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UNIVERSIDAD NACIONAL JOSÉ FAUSTINO SÁNCHEZ CARRIÓN

FACULTAD DE ING. AGRARIA, INDUSTRIAS ALIMENTARIAS Y AMBIENTAL

ESCUELA DE INGENIERÍA AMBIENTAL

INFORME

Tema:

COLORACIÓN SIMPLE Y COMPUESTA

Presentado por:

RAMIREZ CAMPOS, Vanessa Karelly

DOCENTE:

Francisco, MORE CASTILLO

CICLO:

II

HUACHO – LIMA – PERÚ

2023
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ÍNDICE

INTRODUCCIÓN 3

COLORACIÓN SIMPLE Y COMPUESTA 4

I. OBJETIVOS 4

II. FUNDAMENTO TEORICO 4

2.1. Coloración simple: 4

2.2. Coloración Compuesta 5

2.2.1. Coloración Gram 6

2.2.1.1. Bacterias Gram Positiva: 7

2.2.1.2. Bacterias Gram Negativa: 7

III. MATERIALES 8

IV. PROCEDIMIENTO 14

4.1. Procedimiento para la coloración compuesta 14

4.2. Procedimiento para la coloración simple 17

V. CONCLUSIONES 19

VI. RECOMENDACIONES 19

VII. BIBLIOGRAFÍA 20
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INTRODUCCIÓN

Las tinciones bacterianas son de gran importancia en la microbiología, debido a que

permiten conocer las propiedades y características de las bacterias. Esta práctica tuvo como
objetivo conocer los diferentes tipos de tinciones, simples y compuestas. Se reconoce la
importancia de realizar tinciones ,para demostrar la muestra de microorganismos así como la
morfología de cualquier célula presente determinada la prueba Las tinciones serán siempre
uno de los aspectos más importantes y el primer paso para la detección de microorganismos,
pues una vez identificados sus características como morfología (cocos, bacilos, etc.) y
agrupación (tétradas, cadenas, etc.), así como su clasificación (Gram positivos, Gram
negativos, etc.), será posible proceder a realizar las pruebas, Cuando se dispone de un
microscopio de luz, se pueden teñir las bacterias para facilitar su visualización. Si se tiñe una
muestra del cultivo extendida y fijada en una lámina portaobjeto con un colorante dado, las
células adquirirán el color del colorante añadido y podrá observarse la forma, tamaño y el
arreglo de las mismas. Este tipo de coloración se conoce con el nombre de coloración simple,
también diferenciar entre algunas estructuras bacterianas especiales, mediante de técnicas de
coloración apropiadas ya sea naturales o sintéticos tinciones compuestos para luego realizar
el procedimiento.
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COLORACIÓN SIMPLE Y COMPUESTA

I. OBJETIVOS

• Comprender cada una de las tinciones tanto simples como diferenciales para
poderlas utilizar correctamente.
• Distinguir cada uno de los colorantes, su naturaleza básica o ácida para saber
cuál tiene más afinidad con el microorganismo.
• Interpretar el fundamento de las coloraciones en las prácticas de microbiología.
• Ejercitar las técnicas de coloración simple y compuesta.

II. FUNDAMENTO TEORICO

2.1.Coloración simple:

La tinción simple es un procedimiento de tinción rápido y sencillo en el cual se emplea

un solo colorante, por eso se denomina simple. Se utiliza principalmente para determinar la
morfología y la organización de las células presentes en una muestra. Los colorantes
empleados en la tinción simple deben ser básicos con carga positiva (catiónicos), para que
puedan unirse espontáneamente a la pared y al citoplasma celular. Estas estructuras celulares
están cargadas negativamente. Por ello, el colorante, cargado positivamente, se ve atraído por
las células y se une a estas de manera espontánea. Así, se colorean rápidamente todas las
células presentes en una muestra.

