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GUIA DE LABORATORIO

FICHA DE IDENTIFICACION
TEMA FACTORES QUE AFECTAN LA ACTIVIDAD DE LAS ENZIMAS
ASIGNATURA O CURSO BIOQUIMICA
SEMESTRE II SEMESTRE
DOCENTE RESPONSABLE MARTA HERNANDEZ CUELLO
JOAQUIN PINTO MÉNDEZ
LUCIO LINARES CHACÓN
FECHA
TIEMPO DE 2 HORAS
DESARROLLO
N° ESTUDIANTES

COMPETENCIAS: Al finalizar el laboratorio el estudiante estará en capacidad de:

• Adquirir destrezas en el manejo de implementos de laboratorio para dicha práctica.
• Utilizar con eficacia materiales y espacio en el laboratorio.
• Identificar como actúan las enzimas en las reacciones de un organismo.
• Reconocer que factores afectan la actividad enzimática.

PRECAUCIONES GENERALES: Al ingresar al laboratorio el estudiante debe tener en cuenta lo

siguiente:
Cualquier operación dentro del laboratorio en la que se manipulen productos químicos presenta siempre unos
riesgos. Para eliminarlos o reducirlos de manera importante es conveniente, antes de efectuar cualquier
operación:
- Hacer una lectura crítica de la práctica a realizar
- Asegurarse de disponer del material adecuado
- Manipular siempre la cantidad de producto químico indicado en la guía de laboratorio
- Llevar las prendas y accesorios de protección adecuados
- Tener previsto un plan de actuación en caso de algún accidente
- Evite las bromas y tratamientos incorrectos al momento de realizar la práctica

FUNDAMENTACION TEORICA:

ENZIMAS

Las enzimas son catalizadores biológicos que permiten que las reacciones metabólicas ocurran a
gran velocidad en condiciones compatibles con la vida.
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En las células, la actividad secuencial de muchas enzimas permite que las moléculas se degraden,
o bien se formen moléculas de mayor tamaño a partir de moléculas sencillas.

Desde el punto de vista químico, las enzimas son proteínas globulares, algunas de ellas con
estructura cuaternaria. Para cumplir su función requieren conservar su estructura nativa, en
particular se destaca una región conocida como sitio activo, que es responsable de catalizar la
reacción.
Hay enzimas que para actuar necesitan un componente no proteico

Algunas enzimas para actuar requieren un componente adicional que se llama cofactor. Los
cofactores pueden ser inorgánicos (Fe+2, Mn+2, Zn+2, etc.) o moléculas orgánicas complejas llamadas
coenzimas. Las coenzimas derivan de vitaminas o son la vitamina misma.

Las enzimas son proteínas eficientes, específicas y regulables.

Las enzimas son catalizadores biológicos que, como los catalizadores químicos, aceleran reacciones
y no se consumen durante la reacción, por lo que pueden intervenir muchas veces catalizando la
misma reacción: son moléculas eficientes. A diferencia de otros catalizadores, las enzimas tienen
un sitio activo que les permite unir y orientar las moléculas que intervienen en la reacción y de esa
forma maximizan la posibilidad de formación o ruptura de enlaces necesarios para la obtención de
productos.

El interior de la célula es denso y, aunque los sustratos y las enzimas están en número relativamente
pequeño, se pueden encontrar y dar lugar al complejo ES porque están en continuo movimiento.
Las enzimas se mueven más lentamente que los sustratos y la velocidad de encuentro va a depender
de la concentración de sustrato presente.

El sitio activo tiene una forma determinada por el ordenamiento espacial de los -R que es única y
que es reconocida por su sustrato. Esta es la base de otra de las características de las enzimas que
es su especificidad

En el sitio activo los grupos -R están próximos debido a los plegamientos originados por las
estructuras secundaria y terciaria, a pesar de que están alejados en la estructura primaria de la
enzima. Estos –R participan en la reacción, algunos uniendo y orientando el sustrato y otros,
formando o rompiendo enlaces.

