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9221
METROmúltiple-tubeFerMentaciónttécnica paraMETROascuas delCOLIFORMAGRAMOgrupo

Aprobado por el Comité de métodos estándar, 2014. Grupo de trabajo conjunto: Ellen B. Braun-Howland (presidenta), Jennifer Best, Robert J. Blodgett, Laura Boczek, Gil Dichter, Clifford H. Johnson.

922 1 A.IIntroducción

Las bacterias coliformes se han utilizado durante mucho tiempo como agitado antes de retirar las alícuotas o si las células bacterianas se agrupan, el
indicadores de la calidad del agua basándose en la premisa de que, debido a que valor de MPN será una subestimación de la densidad bacteriana real.
estos organismos están presentes en los intestinos de los animales de sangre
caliente, su presencia en el agua podría indicar que se ha producido una 1. Agua potable
contaminación fecal reciente. Históricamente, este grupo de organismos se ha
definido por su capacidad para fermentar lactosa, más que por los principios de Al analizar el agua potable para determinar si su calidad cumple con los
la bacteriología sistemática, por lo que el grupo consta de bacterias de varios estándares de la EPA de EE. UU., se debe analizar una muestra de 100 ml;
géneros pertenecientes a la familia Enterobacteriaceae. use la técnica de fermentación con 10 tubos repetidos cada uno con 10 ml,
Los métodos descritos en esta sección utilizan un medio de caldo a base de 5 tubos repetidos cada uno con 20 ml o una sola botella que contenga una
lactosa para detectar los productos metabólicos finales de la fermentación de la porción de muestra de 100 ml. Al examinar el agua potable a través de la
lactosa. La presencia de coliformes debe confirmarse en un medio que contenga técnica de fermentación, procese todos los tubos o botellas que
lactosa y sales biliares [caldo verde brillante de lactosa y bilis (BGLB)]. Por lo demuestren crecimiento, con o sin una reacción positiva de ácido o gas,
tanto, cuando se utilizan las técnicas de fermentación de esta sección,coliformes hasta la fase confirmada (9221 B.4). Las muestras de agua potable que son
se definen como todas las bacterias anaerobias facultativas, gramnegativas, no positivas para coliformes totales también deben analizarse para coliformes
formadoras de esporas, con forma de bastón que fermentan la lactosa para termotolerantes (fecales) (9221 E) oEscherichia coli(9221F).
producir ácido, gas o ambos en presencia de sales biliares dentro de las 48 h a 35
°C. Para el examen de rutina de los suministros públicos de agua, el objetivo de la
La prueba estándar para el grupo de coliformes puede llevarse a cabo prueba de coliformes totales es determinar la eficiencia de las operaciones de la
mediante la técnica de fermentación de tubos múltiples o el procedimiento planta de tratamiento y la integridad del sistema de distribución. La prueba
de presencia-ausencia (a través de las fases de presunción confirmada o la también se utiliza para detectar la presencia de contaminación fecal. Algunas
prueba completa) descrita en este documento, la técnica de filtro de ocurrencias de coliformes en un sistema de distribución pueden atribuirse al
membrana (MF) (Sección 9222), o la prueba de coliformes de sustrato crecimiento o supervivencia de coliformes dentro de las biopelículas bacterianas
enzimático (Sección 9223). Cada técnica es aplicable dentro de las en la tubería principal en lugar de fallas en el tratamiento en la fuente de la
limitaciones especificadas y con la debida consideración del propósito del planta o el pozo, o contaminación externa del sistema de distribución. Debido a
examen. La producción de resultados válidos requiere un cumplimiento que es difícil distinguir los coliformes que ingresan al sistema de distribución y
estricto de los procedimientos de control de calidad (QC), que se describen los coliformes que ya están presentes en la biopelícula y los sedimentos de la
en la Sección 9020. tubería, suponga que todos los coliformes se originan en una fuente fuera del
La técnica de fermentación se puede utilizar para detectar coliformes en agua sistema de distribución.
potable o cuantificar coliformes en agua potable y no potable. Cuando se utilizan
múltiples tubos, la densidad de coliformes se estima a través de una tabla de
2. Agua no potable
números más probables (MPN). Este número, generado mediante fórmulas de
probabilidad específicas, es una estimación de la densidad media de coliformes
Cuando analice aguas no potables, inocule una serie de tubos con
en la muestra. Los resultados de las pruebas de coliformes, junto con otra
diluciones decimales apropiadas del agua (múltiplos de 10 ml) según
información obtenida de estudios sanitarios o de ingeniería, proporcionan la
la densidad probable de coliformes. Utilice las fases de presunción
mejor evaluación de la eficacia del tratamiento del agua y la calidad sanitaria de
confirmada del procedimiento de tubos múltiples. Utilice la prueba
la fuente de agua.
completa que requiere más mano de obra (9221 B.5) como medida de
La precisión de la prueba de fermentación para estimar la densidad de
control de calidad en el 10 % (o un porcentaje fijo) de muestras de
coliformes depende del número de tubos utilizados. La información más
agua no potable con resultados positivos para coliformes
satisfactoria se obtiene cuando el inóculo de muestra más grande examinado
trimestralmente. Generalmente, el objetivo de analizar el agua no
muestra producción de ácido o gas en algunos o en todos los tubos; y el inóculo
potable es estimar la densidad bacteriana, determinar una fuente de
de muestra más pequeño no muestra ácido o gas en ninguno o en la mayoría de
contaminación, hacer cumplir los estándares de calidad del agua o
los tubos. La densidad bacteriana se puede estimar mediante la fórmula dada o
rastrear la supervivencia de los microorganismos. La técnica de
de la tabla utilizando el número de tubos positivos en las diluciones múltiples
fermentación de tubos múltiples se puede utilizar para obtener
(9221 C.2). El número de porciones de muestra seleccionadas se rige por la
estimaciones NMP estadísticamente válidas de la densidad de
precisión deseada del resultado. Las tablas MPN se basan en el supuesto de una
coliformes. Examine una cantidad suficiente de muestras de agua
distribución de Poisson (dispersión aleatoria). Sin embargo, si la muestra no es
para obtener resultados representativos para la estación de
adecuadamente
muestreo. Generalmente,

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 9221 TÉCNICA DE FERMENTACIÓN EN TUBO MÚLTIPLE - B. Técnica estándar de fermentación de coliformes totales

3. Otras muestras Para preparar muestras sólidas o semisólidas, pesar la muestra y

agregar diluyente para hacer un 10-1dilución. Por ejemplo, coloque 30 g de
La técnica de fermentación en tubos múltiples se aplica al análisis de aguas saladas muestra en un vaso de batidora estéril, agregue 270 ml de agua de dilución
o salobres, así como de lodos, sedimentos y lodos. Recolecte muestras como se indica tamponada con fosfato estéril o peptona al 0,1 % y mezcle durante 1 a 2
en la Sección 9060 A, utilizando los recipientes de muestra especificados en la Sección minutos a alta velocidad (8000 rpm). Prepare las diluciones decimales
9030 B.19. Siga las precauciones dadas anteriormente sobre el tamaño de las porciones apropiadas de la suspensión homogeneizada lo más rápido posible para
y el número de tubos por dilución. minimizar la sedimentación.

922 1 B.SestándartotAlColIformeFermentaciónttécnica

1. Muestras triptosa 20,0g

Lactosa 5,0 gramos

Recolecte muestras como se indica en la Sección 9060 A, utilizando los recipientes de Fosfato de hidrógeno dipotásico (K2HPO4) 2,75 gramos

muestra especificados en la Sección 9030 B.19. Siga las pautas de control de calidad Dihidrogenofosfato de potasio (KH2correos4) 2,75 gramos

para botellas de muestra descritas en la Sección 9020 B.5d. Asegúrese de que las Cloruro de sodio (NaCl) 5,0 gramos

muestras cumplan con los criterios de aceptación del laboratorio al recibirlas. Lauril Sulfato de Sodio 0,1 gramos