Existen varios colorantes básicos que se pueden usar en el laboratorio de microbiología,

como el azul de metileno, el violeta de cristal, la verde malaquita y la fucsina básica. Los
tiempos de tinción para la mayoría de estos colorantes son relativamente cortos, generalmente
oscilan entre los 30 segundos hasta los 2 minutos, dependiendo de la afinidad del tinte. Es
importante tener en cuenta que antes de teñir una muestra mediante tinción simple, esta debe
ser extendida y fijada a la lámina de vidrio (portaobjeto).
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2.2.Coloración Compuesta

La coloración compuesta es una técnica de tinción utilizada en microbiología para

identificar bacterias. Esta técnica se realiza en dos etapas: la primera etapa es la tinción
simple, que utiliza un solo colorante para teñir todas las células presentes en la muestra. La
segunda etapa es la tinción diferencial, que utiliza dos o más colorantes para teñir diferentes
tipos de células en la muestra.

La tinción compuesta más comúnmente utilizada es la tinción de Gram, que utiliza

cristal violeta y safranina como colorantes. La tinción de Gram se utiliza para identificar
bacterias grampositivas y gramnegativas. Las bacterias grampositivas se tiñen de morado,
mientras que las bacterias gramnegativas se tiñen de rosa.
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2.2.1. Coloración Gram

La coloración GRAM es un procedimiento de gran utilidad empleado en los laboratorios

donde se manejan pruebas microbiológicas. Es definida como una tinción diferencial, ya que
utilizados colorantes y clasifica a las bacterias en dos grandes grupos: bacterias Gram
negativas y bacterias Gram positivas. Los principios de la coloración de Gram están basados
en las características de la pared celular de las bacterias, la cual le confiere propiedades
determinantes a cada microorganismo. La pared celular de las bacterias Gram negativas está
constituida por una capa fina de peptidoglicano y una membrana celular externa, mientras
que las bacterias Gram positivas poseen una pared celular gruesa constituida por
peptidoglicano, pero no cuentan con membrana celular externa; así pues, la composición
química y el contenido de peptidoglicano en la pared celular de las bacterias Gram negativas
y Gram positivas explica y determina las características tutoriales. La coloración de Gram se
basa en colocar como colorante primario cristal violeta, el cual tiene afinidad con el
peptidoglicano de la pared bacteriana.

Posteriormente, se coloca lugar, el cual sirve como mordiente e impide la salida del
cristal violeta por la formación de un complejo cristal violeta-yodo que satura los espacios del
peptidoglicano de la pared bacteriana. Enseguida, se coloca una mezcla de alcohol-acetona, la
cual deshidrata la pared bacteriana y cierra los poros de la misma, también destruye la
membrana externa de las bacterias Gramnegativos debido a que ésta es soluble a la acción de
solventes orgánicos, como la mezcla de alcohol-acetona.
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2.2.1.1. Bacterias Gram Positiva:

Ejerce una notable influencia en la resistencia frente a varios antibióticos, sobre todo a los
que actúan sobre la pared de peptidoglicanos, que es el punto débil estas bacterias. Hay que
pensar que el antibiótico no induce resistencia, solamente actúa en una interferencia clara de
la humanidad en el proceso de selección natural. Las bacterias Gram positivas son un grupo
de microorganismos que se tiñen de colorpúrpura o violeta en la técnica de coloración de
Gram. A diferencia de las bacterias Gram negativas, las bacterias Gram positivas tienen una
pared celular muy rica en ácido teicoico y en peptidoglicano, y muy espesa. La envoltura
celular de las bacterias Gram positivas comprende la membrana citoplasmática y una pared
celular compuesta por una gruesa capa de peptidoglicano. Las bacterias Gram positivas no
poseen una membrana externa para proteger el citoplasma bacteriano. Las bacterias Gram
positivas son uno de los principales grupos de bacterias.

2.2.1.2.Bacterias Gram Negativa:

Las bacterias Gram negativas tienen paredes celulares con una fina capa de
peptidoglicano y una membrana externa con moléculas de lipopolisacárido (LPS) adheridas,
se decoloran rápidamente con la aplicación del alcohol, admitiendo el colorante de contraste
que proporciona un color entre rosa y rojo que contrasta con el intenso color violeta. Las
bacterias Gram negativas están encerradas en una cápsula protectora, se utiliza un colorante
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de contraste para visualizar los microorganismos Gram- como la fucsina o safranina.

