Traducido del inglés al español - www.onlinedoctranslator.

com

Micropropagación de Brassavola nodosa (L.) Lindl.

utilizando el biorreactor SETIS™
Wagner Vendrame (-vendrame@u .edu )
Universidad de Floridahttps://orcid.org/0000-0001-6391-7623
Jian Jian Xu
Instituto de Ciencias Agrícolas y Alimentarias de la Universidad de Florida

David G. Beleski
Instituto de Ciencias Agrícolas y Alimentarias de la Universidad de Florida

Artículo de investigación

Palabras clave:Brassavola nodosa, Micropropagación, Sistemas de inmersión temporal, Propagación a

gran escala, Biorreactor SETIS™, Aclimatación

Fecha de publicacion:22 de noviembre de 2022

DOI:https://doi.org/10.21203/rs.3.rs-2226897/v1

Licencia:-- Este trabajo tiene una licencia internacional Creative Commons Attribution 4.0. Leer licencia
completa

Página 1/18
Abstracto
Brassavola nodosa(L.) Lindl. es una orquídea epífita tropical que presenta características de interés para la industria de
viveros ornamentales. Sin embargo, los problemas con los métodos tradicionales de propagación limitan el desarrollo de un
sistema de producción comercial a gran escala. Además, esta especie se considera en peligro de extinción debido a la
reducción de la población causada por la destrucción del hábitat, el cambio climático y la recolección excesiva de las áreas
nativas. Se ha investigado el uso de micropropagación para esta especie, y el uso de líquidoin vitroLos sistemas mostraron
potencial para el uso de biorreactores de inmersión temporal para la micropropagación deB. nodosa. Este estudio evaluó la
eficiencia del sistema de biorreactor SETIS™ para la micropropagación deB. nodosaajustando los parámetros de inmersión
(frecuencia y duración) y comparándolo con los sistemas de cultivo semisólido convencionales. Los resultados indican que la
inmersión temporal de
B. nodosalos explantes con una frecuencia de 2 h y una duración de 2 min arrojaron las tasas de multiplicación más altas,
con 4,6 brotes producidos por explante en comparación con 2,8 brotes por explante en sistemas basados en agar
semisólido. El uso de biorreactores también promovió un mayor crecimiento y desarrollo yin vitro enraizamiento,
mejorando así la supervivencia y facilitando la aclimatación dein vitro-plántulas derivadas. Este es el primer estudio que
demuestra un protocolo exitoso para la micropropagación a gran escala deB. nodosautilizando biorreactores SETIS™, que
podrían tener un valor e impacto significativos para la producción comercial de esta especie, así como para fines de
conservación.

Mensaje clave
Micropropagación deBrassavola nodosase logró utilizando biorreactores de inmersión temporal SETIS, mostrando
buenas tasas de multiplicación, mayor crecimiento y desarrollo y enraizamiento in vitro, mejorando así la
supervivencia y la aclimatación ex vitro.

Introducción
La expansión del mercado ornamental junto con la mayor demanda de plantas con flores, así como los costos de
producción más bajos y las técnicas de producción avanzadas han colocado a las orquídeas entre las principales
plantas con flores en los EE. UU. (Vendrame y Khoddamzadeh 2017). También hay un mayor interés por parte de los
cultivadores y clientes en híbridos de orquídeas nuevos y mejorados.Brassavola nodosa(L.) Lindl. es una orquídea
epífita tropical distribuida desde México a través de América Central y del Sur (Jones 1975; Mata-Rosas y Lastre-Puertos
2015) y produce inorescencias muy fragantes que le dan el nombre común de “Dama de la Noche”. Además de la
fragancia floral, esta especie florece durante todo el año, tiene una forma de flor única y requiere poco
mantenimiento, lo que la hace deseable para la industria ornamental de flores en maceta. Sin embargo, la
propagación de las orquídeas del género Brassavola es difícil y se limita a ramificaciones, pseudobulbos o semillas. La
germinación de semillas en la naturaleza es muy baja, mientras que la propagación por ramificación o pseudobulbos
es un proceso largo (Mengarda et al. 2017). Estos factores limitan la producción comercial a gran escala. Además, la
destrucción del hábitat, el impacto del cambio climático, y la recolección excesiva de los hábitats nativos ha causado
una reducción en la población y distribución de estas orquídeas (Swarts y Dixon 2009; Reed et al. 2011). Se requieren
estrategias de propagación y conservación para garantizar la población

Página 2/18
supervivencia en la naturaleza y proporcionar material vegetal para la producción comercial. La micropropagación
proporciona una alternativa factible para la rápida propagación clonal masiva de plantas fieles al tipo con potencial
comercial, y ha sido responsable del éxito de la industria de las orquídeas (Chugh et al. 2009; Kumar y Reddy 2011;
Bhoite y Palshikar 2014; Phillips 2019).

Se ha informado sobre la micropropagación de varias especies de orquídeas e híbridos para varios

géneros, incluidos Anoectochillus, Arundina, Cymbidium, Dendrobium, Doritaenopsis, Phalaenopsis,
Paphiopedilum, Vanda y Vanilla, entre muchos otros (Griesbach 1986; Jones y Tisserat 1990; Arditti y Ernst
1993). ; Tokuhara y Mii 1993; Kyte y Kleyn 1996; Devi et al. 1997; Tisserat y Jones 1999; Kalimuthu et al.
2006; Wu et al. 2007, Chugh et al. 2009; Neumann et al. 2009; Alam et al. 2010; Paek et al. 2011; Panwar et
al. 2012; Divakaran et al. 2015; Teixeira da Silva et al. 2015; Rodrigues et al. 2015; Zeng et al. 2015).

Sin embargo, la micropropagación de orquídeas Brassavola sigue siendo un desafío (Xu et al. 2022) debido al
número limitado de estudios en el género Brassavola, incluidosin vitrogerminación de unBrassavola perrinii
híbrido (Chiapim et al. 2012)dtuberculata(Soares et al. 2020), micropropagación de un híbrido de Brassavola
(Villa et al., 2014) y aclimatación dein vitroplántulas derivadas (Sousa et al. 2015) yin vitroproducción de brotes
(Mengarda et al. 2017) deB.tuberculata.

El uso de cultivos líquidos podría ser un enfoque factible para mejorar la micropropagación de orquídeas (Young et al. 2000; Wu et

al. 2007; Murthy et al. 2018). Los sistemas de cultivo líquido ofrecen ventajas sobre los sistemas tradicionales basados en agar

semisólido en micropropagación, incluida una mejor absorción de nutrientes y, por lo tanto, un mejor crecimiento y desarrollo de

las plantas, mayores tasas de multiplicación, el potencial de reducción de la contaminación y costos reducidos mediante la

automatización de sistemas líquidos (Ziv 2000) . Además, los cultivos líquidos mejoran la uniformidad de las condiciones de cultivo,

como una renovación más fácil de los medios, la oportunidad de usar recipientes más grandes y la necesidad de subcultivos menos

frecuentes (Etienne y Berthouly 2002).

