 5b). Estas variantes
ya no se asocian al cromosoma en E. coli (Fig.
suplementaria 6a).

However, upon co-expression with PadC-YFP, Sin embargo, tras la coexpresión con PadC-YFP,
they again localized to the condensed nucleoids volvieron a localizarse en los nucleoides
(Fig. 5d and Supplementary Fig. 6b), condensados (Fig. 5d y Fig. 6b suplementaria), lo
demonstrating a direct interaction between ParA que demuestra una interacción directa entre ParA
mCherry and the DNA-bound PadC-YFP fusion. mCherry y la fusión PadC-YFP unida al ADN.
ParA cycles between a monomeric and dimeric ParA alterna entre un estado monomérico y
state, dependent on nucleotide binding and dimérico, dependiendo de la unión e hidrólisis
hydrolysis (Fig. 5b). To clarify how the del nucleótido (Fig. 5b). Para aclarar cómo se
interaction pattern of ParA correlates with its correlaciona el patrón de interacción de ParA con
oligomerization state, we made substitutions in su estado de oligomerización, realizamos
the protein that were predicted to block its sustituciones en la proteína que se predijo que
ATPase cycle at the steps of dimerization (K31A bloquearían su ciclo ATPasa en los pasos de
and G32V) or nucleotide hydrolysis (K36R and dimerización (K31A y G32V) o hidrólisis de
D60A), based on previous studies of other ParA nucleótidos (K36R y D60A), basándonos en
homologs. As expected, the K31A and G32V estudios previos de otros homólogos de ParA.
variants lacked non specific DNA-binding Como era de esperar, las variantes K31A y G32V
activity when synthesized in E. coli carecían de actividad no específica de unión al
(Supplementary Fig. 6a). Nevertheless, they ADN cuando se sintetizaban en E. coli (Fig. 6a
localized to the condensed nucleoids upon suplementaria). Sin embargo, se localizaron en
co-expression with PadC-YFP, demonstrating los nucleoides condensados al coexpresarse con
that PadC is able to interact with ParA monomers PadC-YFP, lo que demuestra que PadC es capaz
(Fig. 5d and Supplementary Fig. 6b). This result de interactuar con los monómeros de ParA (Fig.
was corroborated by ectopic expression of alleles 5d y Fig. 6b suplementaria). Este resultado fue
encoding mutant ParA-YFP fusions in M. corroborado por la expresión ectópica de alelos
xanthus cells, which showed that both que codifican fusiones mutantes de ParA-YFP en
monomeric variants adopted the typical bipolar células de M. xanthus, lo que demostró que
pattern observed for PadC (Fig. 5e and ambas variantes monoméricas adoptaban el
Supplementary Fig. 6c; compare Fig. 3d). The patrón bipolar típico observado para PadC (Fig.
ATP locked, dimeric K36R and D60A variants, 5e y Fig. 6c suplementaria; compárese con la
on the other hand, exhibited strong DNA-binding Fig. 3d). Por otro lado, las variantes K36R y
activity in E. coli (Supplementary Fig. 6a). When D60A, diméricas y bloqueadas por ATP,
expressed in M. xanthus, they lacked the typical mostraron una fuerte actividad de unión al ADN
bipolar distribution and instead formed a variable en E. coli (Fig. 6a suplementaria). Cuando se
number of distinct foci (Fig. 5e and expresan en M. xanthus, carecen de la típica
Supplementary Fig. 6c), likely positioned over distribución bipolar y en su lugar forman un
the nucleoid. These results indicate that the número variable de focos distintos (Fig. 5e y Fig.
bactofilin-PacD complex mostly associates with suplementaria 6c), probablemente situados sobre
the monomeric form of ParA in vivo. el nucleoide. Estos resultados indican que el
Interestingly, however, DNA binding-defective complejo bactofilina-PacD se asocia
variants of ParA (R209A and R238E) also principalmente con la forma monomérica de
colocalized with PadC (Figs. 5d and e and ParA in vivo. Curiosamente, sin embargo, las
Supplementary Fig. 6b), even though a sizable variantes de ParA defectuosas en la unión al
fraction of these proteins may be in the dimeric ADN (R209A y R238E) también se
state. Similarly, a constitutively dimeric colocalizaron con PadC (Figs. 5d y e y Fig. 6b
ParA-mCherry variant defective in DNA binding suplementaria), a pesar de que una fracción
(D60A R238E) (Supplementary Fig. 6a) still considerable de estas proteínas puede estar en
colocalized with PadC-YFP in E. coli estado dimérico. De forma similar, una variante
(Supplementary Fig. 6b). Consistent with the in constitutivamente dimérica de ParA-mCherry
vitro data (see Fig. 5a), PadC is thus also capable defectuosa en la unión al ADN (D60A R238E)
of interacting with ParA dimers, although this (Fig. 6a) todavía se colocalizó con PadC-YFP en
ParA species may be largely sequestered to the E. coli (Fig. 6b). De acuerdo con los datos in
nucleoid and/or the origin-bound ParB vitro (ver Fig. 5a), PadC también es capaz de
complexes under normal conditions. interactuar con dímeros de ParA, aunque esta
especie de ParA puede estar en gran medida
secuestrada en el nucleoide y/o en los complejos
ParB unidos al origen en condiciones normales.

