Octavo semestre

Diagnóstico
molecular
 Clase 02 - Métodos
moleculares de uso
frecuente en el laboratorio
clínico
El método más utilizado es el PCR. Hoy en día algunos
laboratorios de biología molecular trabajan de forma manual en
donde la técnica depende de la mano del TM. Sin embargo, en
la mayoría de las instituciones la extracción de DNA se realiza
de forma automatizada.

Una ventaja del método automatizado es que disminuye el

margen de error al disminuir la manipulación humana.

Métodos de extracción de ácidos nucleicos

Existen kits de diversos tipos, algunos destinados a extraer

DNA en células bacterianas, vegetales, de virus, otros para
extraer RNA, etc.

El método por
columna cuenta con
diversas etapas. El
primer paso consistía
en lisar la célula, unir
el DNA a la columna
de sílice, lavar y
finalmente soltar el
DNA de la columna,
fase llamada elución.
2
Todo el material y soluciones deben
encontrarse estériles para evitar
contaminar el DNA pues siempre está la
posibilidad de que el medio contenga
nucleasas que degraden este ácido
nucleico. Es muy importante también
utilizar guantes y mascarillas, pues en la
boca abundan estas enzimas.

La extracción consiste en sacar los

componentes desde un compartimiento
celular. Algunos detergentes que se
utilizan en los laboratorios es el tritón X y
SDS pues destruyen la membrana
celular aunque también se utilizan
métodos físicos como la sonicación,
este consiste en disponer las células en
suspeción y gracias a la aplicación de
vibraciones las partículas se agitan y
lisan la célula.

La extracción con compuestos

orgánicos es un método que no se
utiliza frecuentemente.

Clarificación: separación de los ácidos

nucleicos de los restos celulares (debris
lípidos, carbohidratos, de sales y otros adición de agua, las sales se diluyen y
celular) a través de seriadas
compuestos orgánicos. La purificación se logra soltar el DNA de la columna.
centrifugaciones a altas velocidades.
de DNA por columna se logra con
ayuda de las sales cautrópicas, estas le El etanol tiene por función precipitar el
La purificación contempla separar el brindan cargas positivas a la columna DNA ya que lo limpia de las sales como
ácido nucleico de proteínas solubles, de de naturaleza negativa permitiendo la el NaCl.
otros ácidos nucleicos no deseados, de unión del DNA a la columna. Con la

3
El objetivo de una buena extracción es obtener una alta Para estimar la pureza del DNA se considera la absorbancia
cantidad de DNA, de buena calidad, es decir, que esté íntegro a 260 nm y a 280 nm para las proteínas. Una proporción de
y de alta pureza -ausente de contaminaciones-. La evaluación 1,8 a 2 es aceptada como DNA puro, proporciones menores
de la integridad de los ácidos nucleicos se realiza con una a este valor indican la presencia de proteínas.
electroforesis. Un carril que exprese un DNA ‘chorreado’ será
un problema posteriormente en el PCR ya que un DNA En la práctica, lo ideal es realizar todos estos procesos
desintegrado tendrá dificultades en la etapa de aniling pues -cuantificar, chequear la pureza e integridad del DNA-. Sin
cuando los primers se unan a las hebras la enzima polimerasa embargo, por tiempo sólo se mide la concentración de DNA
amplificara secuencias cortas. recolectado.