Agua de grado reactivo 1L

2. Control de calidad
Agregue los ingredientes deshidratados al agua, mezcle bien y caliente para
Todas las fases de la técnica de fermentación (9221 BG) requieren el disolver. Antes de la esterilización, dispense suficiente medio en los tubos de
cumplimiento de las pautas de control de calidad/garantía de calidad (QA/QC) fermentación que contienen viales invertidos (también conocidos como tubos
presentadas en la Sección 9020, que incluyen, entre otros, QC analítico (Sección Durham) para cubrir el vial invertido al menos entre la mitad y dos tercios
9020 B.9), instrumentación/equipo (Artículos 9020 B.4 y 9030 B), y suministros después de la esterilización. Alternativamente, agregue 0.01 g/L de púrpura de
(Artículo 9020 B.5). Consulte la Tabla 9020:1 para conocer los procedimientos bromocresol al caldo de lauril triptosa para determinar la producción de ácido,
clave de control de calidad. Además, tenga en cuenta las secciones relacionadas un indicador de un resultado positivo en esta parte de la prueba de coliformes.
con el almacenamiento y la preparación adecuados de los medios de cultivo No se requieren viales invertidos si se agrega púrpura de bromocresol, pero su
deshidratados y la calidad del agua (Secciones 9050 y 9020 B.5F). inclusión permite la evaluación de la producción de gas y ácido en la muestra.
Cierre los tubos con tapas de metal o de plástico resistente al calor.
Utilice medios deshidratados comerciales cuando sea posible y Prepárelo de acuerdo con la Tabla 9221:1, haciendo que el caldo de lauril
asegúrese de que sus formulaciones coincidan con las especificadas aquí triptosa se concentre lo suficiente como para que agregar porciones de muestra
porque las formulaciones comerciales pueden variar. Los medios de de 100, 20 o 10 ml al medio no reduzca las concentraciones de los ingredientes
fermentación preparados se pueden almacenar en tubos o botellas bien por debajo de las del medio estándar. Autoclave medio a 121 ° C durante 12 a 15
tapados hasta por 3 meses en la oscuridad, si las temperaturas están entre min. Asegúrese de que los viales invertidos, si se utilizan, no tengan burbujas de
1 y 30 °C y la evaporación es inferior al 10 % del volumen original. Si los aire. El pH del medio debe ser 6.8±0,2 después de la esterilización.
tubos se refrigeraron después de la esterilización, incúbelos durante la b. Procedimiento:
noche a temperatura ambiente (20 °C) antes de usarlos y deseche los que 1) Coloque los tubos de fermentación en filas de 5 o 10 tubos cada uno
muestren crecimiento o burbujas para evitar resultados falsos positivos. en una gradilla para tubos de ensayo. El número de filas y los volúmenes
Para demostrar un rendimiento medio aceptable, los controles de cultivo de muestra seleccionados dependen de la calidad y el carácter del agua a
positivos y negativos deben analizarse antes del primer uso y según se examinar. Para agua potable, se deben analizar 100 ml. Use cinco
especifique (consulte la Tabla 9020:6). Verifique y registre la esterilidad, el porciones de 20 ml, diez porciones de 10 ml o una porción de 100 ml (una
volumen por tubo y el pH. Para demostrar la comparabilidad entre lotes de sola botella). Para agua no potable, use 5 tubos por dilución (p. ej., de 10, 1,
medios, realice una prueba de uso (Sección 9020 B.5F2). 0,1 mL).
Al cambiar a la técnica de fermentación de múltiples tubos, lo ideal es Al hacer diluciones y medir volúmenes de muestras diluidas, siga las
realizar primero pruebas paralelas con el método anterior para demostrar precauciones que se indican en la Sección 9215 B.2. Utilice la Figura 9215:1
la aplicabilidad y la comparabilidad. Los resultados de muchos estudios de como guía para preparar diluciones. Agite la muestra y las diluciones
rendimiento de coliformes están disponibles en la literatura, y las tasas de
resultados falsos positivos y negativos pueden diferir entre varios medios. Cuadro 9221:1. Preparación del Caldo Lauril Triptosa
Seleccione cuidadosamente el medio y el procedimiento que mejor se
Cantidad de Volumen de Lauril deshidratado
adapte a los requisitos.
inóculo Medio adentro Medio + Caldo Triptosa
(ml) Tubo (mL) Inóculo (mL) Requerido (g/L)
3. Fase Presuntiva
1 10 o más 11 o más 35.6
10 10 20 71.2
Use caldo de lauril triptosa en esta fase de la prueba de tubos múltiples, siguiendo
10 20 30 53.4
las pautas de control de calidad citadas en 9221 B.2.
20 10 30 106.8
a. Reactivos y medio de cultivo: 100 50 150 106.8
Caldo lauril triptosa: 100 35 135 137.1
100 20 120 213.6

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 9221 TÉCNICA DE FERMENTACIÓN EN TUBO MÚLTIPLE - B. Técnica estándar de fermentación de coliformes totales

vigorosamente 5 s (alrededor de 25 veces). Inocule cada tubo en un conjunto de 5 con Incube rápidamente los tubos de caldo BGLB inoculados a 35± 0,5 ºC.
volúmenes de muestra duplicados en diluciones decimales crecientes, si se utilizan Cualquier cantidad de gas formada en el vial invertido del tubo de
cantidades decimales de la muestra. Mezcle las porciones de prueba en el medio fermentación de caldo BGLB en cualquier momento dentro de los 48±3 h
agitando suavemente. constituye una fase positiva confirmada. Para estimar la densidad de
2) Incube rápidamente los tubos o frascos inoculados, los controles de coliformes, calcule el valor de MPN a partir del número de tubos BGLB
cultivo y los espacios en blanco de esterilidad a 35±0,5 ºC. después de 24±2 positivos como se describe en 9221 C.
h, agite suavemente cada tubo o botella y examínelo en busca de C. Procedimiento alternativo:Use esta alternativa solo para agua contaminada o
crecimiento, gas y reacción ácida (tonos de color amarillo) y, si no hay gas o aguas residuales que se sabe que producen resultados positivos consistentemente.
reacción ácida evidente, vuelva a incubar y volver a examinar al final de 48± Si todos los tubos presuntivos son positivos en 2 o más diluciones
3 horas Registre la presencia o ausencia de crecimiento, gas y producción consecutivas dentro de las 24 h, entonces solo envíe a la fase confirmada los
de ácido. Si se omite el vial interior, el crecimiento con acidez (color tubos con la dilución más alta (inóculo de muestra más pequeño) en los que
amarillo) significa una presunta reacción positiva. todos los tubos sean positivos, junto con cualquier tubo positivo en diluciones
C. Interpretación:Detección de una reacción ácida (color amarillo) o aún más altas. Someter a la fase confirmada todos los tubos en los que se
gas en los tubos o botellas dentro de los 48±3 h constituye una produzca gas o crecimiento ácido en 24 a 48 h.
presunta reacción positiva. Presentar tubos o frascos con presunta
reacción positiva a la fase confirmada (9221 B.4). 5. Fase Completada
La ausencia de reacción ácida o formación de gas al final de 48±
3 h de incubación constituye una prueba negativa. Envíe muestras La prueba completa como se describe aquí no es necesaria para los análisis de
de agua potable que demuestren crecimiento sin gas positivo o muestras de cumplimiento de agua potable. Para las muestras de agua no
reacción ácida a la fase confirmada (9221 B.4). potable recolectadas bajo la Ley de Agua Limpia, ya no existe el requisito de que
el 10% de todos los tubos positivos para coliformes totales se sometan a la
4. Fase Confirmada prueba completa en forma estacional. La prueba completa se incluye aquí como
una recomendación de control de calidad y para su uso cuando los resultados de
a. Medio cultural:Use tubos de fermentación de caldo BGLB para la fase la prueba son inciertos. Como prueba adicional para coliformes termotolerantes
confirmada, siguiendo las pautas de control de calidad citadas en 9221 B.2. (fecales) oE. colise requiere de pruebas positivas de coliformes, las pruebas
Caldo de bilis de lactosa verde brillante: adicionales con caldos EC o EC-MUG se consideran una prueba completa. Para
propósitos de control de calidad, si no se reciben muestras positivas de agua
peptona 10,0 gramos potable dentro de un trimestre, entonces analice al menos una muestra positiva
Lactosa 10,0 gramos de fuente de agua para confirmar que los medios responden apropiadamente.
Oxgall 20,0g Para verificar la presencia de bacterias coliformes y proporcionar datos de
Verde brillante 0,0133 gramos control de calidad para el análisis de muestras de agua no potable, use la prueba
Agua de grado reactivo 1L completa en al menos una muestra positiva por trimestre. Si no se produce
ninguna muestra positiva dentro de un trimestre, realice una verificación de
Agregue los ingredientes deshidratados al agua, mezcle bien y caliente para
control de calidad utilizando una muestra positiva conocida. Los analistas
disolver. Antes de la esterilización, dispense el medio en los tubos de fermentación con
pueden inocular simultáneamente medios presuntivos positivos en caldo BGLB
un vial invertido, asegurándose de que haya suficiente volumen de medio para cubrir el
para la confirmación de coliformes totales y caldo EC para coliformes
vial invertido al menos entre la mitad y dos tercios después de la esterilización. Cierre
termotolerantes (fecales) (9221 E) o caldo EC MUG paraEscherichia coli(9221 F)
los tubos con tapas de metal o de plástico resistente al calor. Autoclave medio a 121 ° C
siempre que el caldo BGLB se inocule en último lugar. Resultados positivos de la
durante 12 a 15 min. Asegúrese de que los viales invertidos no tengan burbujas de aire.
incubación en caldos EC o EC-MUG a temperatura elevada (44,5±0,2 °C) puede
El pH del medio debe ser 7.2±0,2 después de la esterilización.
considerarse una prueba completa. Cultivos de caldo BGLB positivos paralelos
b. Procedimiento:Envíe de inmediato todos los presuntos tubos o botellas que con cultivos de caldo EC o EC-MUG negativos indican la presencia de coliformes
muestren crecimiento, cualquier cantidad de gas o reacción ácida dentro de las no fecales. Los tubos EC o EC-MUG positivos paralelos y los cultivos de caldo
24±2 h de incubación a la fase confirmada. Si los tubos o botellas presuntivas BGLB negativos indican la presencia de coliformes (fecales) termotolerantes oE.
adicionales muestran fermentación activa o reacción ácida al final de un 48± coli, respectivamente. Alternativamente, la prueba completa para coliformes
Período de incubación de 3 h, envíelos rápidamente a la fase confirmada. Para totales positivos se puede realizar de la siguiente manera.
confirmar colonias presuntas de coliformes que crecen en un medio sólido a. Medios de cultivo y reactivos:Siga las pautas de control de calidad citadas
utilizando medios de fermentación, consulte la Sección 9222 B.4gramo. en 9221 B.2.
Agite o gire suavemente los tubos o botellas presuntivas que 1)Agar LES Endo—Ver Sección 9222 B.2a. Utilice placas de Petri de 100 ×
muestren gas o crecimiento ácido para resuspender los organismos. 15 mm.
Con un asa estéril de 3,0 a 3,5 mm de diámetro, transfiera una o más 2)Agar Mac Conkey:
asas llenas de cultivo a un tubo de fermentación que contenga caldo
BGLB. Como alternativa, inserte un aplicador de madera estéril al
peptona 17 gramos
menos 2,5 cm en el cultivo, retírelo rápidamente y sumerja el peptona de proteosa 3 gramos