Se han informado tasas de multiplicación más altas en medios líquidos para muchas especies (Douglas 1984;
Bergervoet et al. 1989; Chu et al. 1993). Sin embargo, el uso de sistemas de cultivo líquido es reciente y aún no
popular para la propagación de orquídeas. Más recientemente, la micropropagación deB. nodosaSe investigó el uso
de cultivo líquido con inmersión parcial y mostró resultados positivos, lo que crea una oportunidad para el uso de
biorreactores de inmersión temporal (Xu et al. 2022).

Los sistemas de inmersión temporal (TIS) son técnicas avanzadas de micropropagación que utilizan
medios líquidos en biorreactores y se basan en la inmersión periódica de tejidos vegetales en el medio
líquido durante un período de tiempo predeterminado, con períodos alternos de aireación. Esto
permite una mayor absorción de nutrientes, lo que convierte a TIS en un sistema eficiente para la
micropropagación de plantas a gran escala (Georgiev et al. 2014; Ramírez-Mosqueda y Bello-Bello
2021). Se han diseñado varios sistemas de biorreactor TIS, incluido el biorreactor de flujo y reflujo
(Tisserat y Vandercook 1985), RITA® (Teisson y Alvard 1995) y Twin Flask System (Escalona et al. 1999).
Más recientemente, se ha desarrollado un nuevo sistema de biorreactor (SETIS™, VERVIT, Bélgica) y se
ha utilizado comercialmente para la micropropagación de varios cultivos, incluidos bayas, caña de
azúcar y orquídeas, entre otros.
Página 3/18
gran capacidad de medio de cultivo, y se han reportado protocolos exitosos para la micropropagación de
banano y vainilla (Bello-Bello et al. 2019; Ramírez-Mosqueda y Bello-Bello 2021). Estas características hacen del
biorreactor SETIS™ un sistema ideal para la micropropagación comercial de orquídeas.

Por lo tanto, el objetivo de este estudio fue evaluar la eficiencia del biorreactor SETIS™ para la
micropropagación deB. nodosa. Los objetivos específicos incluyeron el desarrollo de un protocolo de
micropropagación eficiente utilizando el biorreactor SETIS™ ajustando los parámetros de inmersión
(frecuencia y duración) y comparándolo con los sistemas de cultivo semisólido convencionales. El desarrollo de
un sistema de micropropagación a gran escala paraB. nodosapuede ayudar en su comercialización y contribuir
a la conservación de la especie.

Materiales y métodos
Material vegetalLas semillas se originaron a partir de un híbrido de Brassavola,Brassavola nodosa'Remar' x 'Mas Mejor'
fueron seleccionados para este estudio. Las semillas se esterilizaron superficialmente con etanol al 70 % (Decon Labs, Inc.,
King of Prussia, PA) durante 1 min, seguido de inmersión en hipoclorito de sodio al 0,8 % (NaClO, Thermo Fisher Scientific,
Hampton, NH) con 2 gotas de Tween 20 ( Fisher Scientific, Pittsburg, PA) durante 5 min. Posteriormente, las semillas se
enjuagaron tres veces en agua esterilizada en autoclave. semillas germinadasin vitroen medio Murashige y Skoog (MS) de
concentración media (Murashige y Skoog 1962, Phytotechnology Laboratories, Lenexa, KS)

conteniendo 15 g L− 1sacarosa (Thermo Fisher Scientific) y 7 g L− 1agar (Thermo Fisher Scientific). El pH del medio se
ajustó a 5,7 y el medio se autoclavó a 121°C y 15 lbs de presión durante 20 min. Se dispensaron aproximadamente 15
ml de medio en placas de Petri desechables de 100 mm x 15 mm (Thermo Fisher Scientific). Sesenta días después de la
germinación de las semillas, cuando los protocormos habían desarrollado de 1 a 2 hojas y raíces, las plántulas se
transfirieron a microcajas RA40 de 120 mm x 75 mm (Sac O2, Deinze, Bélgica) que contenían
unos 100 mL de medio MS suplementado con 30 g L− 1sacarosa y 7 g L− 1agar

Efecto del sistema de cultivo en la multiplicación de brotesSe recolectaron explantes consistentes en puntas de brotes
jóvenes que miden entre 0,3 y 0,5 cm de 1 año de edad.in vitroplántulas y se utiliza para la multiplicación de brotes.

Las puntas de los brotes se cultivaron en medio MS que contenía 2 mg L− 1glicina, 0,1 mg L− 1NAA (ácido naftaleno
acético), 2,0 mg L− 1BA (benciladenina), 30 mg L− 1sulfato de adenina, agua de coco al 10% y 30 g L− 1
sacarosa El pH del medio se ajustó a 5,2 y se autoclavó a 121°C y 15 lbs de presión durante 20 min.

Se utilizaron cuatro sistemas de cultivo diferentes parain vitrocultivo de puntas de brotes: 1) en 160 mm x 100 mm TP1600
Microbox (Sac O2, Bélgica) que contiene 500 ml de medio semisólido (7g L− 1agar) como control, 2) en biorreactor de
inmersión temporal de 4 L (SETIS™, VERVIT, Bélgica) con una frecuencia de inmersión y aireación de 2 h, 3) en biorreactor de
inmersión temporal de 4 L con una frecuencia de inmersión y aireación de 4 h, y 4) en biorreactores de inmersión temporal
de 4L con una frecuencia de inmersión y aireación de 8 h (Fig. 1). Para todos los tratamientos, la duración de la inmersión y la
aireación fue de 2 min. El experimento estuvo compuesto por 3 réplicas por tratamiento, cada réplica contenía 20 explantes.
Los cultivos se mantuvieron en condiciones ambientales controladas con un fotoperíodo de 12 horas a una intensidad de luz
de 50 µmol m− 2s− 1y temperatura de 26°C. Multiplicación de brotes, longitud de brotes, número de hojas por brote,
porcentaje de enraizamiento,
Página 4/18
El número de raíces, la longitud de las raíces, el peso fresco, el peso seco, el contenido relativo de clorofila, el número de estomas y el

tamaño de los estomas se evaluaron 60 días después del establecimiento del cultivo. Se repitió todo el experimento.

Análisis de contenido relativo de clorofilaSe seleccionaron hojas completamente expandidas de 5 plantas por tratamiento
para el análisis del contenido relativo de clorofila. El contenido relativo de clorofila se midió como valor SPAD colocando la
tercera hoja de cada plántula, contada de arriba hacia abajo en un medidor de clorofila portátil SPAD-502 (SPAD-502,
Minolta Co., Ltd., Japón).