PadC recruits ParA to bactofilin structures. PadC recluta a ParA a estructuras de bactofilina.

The above results show that ParA binds to the Los resultados anteriores muestran que ParA se
ParBC domain of PadC. To further clarify the une al dominio ParBC de PadC. Para aclarar aún
role of this interaction, we explored whether más el papel de esta interacción, exploramos si
PadC was sufficient to mediate the recruitment of PadC era suficiente para mediar en el
ParA to bactofilin structures. As a first approach, reclutamiento de ParA a estructuras de
we set out to reconstitute a ternary bactofilina. Como primera aproximación, nos
BacP-PadC-ParA complex in vitro. To this end, a propusimos reconstituir un complejo ternario
fragment comprising the C-terminal extension of BacP-PadC-ParA in vitro. Para ello, se
BacP (BacPC) was immobilized on a bio-layer inmovilizó un fragmento que comprendía la
interferometry sensor and incubated with extensión C-terminal de BacP (BacPC) en un
PadCΔN. Subsequent titration of the sensors with sensor de interferometría de biocapa y se incubó
purified ParA led to the concentration-dependent con PadCΔN. La valoración posterior de los
formation of a stable ternary complex (Fig. 6a). sensores con ParA purificada condujo a la
By contrast, no interaction was observed in formación, dependiente de la concentración, de
control reactions lacking PadCΔN un complejo ternario estable (Fig. 6a). Por el
(Supplementary Fig. 7a), supporting the idea that contrario, no se observó ninguna interacción en
PadC functions as an adapter mediating the las reacciones de control que carecían de
bactofilin–ParA interaction. To validate this PadCΔN (Fig. suplementaria 7a), lo que apoya la
hypothesis, we tested for the ability of PadC to idea de que PadC funciona como un adaptador
recruit ParA-YFP to a complex of mCherry-BacP que media la interacción bactofilina-ParA. Para
and CFP-BacO after heterologous expression in validar esta hipótesis, comprobamos la capacidad
E. coli (Fig. 6b). Consistent with the above de PadC para reclutar ParA-YFP a un complejo
results (Supplementary Fig. 6a), wild-type de mCherry-BacP y CFP-BacO tras su expresión
ParA-YFP was quantitatively associated with the heteróloga en E. coli (Fig. 6b). En consonancia
nucleoids in cells lacking PadC (Fig. 6b; top con los resultados anteriores (Fig. suplementaria
row). By contrast, the fusion became partly 6a), la ParA-YFP de tipo salvaje se asoció
associated with the bactofilin structures upon cuantitativamente con los nucleoides en las
co-expression of the padC gene (Fig. 6b, middle células que carecían de PadC (Fig. 6b; fila
row). When the same analysis was repeated with superior). Por el contrario, la fusión se asoció
a monomeric, DNA binding-deficient variant parcialmente con las estructuras de bactofilina
(G32V) of ParA-YFP, the protein completely tras la coexpresión del gen PadC (Fig. 6b, fila
colocalized with the bactofilin structures (Fig. central). Cuando se repitió el mismo análisis con
6b, bottom row), whereas a control strain una variante monomérica, deficiente en la unión
producing YFP instead of the fusion protein al ADN (G32V) de ParA-YFP, la proteína se
displayed even fluorescence throughout the cell colocalizó completamente con las estructuras de
(Supplementary Fig. 7b). In the absence of PadC, bactofilina (Fig. 6b, fila inferior), mientras que
the monomeric variant was largely dispersed una cepa de control que producía YFP en lugar
within the cell, although a minor fraction de la proteína de fusión mostró una fluorescencia
appeared associated with the bactofilin uniforme en toda la célula (Fig. 7b
complexes (Supplementary Fig. 7c). Together, suplementaria). En ausencia de PadC, la variante
these results strongly support the notion that monomérica se dispersó en gran medida dentro
PadC is necessary and sufficient to recruit ParA, de la célula, aunque una fracción menor apareció
and in particular its monomeric form, to the asociada a los complejos de bactofilina (Fig. 7c
BacNOP complexes. suplementaria). En conjunto, estos resultados
apoyan firmemente la noción de que PadC es
necesario y suficiente para reclutar ParA, y en
particular su forma monomérica, a los complejos
BacNOP.