aplicador en el fondo del tubo de fermentación que contiene el caldo Lactosa 10g
BGLB. Retire y deseche el aplicador. Repita para todos los demás sales biliares 1,5 gramos

tubos presuntivos positivos. Los analistas pueden inocular Cloruro de sodio (NaCl) 5 gramos

simultáneamente caldo BGLB para coliformes totales y caldo EC para agar 13,5 gramos

coliformes termotolerantes (fecales) (ver 9221 E) o caldo EC-MUG para rojo neutro 0,03 gramos

Escherichia coli(ver 9221 F). Sin embargo, si utiliza el mismo asa o el Cristal violeta 0,001 gramos

aplicador de madera para inocular un cultivo en más de un medio, Agua de grado reactivo 1L
inocule el medio más inhibidor (caldo BGLB) en último lugar.

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 9221 TÉCNICA DE FERMENTACIÓN EN TUBO MÚLTIPLE - B. Técnica estándar de fermentación de coliformes totales

Agregue los ingredientes al agua, mezcle bien y caliente hasta que hierva para o colonias de coliformes bien aisladas más típicas o, si no hay colonias típicas
disolver. Esterilizar en autoclave durante 15 min a 121 °C. Templar el agar presentes, elija 2 o más colonias que se consideren con mayor probabilidad de
después de la esterilización y verter en placas de Petri (100 × 15 mm). El pH del ser coliformes. Transfiera el crecimiento de cada aislado a un tubo de
medio debe ser 7.1±0,2 después de la esterilización. fermentación de caldo de lauril triptosa de concentración simple y a un agar
3)Agar nutriente: nutritivo inclinado.
Si es necesario, utilice un dispositivo de aumento de colonias para
peptona 5,0 gramos proporcionar un aumento óptimo cuando se extraen colonias de las placas
extracto de carne 3,0g de agar LES Endo o MacConkey. Al transferir colonias, elija las que estén
agar 15,0g bien aisladas y apenas toque la superficie de la colonia con una aguja de
Agua de grado reactivo 1L transferencia esterilizada con llama y enfriada con aire para minimizar el
peligro de transferir un cultivo mixto.
Agregue los ingredientes al agua, mezcle bien y caliente para disolver. Antes Incube los tubos de caldo secundario (caldo de lauril triptosa con viales
de la esterilización, dispense en tubos con tapa roscada. Autoclave a 121 °C de fermentación invertida) a 35±0,5 °C durante 24±2h; si no se produce gas
durante 15 min. El pH del medio debe ser 6,8±0,2 después de la esterilización. dentro de 24±2 h, reincubar y examinar de nuevo a 48±3 horas Examine
Después de la esterilización, coloque inmediatamente los tubos en una posición microscópicamente las preparaciones teñidas con Gram de los cultivos
inclinada para que el agar se solidifique con una superficie inclinada. Apriete las inclinados de agar nutritivo de 24 h correspondientes a los tubos
tapas de rosca después de enfriar y almacene en un área de almacenamiento secundarios que muestran gas.
fresca y protegida. 3) Técnica de tinción de Gram: la tinción de Gram se puede omitir de la prueba
4)Reactivos de tinción de Gram—Los reactivos están disponibles comercialmente completa para muestras de agua potable solo porque las bacterias Gram
como soluciones preparadas. positivas y los organismos formadores de esporas en el agua potable rara vez
a)Cristal violeta de oxalato de amonio (Hucker)—Disolver 2 g de cristal sobreviven a este procedimiento de detección selectiva.
violeta (90 % de contenido de colorante) en 20 ml de alcohol etílico al 95 %. Existen varias modificaciones de la técnica de tinción de Gram. Use
Precaución: Inflamable.Disolver 0,8 g (NH4)2C2O4⋅H2O en 80 mL de agua la modificación de Hucker (como sigue) para teñir frotis de cultivos
grado reactivo. Mezclar las 2 soluciones y envejecer durante 24 h antes de puros; incluir un cultivo Gram-positivo y Gram-negativo como
usar. Filtrar a través de papel en una botella de tinción. controles.
b)Solución de Lugol, modificación de Gram—Moler 1 g de cristales de En un portaobjetos, prepare emulsiones ligeras separadas del crecimiento
yodo y 2 g de KI en un mortero. Agregue agua de grado reactivo, unos bacteriano de prueba y cultivos de control positivo y negativo usando gotas de
pocos mililitros a la vez, y muela bien después de cada adición hasta que se agua de grado reactivo en el portaobjetos. Secar al aire, fijar pasando el
complete la solución. Enjuague la solución en una botella de vidrio ámbar portaobjetos a través de una llama y teñir durante 1 min con solución de cristal
con el agua restante, utilizando un total de 300 ml. violeta de oxalato de amonio. Enjuague el portaobjetos con agua del grifo y
C)contratinción—Disolver 2,5 g de colorante de safranina en 100 mL de escurra el exceso; aplicar solución de Lugols durante 1 min.
alcohol etílico al 95%. Agregue 10 ml a 100 ml de agua de grado reactivo. Enjuague el portaobjetos manchado en agua del grifo. Decolore durante
Precaución: Inflamable. aproximadamente 15 a 30 s con alcohol de acetona sujetando el portaobjetos
d)alcohol de acetona—Mezclar volúmenes iguales de alcohol etílico entre los dedos y dejando que el alcohol de acetona fluya a través del frotis
(95%) con acetona.Precaución: Inflamable. teñido hasta que el solvente fluya sin color desde el portaobjetos. No decolore en
b. Procedimiento: exceso. Contraste con safranina durante 15 s, enjuague con agua del grifo, seque
1) Usando una técnica aséptica, sembrar una capa de agar LES Endo (Sección con papel absorbente o seque al aire y examine al microscopio. Los organismos
9222 B.2a) o placa de agar MacConkey de cada tubo positivo presuntivo de caldo grampositivos son azules; Los organismos gramnegativos son rojos. Los
BGLB tan pronto como sea posible después de observar el gas. Rayar las placas resultados son aceptables solo cuando los controles han dado las reacciones
de manera que se asegure la presencia de algunas colonias discretas separadas adecuadas.
por al menos 0,5 cm. Para obtener una alta proporción de aislamientos exitosos C. Interpretación:Formación de gas en el tubo secundario de caldo de
si hay organismos coliformes presentes, use el siguiente enfoque: lauril triptosa dentro de los 48±3 h y la demostración de bacterias
gramnegativas, no formadoras de esporas y con forma de bastoncillo del
a) Utilice un asa estéril de 3 mm de diámetro o una aguja de inoculación cultivo de agar constituyen un resultado positivo para la prueba completa,
ligeramente curvada en la punta; lo que demuestra que está presente un miembro del grupo de coliformes.
b) golpee suavemente e incline el tubo de fermentación para evitar recoger
cualquier membrana o espuma en la aguja;
Bibliografía
c) insertar el extremo del lazo o aguja en el líquido del tubo hasta una
profundidad de aproximadamente 0,5 cm; y Hucker GJ, Conn HJ. Más estudios sobre los métodos de tinción de Gram
d) rayar una placa de aislamiento con la sección curva de la aguja en (Boletín Técnico N° 128). Ginebra (NY): Estación Experimental Agrícola
contacto con el agar para evitar que se raye o rompa la superficie. Flamee del Estado de Nueva York; 1927.
el bucle entre el segundo y el tercer cuadrante para mejorar el aislamiento Cowles PB. Un tubo de fermentación modificado. J Bacteriol. 1939;38(6):677–
de la colonia. 678.
Incubar las placas, invertidas, a 35±0,5 °C durante 24±2 horas Skerman VBD. Una guía para la identificación de los géneros de bacterias.
2) Las colonias que se desarrollan en agar LES Endo se definen como Baltimore (MD): Williams & Wilkins; 1967.
típico(rosa a rojo oscuro con un brillo superficial metálico verde) o atípico( Evans TM, Waarvick CE, Seidler RJ, LeChevallier MW. fracaso de la
técnica del número más probable para detectar coliformes en agua potable y
colonias rosadas, rojas, blancas o incoloras sin brillo) después de 24 h de
suministros de agua cruda. Aplicación Environ Microbiol. 1981;41(1):130–138.
incubación. Las colonias típicas de fermentación de lactosa que se
Gerhards P, ed. Manual de métodos para bacteriología general. Washington
desarrollan en agar MacConkey son rojas y pueden estar rodeadas por una (DC): Sociedad Americana de Microbiología; 1981.
zona opaca de bilis precipitada. De cada plato, elige uno