Análisis estomáticoSe seleccionaron al azar cinco plántulas de cada tratamiento para el análisis de estomas. Se
seccionó la mitad de la tercera hoja completamente expandida. Se prepararon secciones de hojas en portaobjetos de
vidrio sobre una fina capa de superpegamento previamente aplicada. Después de que el pegamento se secó por
completo, las hojas se cubrieron con un trozo de cinta transparente y la cutícula se unió a la cinta con cuidado,
dejando una impresión de hoja. Los estomas en las impresiones de las hojas se visualizaron con un microscopio óptico
Leica DMLB (Leica microsystems, Buffalo, NY, EE. UU.), con un aumento de 100x. El número de estomas en la
epidermis abaxial y adaxial se contó dentro de un diámetro de 5 mm bajo el microscopio de tres
diferentes campos en la superficie de la hoja. Los resultados se expresaron como medias de recuentos por mm2.

La longitud y el ancho de los estomas se midieron eligiendo aleatoriamente 3 estomas en la superficie adaxial y
abaxial de cada hoja en tres ubicaciones diferentes. Los portaobjetos se observaron y fotografiaron con un
microscopio óptico Leica DMLB (Leica microsystems, Buffalo, NY, EE. UU.), acoplado a una cámara digital SPOT 4.7
IDEA (SPOT Imaging, Sterling Heights, MI, EE. UU.). Las imágenes y el tamaño de los estomas se analizaron utilizando
el software de imágenes de microscopio SPOT basic (SPOT Imaging, Sterling Heights, MI, EE. UU.).

AclimataciónSe seleccionaron dieciocho brotes de cada sistema de cultivo para su aclimatación. Los brotes se trataron
con polvo de hormona de enraizamiento (TakeRoot® Rooting Hormone, Bridgeton, MO) que contenía 1,0 mg
L− 1IBA. y se transfirió a bandejas de plástico de 40 celdas con medios sin suelo que contenían corteza de orquídea (Sequoia Bark Sales,

Reedley, CA). Las plantas se mantuvieron en un invernadero con un sistema de niebla funcionando durante 20 segundos cada 30 minutos.

Las plantas se fertilizaron semanalmente con 300 ppm de 11-35-15 (% NP2O5-K2O) fertilizante de orquídeas

(Orquídea Better-Gro® Better-Bloom®, Arcadia, FL). Élex-vitroSe evaluó la supervivencia de las plantas, la longitud de los brotes, el número

de hojas por brote, el porcentaje de enraizamiento, el número de raíces, la longitud de las raíces, el peso fresco y el peso seco para todos los

tratamientos después de 60 días.

Análisis estadísticoPara todos los experimentos se utilizó un diseño experimental completamente al azar. Los datos se
recopilaron y se sometieron a análisis de varianza (ANOVA) utilizando el software OriginPro® 2021b (OriginLab,
Northampton, MA). Se utilizó el ajuste de comparación múltiple post hoc de Tukey (α = 0,05) para todas las
comparaciones de medias por pares.

Resultados

Evaluación de diferentes sistemas de cultivo en la multiplicación de brotesSe observaron diferencias significativas

entre los diferentes sistemas de cultivo parain vitromultiplicación de brotes (PAG< 0,036) (fig. 2A). El mayor número
de brotes (4,6 brotes/explante) se produjo en el biorreactor SETIS™ bajo inmersión y aireación
Página 5/18
frecuencia de 2 h, seguida de inmersión y frecuencia de aireación de 4 h (3,5 brotes/explante) y 8 h (3,5 brotes/
explante). El testigo en medio semisólido tuvo una tasa de multiplicación de 2.8 brotes/explante. Para el número de
hojas y la longitud de los brotes, no hubo diferencias significativas entre los sistemas de cultivo (Fig. 2B, 2C). Porcentaje
de enraizamiento (PAG< 0.001) (73.3–80.0%) y número de raíz (PAG< 0.001) (2.0 a 2.6 raíces por explante) en
biorreactores fueron significativamente mayores que los explantes cultivados en semisólido, con 6.7% de porcentaje
de enraizamiento y 0.1 raíces por explante (Fig. 2D, 2E). La raíz más larga (PAG< 0,024) en el biorreactor SETIS™ con
una frecuencia de inmersión de 2 h (1,58 cm), seguido de 4 h (1,01 cm) y 8 h (0,97 cm), pero no fueron
significativamente diferentes (Fig. 2F). Sin embargo, el control en medio semisólido mostró una longitud de raíz
significativamente reducida de 0,03 cm (Fig. 2F).

El contenido relativo de clorofila fue mayor en los explantes cultivados en biorreactores con valores SPAD de 39,4 con
una frecuencia de inmersión de 2 h, 37,7 con una frecuencia de inmersión de 4 h y 30,6 con una frecuencia de
inmersión de 8 h, pero no fueron significativamente diferentes (PAG< 0,001). Sin embargo, el control en medio
semisólido mostró un valor SPAD significativamente más bajo de 26.5 (PAG< 0,001) (fig. 3A). El peso fresco más grande
(PAG< 0.001) en biorreactores bajo frecuencia de inmersión de 2 h (0.121 g), seguido de 4 h (0.083 g), 8 h (0.079 g) y el
control en medio semisólido (0.060 g) (Fig. 3B) . El mayor peso seco (PAG< 0.003) se registró en biorreactores bajo
frecuencia de inmersión de 2 h (0.012 g), seguido de 4 h (0.009 g), 8 h (0.010 g) y el control en medio semisólido (0.006
g) (Fig. 3C) . No hubo diferencias significativas en el peso fresco entre la frecuencia de inmersión de 8 h y el control. Sin
embargo, el peso seco en biorreactores con una frecuencia de inmersión de 8 h fue mayor que el control (Fig. 3B, C).

Efectos de los sistemas de cultivo en la formación de estomasLa evaluación del efecto de diferentes sistemas de cultivo en la

formación de estomas mostró que los explantes cultivados en biorreactores con una frecuencia de inmersión de 2 h presentaron la

mayor (PAG< 0,022) (75,3) y abaxial (PAG< 0.013) (95.0) número de estomas, seguido de 58.7 estomas adaxiales y 84.3 estomas

abaxiales menores de 4 h, 52.7 estomas adaxiales y 61.7 estomas abaxiales menores de 8 h, y 53.3 estomas adaxiales y 60.0

estomas abaxiales bajo control, respectivamente (Cuadro 1). Longitud significativa de los estomas adaxiales más largos (PAG<

0,006), ancho de los estomas adaxiales (PAG< 0.002), y longitud de los estomas abaxiales (PAG< 0,008) para las plantas en

biorreactores con una frecuencia de inmersión de 2 h en comparación con otros tratamientos. Tanto los tratamientos de frecuencia

de inmersión de 2 h como de 4 h dieron como resultado el tamaño más grande del ancho de los estomas abaxiales (PAG< 0,002)

(Cuadro 1). Los explantes cultivados bajo una frecuencia de inmersión de 2 h produjeron estomas esféricos y abiertos distribuidos

en las superficies de las hojas adaxial y abaxial (Fig. 4). Bajo una frecuencia de inmersión de 4 h, la morfología de los estomas fue

similar a aquellos bajo una frecuencia de inmersión de 2 h, pero con un número de estomas más bajo. Los explantes cultivados con

una frecuencia de inmersión de 8 h y en el control tenían en su mayoría estomas cerrados y un número total de estomas más bajo

en las superficies de las hojas adaxial o abaxial (Fig. 4).