Defects in BacNOP or PadC affect Los defectos en BacNOP o PadC afectan a la

chromosome structure and segregation. estructura y segregación cromosómica.

The lack of BacNOP or PadC strongly affects the La falta de BacNOP o PadC afecta fuertemente a
subcellular arrangement of the ParABS la disposición subcelular de la maquinaria de
chromosome partitioning machinery. To clarify partición cromosómica ParABS. Para aclarar las
the physiological consequences, we first consecuencias fisiológicas, primero
determined the dimensions of the nucleoids in determinamos las dimensiones de los nucleoides
various mutant backgrounds. Although en varios fondos mutantes. Aunque las cepas
bactofilin-deficient strains did not show any deficientes en bactofilina no mostraron cambios
appreciable changes in cell length and growth apreciables en la longitud celular ni en la
rate (Supplementary Fig. 8a and b), the nucleoids velocidad de crecimiento (Fig. suplementaria 8a
of bactofilin and padC mutants were significantly y b), los nucleoides de los mutantes de
more compact, with their longitudinal sizes bactofilina y padC eran significativamente más
decreasing from 51% of the cell length in the compactos, y su tamaño longitudinal disminuyó
wild type to only 37% in the ΔbacNOP ΔpadC del 51% de la longitud celular en el tipo salvaje a
strain (Fig. 7a). Apart from this change in sólo el 37% en la cepa ΔbacNOP ΔpadC (Fig.
nucleoid size, bactofilin mutants often displayed 7a). Aparte de este cambio en el tamaño de los
an abnormal chromosome arrangement, with nucleoides, los mutantes de bactofilina
their origin regions displaced from the mostraban a menudo una disposición anómala de
pole-proximal edges to more central regions of los cromosomas, con sus regiones de origen
the nucleoids (Fig. 7b). Notably, using ParB-YFP desplazadas desde los bordes polo-proximales
as a label for the chromosomal origin regions, we hacia regiones más centrales de los nucleoides
identified a moderate increase in origin copy (Fig. 7b). En particular, utilizando ParB-YFP
numbers in the ΔbacP background como etiqueta para las regiones de origen
(Supplementary Fig. 8d). In line with this cromosómico, identificamos un aumento
observation, populations of ΔbacNOP cells moderado en el número de copias de origen en el
exhibited a noticeable fraction of cells with fondo ΔbacP (Fig. suplementaria 8d). En
abnormally high DNA content (Fig. 7c), consonancia con esta observación, las
suggesting that the proper positioning of ParABS poblaciones de células ΔbacNOP mostraron una
helps to make chromosome segregation more fracción notable de células con un contenido de
robust. ADN anormalmente alto (Fig. 7c), lo que sugiere
que el posicionamiento adecuado de ParABS
ayuda a que la segregación cromosómica sea más
robusta.