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 9221 TÉCNICA DE FERMENTACIÓN EN MÚLTIPLES TUBOS - C. Estimación de la Densidad Bacteriana

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922 1 c. miESTIMACIÓN DEBACTERIALdenSidad

1. Precisión de la prueba de fermentación en tubos múltiples directrices, las 3 diluciones del Ejemplo A se seleccionan mediante la eliminación
de las diluciones más altas (0,001 ml) y más bajas (10 ml).
La prueba de fermentación de tubos múltiples no es muy precisa a Si la dilución más baja no tiene todos los tubos positivos y varias de
menos que se examinen muchas porciones de muestra, así que tenga las diluciones más altas tienen todos los tubos negativos, elimine las
cuidado al interpretar el significado sanitario de cualquier resultado de diluciones negativas más altas (Ejemplo B).
coliformes. La precisión mejora mucho cuando se estiman por separado Pueden quedar más de 3 diluciones después de retirar la dilución más
varias muestras de un punto de muestreo determinado y se calcula su baja con todos los tubos positivos y las diluciones altas con todos los tubos
media geométrica. negativos. En este caso, si la dilución más alta contodotubos positivos está
Aunque las tablas y los cálculos del número más probable (NMP) se describen para dentro de 2 diluciones de la dilución más alta concualquiertubos positivos,
su uso en la prueba de coliformes, también se pueden usar para determinar el NMP de luego use la dilución más alta concualquiertubos positivos y las 2 diluciones
cualquier organismo siempre que se disponga de medios de prueba adecuados. Las inmediatamente inferiores. En el Ejemplo C, la dilución más alta con todos
calculadoras de MPN en línea están disponibles, pero hasta que se haya verificado la los tubos positivos es de 0,1 mL, que está dentro de 2 diluciones de 0,001
precisión de una calculadora, confirme sus resultados usando una tabla de MPN en esta mL, que tiene 1 tubo positivo. En el ejemplo D, la mayor
sección.

2. Uso de tablas para determinar MPN Cuadro 9221:2. Índice MPN y límites de confianza del 95 % para todas las
combinaciones de resultados positivos y negativos cuando se utilizan cinco

Registre la concentración de coliformes como MPN/100 mL. Los porciones de 20 ml

valores de MPN para una variedad de combinaciones de tubos 95% de confianza

No. de tubos que dan
positivos y negativos se dan en la Tabla 9221:2, Tabla 9221:3 y Límites (Exacto)
reacción positiva Índice MPN/
Tabla 9221:4. Los volúmenes de muestra indicados en las tablas de 5 (20 ml cada uno) 100ml Más bajo Superior
9221:2 y 3 se eligen especialmente para análisis de agua potable.
La Tabla 9221:4 ilustra los valores de MPN para combinaciones de 0 <1.1 – 3.5
resultados positivos y negativos cuando se analizan cinco
1 1.1 0.051 5.4
2 2.6 0.40 8.4
volúmenes de porciones de muestra de 10 ml, cinco de 1,0 ml y
3 4.6 1.0 13
cinco de 0,1 ml de agua no potable. Si los volúmenes de las
4 8.0 2.1 23
porciones de muestra analizados son idénticos a los que se
5 > 8,0 3.4 –
encuentran en las tablas, informe el valor correspondiente a la
combinación adecuada de resultados positivos y negativos como
MPN/100 ml. Sin embargo, si la serie de diluciones decimales es Cuadro 9221:3. Índice MPN y límites de confianza del 95 % para todas las
diferente, seleccione el valor MPN en la Tabla 9221: combinaciones de resultados positivos y negativos cuando se utilizan diez
porciones de 10 ml
MPN/100 mL = (Tabla MPN/100 mL)×10/V
Número de tubos que dan
Límites de confianza del 95% (Exacto)
una reacción positiva índice NMP/
dónde: de 10 (10 ml cada uno) 100ml Más bajo Superior

V = volumen de la porción de muestra en la dilución más baja seleccionada. 0 <1.1 – 3.4

1 1.1 0.051 5.9
Si la serie decimal1incluye más de 3 diluciones, use las siguientes pautas 2 2.2 0.37 8.2
para seleccionar las 3 diluciones más apropiadas y luego use la Tabla 3 3.6 0.91 9.7
9221:4 y la ecuación anterior para calcular el MPN. Consulte la Tabla 4 5.1 1.6 13
9221:5, que proporciona varios ejemplos (AG) de combinaciones de 5 6.9 2.5 15
positivos. Primero, retire la dilución más alta (el volumen de muestra más 6 9.2 3.3 19
pequeño) si tiene todos los tubos negativos y al menos una dilución 7 12 4.8 24
restante tiene un tubo negativo. Luego, retire la dilución más baja (el 8 dieciséis 5.8 34
volumen de muestra más grande) si tiene todos los tubos positivos y al 9 23 8.1 53
menos una dilución restante tiene un tubo positivo. De acuerdo con estos 10 > 23 13 –

https://doi.org/10.2105/SMWW.2882.192 5
 9221 TÉCNICA DE FERMENTACIÓN EN MÚLTIPLES TUBOS - C. Estimación de la Densidad Bacteriana

Cuadro 9221:4. Índice MPN y límites de confianza del 95 % para varias combinaciones de resultados positivos cuando se utilizan cinco tubos por dilución (10 ml, 1,0 ml,
0,1 ml)a

Límites de confianza Límites de confianza

Combinación de Índice MPN/ Combinación de Índice MPN/
Positivos 100ml Bajo Alto Positivos 100ml Bajo Alto
0-0-0 <1.8 – 6.8 4-0-3 25 9.8 70
0-0-1 1.8 0.090 6.8 4-1-0 17 6.0 40
0-1-0 1.8 0.090 6.9 4-1-1 21 6.8 42
0-1-1 3.6 0.70 10 4-1-2 26 9.8 70
0-2-0 3.7 0.70 10 4-1-3 31 10 70
0-2-1 5.5 1.8 15 4-2-0 22 6.8 50
0-3-0 5.6 1.8 15 4-2-1 26 9.8 70
1-0-0 2.0 0.10 10 4-2-2 32 10 70
1-0-1 4.0 0.70 10 4-2-3 38 14 100
1-0-2 6.0 1.8 15 4-3-0 27 9.9 70
1-1-0 4.0 0.71 12 4-3-1 33 10 70
1-1-1 6.1 1.8 15 4-3-2 39 14 100
1-1-2 8.1 3.4 22 4-4-0 34 14 100
1-2-0 6.1 1.8 15 4-4-1 40 14 100
1-2-1 8.2 3.4 22 4-4-2 47 15 120
1-3-0 8.3 3.4 22 4-5-0 41 14 100
1-3-1 10 3.5 22 4-5-1 48 15 120
1-4-0 11 3.5 22 5-0-0 23 6.8 70
2-0-0 4.5 0.79 15 5-0-1 31 10 70
2-0-1 6.8 1.8 15 5-0-2 43 14 100
2-0-2 9.1 3.4 22 5-0-3 58 22 150
2-1-0 6.8 1.8 17 5-1-0 33 10 100
2-1-1 9.2 3.4 22 5-1-1 46 14 120
2-1-2 12 4.1 26 5-1-2 63 22 150
2-2-0 9.3 3.4 22 5-1-3 84 34 220
2-2-1 12 4.1 26 5-2-0 49 15 150
2-2-2 14 5.9 36 5-2-1 70 22 170
2-3-0 12 4.1 26 5-2-2 94 34 230
2-3-1 14 5.9 36 5-2-3 120 36 250
2-4-0 15 5.9 36 5-2-4 150 58 400
3-0-0 7.8 2.1 22 5-3-0 79 22 220
3-0-1 11 3.5 23 5-3-1 110 34 250
3-0-2 13 5.6 35 5-3-2 140 52 400
3-1-0 11 3.5 26 5-3-3 170 70 400
3-1-1 14 5.6 36 5-3-4 210 70 400
3-1-2 17 6.0 36 5-4-0 130 36 400
3-2-0 14 5.7 36 5-4-1 170 58 400
3-2-1 17 6.8 40 5-4-2 220 70 440
3-2-2 20 6.8 40 5-4-3 280 100 710
3-3-0 17 6.8 40 5-4-4 350 100 710
3-3-1 21 6.8 40 5-4-5 430 150 1100
3-3-2 24 9.8 70 5-5-0 240 70 710
3-4-0 21 6.8 40 5-5-1 350 100 1100
3-4-1 24 9.8 70 5-5-2 540 150 1700
3-5-0 25 9.8 70 5-5-3 920 220 2600
4-0-0 13 4.1 35 5-5-4 1600 400 4600
4-0-1 17 5.9 36 5-5-5 > 1600 700 –
4-0-2 21 6.8 40
aResultados a 2 cifras significativas.