III. MATERIALES

1. Gradilla: Este es un aparato que se ha creado para mantener y ordenar tubos de

ensayo, probetas, y otros objetos similares de forma segura y vertical. Por lo general,
están fabricados con materiales resistentes a la corrosión, como plástico o metal, y
tienen una estructura que se parece a una rejilla o cuadrícula con muchos orificios o
espacios.
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2. Tubo de jeringa: El tubo de la jeringa es la parte donde se coloca el líquido que se va

a introducir o extraer. El tubo está calibrado y va desde 0.5 ml. hasta 60 ml. En el
laboratorio, los tubos de la jeringa se utilizan para extraer, transferir, aspirar o
dispensar pequeñas cantidades de líquidos o gases.

3. Portaobjeto: El portaobjetos es una herramienta esencial en cualquier laboratorio de

investigación, ya que provee una base para la observación y el análisis de muestras.
Se trata de una lámina delgada de vidrio sobre la cual se colocan pequeñas sustancias,
bacterias, tejidos, entre otros elementos, para ser analizados a mayor profundidad
usando un microscopio. El portaobjetos permite un soporte estable, sin movimiento,
que evita el contacto directo con la sustancia o muestra que va a sufrir procesos de
experimentación. Además, permite el montaje de las muestras de manera perfecta,
para que puedan ser enfocadas con el microscopio, tanto así que algunos lo consideran
como la pieza fundamental de este instrumento.
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4. Alcohol: El alcohol se utiliza en la coloración Gram para disolver los lípidos de la

membrana celular externa de las bacterias Gram-negativas, permitiendo que el
complejo cristal violeta yodo se filtre fuera de la capa más delgada de peptidoglicano.
La tinción de Gram es un procedimiento de tinción diferencial que muestra qué
bacterias son Gram-positivas o Gramnegativas en función de su color de tinte. La
mezcla de alcohol-acetona que se agrega, sirve para realizar la decoloración. Las
células Gram-positivas no se decoloran, mientras que las Gram-negativas sí lo hacen.
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5. Mechero de alcohol: El mechero de alcohol es un instrumento que se utiliza en

laboratorios para calentar diferentes sustancias en procedimientos químicos. Es un
instrumento indispensable en cualquier laboratorio, ya que casi todas las reacciones
dependen directamente del calentamiento de estas. El fuego producido por el mechero
de alcohol es de baja intensidad y de tiempo constante, lo que permite la producción
de luz o calor. Además, puede generar energía de manera rápida, pues al encenderse
emite fuego directo.

6. Lugol GRAM: El Lugol es una solución de yodo y yoduro de potasio en agua

destilada que se utiliza en la coloración de Gram para retener el colorante cristal
violeta. También se utiliza como contraste visual en parasitología y como indicador
en la prueba del yodo, que sirve para identificar polisacáridos como los almidones,
glucógeno y ciertas dextrinas.
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7. Cristal violeta: El cristal violeta es un colorante orgánico, sintético y alcalino de

triaminotrifenilmetano. Se encuentra como un polvo con brillo metálico verde oscuro.
Recibe varios nombres, entre los cuales se puede mencionar cloruro de hexametil
pararosanilina o violeta de metilo, violeta de anilina, violeta de genciana, etc.
El cristal violeta se utiliza en la coloración Gram para identificar bacterias. El cristal
violeta se une a las paredes celulares de las bacterias y las tiñe de morado. En el
proceso de coloración Gram, el cristal violeta es el primer colorante que se aplica a la
muestra.

8. Asa de kolle: El asa de Kolle, también conocida como asa bacteriológica, es un

instrumento de laboratorio que se utiliza para transportar, arrastrar y trasvasar
inóculos (pequeño volumen que contiene microorganismos en suspensión) desde la
solución de trabajo, también llamada «solución madre» al medio de cultivo (sólido o
líquido) o de un medio a otro (resiembra). El asa de Kolle consta de una base que
puede estar hecha de platino, acero, aluminio y un filamento que puede ser de
nicromo, wolframio o platino que termina o en un arito de 5 mm o en punta. También
sirve para la realización de frotis, lo que haremos en este experimento.
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9. Safranina: La safranina es un colorante biológico que se utiliza en la coloración de

Gram para proporcionar un color violeta más intenso a las bacterias Gram+ y tiñe de
rosa a las bacterias G-; en histología y citología, se utiliza como colorante de contraste
para teñir diversas estructuras celulares, tanto de organismos eucariotas como
procariotas. La safranina es una sustancia con carga positiva, por lo que tiene afinidad
con estructuras cargadas negativamente. Es importante tener en cuenta que la
safranina es un compuesto tóxico y debe ser manipulado con precaución.