We fortuitously observed that fusion of BacP Fortuitamente observamos que la fusión de BacP
with the HA affinity tag created a variant that con la etiqueta de afinidad HA creaba una
formed extended unipolar, instead of bipolar, variante que formaba parches unipolares
patches (Fig. 7d), providing a means to test the extendidos, en lugar de bipolares (Fig. 7d),
role of bactofilins on ParAB localization in a proporcionando un medio para probar el papel de
non-native context. Interestingly, bacP-HA cells las bactofilinas en la localización de ParAB en
showed impaired growth (Supplementary Fig. un contexto no nativo. Curiosamente, las células
8c) and a severe chromosome segregation bacP-HA mostraron un crecimiento deficiente
defects, with many of them containing either (Fig. suplementaria 8c) y graves defectos de
more than two (17%) or no (8%) ParB-YFP segregación cromosómica, y muchas de ellas
complexes (Supplementary Fig. 8d). contenían más de dos complejos ParB-YFP
Consistently, a large fraction of the population (17%) o ninguno (8%) (Fig. suplementaria 8d).
contained an abnormal number of chromosome Consistentemente, una gran fracción de la
equivalents (Fig. 7c), resulting in part from población contenía un número anormal de
divisions over the nucleoid (Fig. 7e). Moreover, equivalentes cromosómicos (Fig. 7c), resultado
even in cells containing two chromosomes, the en parte de divisiones sobre el nucleoide (Fig.
origin regions were severely mislocalized and, in 7e). Además, incluso en células que contenían
most cases, located in close proximity rather than dos cromosomas, las regiones de origen estaban
at opposite edges of the nucleoid (Fig. 7e). severamente deslocalizadas y, en la mayoría de
Importantly, in the mutant cells, ParA-mCherry los casos, localizadas muy próximas en lugar de
had lost its typical bipolar localization landmark en bordes opuestos del nucleoide (Fig. 7e). Es
proteins, these structures do not recruit their importante destacar que, en las células mutantes,
interaction partners to the very tips of the cells ParA-mCherry había perdido su localización
but to well-defined positions within the bipolar típica: las proteínas de referencia, estas
cytoplasmic space, located at a considerable estructuras no reclutan a sus socios de
distance from the cell poles. The establishment interacción en las puntas mismas de las células,
of this additional, subpolar domain expands the sino en posiciones bien definidas dentro del
range of potential protein localization sites, espacio citoplasmático, situadas a una distancia
providing a new mechanism for cellular considerable de los polos celulares. El
organization that may facilitate the assembly of establecimiento de este dominio subpolar
multiple large macromolecular complexes within adicional amplía la gama de posibles sitios de
the polar or subpolar regions of the cell. localización de proteínas, proporcionando un
nuevo mecanismo de organización celular que
puede facilitar el ensamblaje de múltiples
complejos macromoleculares de gran tamaño
 dentro de las regiones polares o subpolares de la
célula.