Página 6/18
 tabla 1
Efecto de diferentesin vitrosistemas de cultivo sobre formación de estomas deBrassavola nodosadespués de 60 días en
cultura.
Cultura AdSN AbSN AdSSL AdSSW AbSSL AbSSW
sistemas (µm) (µm) (µm) (µm)

Control 53,3 ± 4,6b 60,0 ± 20,73 ± 18,0 ± 2,7b 20,8 ± 1,9b 16,1 ± 2,7b
10.6b 1.7b

Biorreactor 2h 75,3 ± 95,0 ± 8,7a 29,68 ± 23,7 ± 1,2a 27,9 ± 2,0a 22,1 ± 2,2a
10.0a 1.3a

Biorreactor 4h 58,7 ± 84,3 ± 22,85 ± 21,2 ± 1,5abdominales

25,0 ± 22,6 ± 2,1a
9.1abdominales 8.0abdominales 0.4b 2.4abdominales

Biorreactor 8h 52,7 ± 5,7b 61,7 ± 22,85 ± 17,9 ± 3,0b 23,3 ± 18,4 ± 0,9abdominales
16.3b 2.1b 3.0abdominales

Los números representan la media ± SE (error estándar). Medias con letras diferentes son significativamente diferentes
(Tukey, p.≤0,05).

Control = medio semisólido; Biorreactor de inmersión temporal: 2 horas de frecuencia de inmersión/aireación; frecuencia de
inmersión/aireación de 4 horas; 8 horas de frecuencia de inmersión/aireación. La duración de la inmersión fue de 2 minutos
para todos los tratamientos del biorreactor. AdSN = Número de Estomas Adaxiales; AbSN = Número de Estomas Abaxiales;
AdSSL = Longitud de estomas adaxiales; AdSSW = Ancho de los Estomas Adaxiales; AbSSL = Longitud de los Estomas Abaxiales;
AbSSW = Ancho de estomas abaxiales.

AclimataciónDurante la etapa de aclimatación se observaron diferencias significativas en el desarrollo y supervivencia de las

plantas. Las plántulas derivadas de biorreactores bajo una frecuencia de inmersión de 2 h tuvieron la mayor supervivencia (
PAG< 0,001) (93,3 %), seguido de la frecuencia de inmersión de 4 h (66,7 %), la frecuencia de inmersión de 8 h (33,3 %) y el
control (6,7 %) (tabla 2). Las plántulas derivadas de la frecuencia de inmersión de 2 h y 4 h mostraron un 100 % de
enraizamiento, mientras que las plántulas derivadas de la frecuencia de inmersión de 8 h mostraron un 53,3 % de
enraizamiento (PAG< 0,001) (Cuadro 2). El mayor número de raíces se observó en las plántulas derivadas de la frecuencia de
inmersión de 4 h con un promedio de 5,3 raíces por planta, seguido de 2 h con 4,3 raíces por planta y 8 h con 1,7 raíces por
planta (PAG< 0,002) (Cuadro 2). Peso fresco más alto (PAG< 0.029), peso seco (PAG< 0.025), y longitud de raíz (PAG< 0.032) se
registraron en plantas derivadas de una frecuencia de inmersión de 2 h (Cuadro 2, Fig. 5). No hubo diferencias significativas
en la longitud de los brotes y el número de hojas entre los diferentes sistemas de cultivo, excepto en el control (Cuadro 2). Se
desarrollaron nuevas raíces en plántulas derivadas de biorreactores con una frecuencia de inmersión de 2 h y 4 h, pero se
redujeron en menos de 8 h (Fig. 5). El control no mostró desarrollo de raíces y baja supervivencia, lo que impidió la
recolección de datos para otros parámetros (Cuadro 2, Fig. 5). No se observaron variaciones morfológicas para las plantas
cultivadas a partir de los tratamientos de inmersión de 2h, 4h y 8h y mostraron un fenotipo normal (Fig. 5).

Página 7/18
 Tabla 2
Efecto de diferentesin vitrosistemas de cultivo sobre el desarrollo vegetal deBrassavola nodosadespués de 60 días
aclimatación.
Cultura Disparo Hoja Fresco Seco Enraizamiento Raíz Raíz Supervivencia

sistemas longitud número peso peso porcentaje número longitud (%)

(cm) (gramo) (cm)
(gramo)

Control N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A 6,7 ±

3.3d

biorreactor 2,2 ± 6,7 ± 0,33 ± 0,030 ± 100,0 ± 0a 4,3 ± 2,8 ± 93,3 ±

2 horas
0.3a 1.3a 0.07a 0.006a 0.3abdominales 0.4a 6.7a

biorreactor 2,1 ± 4,0 ± 0,18 ± 0,016 ± 100,0 ± 0a 5,3 ± 1,5 ± 66,7 ±

4 horas
0.1a 0.6a 0.05abdominales 0.003abdominales 1.2a 0.4abdominales 6.7b

biorreactor 1,7 ± 4,3 ± 0,10 ± 0,009 ± 53,3 ± 5,8b 1,7 ± 0,7 ± 33,3 ±
8h 0.2a 0.7a 0.02b 0.002b 0.9b 0.4b 3.3C

Los números representan la media ± SE (error estándar). Medias con letras diferentes son significativamente diferentes
(Tukey, p.≤0,05).

Control = medio semisólido; Biorreactor de inmersión temporal: 2 horas de frecuencia de inmersión/aireación; frecuencia de
inmersión/aireación de 4 horas; 8 horas de frecuencia de inmersión/aireación. La duración de la inmersión fue de 2 minutos
para todos los tratamientos del biorreactor. NA = datos no disponibles.

