UNGS-Instituto de Ciencias

Laboratorio II – T.P.N° 6 “separación de sustancias por cromatográfica en columna”

T.P.N° 6 :SEPARACIÓN DE SUSTANCIAS POR

CROMATOGRÁFICA EN COLUMNA
Analista: Grachot, María Eugenia
Comisión: 03
Fecha de entrega: 26 - 10 – 2023

OBJETIVOS

● Separar mezclas binarias de sólidos coloreados e incoloros, utilizando cromatografía

en columna de sílica gel.
● Encontrar las condiciones de elución más adecuadas para la separación de los
componentes presentes en cada muestra, tales como: solventes de elución, largo de la
columna, cantidad de sílica gel, entre otras.
● Extrapolar las condiciones cromatográficas de ccd a las condiciones de elución de la
columna.

INTRODUCCIÓN

Las cromatografías son una técnica cuyo principio general se basa en la distribución de
un compuesto entre dos fases, una fija y otra móvil. Se la puede ver como la remoción
selectiva de los componentes de una mezcla por acción de la fase móvil que fluye a
través de la fase estacionaria, donde se encuentran.
En la cromatografía de adsorción, el soluto es adsorbido en la superficie del adsorbente
(fase sólida) y luego desorbido por el solvente de fase móvil. Si se trata de una mezcla
de solutos, el más fuertemente atraído por el adsorbente, será el más difícil de eluir y
será el que “corre” o se desplaza menos. Este tipo de cromatografía se utiliza en la
cromatografía en capa delgada (ccd) y en la cromatografía en columna.
La ccd, entre otros fines analíticos para los que se la utiliza, permite elegir la secuencia
de solventes apropiados para la elución de los componentes de la mezcla en una
columna. Generalmente se usan como adsorbente sílica gel sobre un soporte de
aluminio (Figura 1).

cromatografía en capa delgada (ccd)

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sílica gel
Flujo de solvente

Frente de corrida

Tiempo

Figura 1. Esquema de una cromatografía en capa delgada.

La cromatografía en columna, por otro lado, se utiliza para la separación de compuestos

presentes en una muestra (Figura 2). La columna tiene como ventaja, frente a otros
tipos de cromatografía, que permite el cambio secuencial de la polaridad del solvente de
elución. Por lo tanto, es una condición general empezar el desarrollo de la columna con
solventes de baja polaridad, para luego aumentarla lentamente.

Figura 2. Esquema de una cromatografía en columna para separar dos componentes de una
muestra coloreada, utilizando un gradiente de polaridad para los solventes de elución.

Así, se decide primero mediante una ccd qué solventes son óptimos para separar los
compuestos de la muestra de interés, y posteriormente se extrapola esas condiciones
cromatográficas a las condiciones de elución de la columna.

DESARROLLO EXPERIMENTAL

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Para determinar el sistema de solventes que se utilizarán en cada una de las