¿Cuál es la concentración mínima de DNA para realizar una Si deseo diseñar un PCR para virus emergentes debemos
PCR? 200 ng/uL partir buscando la secuenciación del virus en la página de
NCBI. El DNA a escoger para el diseño de partidores debe
Para la cuantificación de los ácidos nucleicos puede ser específico y conservado, esto lo logramos realizando un
realizarse por dos métodos. La cuantificación por técnica BLAST N. La creación de partidores se realiza en páginas
espectrofotométrica es regida por la ley de Beer-Lambert como Primer3Plus. ¿Qué tipo de PCR realizaríamos? Cuando
quien postula que la concentración de una molécula en uno desea detectar un gen no es necesario cuantificar, frente
solución depende de la cantidad de luz absorbida de las a esto, el desarrollo de una qPCR es ventajoso ya que,
moléculas disueltas. El DNA absorbe luz ultravioleta a 260 además de ser rápido es altamente específico.
nm.
¿Cuáles son los reactivos utilizados en una PCR
En el caso de DNA genómico o convencional? DNA problema, primers específicos, DNApol,
de doble cadena, una densidad cofactores (MgCl2), dNTPs, termociclador.
óptica equivale a 50 ug/mL
siempre y cuando el pocillo sea ¿Cuáles son las etapas de la PCR convencional?
de material cuarzo.
Inicio de la desnaturalización Separación de la doble hebra de
DNA a temperaturas de 94°C a 95°C
La cuantificación de ácidos nucleicos con métodos Ciclos de amplificación/aniling (se Temperatura de desnaturalización
fluorimétricos tiene por fundamento la unión de un fluoróforo a realizan entre 30 a 40 ciclos) 94°C
Temperatura de alineamiento entre
un gen conservado del dsDNA. Niveles altos de fluorescencia 40 a 60°C
indican altas cantidades de DNA, y viceversa. Temperatura de extensión a 72°C
pues es la temperatura ideal de la
TAQpol
Amplificación final
Almacenamiento temporal
4
La amplificación por PCR es una técnica que permite obtener En la técnica de qPCR no se realiza electroforesis pues el
un gran número de copias de fragmentos de ADN en muy termociclador se encuentra conectado directamente a un
poco tiempo. Durante la etapa de amplificación se realizan sistema computacional que transmite las curas de
una cantidad específica de ciclos ya que luego de unos amplificación ya que detecta fluorocromos mediante luz laser.
cuantos, los dNTPs se agotan y no se puede continuar la
amplificación.

Para cada 1.000 pb se debe programar 1 minuto.

Una PCR convencional concluye con el desarrollo de una

electroforesis. La concentración de la agarosa depende de la
concentración del DNA a disposición pues DNA altamente
concentrados requieren de que el gel tenga poros grandes,
en bajas concentraciones. Caso contrario ocurre en DNA en
bajas concentraciones utilizan geles de agarosa más
concentrados, entre 3-5%.

Antes de que el DNA sea cargado en el gel de agarosa debe En este gráfico ¿hubo amplificado? Sí. Cuando no lo hay, los
ser combinado con un buffer de carga a fin de brindarle resultados se expresan en una línea recta, paralela al eje x.
densidad y color. El tiempo requerido para que migre el DNA
depende del tamaño de este. Recordemos que el fabricante de los packs recomiendan “si
usted obtuvo amplificado luego del ciclo 30, probablemente el
Es de vital importancia agregar un amplificado sea inespecífico”. Frente a esto, debemos fijarnos
standard de peso molecular. Este nos en la línea de threshold.
permite orientarnos en el experimento,
pues las bandas que se forman son
bandas con pesos moleculares
conocidos. La visualización de los
resultados son posibles gracias a los
agentes intercalantes como el RedGel o bromuro de etidio,
estos se unen al DNA y frente a luz UV brilla.

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 Cuando la señal fluorescente de la qPCR es detectable a ¿De qué depende el tiempo de cada etapa de la PCR?
niveles mínimos se puede identificar la Threshold line (línea de Depende de cuánto se busca amplificar. Se calcula que cada
umbral). En otras palabras, la fluorescencia que se presenta 1.000 pb se programa 1 minuto aproximadamente en el
es aun muy débil como para que posea una significancia termociclador.
diagnóstica.
PCR anidada: posee mayor sensibilidad y especificidad.
Otro aspecto importante en la interpretación de resultados es
la CT que se define como el ciclo en el que se alcanza la línea
de threshold. Corresponde a la primera curva que alcanza un
amplificado lo suficientemente detectable en una menor
cantidad de ciclos puesto que contiene una mayor carga viral.
Ejemplificando esto, en la imagen anterior, la curva que posee
una mayor cantidad de DNA blanco es la curva azul, y de
esta, se extrae la CT.