Las enzimas tienen un pH y una temperatura óptimos

Las enzimas son catalizadores biológicos que tienen una configuración nativa determinada por las
fuerzas estabilizadoras de la proteína. Cualquier factor externo que altere esas fuerzas va a
modificar la actividad de la misma.

Los valores de pH o temperatura óptimos varían según la enzima pero en todos los casos permiten
que la estructura del sitio activo sea la más adecuada para la catálisis.

La cinética enzimática estudia las velocidades de las reacciones catalizadas por enzimas y su
variación frente a cambios de parámetros experimentales. La velocidad de una reacción química
corresponde al número de moléculas de reactivo(s) que se convierten en producto(s) por unidad de
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tiempo y depende de la concentración de los compuestos incluídos en el proceso y de la constante

de velocidad que es una característica de la reacción. Por ejemplo, la conversión reversible de A en
B tiene una velocidad de reacción directa cuya ecuación es:

v= k+1 [A] y otra inversa que es v inversa = k-1 [B]

donde k+1 y k-1 son las constantes de velocidad y [A] y [B] simbolizan las concentraciones de A y
B respectivamente. En el equilibrio, las dos velocidades son iguales lo que lleva a definir la constante
de equilibrio de la reacción (Keq)

Keq = k+1/k-1 = [B] / [A]

Todas las enzimas actúan en general de la misma manera, aún cuando el mecanismo de acción de
cada enzima es único. Los reactivos y los productos están en concentraciones cientos o miles de
veces mayores que las de la enzima en una reacción enzimática típica. Por lo tanto, cada molécula
de enzima cataliza la conversión en producto de varias moléculas de reactivo. A los reactivos en
bioquímica los llamamos sustratos y su conversión en productos ocurre en el sitio activo de la
enzima. El complejo que se forma cuando el sustrato y la enzima se combinan se llama complejo
enzima-sustrato (ES). Entre la unión del sustrato a la enzima y la reaparición de enzima libre y
productos se producen una serie de pasos que se resumen a continuación:

E + S ========> ES ===========> EP =====> E + P

La cantidad de producto formado a partir de una determinada concentración de sustrato y de enzima

varía con el tiempo. Solamente en los primeros minutos de la reacción existe una relación lineal
entre el producto formado y el tiempo. La velocidad de la reacción calculada a partir de los datos de
esos primeros minutos, es lo que llamamos velocidad inicial (Vo) y este es el término al que nos
referiremos de ahora en adelante cuando hablemos de velocidad.

La velocidad (Vo) de una reacción enzimática se puede medir por la variación de la cantidad de
sustrato transformado, o la cantidad de producto formado por unidad de tiempo. En algunas
reacciones en las que intervienen coenzimas, la velocidad puede medirse por la cantidad de
coenzima transformada por unidad de tiempo en lugar de medir el sustrato o el producto.

Las reacciones catalizadas por enzimas tienen cinética de saturación

Cuando se miden las velocidades iniciales (Vo) de una reacción enzimática con distintas
concentraciones de sustrato [S] en las mismas condiciones de pH y temperatura y manteniendo
constante la concentración de enzima [E], se obtiene una curva como se representa a continuación:
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Para valores bajos de [S] la Vo aumenta en forma directamente proporcional a la [S]. En ese tramo,
cada vez más moléculas de S forman el complejo ES y la reacción tiene cinética de primer orden.
En este caso la reacción se representa como Vo µ k [S] 1 A determinada [S], todas las moléculas
de S están formando ES y entonces la Vo se hace independiente de la [S], la cinética de la reacción
es de orden 0 y se alcanza la Vmáx. En este caso la reacción se representa como vo µ k [S] 0. La
reacción en presencia de mayor [S] no produce mayor velocidad porque todas las moléculas de
enzima están saturadas con sustrato.

La relación entre la Vo y [S] se puede expresar cuantitativamente

La cinética de las reacciones esquematizadas anteriormente fue caracterizada por los investigadores
Michaelis y Menten. La ecuación de Michaelis-Menten es:

vmax [S]
ov = (1)
KM + [S]
Esta ecuación es una descripción cuantitativa de la relación entre la velocidad (Vo) de una reacción
catalizada por una enzima, la concentración de sustrato [S] y dos constantes Vmáx y Km (constante
de Michaelis). Esta ecuación es una hipérbola equilátera con coordenadas Vo y [S] y donde Vmáx
es la asíntota de la gráfica.