la dilución con todos los tubos positivos es de 0,01 ml, que está dentro de 2 los tubos contienen 10 mL; esta dilución se eliminó en el segundo paso. Quedan
diluciones decimales de 0,001 ml, para producir una combinación de 4-5-1. cuatro diluciones, ninguna de las cuales tiene todos los tubos positivos. En estas
Si, después de retirar la dilución más baja con todos los tubos positivos, no circunstancias, seleccione las 2 diluciones restantes más bajas correspondientes
queda ninguna dilución con todas las reacciones positivas, seleccione las 2 a 1 y 0,1 mL de muestra. Para la tercera dilución, agregue el número de tubos
diluciones más bajas y asigne la suma de las diluciones restantes a la tercera positivos en todas las diluciones más altas (0,01 y 0,001 ml de muestra), para
dilución. En el Ejemplo E, la dilución más alta con todos los positivos obtener una combinación final de 4-4-1.

https://doi.org/10.2105/SMWW.2882.192 6
 9221 TÉCNICA DE FERMENTACIÓN EN MÚLTIPLES TUBOS - C. Estimación de la Densidad Bacteriana

Si ninguna dilución tiene todos los tubos positivos (Ejemplo F), 1%, indica que la técnica es defectuosa o que no se cumplen los
seleccione las 2 diluciones más bajas, correspondientes a 10 y 1 mL de supuestos estadísticos que subyacen a la estimación del MPN (p. ej.,
muestra. Para la tercera dilución, agregue el número de tubos positivos en inhibición del crecimiento a bajas diluciones).
las diluciones restantes (0,1, 0,01 y 0,001 ml de muestra) para obtener una El MPN para combinaciones que no aparecen en la tabla, o para otras
combinación final de 4-3-2. Si a la tercera dilución se le asignan más de 5 combinaciones de tubos o diluciones, puede serestimadode la siguiente
tubos positivos, entonces la combinación seleccionada no estará en la manera: Primero, seleccione la dilución más baja que no tenga todos los
Tabla 9221:4. resultados positivos. En segundo lugar, seleccione la dilución más alta con
Si las 3 diluciones seleccionadas no se encuentran en la Tabla 9221:4, al menos 1 resultado positivo. Finalmente, selecciona todas las diluciones
entonces algo en la dilución en serie fue inusual. En este caso, es posible entre ellas. Por ejemplo, de (10/10, 10/10, 4/10, 1/10, 0/10) use solo (–, –,
que no se apliquen los métodos habituales para calcular el MPN que se 4/10, 1/10, –), correspondiente a 4/10 en 0.1 mL muestra/tubo y 1/10 a 0,01
presentan aquí. Si no se puede recolectar una nueva muestra y todavía se mL muestra/tubo. Asimismo, de (10/10, 10/10, 10/10, 0/10, 0/10),
desea un valor de MPN, use la dilución más alta con al menos 1 tubo seleccione solo (–, –, 10/10, 0/10, –), correspondiente a 10/10 a 0,1 mL
positivo y las 2 diluciones inmediatamente más bajas que las 3 diluciones muestra/tubo y 0/10 a 0,01 mL muestra/tubo. Use solo las diluciones
seleccionadas. En el Ejemplo G, la primera selección, 4-3-6 (el resultado de seleccionadas en la siguiente fórmula de Thomas:1
las 3 diluciones más altas), no está en la Tabla 9221:4 porque 6 es mayor
que 5. La segunda selección, de acuerdo con las pautas anteriores, sería 3
MPN/100 mL (aprox.) =100×PAG/(norte×T)1/2
-2-1. Si este segundo conjunto de diluciones seleccionadas no está en la
Tabla 9221:4, utilice la siguiente fórmula para calcular el MPN:
dónde:

- PAG=número de resultados positivos,

norte=volumen de muestra en todas las porciones negativas combinadas (mL),
230.3 ------- −
xz
ss -------------
y
− 10-1
registro
zs k T=volumen total de muestra en las diluciones seleccionadas (mL).
---- ∑ nortejzj-----

--- j=s Eso es,norte= ∑(nortej−Xj)zj,PAG= ∑Xj,yT= ∑nortejzj,donde las sumas son
sobre las diluciones seleccionadas, yXj=el número de tubos
dónde: positivos en eljeldilución.
En el primer ejemplo anterior,
zs=la cantidad de la muestra original inoculada en cada tubo de
la dilución algo,
Xs=el número de tubos positivos en la dilución sth, k= MPN/100 mL (aprox.) =100×5/(0,69×1.1)1/2
el número de diluciones, =500/0,87 = 570/100 ml
j=una dilución,
s=la dilución más alta con al menos un tubo positivo, nortej= En el segundo ejemplo anterior,
el número de tubos en la j-ésima dilución, y
zj=la cantidad de la muestra original inoculada en cada tubo en
eljeldilución. MPN/100 mL (aprox.) =100×10/(0,1×1.1)1/2
=1000/0,332 = 3000/100 ml
Por ejemplo, en la serie xx-3-0-0, donde el tercer nivel de
dilución (zs) es igual a 0,1 ml,Xszs=0.3 y Σnortejzj=0.555. Así, el
Los 2 ejemplos se comparan bien con los MPN verdaderos, 590/100 mL y
MPN calculado = 780/100 mL.
2400/100 mL, respectivamente. El segundo ejemplo es un caso especial en el que
Esta fórmula también se aplica a las diluciones en serie que tienen todos los
se puede calcular directamente una solución exacta para las 2 diluciones
tubos positivos en una sola dilución y puede servir como una aproximación para
seleccionadas.
resultados como 5-5-5-0-0-0, donde se usan 5 tubos por dilución, usando solo el
Al resumir los resultados de varias muestras con un solo valor
último. 4 diluciones.
de MPN, utilice la media geométrica o la mediana. La media
La tabla 9221:4 muestra todas las combinaciones de tubos positivos menos las
geométrica se calcula promediando los valores logarítmicos; por
improbables para una serie de 3 diluciones. Al probar 10 muestras, hay un 99 %
ejemplo, la media geométrica deun, b,yCes 10Ldónde:
de posibilidades de encontrar todos los resultados entre estos 95 resultados. Si
las combinaciones no tabuladas ocurren con una frecuencia mayor que

Cuadro 9221:5. Ejemplos de elección de 3 combinaciones de positivos de 5 diluciones

Combinación de Índice MPN

Ejemplo 10 1 Volumen (ml) 0,1 0.01 0.001 Positivos (Núm./100 mL)

A 5 5 1 0 0 x-5-1-0-x 330
B 4 5 1 0 0 4-5-1-xx 48
C 5 2 5 2 1 xx-5-2-1 7000
D 4 5 4 5 1 xx-4-5-1 4800
mi 5 4 4 0 1 x-4-4-1-x 400
F 4 3 0 1 1 4-3-2-xx 39
GRAMO 4 3 3 2 1 xx-3-2-1 1700

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 9221 TÉCNICA DE FERMENTACIÓN EN TUBO MÚLTIPLE - D. Prueba de presencia-ausencia (PA) de coliformes

Eisenhart C, Wilson PW. Métodos estadísticos y de control en bacteriología.

L= (registro10A+log10B+log10C)/3
Bacteriol Rev. 1943;7(2):57–137.
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Los valores medios se reportan como el antilogaritmo deL. número probable”. Biometría. 1950;6(2):105–116.
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Asociación de Obras Hidráulicas 1957;49(8):1060–1068.
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por el método de tubo de fermentación. Pub Health Rep. 1934;49(12):393–405.

922 1 día PAGreSencia-ABSencia(PA) colIformetest

La prueba de presencia-ausencia (PA) para el grupo de coliformes es una extracto de carne 3,0 gramos

modificación simple del procedimiento de tubos múltiples que está diseñada peptona 5,0 gramos

para usarse en muestras de rutina recolectadas de sistemas de distribución o Lactosa 7,46 gramos

plantas de tratamiento de agua. Esta simplificación que utiliza una porción de triptosa 9,83 gramos

prueba grande (100 ml) en una sola botella de cultivo para determinar Fosfato de hidrógeno dipotásico (K2HPO4) 1,35 gramos

cualitativamente si los coliformes están presentes o ausentes se justifica con la Dihidrogenofosfato de potasio (KH2correos4) 1,35 gramos

teoría de que no hay coliformes presentes en 100 ml de una muestra de agua Cloruro de sodio (NaCl) 2,46 gramos

potable. Además, permite a los analistas examinar más muestras en un período Lauril Sulfato de Sodio 0,05 gramos