La técnica de PCR no está exenta de no sufrir errores pues se

pueden dar:

Errores preanalíticos Relacionados con la toma y

almacenamiento de muestra
Errores analíticos Siempre es importante agregar en un
PCR controles positivos, y negativos
como la adición de un DNA sin el gen
blanco.
Es muy frecuente que se den
contaminaciones durante la PCR.
Resultados alterados también son a
causa de primers mal diseñados,
TAQpol degradada, respetar cadena de
frío, olvido de algún reactivo, mala
programación de las etapas de la PCR
-principalmente la etapa más crítica, la
de aniling-
Errores postanalíticos Principalmente generados por una mala
interpretación de e resultados y/o un
mal informe de estos

6
 Clase 03 - Epidemiología
molecular
Se define como la ciencia que se focaliza en la contribución
de los posibles factores de riesgo genético y ambientales
(identificados a nivel bioquímico y molecular) a la etiología,
distribución y prevención de enfermedades dentro de la
familia y entre poblaciones.

Los objetivos de la epidemiología molecular son bastante

amplios e incluyen:

1) Estudios descriptivos y analíticos para evaluar las

interacciones huésped/ambiente en la enfermedad. Un
ejemplo podría ser aguas contaminadas con virus y bacterias,
que pueden infectar al humano.

2) El desarrollo de estrategias para el control de

enfermedades bacterianas, parasitarias y virales mediante el
diagnóstico molecular.

3) La prevención de enfermedades no transmisibles y

trastornos genéticos mediante la evaluación del riesgo y la
identificación de individuos susceptibles mediante pruebas
genéticas. Pensemos en el cáncer, diabetes, enfermedades
que podemos pesquisar con PCR.

La epidemiología molecular evalúa la asociación en la

variación de genes conocidos con riesgos de enfermedades,
utiliza la vigilancia molecular de factores de riesgo de
enfermedades.

7
Esta ciencia mide la distribución geográfica y temporal de Investigación han revelado que la edad de la menarquia,
factores de riesgos. Caracterizando la evolución patógenos y la dieta, los antecedentes reproductivos y los
clasificación de nuevas especies de patógenos. antecedentes familiares positivos de cáncer de mama
se encuentran entre los principales factores de riesgo
Ejemplos de estudios en epidemiología molecular de la enfermedad. La contribución de la epidemiología
molecular al desarrollo de guías prácticas y políticas de salud
1. Cáncer de mama: es una de las principales causas de pública a enfermedades no transmisibles como el cáncer de
morbilidad y mortalidad entre las mujeres en los EE. UU. Las mama.
tasas de incidencia están aumentando en todo el mundo.
2. Seguimiento de la distribución geográfica y temporal de
Los avances en el Proyecto Genoma Humano han llevado a la agentes de enfermedades infecciosas: en América del Sur,
identificación de varios genes de susceptibilidad, incluido el una gran proporción de casos de tuberculosis son causados
BRCA1 en el cromosoma 7q21, que está relacionado con el por una cepa de Mycobacterium tuberculosis perteneciente al
cáncer de mama y ovario de inicio temprano. La actriz clado Latinoamericano-Mediterráneo (LAM).
Angelina Jolie extirpó sus mamas ya que poseía el gen, de
forma preventiva decidió retirarse las mamas. Otro linaje de M. tuberculosis, el clado de Beijing, se
encuentra con mayor frecuencia en países del hemisferio
Desde este descubrimiento inicial, se han identificado más de norte, incluidos Europa occidental y América del Norte, pero
200 mutaciones distintas de BRCA1, ninguna de las cuales es poco común en los países del hemisferio sur, excepto en
parece ser muy común. Sudáfrica.

Solo una proporción relativamente pequeña de cánceres de Nuevamente, se especula que este patrón de distribución es
mama puede explicarse por la presencia de mutaciones el resultado de distintos patrones de migración de la
genéticas en los genes BRCA1 y BRCA2. población humana en el pasado reciente o remoto.

Estos, junto con las mutaciones en genes como ATM, Técnicas más utilizadas en epidemiología molecular
BARD1, PALB2 y CHECK2, explican alrededor del 20 al 25%
del riesgo de cáncer de mama. 1. PCR
2. Hibridación DNA
3. Identificación de plásmidos
4. Análisis de patrones de bandas cromosomales
5. Secuenciación

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 Hibridación de ácidos nucleicos

La hibridación se realiza usando sondas,

estas son secuencias de DNA corta que
viene marcada con un fluoróforo o
radioactividad, aunque lo más recurrente
es el primer caso, esta es
complementaria al sitio a identificar.
Cuando entra en contacto comienza a
emitir una fluorescencia. La creación de
una sonda es igual a como se
desarrollan los primers.