Discusión
Se ha informado que la micropropagación de orquídeas con biorreactores TIS da como resultado tasas de multiplicación más
altas, una mayor producción de biomasa y un desarrollo más saludable del crecimiento de las plantas en comparación con
los sistemas de cultivo convencionales que utilizan un medio semisólido. (Young et al. 2000; Wu et al. 2007; Murthy et al.
2018; Leyva-Ovalle et al. 2020; Ramírez-Mosqueda y Bello-Bello 2021). En este estudio,B. nodosapropagadas en biorreactores
SETIS™ mostraron mayores tasas de multiplicación y un mayor peso fresco/seco en comparación con las cultivadas en medio
de cultivo semisólido (Fig. 2 y Fig. 3). Se obtuvieron tasas de multiplicación de 4.6 brotes por explante paraB. nodosa
utilizando el biorreactor SETIS™ en un plazo de 60 días. Los resultados son similares a los de Bello-Bello et al. (2019)
comparando diferentes sistemas de cultivo parain vitromultiplicación de brotes de banano, donde el mayor número de
brotes (7,3 brotes por explante) se obtuvo en biorreactores SETIS™. De manera similar, Ramírez-Mosqueda (2021) informó la
mayor multiplicación de brotes (11,4 brotes por explante) de vainilla en biorreactores SETIS™. Leyva-Ovalle et al. (2020)
también informaron una mayor multiplicación de brotes (6 brotes por explante) para la orquídeaGuarianthe skinnerial
utilizar biorreactores de inmersión temporal para la micropropagación, aunque los biorreactores utilizados fueron diferentes
al sistema SETIS™.

Específicamente para el género Brassavola, Mengarda et al. (2017), reportaron un periodo de 90 días para la inducción de
4 brotes por explante paraBrassavola tuberculadamicropropagadas en medio semisólido a base de agar, lo que contrasta
con nuestro estudio en el que los brotes se produjeron en un período de tiempo más corto (60 d).

Página 8/18
Estos resultados demuestran la eficiencia de la micropropagación de especies de orquídeas del géneroBrassavola utilizando

biorreactores TIS. La multiplicación de brotes se puede lograr en un período de tiempo más corto, lo que también puede resultar

en tasas de multiplicación más altas. Además, los estudios sobre la optimización de las condiciones de cultivo, incluida la

composición del medio y el ajuste de los parámetros de inmersión (frecuencia y duración) en los biorreactores pueden ayudar a

aumentar las tasas de multiplicación.

Una observación interesante fue que los explantes en biorreactores generaron raíces durante la etapa de multiplicación.
Esto representa un ahorro de tiempo y costos durantein vitromultiplicación y es un factor que facilitó la aclimatación de las
plántulas micropropagadas en invernadero. De igual forma se observó la presencia de raíces durante la micropropagación
de la orquídeaGuarianthe skinnerien biorreactores TIS (Leyva-Ovalle et al. 2020). A diferencia de,B. nodosalos explantes
cultivados en medio semisólido produjeron un número reducido de raíces (Fig. 2), posiblemente debido a las citoquininas en
el medio. Una mayor concentración de citoquininas podría reducir la biosíntesis de auxinas e inhibir el crecimiento de las
raíces (Su et al. 2011). Además, los cultivos semisólidos pueden requerir subcultivos frecuentes para mejorar la multiplicación
y el enraizamiento (Leyva-Ovalle et al. 2020), aunque en nuestro estudio, la frecuencia de subcultivo enin vitroculturas deB.
nodosano fue abordado. Sin embargo, la necesidad de aumentar el subcultivo para mejorar el enraizamiento agrega otro
elemento que aumenta tanto la mano de obra como el costo en el proceso de micropropagación, lo que hace que el sistema
de biorreactor TIS sea más eficiente.

La frecuencia y la duración de la inmersión y la aireación en los biorreactores TIS juegan un papel importante en la planta.
in vitro tanto en la multiplicación como en el desarrollo de las plantas, y la optimización de dichos parámetros es
importante para prevenir trastornos fisiológicos como la hiperhidricidad, entre otros. En este estudio, la frecuencia de
inmersión/aireación de 2 h con una duración de 2 min en biorreactores SETIS™ devolvió el mayor número de brotes
durante la micropropagación deB. nodosa. Los resultados informados en la literatura para otras especies de orquídeas
mostraron variación en la frecuencia de inmersión/aireación y los parámetros de duración, respectivamente, por ejemplo,
3 h/10 min parafalaenopsis(Hemping y Preil 2005), 4 h/2 min paraVainilla planifolia(Ramírez-Mosqueda y Bello-Bello 2021),
6 h/3 min paraBletilla estriada(Zhang et al. 2018), y 4 h/2 min para Guarianthe skinneri(Leyva-Ovalle et al. 2020). Esto
demuestra claramente que el genotipo juega un papel en la determinaciónin vitrolas respuestas y los parámetros de
inmersión y aireación deben evaluarse y ajustarse en consecuencia para cada especie. Nuestro estudio también muestra
que las respuestasin vitrodeB. nodosase mejoran bajo altas frecuencias y duración de inmersión y aireación, como 2 h/2
min.

El contenido relativo de clorofila fue significativamente mayor para las plántulas producidas en biorreactores TIS en
comparación con las del medio semisólido. El aumento en el contenido relativo de clorofila podría estar relacionado con el
aumento de la irradiación a través de los recipientes del biorreactor SETIS™ en comparación con la irradiancia limitada
proporcionada a los explantes en medio semisólido en microcajas. La irradiancia es un factor importante en los procesos
fisiológicos que afecta la síntesis de clorofila (Mancilla-Álvarez et al. 2021). Se ha informado un aumento en la síntesis de
clorofila usando inmersión temporal para la micropropagación deanturio andreanum(Martínez-Estrada et al. 2019). En este
estudio, la aireación frecuente proporcionada también puede haber contribuido al aumento del contenido relativo de
clorofila. Se ha informado que el aumento del intercambio de aire en los sistemas de inmersión temporal mejora la actividad
fotosintética (Aragón et al. 2010; Bello-Bello et al. 2019).