Púrpura de bromocresol 0,0085 gramos

de tiempo determinado en comparación con los métodos cuantitativos. Los
estudios comparativos con el procedimiento de filtro de membrana indican que
Agua de grado reactivo 1L
la prueba PA puede maximizar la detección de coliformes en muestras que
Haga que esta formulación tenga una fuerza triple (3x) al examinar
contienen muchos organismos que podrían crecer demasiado en las colonias de
muestras de 100 ml. Disolver el medio PA en agua removiendo (no
coliformes y causar problemas de detección.
usar calor). Dispense 50 mL del medio preparado en botellas de
El caldo PA contiene lactosa y un indicador de pH para detectar la
dilución de leche de 250 mL con tapón de rosca o recipientes
presencia de producción de ácido. Los analistas observan las botellas de
equivalentes. Un inserto de vial de fermentación es innecesario.
cultivo para la producción de gas y ácido, los productos metabólicos finales
Autoclave por 12 min a 121 °C; limite el tiempo total en el autoclave a
de la fermentación de la lactosa. Los resultados positivos presuntivos de
30 min o menos. El pH del medio debe ser 6.8±0,2 después de la
coliformes obtenidos del caldo PA deben confirmarse con el caldo BGLB.
esterilización.
Si se esteriliza por filtración, se puede usar un medio PA de 6x de
potencia. Dispense asépticamente 20 ml del medio 6x en una botella de
1. Muestras dilución estéril de 250 ml o un recipiente equivalente.
b. Procedimiento:Agite la muestra enérgicamente durante 5 s
Recopile muestras como se indica en la Sección 9060, usando los recipientes de
(aproximadamente 25 veces) e inocule 100 ml en una botella de cultivo PA.
muestra especificados en la Sección 9030 B.19. Siga las pautas de control de calidad
Mezcle bien invirtiendo la botella una o dos veces para distribuir
para botellas de muestra descritas en la Sección 9020 B.5d. Asegúrese de que las
uniformemente la muestra por todo el medio. Incubar a 35±0,5 °C e
muestras cumplan con los criterios de aceptación del laboratorio al recibirlas.
inspeccionar después de 24±2h y 48±3 h para reacciones ácidas.
C. Interpretación:Si existen condiciones ácidas después de la
2. Fase Presuntiva fermentación de la lactosa, se forma un color amarillo distintivo en el
medio. Si también se produce gas, se producirá espuma cuando se agite
a. Medio cultural: suavemente la botella. Cualquier cantidad de gas o ácido constituye una
caldo PA:Siga las pautas de control de calidad citadas en 9221 B.2. prueba presuntamente positiva que requiere confirmación.

https://doi.org/10.2105/SMWW.2882.192 8
 9221 TÉCNICA DE FERMENTACIÓN EN TUBO MÚLTIPLE - D. Prueba de presencia-ausencia (PA) de coliformes

Figura 9221:1. Resumen esquemático de las fases presuntiva, confirmada y completada para la detección de coliformes totales.

3. Fase Confirmada 4. Fase Completada

La fase confirmada se describe en la Figura 9221:1. La fase completa, requerida para el análisis de muestras de agua no
a. Medio cultural:Utilice tubos de fermentación de caldo BGLB (consulte potable, se describe en 9221 B.5 y Figura 9221:1.
9221 B.4).
b. Procedimiento:Después de la incubación, use rápidamente un 3.0- a Bibliografía
Asa estéril de 3,5 mm de diámetro para transferir una o más asas
llenas de cultivo desde una botella presuntamente positiva a un tubo Weiss JE, Hunter CA. Examen bacteriológico simplificado del agua. j
de fermentación que contiene caldo BGLB. Como alternativa, inserte Asociación de Obras Hidráulicas de Amer. 1939;31(4):707–713.

un aplicador de madera estéril al menos 2,5 cm en el cultivo, retírelo Clark JA. La detección de varias bacterias indicadoras de contaminación del agua

rápidamente y sumerja el aplicador en el fondo de un tubo de lución por un procedimiento de presencia-ausencia (PA). Can J Microbiol.
fermentación que contenga caldo BGLB. Retire y deseche el aplicador. 1969; 15 (7): 771–780.
Clark JA, Vlasoff LT. Relaciones entre bacterias indicadoras de contaminación
Repita para todos los demás tubos positivos presuntivos e inocule a 35
aislado del agua cruda y de los sistemas de distribución por la prueba de presencia-
± 0,5 °C (ver 9221 B.4).
ausencia (PA). Ciencias del laboratorio de salud. 1973;10(3):163–172.
Asas llenas de cultivo de frascos presuntivamente positivos también
Clark JA. La influencia de un número creciente de organismos no indicadores
pueden transferirse a caldo EC [para la determinación de coliformes a la detección de organismos indicadores por el filtro de membrana y
(fecales) termotolerantes], caldo EC-MUG (paraE. colideterminaciones), o pruebas de presencia-ausencia. Can J Microbiol. 1980;26(7):827–832.
ambos al mismo tiempo, siempre que el medio más inhibidor (caldo BGLB) Clark JA, Burguer CA, Sabatinos LE. Caracterización de bacterias indicadoras
se inocule en último lugar. ria en agua cruda municipal, agua potable y nuevas muestras de agua
C. Interpretación:Producción de gas en el caldo de cultivo BGLB dentro principal. Can J Microbiol. 1982;28(9):1002–1013.
de los 48±3 h confirma la presencia de bacterias coliformes. Reporte el Jacobs NJ, Zeigler WL, Reed FC, Stukel TA, Rice EW. Comparación de
filtro de membrana, tubo de fermentación múltiple y técnicas de presencia-ausencia
resultado como prueba PA positiva o negativa para coliformes totales en
para detectar coliformes totales en sistemas de agua de comunidades pequeñas.
100 mL de muestra. Las muestras de agua potable que son positivas para
Aplicación Environ Microbiol. 1986;51(5):1007–1012.
coliformes totales también deben analizarse para coliformes
Rice EW, Geldreich EE, Read EJ. La prueba de presencia-ausencia de coliformes para
termotolerantes (fecales) (9221 E) oE. coli(9221F).
monitoreo de la calidad del agua potable. Pub Health Rep. 1989;104(1):54.

https://doi.org/10.2105/SMWW.2882.192 9
 9221 TÉCNICA DE FERMENTACIÓN EN TUBO MÚLTIPLE - E. Procedimiento para coliformes termotolerantes (fecales)

922 1 e. thermotolerant(FecAl) ColIformePAGprocedimiento

Tradicionalmente llamadocoliformes fecales,Los coliformes 2) Coloque todos los tubos de EC en un baño de agua circulante (preferiblemente
termotolerantes (aquellos que fermentan la lactosa para producir gas a con una cubierta a dos aguas) dentro de los 30 minutos posteriores a la inoculación.
44,5 °C) se han documentado en aguas orgánicamente ricas o climas Incubar los tubos de caldo EC inoculados a 44,5±0,2 °C durante 24±2 horas Mantenga
tropicales en ausencia de contaminación fecal reciente. Al buscar evidencia una profundidad de agua suficiente en la incubadora de baño de agua para sumergir
de contaminación fecal, las pruebas deE. coli—se recomienda un indicador los tubos hasta el nivel superior del medio.
más específico. No obstante, las reglamentaciones pueden exigir que se C. Interpretación:Producción de gas con crecimiento en un caldo de
identifiquen y enumeren los coliformes (fecales) termotolerantes. cultivo EC dentro de 24±2 h o menos se considera una reacción positiva de
Para analizar los coliformes termotolerantes, use uno de los coliformes termotolerantes (fecales). La falta de producción de gas (con
procedimientos de tubos múltiples descritos aquí o los métodos de filtro de poco o ningún crecimiento) constituye una reacción negativa. Si se utilizan
membrana descritos en las Secciones 9222 D y E. En la técnica de varios tubos, calcule el MPN de coliformes termotolerantes a partir del
fermentación de tubos múltiples, los coliformes termotolerantes se número de tubos de caldo EC positivos, como se describe en 9221 C.
identifican por su capacidad de fermentar lactosa para producir gas a 44.5± Cuando utilice un solo tubo para subcultivo de una sola botella presuntiva,
0,2 °C en 24±2 horas notifique la presencia o ausencia de coliformes termotolerantes. Si se
produce un gran crecimiento sin producción de gas, someta el cultivo a un
1. Prueba de coliformes termotolerantes (medio EC) coliforme termotolerante oE. coliprueba usando un medio diferente.

La prueba de coliformes termotolerantes con medio EC es aplicable a 2. Prueba directa de coliformes (fecales) termotolerantes (medio A-1)
investigaciones de agua potable, contaminación de corrientes, fuentes de agua
cruda sin filtrar, sistemas de tratamiento de aguas residuales, aguas de baño, a. Medio A-1:Este medio se puede utilizar para aislar directamente
aguas de mar y monitoreo general de la calidad del agua. No utilice el medio EC coliformes termotolerantes de fuentes de agua sin filtrar, aguas residuales
para aislar coliformes termotolerantes directamente del agua; se requiere un tratadas y agua de mar, pero no agua potable. Siga las pautas en 9221 B.1
enriquecimiento previo en un medio presuntivo para una recuperación óptima para la recolección de muestras. A diferencia del medio EC, el medio A-1 no
de coliformes termotolerantes. (Para probar colonias presuntas de coliformes requiere un enriquecimiento previo en un medio presuntivo para una
que crecen en medios sólidos, consulte la Sección 9222 G.3C) recuperación óptima de coliformes termotolerantes. Use las pautas de
control de calidad citadas en 9221 B.2.
a. Medio CE:Prepare el medio EC siguiendo las pautas de control de calidad
citadas en 9221 B.2. Lactosa 5,0 gramos

triptona 20,0g
Triptosa o tripticasa 20,0g Cloruro de sodio (NaCl) 5,0 gramos

Lactosa 5,0 gramos salicina 0,5g

Mezcla de sales biliares o sales biliares No. 3 1,5 gramos Polietilenglicol p-isooctilfenil éter (Triton-X) Agua de 1,0 ml
Fosfato de hidrógeno dipotásico (K2HPO4) 4,0 gramos grado reactivo 1L
Dihidrogenofosfato de potasio (KH2correos4) 1,5 gramos