El rigor de la hibridación hace referencia

a ‘¿qué tan complementaria es la sonda
a la secuencia que deseamos detectar?’,
por lo que consiste en ayudar a la sonda
a aumentar su afinidad con el DNA,
fortaleciendo esta unión. Se puede
aumentar la temperatura para forzar la
complementariedad sea máxima,
también podemos aumentar la
concentración de formamida o urea que
rompen los enlaces de hidrógeno y toda
sonda poco específica y parcialmente
unidas al DNA se sueltan de la cadena
dejando únicamente las sondas
fuertemente complementarias.

El sodio, de carga positiva, se une al

DNA, en bajas concentraciones de NaCl
apantalla las repulsiones entre estas
interacciones, fortaleciendo la union de
las sondas altamente complementarias

9
 Tipos de hidridación. de interés gracias a nucleasas y ligasas. Por medio de la
clonación, se integra en bacterias para que a medida que se
Hibridación en fase líquida: es un método costoso. Separado replican el plásmido también lo haga.
ya el DNA se adiciona la sonda marcada, cuando se cumple su
interacción debemos posteriormente detectar y cuantificar todo
aquel DNA que sí pudo ser marcado tras la unión de la sonda
con este, existen dos métodos:

- Cromatografía de adsorción: la muestra se hace pasar por

una columna de gel de hidroxiapatito, una sustancia química
que posee afinidad a DNA de hebra doble. El único DNA de
hebra doble será aquel que logró ser apareado con la sonda.

- Enzimas de restricción: estas nucleasas S1 sólo corta DNA

de hebra simple, degradándolo mientras que el DNA de
doble hebra se mantiene. Se precipita la muestra con etanol,
se centrifuga, y así se obtiene el DNA hibridado.
Se utiliza un papel de nitrocelulosa o de nylon, esta se pone en
contacto con las colonias de forma que entre en contacto con
las colonias bacterianas. Es necesario colocar señas en el
papel para posteriormente identificar a las colonias.

Las bacterias que quedan pegadas en la nitrocelulosa deben

romperse y desnaturalizar el DNA con alcali, posteriormente se
deposita en una bolsa Ziploc la membrana de nitrocelulosa
junto con las sondas a la espera de que se reconozca la
secuencia de DNA a través de la fluorescencia o por
cromatografía si se está utilizando radioactividad en las sondas.

En ocasiones la membrana se lava con un buffer para retirar

impurezas, o bien con leche para bloquear uniones
Hibridación en fase sólida: en un plásmido -obtenido inespecíficas gracias a la ayuda de la albúmina que se adosa al
comercialmente por ejemplo- se coloca una secuencia de DNA papel.

10
Hibridación en fase sólida: Dot-blot y Slot-blot: sobre una Una vez que corre el gel, se saca y se desnaturaliza con alcali
membrana de nitrocelulosa o nylon se aplican las muestras, para separar la hebra doble del DNA. Luego se realiza un
ya sea en gotas (dot-blot) o en una pequeña línea (slot-blot). “sandwich” de transferencia que está formado por la
membrana de nitrocelulosa y el gel con el DNA separado,
para que esto quede bien pegado en la superficie se le aplica
peso, este se deja transfiriendo entre 8 a 12 horas.

Cuando esto esté listo esperamos encontrar el DNA pegado a

la membrana para poder adicionar las sondas, y finalmente se
hace una autorradiografía del filtro para ubicar la marca
radioactiva.

Hibridación en fase sólida: Southerblot: se toman muestras de

DNA de varias muestras para ser cargadas en una
electroforesis, o bien, se puede digerir la muestra de DNA con
enzimas de restricción previo a cargar el gel de agarosa.

La sonda A se va a unir a dos fragmentos ya que la enzima de

restricción justo cortó la secuencia complementaria a la mitad,
cuando se vean los resultados al final, se encontrarán 2
bandas radioactivas, una de 1,3 kb y otra de 4,9 kb. La
sonda B se unirá sólo a un fragmento.