cromatografías de adsorción en columna, se realiza como primer paso una serie de
diferentes cromatografías en capa delgada, utilizando como fase estacionaria sílica gel y
como fase móvil diferentes mezclas de ciclohexano y acetato de etilo. Se observa el
comportamiento de cada componente mediante el cálculo de sus Rf (ver Anexo de
Cálculos) de forma tal de elegir los solventes de elución para la columna cromatografía
a realizar posteriormente. Los resultados de las placas cromatográficas figuran en el
apartado Resultados. Todas las ccd realizadas fueron reveladas con lámpara UV.
Parte A: muestra coloreada
Una vez elegido el sistema de solventes, se prepara 10,0 mL de cada mezcla de
solventes. Se utiliza como columna una bureta de 10,0 mL, a la cual previamente se le
coloca un tapón de algodón en la parte baja y se le adiciona arena. Se agrega solvente de
armado (ciclohexano) para eliminar burbujas de aire del vástago de la bureta. Se agrega
la fase estacionaria (sílica gel, previamente preparada con 4,0 gramos de sílica gel en
10,0 mL de ciclohexano). Se elimina el exceso de ciclohexano una vez que la sílica gel
se solidifique, dejando una fina capa (2-3 cm) sobre la sílica gel. Se siembra 0,5 mL de
la muestra utilizando pipeta Pasteur, asegurándose que la muestra caiga por las paredes.
Se abre el robinete para que la muestra entre a la columna; se hacen dos lavados con 3,0
mL de ciclohexano.
Se agrega el primer solvente de elución, mezcla de ciclohexano:AcOEt 8:2. Se observa
que la muestra comienza a eluir y se produce la formación de bandas coloreadas.
Cuando el primer componente esté cercano a eluir completamente de la columna, se
agrega el segundo solvente de elución, mezcla de ciclohexano:AcOEt 8:2, de forma tal
que comience a eluir el segundo componente coloreado. Se agrega solvente de elución
ciclohexano:AcOEt 1:1 para terminar de eluir el segundo componente. Las fracciones se
recogen en tubos Hach.
Por lo tanto, el solvente ideal para el desarrollo verificado por la ccd es que primer
compuesto tenga un rf entre 0,3-05 y el segundo el compuesto tenga un rf aproximado o
igual a cero (o sea que el compuesto no se mueva).
Figura 4. columna cromatográfica experimental

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Parte B: muestra incolora B1

Una vez elegidos los solventes de elución, se procede a armar la columna
cromatográfica. Para esto se coloca algodón en la parte baja de una bureta de 10,0 mL,
ayudándose con una varilla de vidrio. Se agrega una pequeña cantidad de arena. Se
agrega solvente de armado (ciclohexano) para eliminar burbujas de aire del vástago. Se
agrega la fase estacionaria (sílica gel, previamente preparada con 4,0 gramos de sílica
en 10 mL). Se siembra 0,5 mL de la muestra incógnita utilizando pipeta Pasteur,
asegurándose que la muestra caiga por las paredes. Se abre el robinete para que la
muestra entre a la columna; se hacen dos lavados con 3,0 mL de ciclohexano.
Se agrega el primer solvente de elución elegido, mezcla ciclohexano:AcOEt 8:2, de
forma tal de eluir el analito menos polar. Se sigue la cromatografía utilizando una placa
de seguimiento rápido, sembrando gotas de las fracciones (5,0 mL) recogidas en tubos
Hach.
De esta forma, se observa qué se tiene en cada fracción y se puede elegir el momento
adecuado para agregar el segundo solvente de elución (mezcla ciclohexano:AcOet 1:1),
de forma de comenzar a eluir el analito más polar mientras el menos polar continúa
eluyendo fuera de la columna. Posteriormente se agrega solvente de elución
ciclohexano:AcOEt 4:6 y para finalizar de eluir el último componente, se utiliza
ciclohexano:AcOEt 0:1.
Finalmente se analizan los tubos Hatch y se selecciona dos tubos donde aparecen los
analitos presentes (uno por cada analito), se realiza una ccd en una Cuba
ciclohexano:AcOEt 8:2; donde se siembra el componente 1, la muestra B1 y el
componente 2. Por último, se revela en uv.

RESULTADOS
Parte A: muestra coloreada
1 2 3 4 5 6 7 8
solvente de 1:0 9:1 8:2 7:3 6:4 1:1 2:8 0:1
elución
hexano:AcOEt
frente de corrida 3,5 cm 3,5 cm 3,5 cm 3,5 cm 3,5 cm 3,5 cm 3,5 cm 3,5 cm
Rf mancha 0,10 0,38 0,48 0,64 0,71 0,78 0,83 0,90
superior
Rf marcha 0,00 0,00 0,00 0,22 0,43 0,48 0,66 0,80
inferior
∆Rf 0,10 0,38 0,48 0,42 0,28 0,30 0,17 0,10

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Tabla 1: Corridas cromatográficas de la muestra utilizando diferentes mezclas de solventes de
elución ciclohexano:AcOEt, con sus respectivos Rf. Fase estacionaria: sílica gel. Revelador:
lámpara UV.