Cloruro de sodio (NaCl) 5,0 gramos Caliente para disolver los ingredientes sólidos, agregue polietilenglicol pag
Agua de grado reactivo 1L -isooctilfenil éter, y ajustar a pH 6,9±0.1. Para muestras de 10 ml, prepare un
medio de doble potencia para que la concentración final de los ingredientes
Agregue los ingredientes deshidratados al agua, mezcle bien y caliente para después de agregar la muestra sea la correcta. Antes de la esterilización,
disolver. Antes de la esterilización, dispense suficiente medio en tubos de dispense suficiente medio en los tubos de fermentación con un vial invertido
fermentación con un vial invertido para cubrir el vial invertido al menos entre la para cubrir el vial invertido al menos entre la mitad y dos tercios después de la
mitad y dos tercios después de la esterilización. Cierre los tubos con tapas de esterilización. Cierre con tapones de metal o de plástico resistente al calor.
metal o de plástico resistente al calor. Autoclave medio a 121 ° C durante 12 a 15 Esterilizar en autoclave a 121 °C durante 10 min. Asegúrese de que los viales
min. Asegúrese de que los viales invertidos no tengan burbujas de aire. El pH del invertidos no tengan burbujas de aire. Almacene en la oscuridad a temperatura
medio debe ser 6.9±0,2 después de la esterilización. ambiente por no más de 7 días. Ignorar el precipitado formado durante el
b. Procedimiento: almacenamiento.
1) Después de la incubación, agite o gire suavemente los tubos o botellas de b. Procedimiento:Inocular tubos de caldo A-1 como se indica en
fermentación que muestren gas, crecimiento o acidez para resuspender los 9221 B.3b. Incubar durante 3 h a 35±0,5 ºC. Transfiera los tubos a un
organismos. Utilice inmediatamente un asa estéril de 3 a 3,5 mm de diámetro baño de agua a 44,5±0,2 °C e incubar durante otros 21±2 horas
para transferir una o más asas llenas de cultivo desde botellas o tubos que C. Interpretación:La producción de gas en cualquier caldo de cultivo A-1
muestren crecimiento con producción de ácido o gas a un tubo de fermentación dentro de las 24 horas o menos es una reacción positiva [es decir, están
que contenga caldo EC. Como alternativa, inserte un aplicador de madera estéril presentes coliformes (fecales) termotolerantes]. Calcule el MPN de coliformes
al menos 2,5 cm en el cultivo, retírelo rápidamente y sumerja el aplicador en el termotolerantes (fecales) a partir del número de tubos de caldo A-1 positivos,
fondo de un tubo de fermentación que contenga caldo EC. Retire y deseche el como se describe en 9221 C.
aplicador. Repita para todos los demás tubos presuntivos positivos.

Bibliografía
Es aceptable la inoculación simultánea en caldo EC, caldo EC-
MUG o ambos junto con caldo BGLB, si el medio más inhibidor Perry CA, Hajna AA. Un medio de Eijkman modificado. J Bacteriol.
(caldo BGLB) se inocula en último lugar. 1933;26(4):419–429.

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 9221 TÉCNICA DE FERMENTACIÓN EN MÚLTIPLES TUBO - F.Escherichia coliProcedimiento con sustrato fluorogénico

Perry CA, Hajna AA. Evaluación adicional del medio EC para el aislamiento Geldreich EE. Importancia sanitaria de los coliformes fecales en el medio ambiente
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922 1 f.miSchErichia coliPAGprocedimientotuCantarFluorógenoSUBSTRAR

Escherichia colies un miembro de la flora fecal autóctona de los animales o tapas de plástico resistentes al calor. El pH del medio debe ser 6.9±0,2 tras
de sangre caliente. La presencia deE. colien el agua se considera un esterilización durante 15 min a 121 °C.
indicador específico de contaminación fecal y de la posible presencia de b. Procedimiento:
patógenos entéricos. Pruebas paraE. colison aplicables al análisis de agua 1) Agite o gire suavemente los tubos o botellas de fermentación que
potable, superficial, subterránea y residual. Prueba paraE. colise puede muestren crecimiento, gas o acidez para resuspender los organismos. Con
realizar utilizando el procedimiento de tubos múltiples descrito aquí, un asa estéril de 3 o 3,5 mm de diámetro, transfiera una o más asas de
mediante el método de filtro de membrana descrito en la Sección 9222 G, o cultivo del tubo o botella de fermentación al caldo EC-MUG. Como
mediante las pruebas de sustrato de enzima cromogénica descritas en la alternativa, inserte un aplicador de madera estéril al menos 2,5 cm en el
Sección 9223. OtrosE. coliLos procedimientos se presentan en 9221 G. cultivo, retírelo rápidamente y sumerja el aplicador en el fondo de un tubo
Para elE. coliprueba usando medio EC-MUG,E. colise define de fermentación que contenga caldo EC-MUG.
como la especie de bacteria coliforme que posee la enzima b- 2) Coloque todos los tubos EC-MUG en un baño de agua dentro de los 30
glucuronidasa, que puede escindir el sustrato fluorogénico 4- minutos posteriores a la inoculación. Incube los tubos EC-MUG inoculados y los
metilumbeliferil-b-d-glucurónido (MUG), liberando así el controles negativos durante 24±2 h en un baño de agua circulante
fluorógeno en 24±2 h o menos cuando se cultiva en medio EC- (preferiblemente con tapa a dos aguas) mantenido a 44,5±0,2 ºC. Mantenga una
MUG a 44,5±0,2 ºC. profundidad de agua suficiente en la incubadora de baño de agua para sumergir
los tubos hasta el nivel superior del medio.
1.Escherichia coliPrueba (EC-MUG Medio) C. Interpretación:Examine todos los tubos que muestren crecimiento en busca de
fluorescencia usando una lámpara UV de longitud de onda larga de 6W, 365-366 nm. La

El uso del medio EC-MUG para detectarE. colies aplicable a las presencia de fluorescencia azul brillante se considera un resultado positivo paraE. coli.

investigaciones de agua potable, contaminación de corrientes, fuentes de El crecimiento en ausencia de fluorescencia azul brillante se considera un resultado

agua cruda sin filtrar, sistemas de tratamiento de aguas residuales, aguas negativo. Para ayudar a interpretar los resultados y evitar la identificación errónea de

de baño, aguas de mar y monitoreo general de la calidad del agua. No una autofluorescencia débil del medio o los tubos de vidrio como una respuesta

utilice EC-MUG para el aislamiento directo deE. coli;se requiere un positiva, incluya en el ensayo un control positivo [un control conocido

enriquecimiento previo en un medio presuntivo para una recuperación E. coli(MUG-positivo)], un control negativo [un termotolerante
óptima. (Para probar colonias presuntas de coliformes que crecen en Klebsiella pneumoniae(cultivo MUG-negativo)], y un medio de control
medios sólidos, consulte la Sección 9222 G.2). sin inocular. La distancia entre la lámpara UV y los tubos debe ser tal
Use el medio EC-MUG para probarE. colien un cultivo positivo para coliformes que laE. coliel control positivo muestra una fluorescencia distintiva
totales, siguiendo las pautas de control de calidad citadas en 9221 B.2. mientras que los controles MUG-negativo y sin inocular no. Si usa
a. EC-MUG medio:Prepare el medio EC-MUG siguiendo las pautas de múltiples tubos, calcule el MPN paraE. colide la cantidad de tubos de
control de calidad citadas en 9221 B.2. caldo EC-MUG positivos, como se describe en 9221 C. Cuando se use
un solo tubo o se subcultive de una sola botella o colonia presuntiva,
Triptosa o tripticasa 20,0g informe la presencia o ausencia deE. coli.
Lactosa 5,0 gramos

Mezcla de sales biliares o sales biliares No. 3 1,5 gramos 2. Determinación simultánea de coliformes termotolerantes
Fosfato de hidrógeno dipotásico (K2HPO4) 4,0 gramos yE. coli
Dihidrogenofosfato de potasio (KH2correos4) 1,5 gramos

Cloruro de sodio (NaCl) 5,0 gramos La presencia de coliformes termotolerantes yE. colipuede
4-metilumbeliferil-b-d-glucurónido (MUG) Agua 0,05 gramos determinarse simultáneamente incluyendo un vial invertido (tubo
de grado reactivo 1L de Durham) en tubos de caldo EC-MUG. Preparar caldo EC-MUG
según 9221 F.1.
Agregue los ingredientes deshidratados al agua, mezcle bien y caliente
a. Configuración:Antes de la esterilización, dispense, en tubos de
para disolver. Antes de la esterilización, dispense en tubos que no emiten
fermentación con un vial invertido, suficiente medio para cubrir el vial invertido
fluorescencia bajo luz ultravioleta (UV) de longitud de onda larga (365-366
al menos entre la mitad y dos tercios después de la esterilización. Cerrar con
nm). No es necesario un tubo invertido. Cerrar tubos con metal
tapones metálicos o resistentes al calor. El pH del medio debe ser 6.9±0,2 tras
esterilización durante 15 min a 121 °C.

