UNIDAD DE TRABAJO 5: APLICACIÓN DE TÉCNICAS DE PCR Y

ELECTROFORESIS EN EL ESTUDIO DE LOS ÁCIDOS NUCLEICOS

Índice
5.1 Técnica de PCR
5.2. Variantes de la PCR
5.3 Técnicas de visualización de fragmentos de ADN e interpretación de los resul-tados
5.4 Aplicaciones de la PCR

5.1. Técnica de la PCR

En 1987 Kary Mullis dio a conocer la técnica de Reacción en Cadena de la Polimerasa o
PCR, hecho que le supuso el Premio Nobel de Química en 1993. Se trata de una técnica
esencial dentro de la Biología Molecular.
Gracias a la PCR, el disponer de una cantidad insuficiente de ADN ya no es una limitación
técnica ni en investigación ni en los procedimientos de diagnóstico.
La técnica de PCR permite replicar cientos de miles de millones de veces, en poco tiempo
(horas) e in vitro, pequeños fragmentos de ADN. Este diseño repetitivo es la clave de la
amplificación puesto que las copias nuevas obtenidas en cada ciclo sirven también de molde
para sintetizar otras nuevas copias en los ciclos siguientes, produciéndose un aumento
exponencial en el número de copias a cada ciclo de replicación sucesivo que se realice.
Uno de los principales aportes de esta metodología consiste, precisamente, en la rapidez y
en la eficiencia mediante las cuales se realiza un análisis que en épocas anteriores precisaba
de muchos días de trabajo.
Ahora bien, para conseguir esto hay que solucionar dos problemas:
¿Cómo conseguir que en cada ciclo de la técnica únicamente se copie (se replique) el
fragmento que nos interesa, entre una mezcla compleja de moléculas de ADN?
¿Cómo conseguir que no se produzca la inactivación de la ADN polimerasa por la
temperatura elevada que es necesaria en la fase de desnaturalización del ADN mol-de?
La solución al primer problema fue el diseño de cebadores específicos que permiten la
amplificación exclusiva de un fragmento concreto de ADN, y la solución al segundo
problema fue el descubrimiento de las ADN polimerasas termoestables.
5.1.1 Componentes de la PCR
En una reacción de PCR son necesarios los siguientes componentes:
-DNA molde, que es el que se quiere replicar. Es un componente imprescindible en la
mezcla de reacción, ya que contiene el fragmento de interés que se quiere amplificar.
Normalmente se utiliza ADN purificado.
-Oligonucleótidos iniciadores, primers o cebadores, que son fragmentos cortos de ADN de
secuencia conocida específicos para cada fragmento de ADN y que requieren un cuidadoso
diseño, ya que son el factor más importante que determina la eficiencia de una PCR.
En una PCR se emplea una pareja de cebadores. Uno se encuentra en la cadena molde “en
sentido”, en uno de los extremos a replicar; el otro se encuentra en el extremo del fragmento
a amplificar, formando parte de la cadena antisentido porque se ha de
diseñacomplementario a la cadena en sentido.
El cebador que se va a unir a la hebra molde que tiene dirección 3' - 5’ se denomina cebador
F o forward. El que se va a unir a la hebra molde que tiene dirección 5' -3' se de-nomina
cebador R o reverse.

-Desoxinucleótidos trifosfatos o dNTP. La ADN polimerasa los incorporan a las cadenas de