Figura 5. Componentes separados de la muestra coloreada mediante cromatografía en

columna de adsorción.

Parte B: muestra incolora

1 2 3 4 5 6 7
solvente de 1:0 9:1 8:2 7:3 6:4 1:1 0:1
elución
hexano:AcOEt
frente de corrida 3,5 cm 3,2 cm 3,5 cm 4,0 cm 3,8 cm 3,5 cm 3,5 cm
Rf mancha 0,14 0,84 0,78 0,83 0,79 0,81 0,90
superior
Rf marcha 0,00 0,00 0,06 0,05 0,08 0,11 0,80
inferior
∆Rf 0,14 0,84 0,72 0,78 0,71 0,70 0,10
Tabla 2: Corridas cromatográficas realizadas para la muestra incógnita con diferentes
mezclas de solvente. Fase estacionaria: sílica gel. Revelador: lámpara UV.

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Figura 6. Placa de seguimiento rápido realizada en conjunto con la cromatografía en columna
de adsorción. Fase estacionaria: sílica gel. Revelador: lámpara UV.

Donde
F = Tubo 3
A = muestra B1
B = Tubo 14
Frente de corrida = 3,5 cm
RfF = 0,48 RfB = 0,00
RfA mancha superior = 0,48
RfA marcha inferior = 0,00

Figura 7. Corrida cromatográfica realizada para la

muestra original B1 y los tubos 3 y 14 obtenidos al realizar la
columna cromatográfica. Fase estacionaria: sílica gel.
Revelador: lámpara UV.

ANÁLISIS DE RESULTADOS

Parte A: muestra coloreada

La muestra coloreada está formada por los colorantes Quinoline Yellow y Rojo Sudán,
cuyas estructuras moleculares figuran en la Figura 8.

Figura 8. Estructuras moleculares de los componentes presentes en la muestra coloreada.

Como se observa en la Figura 8, el Quinoline Yellow es un compuesto más polar que el

Rojo Sudán. Por lo tanto, al hacerlo correr en una cromatografía en capa delgada, las
moléculas de Quinoline Yellow tendrán interacciones más fuertes por la superficie de la
fase estacionaria que las moléculas de solvente, siendo el componente más difícil de

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desorber. Por otro lado, siendo el Rojo Sudán el compuesto adsorbido más débilmente,
será el más fácil de desorber por el solvente, siendo así el que mayor Rf tenga en la
corrida cromatográfica. De forma tal de lograr desorber al Quinoline Yellow, se
aumenta progresivamente la polaridad del solvente de corrida, modificando la
proporción en que se encuentra el componente más polar (acetato de etilo) respecto al
componente menos polar (ciclohexano). De esta manera se obtienen los resultados
mostrados en la Tabla 1 del apartado Resultados. Allí se observa que, al hacer correr la
muestra en ciclohexano puro, el rojo Sudán se desplaza con un Rf de 0,10; y el
Quinoline Yellow no se mueve de la línea de siembra. Al aumentar la polaridad, se
observa que el rojo Sudán continúa siendo el de mayor Rf, mientras que el Quinoline
Yellow se desplaza más respecto a la línea de siembra.
De esta forma se decide realizar la columna cromatográfica utilizando un gradiente de
polaridad de solventes de elución, de forma tal de eluir primeramente al rojo Sudán, y
por separado al Quinoline Yellow.