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 9221 TÉCNICA DE FERMENTACIÓN EN MÚLTIPLES TUBO - G. OtrosEscherichia coliProcedimientos

b. Procedimiento: resultados, incluya en cada ensayo un control positivo [un control

1) Agite o gire suavemente los tubos o botellas de fermentación que conocidoE. coli (MUG-positivo)], un control negativo [un
muestren crecimiento, gas o acidez para resuspender los organismos. termotolerante Klebsiella pneumoniae(cultivo MUG-negativo)], y un
Usando un asa estéril de 3 o 3,5 mm de diámetro, transfiera una o más medio de control sin inocular. La distancia entre la lámpara UV y los
asas llenas de crecimiento de cada tubo o botella de fermentación positiva tubos debe ser tal que laE. coliel control positivo muestra una
al caldo EC-MUG. Como alternativa, inserte un aplicador de madera estéril fluorescencia distintiva mientras que los controles MUG-negativo y sin
al menos 2,5 cm en el cultivo, retírelo rápidamente y sumerja el aplicador inocular no. Si se utilizan varios tubos, calcule el MPN para
en el fondo de un tubo de fermentación que contenga caldo EC-MUG. E. coliy coliformes termotolerantes del número de tubos de caldo EC-
2) Coloque todos los tubos EC-MUG en un baño de agua dentro de los 30 MUG positivos, como se describe en 9221C. Cuando utilice un solo
minutos posteriores a la inoculación. Incube los tubos EC-MUG inoculados, junto tubo, o realice un subcultivo a partir de un solo frasco presuntivo o
con los controles positivo y negativo, durante 24±2 h en un baño de agua colonia, informe la presencia o ausencia deE. coliy coliformes
circulante (preferiblemente con tapa a dos aguas) mantenido a 44,5±0,2 ºC. termotolerantes.
Mantenga una profundidad de agua suficiente en la incubadora de baño de agua
para sumergir los tubos hasta el nivel superior del medio. Bibliografía
C. Interpretación:Examine todos los tubos que muestren crecimiento y gas en
busca de fluorescencia utilizando una lámpara UV de longitud de onda larga de 6 Feng PCS, Hartman PA. Ensayos fluorogénicos para confirmación inmediata
W, 365–366 nm. El crecimiento con producción de gas se considera un resultado deEscherichia coli.Aplicación Environ Microbiol. 1982;43(6):1320–1329.
positivo para los coliformes termotolerantes. La presencia de fluorescencia azul Hartman PA. La prueba MUG (glucuronidasa) paraE. colien comida y
brillante se considera un resultado positivo paraE. coli. Tubos con crecimiento, agua. En: Balows A, Tilton RC, Turano A, eds. Métodos rápidos y

gasyfluorescencia se consideran positivos tanto para coliformes termotolerantes automatización en microbiología e inmunología. Actas del 5º Simposio
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como paraE. coli. Los tubos con crecimiento y gas pero sin fluorescencia azul
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brillante se consideran positivos para coliformes termotolerantes y negativos
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Debido a la autofluorescencia autóctona de los medios, tubos de vidrio o 1991;37(12):908–911.
insertos, tenga cuidado al interpretar los resultados. Para ayudar a interpretar

922 1g oEl rmiSchErichia coliPAGPROCEDIMIENTOS

Para elE. coliprueba usando el reactivo GAD,E. colise define como la caldo del tubo o botella de fermentación al tubo de centrífuga de 15
especie de bacteria coliforme que posee la enzima glutamato ml.
descarboxilasa (GAD), que puede producir una reacción alcalina en 4 h en 2) Concentrar las células bacterianas centrifugando el caldo de 2500 a 3000 ×
un reactivo que contiene ácido glutámico y un agente lítico. Este gramodurante 10 min. Desechar el sobrenadante y resuspender las células en 5
procedimiento se utiliza para probarE. colidespués de un enriquecimiento ml de tampón de fosfato. Reconcentrar las células por centrifugación a 2500 a
previo en un medio utilizado para identificar bacterias coliformes. El 3000 ×gramodurante 10 min. Deseche el sobrenadante y agregue 1,0 ml de
procedimiento es particularmente útil para determinar la presencia de reactivo GAD. Agitar enérgicamente el tubo para resuspender las células en el
cepas MUG negativas deE. coli,algunos de los cuales son patógenos (ver reactivo GAD.
también la Sección 9260 F). 3) Incubar los tubos a 35 °C y observar después de 1 h. Los tubos se pueden
incubar durante un máximo de 4 h.
1.Escherichia coliPrueba (Procedimiento GAD) C. Interpretación:Examine todos los tubos en busca de un cambio de color
distintivo de amarillo a azul, lo que se considera un resultado positivo para

Use el procedimiento GAD para probarMI.coli en un cultivo positivo para E. coli. Para ayudar a interpretar los resultados, incorpore en el ensayo
coliformes totales siguiendo las pautas de control de calidad citadas en 9221 B.2. un control positivo [un control conocidoE. coli(GAD-positivo)], un
a. Reactivo GAD: control negativo [un organismo coliforme total conocido, como
Enterobacter cloacae(GAD-negativo)], y un control de reactivo GAD no
Ácido l-glutámico 1,0g inoculado. Si se utilizan varios tubos, calcule el MPN para
Cloruro de sodio (NaCl) 90,0g E. colide la cantidad de tubos GAD positivos, como se describe en 9221
Verde de bromocresol 0,05 gramos
C. Cuando se use solo un tubo o frasco presuntivo, informe como
Polietilenglicol octilfenil éter (Triton-X) Agua 3,0 ml presencia o ausencia deE. coli.
de grado reactivo 1L
2.Escherichia coliPrueba (producción de indol)
Agregue los ingredientes al agua y mezcle bien hasta que todos los
ingredientes se disuelvan. El pH debe ser 3.4±0.2. El reactivo es estable A los efectos de esta prueba,E. colise define como la especie de
durante 2 meses cuando se almacena a 5 °C. Puede esterilizarse por bacteria coliforme que puede producir indol en 24±2 h cuando se
filtración (filtro de 0,2 µm) y tratarse como una solución estéril. cultiva en agua de triptona a 44,5±0,2 ºC. Hay excepciones: Klebsiella
b. Procedimiento: oxitocay algunas cepas decitrobacter freundiiy Enterobacterspp.
1) Agite o gire suavemente los tubos o botellas de presunción que muestren también son indol positivos. Use agua de triptona y el reactivo de
crecimiento, gas o acidez. Usando una pipeta graduada, transfiera 5 mL Kovac para probarE. colien un cultivo positivo para coliformes totales.

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 9221 TÉCNICA DE FERMENTACIÓN EN MÚLTIPLES TUBO - G. OtrosEscherichia coliProcedimientos

a. Reactivos:Preparar agua triptona y reactivo de Kovac 44.5±0,2 °C durante 24 2 h. Después de la incubación, agregue de 0,2 a 0,3 ml de
siguiendo las pautas citadas en 9221 B.2. reactivo de Kovac a cada tubo de agua con triptona.
1)Agua de triptona: C. Interpretación:Examine todos los tubos para detectar la aparición
de un color rojo intenso en la capa superior, lo que se considera un
triptona 20g resultado positivo paraE. coli. Para ayudar a interpretar los resultados,
Cloruro de sodio (NaCl) 5 gramos incorpore al ensayo un control positivo [un control conocidoE. coli(
Agua de grado reactivo 1L indol-positivo)], un control negativo [un organismo coliforme total
conocido, comoEnterobacter cloacae(indol-negativo)], y un control de
Agregue los ingredientes al agua y mezcle bien hasta que se disuelva. reactivo no inoculado. Si se utilizan varios tubos, calcule el MPN para
Ajuste el pH a 7,5. Dispensar porciones de 5 ml en tubos, tapar y esterilizar E. colidel número de tubos positivos para indol, como se describe en
durante 10 min a 121 °C. 9221 C. Cuando se use solo un tubo o frasco presuntivo, informe
2)Reactivo de Kovac: como presencia o ausencia deE. coli.

pag-Dimetilaminobenzaldehído 5 gramos
Bibliografía
Alcohol amílico (grado analítico) 75 ml
Ácido clorhídrico, conc. 25 ml Fiedler J, Reiske J. Glutaminsauredecarboxylase-schnelltest zur identi-
fikation vonEscherichia coli.Z Ges Hyg Grenzgeb. 1990;36(11):620–622.
Disolver el aldehído en alcohol. Agregue con cuidado el ácido a la mezcla
de aldehído y alcohol y agite para mezclar. Almacenar en la oscuridad a 4 ° Rice EW, Johnson CH, Dunnigan ME, Reasoner DJ. Glutamato rápido
C. Precaución: el reactivo es corrosivo e inflamable. Este reactivo debe ensayo de descarboxilasa para la detección deEscherichia coli.Aplicación Environ
ser de color amarillo pálido a marrón claro. El uso de alcohol amílico de Microbiol. 1993;59(12):4347–4349. Fe de erratas. Aplicación Environ Microbiol.
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b. Procedimiento:Agite o gire suavemente los tubos presuntivos o materias nro. 71: métodos para el examen de aguas y materiales
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botellas que muestren crecimiento, gas o acidez. Con un asa de metal
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estéril de 3 o 3,5 mm de diámetro o un aplicador de madera estéril,
Rice EW, Johnson CH, Reasoner DJ. Detección deEscherichia coli
transfiera el crecimiento del tubo o botella de fermentación presuntiva a un
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tubo que contenga 5 ml de agua triptona. Incube los tubos de agua con Appl Microbiol. 1996;23(3):179–182.
triptona inoculada en un baño de agua o en una incubadora mantenida a

Publicado en línea: 27 de agosto de 2018

Revisado: 3 de enero de 2022

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