Página 9/18
El número, tamaño y funcionalidad de los estomas se ven afectados por la transpiración y la disponibilidad de agua (Larraburu et al. 2016). En este estudio, la morfología

de los estomas fue similar para todos los tratamientos. Sin embargo, los parámetros para el número y tamaño de estomas fueron más altos para las plántulas en

biorreactores TIS con una frecuencia de inmersión de 2 h seguida de una frecuencia de inmersión de 4 h, una frecuencia de inmersión de 8 h y un medio semisólido,

respectivamente. El número de estomas abiertos fue mayor con una frecuencia de inmersión de 2 h, pero similar a los otros tratamientos TIS. La humedad relativa (HR)

más alta proporcionada con una frecuencia de inmersión de 2 h probablemente resultó en tasas de transpiración más altas que contribuyeron al aumento de los

parámetros estomáticos. El efecto opositivo se observó en medio semisólido con parámetros estomáticos más bajos, posiblemente como resultado de la reducción de la

HR y el aumento del intercambio de aire causado por los ltros en las tapas de las microcajas. Se ha informado que la alta supervivencia de las plántulas durante la

aclimatación está relacionada con estomas cerrados y un menor número de estomas, lo que ayuda a prevenir la deshidratación (Ramírez-Mosqueda et al. 2019). Sin

embargo, en este estudio, las plántulas que mostraron estomas abiertos lograron la mayor supervivencia durante la aclimatación. Según Joshi et al. (2006), aunque se

prefieren los estomas cerrados para la aclimatación de las plántulas micropropagadas las plántulas que mostraron estomas abiertos lograron la mayor supervivencia

durante la aclimatación. Según Joshi et al. (2006), aunque se prefieren los estomas cerrados para la aclimatación de las plántulas micropropagadas las plántulas que

mostraron estomas abiertos lograron la mayor supervivencia durante la aclimatación. Según Joshi et al. (2006), aunque se prefieren los estomas cerrados para la

aclimatación de las plántulas micropropagadasex-vitro, aún se podría obtener una alta supervivencia disminuyendo gradualmente la humedad del aire. Esto podría

explicar los resultados informados para este estudio, ya que se promovió una reducción gradual de la HR durante la aclimatación.

La alta supervivencia (93%) observada para plántulas micropropagadas derivadas de biorreactores TIS bajo una frecuencia
de inmersión de 2 h en comparación con otros tratamientos indica que estos parámetros podrían aplicarse con éxito para la
micropropagación deB. nodosaorquídeas utilizando el sistema de biorreactor SETIS. La formación de raíces durante las
etapas de multiplicación también contribuyó a la aclimatación y supervivencia exitosas de las plántulas y podría aumentar
significativamente la eficiencia de propagación de esta especie.

Conclusiones
Este es el primer estudio que informa sobre el uso del sistema de biorreactor de inmersión temporal SETIS™ para la
micropropagación deB. nodosaorquideas Determinamos queB. nodosalas plántulas micropropagadas bajo biorreactores
TIS tuvieron mayores tasas de multiplicación en comparación con los sistemas de cultivo convencionales que utilizan un
medio basado en agar semisólido. La formación de raíces durante la fase de multiplicación mejoró la eficiencia de la
micropropagación, reduciendo así la mano de obra y los costos. Nuestro estudio demostró un protocolo exitoso para la
micropropagación a gran escala deB. nodosautilizando biorreactores, lo que podría tener un valor e impacto significativo
para la producción comercial de esta especie, así como para fines de conservación. La evaluación y el ajuste de los
parámetros de inmersión están garantizados para futuros estudios para mejorar la tasa de multiplicación de brotes.

Declaraciones
F unding

Los autores declaran que no recibieron fondos, subvenciones u otro apoyo durante la preparación de este
manuscrito.

Página 10/18
Conflicto de intereses

Los autores no tienen intereses financieros o no financieros relevantes que revelar.

Contribuciones de autor

Todos los autores contribuyeron a la concepción y el diseño del estudio. La preparación del material, la recopilación y el
análisis de datos estuvieron a cargo de JianJian Xu y David Beleski. El primer borrador del manuscrito fue escrito por
Wagner Vendrame y todos los autores comentaron las versiones anteriores del manuscrito. Todos los autores leyeron y
aprobaron el manuscrito final.

Expresiones de gratitud

Este trabajo cuenta con el apoyo del Instituto Nacional de Alimentación y Agricultura del USDA, proyecto Hatch 1012202.

Referencias
1. Alam MF, Sinha P, Hakim ML (2010) Micropropagación devanda teres(Roxb.) Lindle. En: jainista

2. SM, Ochatt SJ (eds) Métodos en biología molecular, vol. 589. Protocolos parain vitropropagación de plantas
ornamentales. Humana Press, Nueva York, págs. 21-28

3. Aragón CE, Escalona M, Rodriguez R, Cañal MJ, Capote I, Pina D, González-Olmedo J (2010) Efecto de la sacarosa, la
luz y el dióxido de carbono en la micropropagación de plátano en biorreactores de inmersión temporal.
In Vitro Cell Dev Biol Planta 46 (1): 89-94

4. Arditti J, Ernst R (1993) Micropropagación de orquídeas. John Wiley & Sons Inc., Nueva York

5. Bello-Bello JJ, Cruz-Cruz CA, Pérez-Guerra JC (2019) Un nuevo sistema de inmersión temporal para
micropropagación comercial de banano (musaCV AAA. Gran Naine). In Vitro Cell Dev Biol Planta 55 (3):
313-320

. Bergervoet JHW, van der Mark F, Custers JBM (1989) Organogénesis versus embriogénesis a partir de cultivos en
suspensión a largo plazo de pepino (Cucumis sativusl.). Representante de células vegetales 8 (2): 116-119

7. Bhoite HA, Palshikar GS Cultivo de tejidos vegetales: una revisión. Mundo J Pharm Sci 2: 565-572

. Chiapim C, Souza-Leal T, Cordeiro GM, Massaro R, Moraes CP (2012) Crescimentoin vitroem

diferentes meios de cultura: evaluación de híbridoBrassavola perriniiLindl. XCattleya loddigesii
Lindl. Orquidário 26:57–62
9. Chu CY, Knight SL, Smith MAL (1993) Efecto del cultivo líquido sobre el crecimiento y desarrollo de la
rosa en miniatura (Rosa chinensisjacq. 'Mínimos'). Plant Cell Tiss Org Cult 32 (3): 329-334

10. Chugh S, Guha S, Rao IU (2009) Micropropagación de orquídeas: una revisión del potencial de diferentes
explantes. Sci Hort 122 (4):507-520

11. Devi J, Borthakur B, Deka P (1997) Propagación clonal deDendrobium moschatumyCymbidium aloifoliuma
través del cultivo de puntas de brotes. J Orquídea Soc India 11 (1-2): 19-21

Página 11/18
12. Divakaran M, Babu KN, Ravindran PN, Peter KV (2015) Biotecnología para micropropagación y
mejora de variaciones en vainilla. Asian J Plant Sci Res 5:52-62
13. Douglas GC (1984) Propagación de ocho cultivares deRododendro in vitroutilizando medios sólidos y líquidos de
agar y enraizamiento directo de brotes in vivo. Scientia Horticulturae 24 (3):337-347

14. Escalona M, Lorenzo JC, González B, Daquinta M, González JL, Desjardins Y, Borroto CG (1999) Piña (Ananas
comosusL. Merr) micropropagación en sistemas de inmersión temporal. Representante de células vegetales 18
(9): 743-748