La ecuación puede ser usada para demostrar que la concentración de sustrato necesaria
para alcanzar la mitad de Vmáx, es numéricamente igual a Km.

Las unidades de Km son, por lo tanto, unidades de concentración, usualmente molaridad. Km puede
definirse como la [S] a la que la enzima alcanza la mitad de su velocidad máxima o la [S] a la que
la mitad de las moléculas de enzima están formando ES.

En condiciones definidas de pH y temperatura, los valores de Km y Vmáx son las constantes cinéticas
de una determinada enzima frente a su sustrato.

• Km y Vmáx se calculan por el método de las inversas

La forma de determinar Km por el método gráfico definido antes, no es la usada en la práctica; rara
vez se llega a medir Vmáx por problemas tales como la solubilidad del sustrato a concentraciones
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altas. Se utiliza entonces, la transformación de la ecuación (1) realizada por Lineweaver-Burk que
consistió en tomar la inversa de cada término. La ecuación queda como :

1 Km . 1 1
Vo Vmáx [S] Vmáx (2)

La representación gráfica con coordenadas 1/vo y 1/[S] es una recta. El corte de la recta con el eje
de las ordenadas permite calcular Vmáx y el corte con el eje de las abscisas permite calcular Km.

Factores que afectan el funcionamiento de la catalasa

En los ejercicios siguientes se estudiará el funcionamiento de la catalasa. Esta enzima está presente
en casi todas las células aeróbicas y actúa descomponiendo peróxido de hidrógeno (agua
oxigenada) en agua y oxígeno, según la siguiente reacción:

A veces, la reducción de oxigeno al agua es incompleta y se produce “superóxido”, una sustancia

sumamente tóxica. Una enzima rompe el “superóxido” y forma agua y peróxido de hidrógeno, que
es menos tóxico.

DESCRIPCION DE LA PRACTICA:
PRIMERA PARTE: ¿SE COMPORTA LA CATALASA DE IGUAL MANERA EN
TODOS LOS ORGANISMOS?

1. Macere una a una las muestras escogidas hasta obtener un macerado uniforme, deje pequeños
pedazos de las muestras por si se necesitan. Luego agregue agua destilada siga macerando y filtre.

2. Prepare 5 tubos de ensayo así: al primero agregue 3 mL del macerado de papa, al segunda
Hígado, al tercer tubo espinaca al cuarto Champiñón y al quinto agua destilada. Marque el nivel del
macerado.

3. Agregue de 3 mL de peróxido de hidrógeno. Anote sus observaciones.

Homogenado Cantidad de burbujas Cantidad de homogéneo

consumido
Agua
Espinaca
Papa
Hígado
Setas
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¿Qué ocurre con el peróxido de hidrógeno?

¿Por qué hay desprendimiento de burbujas?

SEGUNDA PARTE: EFECTO DE LA TEMPERATURA SOBRE EL

FUNCIONAMIENTO DE LAS ENZIMAS

1. Rotule cuatro tubos de ensayo, añada 5 mL de macerado de hígado a cada tubo.

2. Mantenga los tubos a las siguientes temperaturas:

Tubo 1 = 80 °C por 15 minutos

Tubo 2 = 37 °C por 15 minutos

Tubo 3 = Temperatura ambiental

Tubo 4 = Baño de Hielo por 30 minutos

4. Añada 2 mL de peróxido de hidrógeno al tubo

5. Mida el tiempo transcurrido desde que se añadió el peróxido hasta que se comienzan a producir
burbujas, y anótelo en la Tabla

6. Repita con los demás tubos.

Tubo Temperatura Tiempo que tardo Observaciones

en iniciar la
reacción
1 80 º
2 37º
3 Ambiente
4 Hielo

7. Compare sus resultados en término de tiempo de reacción vs temperatura. Realice una gráfica si
es necesario.

8. ¿Cómo se relacionan la temperatura y la actividad enzimática?