11
El síndrome de Angelman y síndrome de Prader-Willis son enfermedades
neurodegenerativas en humanos, ambas son de baja incidencia. El síndrome de
Angelman causa convulsiones, problemas de lenguaje y retraso mental mientras que
el síndrome de Prader-Willis también genera retraso mental pero va acompañado de
hiperfagia e hipotonía, es decir, los RN son de gran peso y tienen problemas
musculares.

El síndrome de Prader-Willis tiene origen en una mutación en el cromosoma 15

paterno, precisamente en el brazo largo, en las bandas 11-13 (15q11-13). Ahora, si
esta misma mutación se da en el cromosoma materno, se da el síndrome de
Angelman. Sin embargo, estudios proyectan que problemas en la metilación
-epigenética- del DNA también pueden causar estos síndrome, que contraen
problemas en la expresión génica.

Basta que se agreguen grupos metilos a estos genes para que las enzimas de
restricción no las identifique ni corte cuando se hace un Southerblot.

Recordemos que los sitios promotores son ricos en GC y precisamente las

metilaciones del DNA ocurren en estas zonas. Cuando un promotor es metilado, no
se expresa el gen.

Hibridación in situ: el nombre deriva de las sondas que se hibridan dentro de la

célula. Una de las técnicas más populares es hibridación fluorescente in situ (FISH).

¿Cómo se logra que los cromosomas

adquieran distintos colores? Distintas sondas
que tengan distinta fluorescencia, y su
adsorción de la luz a distintas ondas es lo
que les brinda la variedad de colores.

12
¿Qué resultado debiésemos obtener, mediante FISH, para el
diagnóstico del Síndrome de Angelman? Una de las sondas
no logra emitir fluorescencia debido a una mutación o
metilación de las bandas 11-13 del brazo largo del
cromosoma 15 materno (15q11-13). En simples palabras, el
cromosoma 15 emitirá una de fluorescencia como el
cromosoma 18p- de la imagen.

13
 Clase 04
Identificación de plásmidos

Cuando sembramos una bacteria que posee un plásmido de

resistencia antimicrobiana debemos colocarla en un medio que
contenga el antibiótico, de modo que, a medida que la bacteria
se divide los plásmidos que se comparten por conjugación
permitirán la sobrevivencia de aquellas que logran adquirirlo y
expresarlo.

Por ejemplo, una bacteria que posee resistencia a kanamicina

debe seguir el siguiente protocolo:

1. Inocular 3 mL de medio de cultivo selectivo con kanamicina

e incubar 12 horas a la temperatura óptima de la cepa y en
agitación.

2. Transferir 1,5 mL del cultivo a un tubo nuevo estéril y libre

de nucleasas, y centrifugar a 13.000 g por 1 minuto

3. Desechar el sobrenadante y lavar el botón con agua estéril

y libre de nucleasas para retirar totalmente el medio de
cultivo. Será en este botón celular donde se encuentren las
bacterias resistentes al antibiótico, que lograron sobrevivir al
medio. NOTA: el medio de cultivo interfiere con la pureza del
DNA.

4. Resuspender el botón celular en 100 uL de RNAsa y Tris

EDTA. Este último le da pH e isotonía al medio mientras que
la RNAsa va a degradar el RNA y así, aislar el plásmido de
interés.

14
5. Adicionar 450 uL de NaOH para 10. Centrifugar a 14.000
desnaturalizar el DNA separando sus g a 4°C durante 5
hebras, y SDS como detergente, que minutos para ayudar a
rompe las membranas bacterianas y precipitar el DNA y formar
desnaturaliza las proteínas. Agitar por un botón traslúcido al
inversión. fondo del tubo
Eppendorf.
6. Adicionar 225 uL de acetato de sodio
y agitar por inversión. Esta solución va a 11. Retirar el
renaturalizar las cadenas de DNA. Ahora sobrenadante y adicionar
bien, si se tiene acetato de potasio, es 1 mL de etanol al 70%
mejor ya que forma complejos con el para disolver el acetato y
SDS que a su vez interaccionan con las otras sales presentes.
proteínas formando precipitados junto
con el DNA cromosomal. 12. Retirar e
sobrenadante,
7. Dejar incubando 10 minutos sobre resuspender en 50-100 uL
hielo inmediatamente para mejorar la de agua ultra pura libre de
extracción. nucleasas o Tris EDTA.