15. Etienne H, Berthouly M (2002) Sistemas de inmersión temporal en micropropagación de plantas. Culto de la organización de tejidos de

células vegetales 69: 215-231

1. Georgiev V, Schumann A, Pavlov A, Bley T (2014) Sistemas de inmersión temporal en planta

biotecnología. Ciencias de la vida en inglés 14 (6): 607-621

17. Griesbach RJ (1986) Cultivo de tejidos de orquídeas. En: Zimmerman RH, Griesbach 333 RJ, Hammerschlag FA, Lawson
RH (eds) El cultivo de tejidos como sistema de producción de plantas para cultivos hortícolas. Martinus
Nijhoff, Dordrecht, págs. 343-349

1. Hemping T, Preil W (2005) Aplicación de un sistema de inmersión temporal en la propagación masiva de

falaenopsis. En: Hvoslef-Eide AK, Preil W (eds) Sistemas de cultivo líquido parain vitroPropagación
de plantas. Springer Países Bajos, Dordrecht, págs. 231-242

19. Jones HG (1975) Revisión nomenclatural del géneroBrassavolaR. Br. de las Orchidaceae. Annalen des
Naturhistorischen Museums in Wien 79:9-22
20. Jones D, Tisserat B (1990) Propagación clonal de orquídeas. En: Pollard JW, Walker JM (eds.) Métodos en biología
molecular, vol. 6. Cultivo de células y tejidos vegetales. Humana Press, Nueva York. págs. 181-191

21. Joshi P, Joshi N, Purohit SD (2006) Características estomáticas durante la micropropagación deWrightia
tomentosa. Biol Planta 50 (2):275-278

22. Kalimuthu K, Senthilkumar R, Murugalatha N (2006) Regeneración y multiplicación masiva deVainilla planifolia
Andr.–una orquídea tropical. Ciencia actual: 1401-1403

23. Kumar N, Reddy M (2011)in vitroPropagación de plantas: una revisión. Revista de ciencias forestales y
ambientales 27 (2): 61-72

24. Kyte L, Kleyn J (1996) Plantas de tubos de ensayo: una introducción a la micropropagación. Timber Press,
Portland, pág. 13

25. Larraburu EE, Bususcovich AC, Llorente BE (2016)Azospirillum brasilensemejorain vitroyex-vitro

enraizamiento-aclimatación de jojoba. Sci Hort 209:139-147
2. Leyva-Ovalle OR, Bello-Bello JJ, Murguía-González J, Núñez-Pastrana R, Ramírez-Mosqueda MA
(2020) Micropropagación deGuarianthe skinneri(Bateman) Dressler et WE Higging en sistemas de
inmersión temporal. 3 Biotecnología 10 (1):26

27. Mancilla-Álvarez E, Pérez-Sato JA, Núñez-Pastrana R, Spinoso-Castillo JL, Bello-Bello JJ (2021)

Comparación de diferentes biorreactores semiautomatizados parain vitropropagación del taro (
Colocasia esculentaL. Schott). Plantas 10(1010):1-11.

Página 12/18
2. Martínez-Estrada E, Islas-Luna B, Pérez-Sato JA, Bello-Bello JJ (2019) Inmersión temporal
mejorain vitromultiplicación y aclimatación deanturio andreanumlinda Sci Hort 249:185-191

29. Mata-Rosas M, Lastre-Puertos E (2015) Conservación a largo plazo de protocormos deBrassavola

Nodosa(L) Linda. (Orchidaceae): efecto de ABA y una variedad de técnicas de crioconservación.
Crioletras 36 (5):289-298

30. Mengarda LHG, Cola GPA, de Oliveira SC, de Freitas AR (2017) Multiplicación, enraizamientoin vitroy
aclimatación deBrassavola tuberculataGancho. (Orchidaceae), una orquídea endémica de la selva
atlántica brasileña. Biosci J 33 (3):730-738

31. Murashige T, Skoog F (1962) Un medio revisado para crecimiento rápido y bioensayos con cultivos de tejidos de
tabaco. Planta Physiol 15 (3):473-497

32. Murthy HN, Paek KY, Park SY (2018) Micropropagación de orquídeas mediante el uso de tecnología de biorreactores.
En: Lee YI, Yeung EC-T (eds) Propagación de orquídeas: de laboratorios a invernaderos: métodos y protocolos.
Springer Nueva York, Nueva York, NY, págs. 195-208

33. Neumann KH, Kumar A, Imani J (2009)in vitroPropagación de Cymbidium. En: KH Neumann, Kumar
A, Imani J (eds) Cultivo de células y tejidos vegetales: una herramienta en biotecnología: conceptos básicos y aplicación.

Springer-Verlag, Dordrecht, págs. 83-86

34. Paek KY, Hahn EJ, Park y SY (2011) Micropropagación de orquídeas Phalaenopsis a través de protocormos y cuerpos
similares a protocormos. En: Thorpe TA, Yeung C (eds) Métodos en biología molecular. Cultivo de embriones vegetales:
métodos y protocolos. Springer 392 Science Business Media, Dordrecht, págs. 293-306

35. Panwar D, Ram K, Shekhawat SNP (2012)in vitropropagación deEulofia nudaLindl. una orquídea en
peligro de extinción. Sci Hort 139:46-52

3. Phillips GC, Garda M. (2019) Medios y prácticas de cultivo de tejidos vegetales: una descripción general. Desarrollo celular in vitro

Planta Biol 55: 242-257

37. Ramírez-Mosqueda MA, Bello-Bello JJ (2021) El biorreactor SETIS™ aumentain vitromultiplicación y longitud
de brotes en vainilla (Vainilla planifoliajotas Ex Andrews). Planta Physiol Acta 43 (4):52

3. Ramírez-Mosqueda MA, Cruz-Cruz CA, Cano-Ricardez A, Bello-Bello JJ (2019) Evaluación de

diferentes sistemas de inmersión temporal en la micropropagación de anturios (anturio
andreanum). Biotecnología 9:307
39. Reed BM, Sarasan V, Kane M, Bunn E, Pence VC (2011) Conservación de la biodiversidad y herramientas
biotecnológicas de conservación. In Vitro Cell Dev Biol Planta 47 (1): 1-4

40. Rodrigues LA, Neto VBP, Boaretto AG, Oliveira JF, Torrezan 413 MA, Lima SF, Otoni WC (2015)in vitro propagación
deCyrtopodium saintlegerianumrchb. F. (orchidaceae), una orquídea nativa de la sabana brasileña. Cultivo Raza
Aplicación Biotecnología 15:10-17

41. Soares JS, Sorgato JC, Ribeiro LM (2020) Protocolo para la germinación asimbiótica y el desarrollo inicial de
protocormos de orquídeas nativas del Cerrado brasileño. Rodrigo 71:1-10