DISCUSSION

Apart from the universally conserved homologs Aparte de los homólogos universalmente
of actin and tubulin, there are several groups of conservados de la actina y la tubulina, existen
cytoskeletal proteins that are exclusively found varios grupos de proteínas del citoesqueleto que
in bacteria. Among them are the bactofilins, a se encuentran exclusivamente en bacterias. Entre
widespread and highly conserved group of ellos se encuentran las bactofilinas, un grupo de
proteins whose biology is still largely proteínas muy extendido y altamente conservado
unexplored4. In this work, we demonstrate that cuya biología está aún en gran parte
three bactofilin homologs in M. xanthus inexplorada4. En este trabajo, demostramos que
co-assemble into extended subpolar scaffolds tres homólogas de bactofilina en M. xanthus se
which, together with the newly discovered ensamblan en andamiajes subpolares extendidos
protein PadC, control the positioning of the que, junto con la proteína PadC recientemente
chromosomal origin segregation machinery. descubierta, controlan el posicionamiento de la
Unlike other bacterial landmark proteins, these maquinaria de segregación del origen
structures do not recruit their interaction partners cromosómico. A diferencia de otras proteínas
to the very tips of the cells but to well-defined bacterianas de referencia, estas estructuras no
positions within the cytoplasmic space, located at reclutan a sus socios de interacción en las puntas
a considerable distance from the cell poles. The mismas de las células, sino en posiciones bien
establishment of this additional, subpolar domain definidas dentro del espacio citoplasmático,
expands the range of potential protein situadas a una distancia considerable de los polos
localization sites, providing a new mechanism celulares. El establecimiento de este dominio
for cellular organization that may facilitate the subpolar adicional amplía la gama de sitios
assembly of multiple large macromolecular potenciales de localización de proteínas,
complexes within the polar or subpolar regions proporcionando un nuevo mecanismo de
of the cell. organización celular que puede facilitar el
ensamblaje de múltiples complejos
macromoleculares de gran tamaño dentro de las
regiones polares o subpolares de la célula.

This study shows that BacN, BacO, and BacP Este estudio muestra que BacN, BacO y BacP se
consistently colocalize in the cell, indicating that colocalizan sistemáticamente en la célula, lo que
they assemble into a joint polymeric structure. indica que se ensamblan en una estructura
However, each of the three proteins can form polimérica conjunta. Sin embargo, cada una de
filaments on its own in vitro. Therefore, it las tres proteínas puede formar filamentos por sí
remains to be clarified whether the three paralogs sola in vitro. Por lo tanto, queda por aclarar si los
polymerize into homopolymeric structures that tres paralogs polimerizan en estructuras
subsequently assemble into heteromeric homopoliméricas que posteriormente se
complexes or whether they associate randomly ensamblan en complejos heteroméricos o si se
into mixed polymers. Notably, the functional asocian aleatoriamente en polímeros mixtos. En
contributions of the different paralogs vary particular, las contribuciones funcionales de los
significantly. Whereas BacN is largely redundant distintos paralogos varían significativamente.
for the processes analyzed in this study, BacO is Mientras que BacN es en gran medida
important for proper assembly of the bactofilin redundante para los procesos analizados en este
patches. The most pronounced phenotypes, estudio, BacO es importante para el correcto
however, are observed upon inactivation of BacP, ensamblaje de los parches de bactofilina. Sin
which not only plays a central role in the embargo, los fenotipos más pronunciados se
formation of bactofilin patches but also mediates observan tras la inactivación de BacP, que no
the recruitment of PadC and, thus, ParA to these sólo desempeña un papel central en la formación
structures. Apart from the architecture of the de los parches de bactofilina, sino que también
BacNOP complex, the precise subcellular media en el reclutamiento de PadC y, por tanto,
location of the polymers formed is still unknown. de ParA a estas estructuras. Aparte de la
BacNOP could potentially assemble into arquitectura del complejo BacNOP, aún se
cytoplasmic filament bundles. On the other hand, desconoce la localización subcelular precisa de
recent work has demonstrated that bactofilins not los polímeros formados. BacNOP podría
only form filaments but also extensive ensamblarse potencialmente en haces de
two-dimensional arrays in vitro, depending on filamentos citoplasmáticos. Por otra parte,
the experimental conditions. Consistently, trabajos recientes han demostrado que las
live-cell imaging and electron cryo tomographic bactofilinas no sólo forman filamentos, sino
studies suggest that the C. crescentus homologs también extensas matrices bidimensionales in
assemble into sheet-like structures lining the vitro, dependiendo de las condiciones
inner face of the cytoplasmic membrane in vivo. experimentales. Por otra parte, estudios recientes
It is, therefore, conceivable that M. xanthus han demostrado que las bactofilinas no sólo
BacNOP may form similar membrane-associated forman filamentos, sino también extensos
assemblies, but clarification of this issue will conjuntos bidimensionales in vitro, dependiendo
require the development of fully functional de las condiciones experimentales. Por lo tanto,
fluorescent protein fusions. es concebible que la BacNOP de M. xanthus
pueda formar ensamblajes similares asociados a
la membrana, pero la aclaración de esta cuestión
requerirá el desarrollo de fusiones de proteínas
fluorescentes completamente funcionales.