Parte B: muestra incolora B1

De forma tal de encontrar los solventes de elución óptimos para separar los
componentes de la muestra incógnita por cromatografía en columna, se realizó una serie
de ccd con diferentes proporciones de ciclohexano: acetato de etilo, obteniéndose los
resultados mostrados en la Tabla 2, Allí se observa que, a baja polaridad del solvente de
elución, la muestra prácticamente no corre, permaneciendo cercana a la línea de
siembra.
Observando la placa de seguimiento se ve que en los tubos 2,3 y 4 contiene un
componente, luego se observa que a partir del tubo 12 al tubo 16 se obtiene el segundo
componente.
Finalmente se siembra el componente 1 (eligiendo el tubo 3) y el componente 2
(eligiendo el tubo 14) y la muestra B1, se lo lleva a un cuba de mezcla
ciclohexano:AcOEt 8:2 y se revela por UV, dando como resultado que la mancha
inferior de la muestra tiene el mismo rf que el tubo número 14 y a su vez la Mancha
superior tiene el mismo rf que el tubo número 3 (ver figura 7.)

CONCLUSIONES

Se logró encontrar la mezcla de solventes óptimos para separar una muestra coloreada,
cuyos componentes lograron obtenerse en fracciones separadas mediante cromatografía
en columna de adsorción. Por otro lado, fue posible separar los componentes de la
muestra incolora mediante la técnica utilizada.

ANEXO
Cálculo de Rf

Para el cálculo de los Rf de los analitos presentes en las corridas cromatográficas en

capa delgada realizadas, se utilizó la siguiente fórmula general:

di s t a nci a recorrid a por el compueto

Rf =
di s t a nci a recorrid a por el s olvente

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Protocolos experimentales:

Parte A: muestra coloreada

1. Se utiliza como columna, una bureta de 10,0ml y se productos al armado de columna
I. Se
coloca algodón
con ayuda de
una varilla de
vidrio en el
fondo de la
bureta, luego se
agrega la arena.
(ver Figura 9)
II. Se agrega solvente de
armado para eliminar burbujas de aire
de vástago y verificar el correcto goteo
del mismo.
III. Se trabaja bajo campana, y se
prepara la fase estacionaria, utilizando
4,0g de sílica gel y 10,0ml de
ciclohexano en un vaso de precipitados.
IV. Con la ayuda de un embudo se transfiere la fase estacionaria, se golpea
suavemente con una perita para eliminar cualquier burbuja presente y un buen
empaquetamiento(1)
Figura 9: armado de columna cromatográfica (I)
2. Se elimina el resto del solvente de la columna (evitando no dejar sacar la sílica).
3. Se siembra 3gotas de la muestra utilizando pipeta Pasteur, asegurándose que la
muestra caiga por las paredes, teniendo cuidado de no levantar la capa superior de la
sílica.
4. Se abre el robinete, y se observa que la muestra este dentro de la columna.
5. Se agrega el primer solvente de elución, mezcla de ciclohexano:AcOEt 8:2 (10,0ml
aproximadamente), con la ayuda de una varilla de vidrio, descargando solvente por las
paredes de la columna.
6. Se observa que la muestra comienza a eluir y se produce la formación de dos bandas.
7. Se nota que el primer componente a eluir es el Rojo sudan, cuya polaridad es menor.
8. Cuando este compuesto eluya por completo, se agrega el segundo solvente de
elución, ciclohexano :AcOEt 1:1 de tal forma que el Quinoline Yellow comience a eluir.
9. Finalmente se agrega el solvente de elución ciclohexano:AcOEt 0:1 para terminar de
eluir el Quinoline
Yellow (Compuesto
más polar).
10. Se recolecta las
fracciones en tubos
Hasch.