42. Sousa GG, Rosa YBCJ, Macedo MC, Soares JS (2015) Aclimatación deBrassavola tuberculatacom a
utilização de ANA em diferentes sustratos. Hort Brasil 33:208-215
Página 13/18
43. Su YH, Liu YB, Zhang XS (2011) La interacción auxina-citoquinina regula el desarrollo del meristema.
Planta Molec 4 (4):616-625

44. Swarts ND, Dixon KW (2009) Conservación de orquídeas terrestres en la era de la extinción. Anabot 104
(3):543-556
45. Teisson C, Alvard D (1995) Un nuevo concepto de plantain vitromedio líquido de cultivo: inmersión temporal. En:
Terzi M, Cella R, Falavigna A (eds) Temas actuales en biología molecular y celular de plantas: Actas del VIII
Congreso Internacional sobre Cultivo de Tejidos y Células Vegetales, Florencia, Italia, 12-17 de junio de 1994.
Springer Países Bajos, Dordrecht , págs. 105-110

4. Teixeira da Silva JA, Tsavkelova EA, Ng TB, Parthibhan S, Dobranszi J, Cardoso JC, Rao MV, Zeng S
(2015) Asimbióticoin vitroPropagación de semillas de Dendrobium. Representante de células vegetales 34: 1685-1706

47. Tisserat B, Vandercook CE (1985) Desarrollo de un sistema de cultivo de plantas automatizado. Culto de la organización de tejidos de

células vegetales 5 (2): 107-117

4. Tisserat B, Jones D (1999) Propagación clonal de 434 orquídeas. En: Hall RD (ed) Métodos en molecular
biología, Vol.111. Protocolos de cultivo de células vegetales. Humana Press, Nueva York, págs. 127-134

49. Tokuhara K, Mii M (1993) Micropropagación defalaenopsisyDoritaenopsiscultivando las puntas de los brotes de las yemas de los tallos de las

flores. Representante de células vegetales 13 (1): 7-11

50. Vendrame WA, Khoddamzadeh AA (2017) Biotecnología de orquídeas. En: Janick J (ed.) Hort Rev
44:173-228

51. Villa F, Pasqual M, Silva EF (2014) Micropropagación de híbridos de orquídeas en medio de cultivo knudson
con adicción de vitaminas del medio de cultivo MS, bencilaminopurina y carbón activado. Ciênc Agrárias
35:683–694

52. Wu RZ, Chakrabarty D, Hahn EJ, Paek KY (2007) Micropropagación de una orquídea joya en peligro de extinción (
Anoectochilus formosanus) utilizando un sistema de biorreactor. Hortic Environ Biotechnol 48:376-380

53. Xu JJ., Beleski DG, Vendrame WA (2022) Efectos de los medios de cultivo y los reguladores del crecimiento de plantas
enin vitroPropagación de Brassavola nodosa. In Vitro Cell Dev Biol https://doi.org/10.1007/s11627-022- 10276-7

54. Young P, Murthy HN, Kee Yoeup P (2000) Multiplicación masiva de cuerpos similares a protocormos usando un
sistema de biorreactor y posterior regeneración de plantas en Phalaenopsis. Plant Cell Tiss Org Cult 63 (1): 67-72

55. Zeng S, Zhang Y, Silva JAT, Wu K, Zhang J, Duan J (2014) Biología de semillas yin vitrogerminación de semillas de
Cypripedium. Crit Rev Biotecnología 34:358-371

5. Zhang B, Sarsaiya S, Pan X, Jin L, Xu D, Zhang B, Duns GJ, Shi J, Chen J (2018) Optimización de
condiciones nutricionales utilizando un sistema de biorreactor de inmersión temporal para el crecimiento
deBletilla estriadapseudobulbos y acumulación de polisacáridos. Sci Hort 240:155-161

57. Ziv M (2000) Tecnología de biorreactores para la micropropagación de plantas. Hort Apocalipsis 24:1-30

Cifras
Página 14/18
F figura 1

Micropropagación deBrassavola nodosabajo diferentes sistemas culturales. Medio semisólido en microcajas

(A). Medio líquido en biorreactores de inmersión temporal SETIS™ (B). Detalle deB. nodosa in vitrodispara
dentro del vaso del biorreactor (C, D).

Página 15/18
F figura 2

Efectos de diferentesin vitrosistemas de cultivo sobre el crecimiento y desarrollo deBrassavola nodosadespués de 60 días en

cultivo. A) Multiplicación de brotes (número de brotes por explante), B) Número de hojas, C) Longitud de brotes, D) Porcentaje de

enraizamiento, E) Número de raíces y F) Longitud de raíces. Control = medio semisólido; Biorreactor de inmersión temporal: 2

horas de frecuencia de inmersión/aireación; frecuencia de inmersión/aireación de 4 horas; 8 horas de frecuencia de inmersión/

aireación. La duración de la inmersión fue de 2 minutos para todos los tratamientos del biorreactor. Las barras indican la media ±

SE. Letras diferentes indican diferencias significativas por Tukey'stest en p≤0.05.

F figura 3

Efectos de diferentesin vitrosistemas de cultivo sobre el contenido de clorofila (A), y el peso fresco (B) y seco (C) de
Brassavola nodosadespués de 60 días en cultivo. Control = medio semisólido; Biorreactor de inmersión temporal: 2 horas de
frecuencia de inmersión/aireación; frecuencia de inmersión/aireación de 4 horas; 8 horas

Página 16/18
frecuencia de inmersión/aireación. La duración de la inmersión fue de 2 minutos para todos los tratamientos del biorreactor. Las

barras indican la media ± SE. Letras diferentes indican diferencias significativas por la prueba de Tukey en p≤0.05.

F figura 4

Huellas estomáticas de superficies foliares abaxiales y adaxiales deBrassavola nodosadespués de 60 días en cultivo bajo diferentes

sistemas de cultivo. Control = medio semisólido; Biorreactor de inmersión temporal: 2 horas de frecuencia de inmersión/aireación;

frecuencia de inmersión/aireación de 4 horas; 8 horas de frecuencia de inmersión/aireación. La duración de la inmersión fue de 2

minutos para todos los tratamientos del biorreactor. Barras = 50 µm.

Página 17/18
F figura 5

in vitro-plántulas derivadas después de 60 días bajo aclimatación. A) Aclimatación dein vitro-derivado Brassavola nodosaplantas en
invernadero con sistema de niebla. B) Efecto de los sistemas de cultivo sobre el desarrollo de las plantas durante la aclimatación:

Testigo = Medio semisólido; Biorreactor de inmersión temporal: 2 horas de frecuencia de inmersión/aireación; frecuencia de

inmersión/aireación de 4 horas; 8 horas de frecuencia de inmersión/aireación. La duración de la inmersión fue de 2 minutos para

todos los tratamientos del biorreactor. Las barras indican la media ± SE. Barra de escala = 1 cm.

Página 18/18