Despite the lack of nucleotide cofactors, the A pesar de la falta de cofactores nucleotídicos,
BacNOP structures assemble in a tightly las estructuras BacNOP se ensamblan de forma
controlled and cell cycle-dependent manner. estrechamente controlada y dependiente del ciclo
New-born cells often display two differently celular. Las células recién nacidas suelen mostrar
sized complexes, a longer one at the old pole and dos complejos de distinto tamaño, uno más largo
a shorter one at the new pole, whose lengths en el polo antiguo y otro más corto en el polo
gradually equalize as the cells grow. Before cell nuevo, cuyas longitudes se igualan gradualmente
division, an additional patch is formed at midcell. a medida que las células crecen. Antes de la
Its dissection during cytokinesis then división celular, se forma un parche adicional en
re-establishes a nascent bactofilin complex at the la mitad de la célula. Su disección durante la
new pole of the daughter cells (Fig. 8a). Notably, citocinesis restablece un complejo de bactofilina
cell cycle-regulated localization dynamics have naciente en el nuevo polo de las células hijas
also been observed for the bactofilin clusters of (Fig. 8a). En particular, también se han
C. crescentus. The mechanisms controlling observado dinámicas de localización reguladas
BacNOP assembly and localization still remain por el ciclo celular para los grupos de
to be determined. However, given that bactofilins bactofilinas de C. crescentus. Los mecanismos
polymerize independently of nucleotide que controlan el ensamblaje y la localización de
cofactors, their assembly may be regulated BacNOP aún están por determinar. Sin embargo,
through protein–protein interactions. Of notice, dado que las bactofilinas polimerizan
inactivation of PadC led to a change in the independientemente de los cofactores
localization pattern of BacNOP (Supplementary nucleotídicos, su ensamblaje puede estar
Fig. 5e). Apart from recruiting ParA, this protein regulado por interacciones proteína-proteína.
could therefore also be involved in coordinating Cabe destacar que la inactivación de PadC
bactofilin patch formation with cell cycle events provocó un cambio en el patrón de localización
such as chromosome replication or segregation. de BacNOP (Fig. suplementaria 5e). Además de
reclutar a ParA, esta proteína también podría
estar implicada en la coordinación de la
formación de parches de bactofilina con eventos
del ciclo celular como la replicación o
segregación cromosómica.