crecimiento.
-Cloruro de magnesio, factor importante para la optimización de la reacción. Las ADN
polimerasas termoestables requieren iones de magnesio (Mg2+) como cofactor para
desarrollar su actividad.
- Agua libre de ADNasas y ARNasas.
-Buffer para mantener el pH.
-ADN polimerasa termoestable. Es otro reactivo clave para realizar una PCR con éxito. La
elección de una u otra ADN polimeasa dependerá de la fidelidad en la amplificación, de la
longitud del fragmento que se va a amplificar y, en ocasiones, de la secuencia que se va a
amplificar.
La más utilizada es la procedente de la bacteria termófila Thermophilus aquaticus, de-
nominada polimerasa Taq, que actúa eficientemente entre 75ºC y 80ºC y que resiste más de
dos horas a 95ºC. El uso de concentraciones excesivas de ADN polimerasa no supone
ninguna mejora en el rendimiento de la reacción, pero si un considerable incremento del
coste.
El conjunto de estos componentes para la reacción de la PCR se conoce como máster mix.
Generalmente las casas comerciales ofertan este conjunto con todos los reactivos necesarios
para llevar a cabo el proceso.
5.1.2 Descripción de la técnica PCR
El método se basa en la realización de tres etapas sucesivas llevadas a cabo a diferentes
temperaturas. Estas reacciones se repiten periódicamente entre treinta y cuarenta ciclos:
1. Primera etapa. La muestra se calienta hasta lograr la separación de las dos cadenas
de DNA, es decir, se desnaturaliza. Esto se consigue con una temperatura de unos
95ºC durante unos minutos (1-5 minutos). El tiempo va a depender del tamaño del
DNA que se pretende amplificar.
2. Segunda etapa. La temperatura se reduce para permitir el apareamiento o la
hibridación de los cebadores (también llamados iniciadores o primers) con cada una
de las hebras separadas del ADN molde. Estos cebadores son segmentos de DNA de
cadena sencilla obtenidos en el laboratorio y cuya longitud óptima es de 18-25
nucleótidos: están sintetizados de forma que permiten definir el límite del fragmento
de ADN que se pretende replicar.
La temperatura óptima de esta etapa, llamada de annealing, está comprendido entre
50-70ºC, dependiendo de la secuencia de cebadores.
3. Tercera etapa. La enzima de ADN polimerasa (Taq polimerasa), a partir de los ce-
badores, sintetiza las cadenas complementarias al fragmento molde, extendiendo la
secuencia en el espacio comprendido entre ambos cebadores. Este proceso se
conoce como extensión o elongación.
Para este proceso, la Taq polimerasa incorpora dNTPs que han sido introducidos a
la mezcla de reacción (máster mix) y a la temperatura óptima de reacción de la
polimerasa Taq, que suele ser de 72ºC.
Después de un primer ciclo de desnaturalización, annealing y extensión, el
fragmento de ADN elegido se ha duplicado, y se encuentra disponible para volverse
a replicar en un segundo ciclo, de manera que todo este proceso se repite entre 30 y
40 veces, dando lugar a una amplificación geométrica en cadena del fragmento de
DNA inicial. Todas las fases de este proceso tienen lugar en un termociclador que
es un sis-tema automático programable que calienta y enfría la reacción en períodos
cortos de tiempo, consiguiendo la temperatura adecuada en cada fase para que
realice la replicación de ADN.
5.1.3 Problemas en la realización de la PCR
Al realizar una PCR podemos encontrarnos con alguna de las siguientes situaciones:
- No se ha producido amplificación. Se puede intentar solucionarlo aumentando la
cantidad de cloruro de magnesio o bajando un poco la temperatura de hibridación.
- Se producen amplificaciones inespecíficas. Este podría deberse a una concentración
excesiva de dNTP y de cebadores. Se puede solucionar aumentando la temperatura
de hibridación o bajando la concentración de cloruro de Mg2+.
- Se forman dímeros (unión de dos moléculas) de cebadores. Esto se produce si los
ce-badores se unen entre ellos. Debe evitarse que tengan secuencias
complementarias, ya que la polimerasa Taq es capaz de amplificar a temperatura
ambiente, por lo que una vez preparada la máster mix, el ADN debe añadirse lo más
rápido posible para evitar la formación de estos dímeros.
- Se produce contaminación. Esto ocurre cuando alguno en los componentes de la
mez-cla de reacción hay ADN diferente al de la muestra que queremos amplificar.
 En este caso, también amplificaremos el ADN extraño. Para comprobar esto,
siempre es conveniente trabajar con un control negativo, es decir, con todos los
componentes de la mezcla de reacción, pero sin el ADN.