9. ¿Qué les sucede a las enzimas cuando se exponen a temperaturas extremas

TERCERA PARTE: EL EFECTO DEL pH SOBRE EL FUNCIONAMIENTO DE LAS

ENZIMAS

1. Rotule tres tubos de ensayo A, B y C

2. Añada 3 mL de macerado de Hígado a cada tubo.

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3. Añada soluciones Ácido acético CH3COOH y de NaHCO3 a los tubos como se indica a continuación,
y agite suavemente hasta mezclar:

Tubo A – 3 ml de solución Ácido acético (vinagre)

Tubo B – 3 ml de solución bicarbonato de sodio

Tubo C – control (ni ácido ni base)

4. Añada 3 mL de peróxido de hidrógeno a cada tubo.

5. Observe y anote las reacciones en la Tabla

Tubo Tiempo que toma la Descripción comparativa

reacción en completarse de las reacciones
A
B
C
6. ¿Cómo afecta el pH la actividad enzimática?

7. ¿De qué otras maneras se podría explorar el funcionamiento de las enzimas estudiadas en el
laboratorio?

8. Investiga 5 enzimas con los sustratos respectivos sobre los cuales actúa.

9. ¿Fue igual la producción de catalasa en todas las muestras?

10. ¿Qué indican los resultados sobre la fisiología de estos organismos?

RECURSOS A UTILIZAR EN LA PRÁCTICA (Equipos / instrumentos):

Mechero
Soporte universal

MATERIALES QUE DEBE LLEVAR EL ESTUDIANTE:

Espinacas Hígado
Gasas Papa
Setas (Hongo)
Las muestras deben traerlas ya cortadas en pequeños trozos
MATERIALES QUE SERAN SUMINISTRADOS EN EL LABORATORIO:
Peróxido de hidrógeno Baño de María
Termómetro Morteros
Tubos de ensayo grandes o frascos Embudo
Goteros o pipetas desechables Hielo
Solución (Ácido acético) Vinagre Solución Bicarbonato de sodio

METODOLOGIA:
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Teórico-práctica.
SISTEMA DE EVALUACION:
RUBRICA DE EVALUACION:
ITEMS DEFICIENTE ACEPTABLE BUENO
EVALUADO (0-1) (2-3) (4-5)
PREPARACIÓN El estudiante no trae la El estudiante presenta El estudiante
guía de laboratorio a la guía de laboratorio presenta la guía de
desarrollar, no demuestra a desarrollar pero no laboratorio a
conocimiento del tema al demuestra desarrollar,
ser evaluado previamente conocimientos del demuestra
y/o no trae los materiales tema y/o trae los conocimientos sobre
necesarios. materiales de el tema y/o Trae
laboratorio los materiales
incompletos. completos.
REALIZACION El estudiante no tiene en El estudiante no tiene El estudiante
DEL cuenta las normas del en cuenta lo indicado muestra interés en
LABORATORIO laboratorio, incluidas las en la guía de trabajo el desarrollo de las
de bioseguridad. Presenta para el desarrollo del prácticas y sigue las
comportamientos no laboratori0 y/o tiene instrucciones dadas
adecuados durante el dificultades para para llegar a los
desarrollo de las integrar la teoría con resultados de
prácticas. la práctica. aprendizaje.
REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS:
NASSAR, Victor, QUÍMICA MÉDICA Y BIOLÓGICA 10ª Edición. Barranquilla 1998.
SALVE, Maria Luisa. LABORATORIO DE BIOQUIMICAEditorial Mc Graw Hill-interamericana. 1997.
www.salud.gob.mx/csg/publica/pdf/medicamentos/22_soluciones.PDF
http://www.reeme.arizona.edu/materials/Liquidos%20y%20electrolitos.pdf
http://www.aeped.es/protocolos/neonatologia/alimen-parent.pdf
http://www.geocities.com/medicos76/manejoelectrolitos.html
http://www.arrakis.es/~aibarra/dietetica/Enfermeria/liquidos.htm