We show that BacNOP serve to position the Demostramos que BacNOP sirve para posicionar
ParABS chromosome segregation machinery la maquinaria de segregación cromosómica
within the cell. Interestingly, despite being ParABS dentro de la célula. Curiosamente, a
encoded immediately downstream of the parAB pesar de codificarse inmediatamente aguas abajo
genes, their paralog BacM appears not to be de los genes parAB, su paralog BacM no parece
involved in this process but to function estar implicado en este proceso, sino que
exclusively in cell shape maintenance. Consistent funciona exclusivamente en el mantenimiento de
with this notion, it lacks the typical bipolar la forma celular. En consonancia con esta noción,
localization pattern of BacNOP, supporting the carece del patrón de localización bipolar típico
idea that paralogous bactofilins can act de BacNOP, lo que apoya la idea de que las
independently in distinct cellular pathways. bactofilinas paralogas pueden actuar de forma
Despite their functional diversity, bactofilins independiente en vías celulares distintas. A pesar
from different species may share a common role de su diversidad funcional, las bactofilinas de
as localization factors for other proteins4. diferentes especies pueden compartir un papel
However, the determinants responsible for the común como factores de localización de otras
recruitment of interacting factors have remained proteínas4. Sin embargo, se desconocen los
unknown. Our results now identify the long determinantes responsables del reclutamiento de
C-terminal extension of BacP as a central los factores que interactúan. Nuestros resultados
mediator of bactofilin function in M. xanthus, identifican ahora la larga extensión C-terminal de
serving as a hub for the assembly of the BacP como un mediador central de la función de
PadC-ParA complex. Intriguingly, the las bactofilinas en M. xanthus, sirviendo como
ParA-binding (ParBC) domain of PadC bears eje para el ensamblaje del complejo PadC-ParA.
resemblance to the centromer-binding protein Curiosamente, el dominio de unión a ParA
ParB, suggesting that the two proteins may use a (ParBC) de PadC se parece a la proteína de unión
similar mode of interaction with their common a centrómeros ParB, lo que sugiere que las dos
target ParA. However, structural analyses of the proteínas pueden utilizar un modo similar de
respective complexes are necessary to further interacción con su objetivo común ParA. Sin
investigate this possibility. Whereas our results embargo, son necesarios análisis estructurales de
clarify the pathway of ParA recruitment, the los respectivos complejos para investigar más a
mechanism underlying the immobilization of fondo esta posibilidad. Mientras que nuestros
ParB at the ends of the Bac NOP·PadC resultados aclaran la vía de reclutamiento de
assemblies are still unclear. We did not observe ParA, el mecanismo subyacente a la
any binding of purified ParB to the C-terminal inmovilización de ParB en los extremos de los
extension of BacP or the ParBC domain of PadC ensamblajes Bac NOP-PadC sigue sin estar claro.
in vitro (Supplementary Fig. 2g). The protein No observamos ninguna unión de ParB
may thus interact with the bactofilin core domain purificada a la extensión C-terminal de BacP o al
or other regions of BacP, BacO, and/or PadC, dominio ParBC de PadC in vitro (Fig.
which are however not amenable to biochemical suplementaria 2g). Por tanto, la proteína puede
analysis at this point. interaccionar con el dominio central de la
bactofilina o con otras regiones de BacP, BacO
y/o PadC, que sin embargo no son susceptibles
de análisis bioquímico en este momento.

Interestingly, there are striking parallels in the Curiosamente, existen sorprendentes