5.1.4 Ventajas y desventajas de la PCR

La sensibilidad de la técnica de PCR es muy elevada, pero presenta algunos inconvenientes
como el obtener falsos positivos por contaminación, como es el caso de la presencia del
ADN extraño, por lo que se hace imprescindible siempre un control negativo que permita
detectar las contaminaciones.
Es importante protocolizar la técnica para optimizar los resultados y obtener un producto
limpio y concentrado.
Los parámetros más sensibles a considerar son la concentración de cloruro magnésico, la de
los nucleótidos y ADN polimerasa, la concentración de ADN molde y el diseño de los
cebadores.
La PCR no es una técnica cuantitativa, por lo que no es posible determinar la cantidad y el
ADN molde. Para resolver este problema se han desarrollado variantes sobre el esquema de
la PCR que ha dado lugar a la PCR cuantitativa o PCR a tiempo real.
5.2 Variantes de la PCR
Según la utilidad y la finalidad que se busque, se puede trabajar con diferentes variantes de
la técnica de PCR.
5.2.1 PCR múltiplex
Consiste en la ampliación simultánea de varios fragmentos de ADN en la misma PCR. Se
consigue utilizando varios juegos de cebadores, cada uno específico para amplificar una
región diferente.
En el diseño de la PCR múltiple deben tenerse en cuenta diversos aspectos:
- Las regiones a amplificar deben ser de suficiente tamaño para poder distinguirlas en
un gel de agarosa.
- Los cebadores deben tener más de 20 monómeros y deben comprobarse que no se
hi-bridan entre ellos.
- La temperatura óptima de todos los cebadores para hibridar con su diana debe ser
similar, puesto que al usarse un único programa de termociclador, todos los
cebadores de-ben unirse al ADN molde con la misma eficiencia a la temperatura
programada para la fase de hibridación.

5.2.2 PCR nested o anidada

Se realiza una doble PCR. La primera es la convencional y la segunda se realiza sobre el
producto obtenido de la primera, pero con nuevos cebadores (se denominan cebadores
internos).
Se usa para aumentar la sensibilidad en los casos en que el rendimiento de la PCR estándar
es bajo (poca cantidad de producto amplificado) o para aumentar la especificidad en los
casos en que no es posible evitar el acúmulo de productos no deseados con una PCR
estándar.
La PCR anidada se utiliza cuando se parte de una o de muy pocas copias de DNA o de
RNA. Puede utilizarse también cuando existen dos genes con una alta homología y se desea
amplificar solamente uno de los dos. En este caso, se utilizan cebadores menos específicos
de uno de ellos y, una vez amplificado, se puede amplificar de nuevo con cebadores
específicos de uno de los dos.
5.2.3 PCR con transcripción inversa (RT-PCR)
La PCR con transcripción inversa o RT-PCR (del inglés Reverse Transcription-PCR),
permite amplificar y analizar moléculas de ARNm. Es la técnica de PCR utilizada para
detectar el virus Sars CoV- 2 que provoca la enfermedad Covid-19.
Dado que las ADN polimerasas termoestables utilizan ADN como molde, para amplificar
ARN mediante PCR es necesario realizar:
 - Un paso previo de síntesis de ADN complementario (ADNc) mediante una
retrotranscriptasa (RT) o transcriptasa inversa.
- Un segundo paso en el que una ADN polimerasa termoestable utiliza el ADNc
como molde y lo amplifica. Las RT, al igual que las ADN polimerasas necesitan
cebadores que formen una pequeña región en el ARN molde para poder sintetizar el
ADNc.

Esta técnica se combina con la utilización de fluorocromos para hacer un seguimiento de la