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Figura 10: armado de columna cromatográfica (II)

Figura 11: armado de columna cromatográfica (III)

(1) Empaquetamiento: homogeneidad en el armado de la fase fija en la columna, está

dado por un asentamiento parejo de su relleno. La no homogeneidad implicará un
descenso rápido de las bandas por las zonas menos densas de relleno y los compuestos
saldrán mezclados.
a) Columna sembrada
comienza la ilusión.
b) Distorsión del frente de las
bandas de solutos debido al
mal empaquetamiento de
relleno de la columna.
c) El eluato con ambos solutos
como si no hubiera habido separación alguna en la columna

Parte B: muestra incolora B1

1. Se repito los pasos 1 al 4 inclusive del protocolo experimental “Parte A: muestra

coloreada”. Observando que es el mismo solvente de armado.
2. Se agrega primer solvente de elución, mezcla de ciclohexano:AcOEt 8:2 (aprox 10
ml.)
3. Se recolecta en tubos Hach cada 4,0 -5,0 ml.
4. Se utiliza unas placas de seguimiento rápido, sombrando gotas de las fracciones
recogidas en tubos (ver figura 6).
5. Se observa por lámpara UV, si eluye algún componente, al finalizar de eluir el primer
componente, se cambia al segundo solvente de elución.

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6. Se agrega el segundo solvente de elución, mezcla de ciclohexano:AcOEt 1:1 (Aprox.

7,0 ml).
7. Por último, para extraer por completo el último componente, se aumenta la polaridad
del solvente, primero una mezcla de ciclohexano:AcOEt 4:6 (aprox. 10,0ml) y luego 0:1
(aprox. 13,0ml)
8. Finalmente, se analizan los tubos hach y de donde aparecen los a analitos presente, se
elige dos tubos (uno de cada analito)
9. Se realiza una ccd, con el solvente de la cuba una mezcla de ciclohexano:AcOEt 8:2,
donde se siembra componente 1, la muestra B1, componente 2.
10. Se revela en UV y se determina si la muestra B1 corresponde el componente 1 y 2
comparando sus Rf.

BIBLIOGRAFÍA

● GALAGOVSKY KURMAN, Química Orgánica, Fundamentos teóricos-prácticos

para el laboratorio. Ciudad de Buenos Aires. EUDEBA. 2002.

● MARTÍNEZ GRAU, Técnicas experimentales en síntesis orgánica. Madrid. Editorial

Síntesis. 1998.

● Acetato de etilo
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● Ciclohexano
https://www.carlroth.com/medias/SDB-7333-ES-ES.pdf?context=bWFzdGVyfHNlY3V
yaXR5RGF0YXNoZWV0c3wzMTM4NTF8YXBwbGljYXRpb24vcGRmfHNlY3Vya
XR5
RGF0YXNoZWV0cy9oNGIvaDAxLzkwNTgwODIyMjYyMDYucGRmfDQ3Njk1ZW
M3
MTYzZGFhYTAwMDc5ODNhY2JiNzJiNDA4MDA4OTdmOTI3MDFmNDJkZjQzN
TM0 NjQzOWE2ZGE5ZWM

● Acetona
https://www.merckmillipore.com/AR/es/product/msds/MDA_CHEM-107021?Referrer
URL=https%3A%2F%2

● Sílica gel
https://www.merckmillipore.com/AR/es/product/msds/MDA_CHEM-107735

● Rojo Sudan

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https://www.carlroth.com/medias/SDB-4711-ES-ES.pdf?context=bWFzdGVyfHNlY3V
yaXR5RGF0YXNoZWV0c3wyMzMwNjd8YXBwbGljYXRpb24vcGRmfHNlY3VyaX
R5
RGF0YXNoZWV0cy9oN2UvaDliLzkwNTkzMjE1Nzc1MDIucGRmfGMxNDQ2ZDU
1Z
WM4MTA2YTRiMTc2Y2QwYWRhYjVkNjM4YzgxNjY2ZTgxZjVhZWRlYTFhNT
U0NjE 0YTE0NGZkN2E

● Quinoline Yellow
https://www.fishersci.com/store/msds?partNumber=AC277340250&productDescriptio
n=QUINOLINE+YELLOW
%2C+WATER+25GR&vendorId=VN00032119&countryCod e=US&language=en

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