(sub)polar targeting of ParA in M. xanthus and paralelismos en la orientación (sub)polar de ParA
C. crescentus. Only the monomeric forms of M. en M. xanthus y C. crescentus. Sólo las formas
xanthus ParA are efficiently recruited to the monoméricas de ParA de M. xanthus son
bactofilin-PadC complex in vivo. Dimeric reclutadas eficazmente al complejo
variants, by contrast, localize to the nucleoid or bactofilina-PadC in vivo. Las variantes
ParB, but they are redirected to the subpolar diméricas, por el contrario, se localizan en el
regions when impaired in DNA binding. Exactly nucleoide o en ParB, pero se redirigen a las
the same pattern was observed for the interaction regiones subpolares cuando se deteriora la unión
of ParA with the polar scaffolding protein PopZ al ADN. Se observó exactamente el mismo
in C. crescentus. In this species, the patrón para la interacción de ParA con la
accumulation of ParA monomers within the proteína de andamiaje polar PopZ en C.
PopZ matrix was suggested to confine ParA crescentus. En esta especie, se sugirió que la
dimerization to the polar regions of the cell, acumulación de monómeros de ParA dentro de la
thereby creating a gradient of DNA-bound matriz PopZ confina la dimerización de ParA a
actinomycetes interact with the las regiones polares de la célula, creando así un
centromere-binding protein ParB to control the gradiente de actinomicetos unidos al ADN que
positioning of the chromosomal origin regions. interactúan con la proteína de unión al
Moreover, both proteins interact with the centrómero ParB para controlar el
chromosome partitioning ATPase ParA. This posicionamiento de las regiones de origen
association can be either direct, as reported for cromosómico. Además, ambas proteínas
PopZ and DivIVA from M. smegmatis or interactúan con la ATPasa de partición
mediated through an adapter protein such as the cromosómica ParA. Esta asociación puede ser
coiled-coil-rich protein Scy in S. coelicolor18. directa, como en el caso de PopZ y DivIVA de
Moreover, each of these proteins interacts with M. smegmatis, o mediada por una proteína
additional factors not involved in chromosome adaptadora, como la proteína rica en espirales
segregation. PopZ, for instance, also mediates the enrolladas Scy de S. coelicolor18. Además, cada
polar localization of various proteins involved in una de estas proteínas interactúa con factores
C. crescentus cell cycle regulation whereas adicionales no implicados en la segregación
DivIVA additionally organizes the polar cromosómica. PopZ, por ejemplo, también
peptidoglycan biosynthetic machinery of interviene en la localización polar de varias
actinomycete species. Moreover, DivIVA was proteínas implicadas en la regulación del ciclo
shown to recruit another cytoske letal structure, celular de C. crescentus, mientras que DivIVA
formed by the intermediate-filament-like protein también organiza la maquinaria biosintética de
FilP, to the growing cell poles of S. coelicolor peptidoglicanos polares de las especies de
hyphae. Notably, there are also non-polymerizing actinomicetos. Además, se ha demostrado que
proteins that act as multi-functional polar DivIVA recluta otra estructura citoske letal,
localization factors, including HubP, which formada por la proteína FilP, similar a un
mediates the polar recruitment of ParA, the filamento intermedio, en los polos celulares en
flagellar apparatus, and chemotaxis arrays in crecimiento de las hifas de S. coelicolor. Cabe
Vibrio cholerae. Thus, many bacteria have a destacar que también hay proteínas no
common need for pole-organizing factors that polimerizantes que actúan como factores
help arrange the chromosome segregation multifuncionales de localización polar, como
machinery and diverse macromolecular HubP, que media en el reclutamiento polar de
complexes within the cell. However, different ParA, el aparato flagelar y los conjuntos de
evolutionary lineages have obviously found very quimiotaxis en Vibrio cholerae. Así pues,
differ ent solutions to cope with this problem. muchas bacterias tienen una necesidad común de
factores de organización polar que ayuden a
organizar la maquinaria de segregación
cromosómica y diversos complejos
macromoleculares dentro de la célula. Sin
embargo, es evidente que los distintos linajes
evolutivos han encontrado soluciones muy
diferentes para hacer frente a este problema.

The reason why M. xanthus has evolved a La razón por la que M. xanthus ha desarrollado
mechanism to position proteins in the subpolar un mecanismo para posicionar las proteínas en
regions and not, as observed for other species, at las regiones subpolares y no, como se ha
the very poles of the cell is still unclear. observado en otras especies, en los polos de la
However, a prominent feature of M. xanthus is célula, aún no está clara. Sin embargo, una
its intricate motility machinery, whose característica destacada de M. xanthus es su
coordination and activity involves an array of intrincada maquinaria de motilidad, cuya
pole-associated structural and regulatory coordinación y actividad implica una serie de
proteins. These factors may occupy a large part proteínas estructurales y reguladoras asociadas a
of the polar cell envelope and thus not leave los polos. Estos factores pueden ocupar gran
sufficient space for other large macromolecular parte de la envoltura celular polar y, por tanto, no
structures to assemble at the same site without dejar espacio suficiente para que otras grandes
causing steric or regulatory interference. It will estructuras macromoleculares se ensamblen en el
be interesting to see whether other bacterial mismo sitio sin causar interferencias estéricas o
groups also use bactofilins to establish reguladoras. Será interesante ver si otros grupos
comparable subpolar bacterianos también utilizan bactofilinas para
establecer envolturas celulares subpolares
comparables.