amplificación en un segmento de ADN. Los flurocromos se unen al ADN copiado, lo que
aumenta su fluorescencia haciendo que emita más luz, que permite detectar la secuencia. Se
cuantifica la cantidad de fluorescencia en cada ciclo y se representa en una gráfica.
Esta cuantificación de la fluorescencia es proporcional a la cantidad de ADN que se está
amplificando. Para poder conocer la cantidad total de ADN que se está amplificando, es
necesario realizar paralelamente una curva patrón en las mismas condiciones.
Hay una serie de métodos de detección del producto por fluorescencia:
- Sondas de hibridación
- Hidrólisis de la sonda
- Fluorocromos intercalantes (SYBR Green)
Los termocicladores que llevan a cabo la RT-PCR incorporan un lector de fluorescencia y
están diseñados para poder medir en todo momento la fluorescencia emitida en cada uno de
los viales en los que se realice la amplificación
Las ventajas de esta técnica frente a la PCR convencional son varias:
- Presenta mayor sensibilidad y precisión.
- Permite la amplificación de varias secuencias de DNA diferentes de una misma
reacción.
- Ahorra tiempo y se minimizan los problemas de contaminación.
- Permite que se vayan tomando datos durante el transcurso de la técnica.
5.3 Técnicas de visualización de fragmentos de ADN e interpretación de los resultados
Tras la separación por electroforesis, procederemos a la visualización de los resultados de
esta. Existen dos técnicas básicas para ello.
5.3.1 En geles de agarosa
La visualización de los ácidos nucleicos separados en geles de agarosa puede llevarse a
cabo por la introducción previa a la electroforesis en el gel de un agente químico llamado
bromuro de etidio (BrEt). control

Puesto que se sabe que el bromuro de etidio es un reactivo muy tóxico y mutagénico, se
prefiere utilizar colorantes fluorescentes alternativos para evitar riesgos mutagénicos.
Es importante disponer de un transiluminador de luz ultravioleta y un equipo de fotografía
para poder documentar los geles.
Una vez terminada la electroforesis, desconectados los cables y retirada la tapa de la cubeta,
se introduce el gel en el transiluminador ultravioleta y se fotografía.
Una vez fotografiado el gel, si se ha utilizado BrEt, debe desecharse en un recipiente
especial previsto para él y para todos los materiales que hayan estado en contacto con él:
puntas de pipeta, guantes contaminados, etc.
Los resultados se pueden registrar, tomando una fotografía del gel con una cámara
instantánea o mediante un sistema computarizado de análisis de imágenes, con un lector de
geles de agarosa y un software de imágenes de los geles.

5.3.2 Por cromatografía líquida

Algunas de estas metodologías convencionales de electroforesis no tienen suficiente
capacidad de detección de pequeños cambios en la secuencia, presentan problemas de
reproducibilidad y son poco exactas para medir cuantitativamente el producto de PCR que
se analiza.
Otras, a pesar de poseer alta capacidad de detección de mutaciones, no están suficien-
temente automatizadas para llevar a cabo el análisis rutinario de numerosas muestras de
forma reproducible.
Para detectar o medir la variabilidad del DNA de forma eficaz se ha desarrollado un mé-
todo de análisis de fragmentos de DNA basado en la cromatografía líquida de alta re-
solución adaptada al DNA (dHPLC).
Esta metodología posee una alta capacidad de detección de variaciones en la secuencia de
DNA del fragmento analizado y una alta reproductibilidad y rapidez, puesto que está
totalmente automatizado.