10. Aceite de cedro: El aceite de cedro se utiliza en el laboratorio como medio de

inclusión en microscopía, análisis, investigación y química. La función del aceite de
inmersión es restringir el movimiento de la muestra, además de evitar el rozamiento
entre el cubreobjetos y el objetivo. También se utiliza para aumentar el poder de
resolución de un microscopio. Se coloca una gota de aceite entre el objetivo y el
cubreobjetos, de índice de refracción casi igual al vidrio. Esto permite que la luz pase
sin desviación y llegue al objetivo con mayor intensidad.
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11. Azul de metileno: El azul de metileno es un colorante orgánico con múltiples

funciones. También es conocido como cloruro de metiltionina. Su fórmula molecular
es C16H18ClN3S. Fue sintetizado en el año 1876 para teñir prendas textiles, sin
embargo, no pasó mucho tiempo en que los científicos de la época descubrieran su
gran utilidad en el campo de la medicina, especialmente para teñir preparaciones
microscópicas. Este uso aún se conserva, pues actualmente es utilizado en técnicas de
coloración simple para el diagnóstico de ciertas patologías infecciosas, tales como,
pitiriasis versicolor, eritrasma o meningitis por Haemophilus influenzae. También es
frecuente su uso como colorante de contraste, como por ejemplo en la técnica de
coloración de Ziehl Neelsen, específica para el diagnóstico de microorganismos ácido
alcohol resistente.

12. Materiales para bioseguridad

• Toca
• Mascarilla
• Guardapolvo
• Guantes

IV. PROCEDIMIENTO

4.1.Procedimiento para la coloración compuesta

1. Frotis de la muestra, se flamea o se seca.

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2. Agregamos 2 o 3 gotas de cristal violeta y dejamos por 1 min.

3. Lavar con agua

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4. Echamos 2 a 3 gotas de Lugol y dejamos por 1 minuto.

5. Lavamos.

6. Agregamos alcohol y dejamos por 10 segundos y lavamos.

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7. Agregamos safranina 2 a 3 gotas y dejamos por 1 min. y lavamos.

8. Finalmente pasamos al microscopio y si queremos “aclarar” la muestra le agregamos

aceite de cedro.

4.2.Procedimiento para la coloración simple

1. Frotis de la muestra.
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2. Agregamos 2 gotas de azul de metileno y dejamos por 10 min.

3. Lavamos y flameamos

4. Pasamos al microscopio y agregamos aceite de cedro para aclarar la muestra.

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5. Observamos hongos 20 y 30 micras.

V. CONCLUSIONES

• El azul de metileno es un colorante orgánico utilizado para teñir células o

bacterias al microscopio, para tratar la metahemoglobinemia, desinfectante y
reactivo para análisis químico.
• Al usar el colorante azul de metileno podemos observar las diferentes formas,
tamaños y agrupaciones que presentan los microorganismos.
• Al usar los colorantes cristal violeta y safranina se observa el comportamiento de
la célula bacteriana y se la clasifica como Gram (+) si reacciona con el cristal
violeta y como Gram (-) cuando reacciona con la safranina.
• La diferencia entre Gram (+) y Negativas (-) es que las positivas presentas
lipopolisacáridos en su membrana más externa.

VI. RECOMENDACIONES

• Para tener una mejor visión de los microorganismos en el microscopio primero

localizamos el campo con el objetivo y luego afinamos la imagen.
• Recordar que cuando observamos bacterias utilizamos aceite de inmersión y
cuando observamos levaduras afinamos la imagen a 40x.
• Debemos limpiar el aceite de inmersión que se encuentra en el microscopio al
terminar.
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• Debemos tener cuidado con el tiempo de coloración, ya que si pasa mucho

tiempo el colorante se secará y cristalizará dificultando la observación.

VII. BIBLIOGRAFÍA

https://biositio.com/tinciones-simples/#google_vignette

http://www.fcn.unp.edu.ar/sitio/microgeneral/wp-content/uploads/2017/02/03-
COLORACIONES.pdf

https://www.monografias.com/docs113/tinciones-microbiologia/tinciones-microbiologia

https://www.aeped.es/comite-medicamentos/pediamecum/azul-metileno