El sistema ofrece prestaciones diversas, como la separación de oligonucleótidos o de
fragmentos de PCR y el análisis de productos de RT-PCR competitivas para determinar
grados relativos de expresión génica.
Separación de fragmentos de DNA según su tamaño:
El proceso metodológico del análisis mediante dHPLC se debe al desarrollo de matrices de
polímeros y gradientes de soluciones apropiados para el análisis de fragmentos de DNA.
En el cromatógrafo, los fragmentos de DNA son transportados desde los pocillos de
muestra a lo largo del circuito con soluciones líquidas.
En el conjunto constituye la fase móvil. Mediante una bomba de alta presión, se desplazan
las soluciones con la muestra a analizar a través de los filtros y de la columna de separación.
Dicha columna está recubierta en su interior de un polímero no poroso, cuyas partículas son
uniformes y de pequeño tamaño. Esta caracterización permite una gran área de superficie y
una menor difusión de las moléculas de DNA, además de mayores flujos de la fase móvil y
perfiles de gradiente con pendiente muy acusadas.
La separación de los fragmentos de DNA según su tamaño se logra mediante la adsorción
diferenciada o partición entre el líquido y la matriz (fase estacionaria) en la columna de
polímero del aparato.
Las moléculas de ADN están cargadas negativamente debido a la presencia de iones
fosfatos.
Sin embargo, la fase estacionaria de la columna es eléctricamente neutra e hidrofóbica y los
fragmentos de ADN no pueden adsorberse a la matriz de la columna. Se precisa para ello
una molécula “puente”, el acetato de trietilamonio (TEAA). Los iones de amonio cargados
positivamente interaccionan con los iones de fosfato cargados negativamente de las
moléculas de ADN.
Cuanto mayor sea la longitud del fragmento de ADN, más cargas negativas interaccionan
con un mayor número de moléculas de TEAA.
Al mismo tiempo, las cadenas de alquilo de la molécula de TEAA interaccionan con la
superficie hidrofóbica de la columna. Por tanto, los fragmentos más largos son adsorbidos
más fuertemente a la fase estacionaria que los fragmentos más cortos.
Esta interacción se rompe al paso de una concentración creciente de acetatonitrilo. La
interacción entre la fase estacionaria y las cadenas alquilo de las moléculas puente se reduce
a medida que aumenta la concentración de acetatonitrilo contenida en la fase móvil. El
acetatonitrilo rompe las interacciones establecidas entre ambas fases. El gradiente de
concentración del acetatonitrilo se logra mediante una combinación cambiante de dos
soluciones de ese compuesto (A y B) a distinta concentración. Los fragmentos más cortos se
liberan y son eluídos antes que los largos debido a su menor contenido en moléculas puente
de TEAA. Por lo tanto, el sistema puede separar fragmentos según su tamaño. La
separación es más rápida que en las separaciones en gel debido a un flujo mayor de la fase
líquida.
La temperatura de análisis es un factor extremadamente importante. La más apropiada para
la separación de fragmentos con la máxima resolución es de 50ºC. A temperatura más altas
se produce un descenso rápido de la eficacia en la separación por tamaños, aunque estas
temperaturas son más adecuadas para la detección de mutaciones.
Después de pasar por la columna de separación, el circuito se completa con una lámpara de
luz ultravioleta y un detector, en el que la señal analógica se convierte en un valor y los
resultados se presentan como cromatogramas o series de picos correspondientes a los
fragmentos de DNA.

5.4. Aplicaciones las técnicas de PCR

Las técnicas de PCR tienen multitud de aplicaciones en campos diversos, pero
especialmente en el diagnóstico clínico y en el análisis forense.
5.4.1 Aplicaciones diagnósticas
El diagnóstico molecular está revolucionando la práctica de la clínica de enfermedades
infecciosas.
La PCR es una técnica que tiene una amplia gama de aplicaciones clínicas tales como la
detección de patógenos específicos o de amplio espectro, la evaluación de diferentes
infecciones, la detección temprana de agentes biológicos y la creación de perfiles de
resistencia a los antimicrobianos. Los métodos basados en PCR también pueden asociar-se a
los procedimientos tradicionales de diagnóstico.
La PCR convencional se utiliza como base para un gran número de técnicas en el
laboratorio debido a su especificidad y rapidez. Entre otras aplicaciones destacan las
siguientes:
1. Identificación de especies microbianas que producen determinados cuadros
infecciosos. Esto se consigue amplificando cierta zona del genoma del agente cuyo
producto de PCR posea características particulares que permiten identificar de una
manera inequívoca la bacteria o agente causal.
2. En el caso de infecciones virales que implican la integración del genoma del
patógeno en el ADN del hospedador, como es el caso de la infección por Sars Cov-
2, la PCR RT posibilita la determinación de la carga viral existente, y por lo tanto,
el estudio de la enfermedad.
3. Realización de la prueba de rutina en servicios de donantes de sangre. Se puede
detectar infecciones peligrosas en el donante (VIH, hepatitis B) mientras están aún
en período de incubación.
4. Diagnóstico de enfermedades hereditarias presentes en el genoma, en las cuáles los
procedimientos se presentan largos y engorrosos. La PCR facilita este problema,
 amplificando mediante iniciadores correspondientes los diferentes genes para la
identificación de mutaciones existentes.
5. Conocimiento de los mecanismos íntimos de muchas enfermedades en
dermatología. La aplicación de la PCR en las enfermedades de la piel ha facilitado
el diagnóstico y también el tratamiento de muchas enfermedades cutáneas. Esta
técnica es muy utilizada en el diagnóstico de enfermedades de la piel producidas por
parásitos, virus y bacterias.
Las enfermedades hereditarias de la piel se caracterizan por mutaciones genéticas. El
diagnóstico molecular por PCR está hoy en día disponible por múltiples enfermedades en
las que anteriormente no se disponía de técnicas diagnósticas de laboratorio, sino solamente
clínica.
Del mismo modo, las variantes de la PCR (múltiplex, anidada), sirven para aumentar la
sensibilidad y la especificidad de la reacción y se utilizan cuando partimos de cantidades
muy bajas de DNA problema.
5.4.2Aplicaciones forenses
Son muchas aplicaciones de las técnicas PCR en este campo: destacamos entre ellas:
1. Huella digital genética. Es una técnica forense que permite identificar a una
persona comparando su DNA con el de una muestra obtenida, por ejemplo, en el
escenario de un crimen. La PCR permite aumentar la cantidad de DNA
amplificando ciertos segmentos polimórficos (variables en la población) para luego
separarlos por electroforesis, lo que se conoce como fingerprint o huella digital.
2. Test de paternidad. Se realiza por amplificación de fragmentos polimórficos de
DNA de la madre del niño, del padre o de los presuntos padres por PCR.
Separándolos por electroforesis se puede visualizar una serie de segmentos que
tiene el niño, que debe compartir con el padre y con la madre biológicos.
5.4.3 Aplicaciones en investigación
Las técnicas de PCR también tienen una gran aplicación en muchas áreas de investigación,
como son los siguientes:
1. Diagnóstico de enfermedades hereditarias. Cada gen en estudio puede ser
amplificado fácilmente por PCR con los iniciadores adecuados, y luego ser
secuencia-do para poder determinar si un individuo es portador de alguna mutación
que ex-plica la presencia de una enfermedad, o su aparición en el futuro que pueda
ser heredada por su hijo.
2. Comparación de la expresión génica. Al introducir una modificación en la PCR
clásica se puede estimar la cantidad de ARNm de un determinado gen en ciertas
condiciones experimentales.
3. Clonación de genes. La PCR es utilizada normalmente para amplificar un
determinado gen o un RNAm (representado por DNAc), que puede introducirse en
un vector y luego en un organismo, que al duplicarse también duplicará el gen que
nos interesa. De esta forma, podemos obtener una cantidad apreciable de gen o de
DNAc para secuenciarlo o producir a gran escala la proteína codificada por este
gen.
4. Mutagénesis. Con variaciones en la secuencia de los primers se puede producir un
fragmento de ADN que presente diferencias en una o más bases con el ADN
 original. Así, se puede alterar una proteína para estudiar o anular su función. Esta
mutación puede producirse en un sitio determinado del gen o en un lugar al azar del
gen del genoma,
5. Análisis del ADN antiguo. Con la PCR se puede analizar ADN que tiene miles de
años de antigüedad, lo que ha permitido estudiar muestras obtenidas desde momias
o restos de animales ya extinguidos.
6. Genotipado de polimorfismos. Mediante el uso de PCR se puede determinar el
genotipado de un individuo para un polimorfismo dado, como microsatélite o un
SNP. Estos polimorfismos son muy útiles para estudios poblacionales y para
relacionar un gen o una región cromosómica con una enfermedad, ya sea mediante
estudios de asociación o de ligamiento.
Por último, hay que señalar que en ocasiones se dispone de poca y variada cantidad de
DNA, es decir, el ADN es bajo en número de copias y mezclas de perfiles de ADN.
La sensibilidad de las técnicas actuales ha hecho posible que se puedan obtener perfiles de
ADN a partir de solamente unas pocas copias (coger una prenda de ropa o un objeto unos
pocos segundos ya es suficiente para dejar perfil). Por desgracia, esto ha hecho más
compleja la interpretación al aumentar el número de casos en los que existe una mezcla de
perfiles de ADN.
El análisis de mezclas de ADN es pues una práctica habitual en la rutina forense y es uno de
los mayores retos. Para solucionar los problemas de interpretación de mezclas de perfiles se
han creado programas informáticos que nos ayudan a la interpretación de mezclas cuando
no existe la posibilidad de la separación física de los perfiles genéticos.