8. Centrifugar a 14.000 g a 4°C durante 13. Analizar 2 uL de muestra

10 minutos. NOTA: los complejos DNA en un gel de agarosa al 1%.
cromosomal-proteínas precipitan, y el
DNA palasmídico permanece disuelto. El plasmidial superenrollado y
el plásmido circular poseen el
9. Transferir el sobrenadante a un tubo mismo tamaño. Sin embargo,
nuevo de 1,5 mL y adicionar 700 uL de en el gel agarosa el plásmido
etanol -también llamado isopropanol- al superenrollado tiende a
99,9% y dar vortex pues, el DNA es migrar más ya que al estar
insoluble en etanol, haciéndolo precipitar. más compactado posee
ventaja de pasar por los
poros del gel.

15
 La imagen genes que no sólo confieren resistencia a quinolonas, también
corresponde a una a otras familias de antibióticos.
electroforesis de
plásmitos tratados con Dentro de estos plásmidos existen las proteínas Qnr que
enzimas de restricción, confieren baja resistencia al antibiótico. Se han identificado
se logra ver una sola más de 100 variantes que se clasifican en 6 familias qnrA,
banda ya que el qnrB, qnrC, qnrD, qnrS y qnrVC. Estas proteínas confieren
plásmido es circular. resistencia a quinolonas mediante dos mecanismos:
Cuando se agregan
ambas enzimas de Reducen la unión de la girasa y la topoisomerasa IV al DNA, protegiendo a
restricción (Eco RI y las células, ya que se reduce el número de dianas disponibles para el
fármaco
Hind IIII) se corta en
Se unen a la girasa y a la topoisomerasa IV e inhiben la unión de las
dos tramos el DNA quinolonas en los complejos de escisión formados por las enzimas
plasmidial. Ahora, la
explicación de porqué en Eco RI migra un poco más en el gel A su vez, se han hallado 2 mutaciones puntuales específicas
es porque posiblemente se habrá sobrenrollado. en la enzima aminoglucósido acetilcolina transferasas W102R
y D179Y. Estas modificaciones provocan sustituciones en los
Generalmente la resistencia a las quinolonas en bacterias está aminoácidos Trp102Arg y Asp179Tyr resultando en la variante
dada por mutaciones cromosomales, principalmente en los Aac(6’)-Ib-cr. Esta variante es capaz de desactivar el
genes GyrA y GyrB que codifican a la DNA girasa y los genes antibiótico agregándole grupos acetilo, disminuyendo su
ParC y ParE para la topoisomerasa IV. Estas mutaciones afinidad por su sitio blanco, por ello, se habla de una
alteran el sitio blanco ya que el mecanismo de acción de las modificación enzimática de las quinolonas.
quinolonas es interferir en la síntesis del DNA al penetrar la
pared celular a través de porinas, inhibiendo directamente la Ahora bien, los plásmidos también contienen genes
replicación bacteriana al interactuar con estas dos enzimas, codificantes a sistemas de expulsión. El plásmido pHPA
necesarias en el superenrollamiento del DNA. codifica a la proteína QepA que confiere resistencia mediante
la expulsión del citoplasma de quinolonas hidrofílicas mientras
Últimamente se ha descubierto que algunas de estas que el plásmido pOLA52 codifica a OqxA, pertenece¿cliente a
resistencias no son cromosomales sino plasmidiales, que la familia de transportadores RND, y a OqxB que tiene una
poseen varias proteínas. Estos plásmidos contienen diversos amplia capacidad de sustrato.

16
 Análisis de patrones de bandas cromosomales

Para este análisis se emplean enzimas de restricción que

corresponden a endonucleasas, son específicas al reconocer
una secuencia corta de DNA doble hebra. Específicamente
hidrolizan el enlace fosfodiester de cada hebra en secuencias
concretas de DNA llamadas sitios de reconocimiento o
restricción.

En biología molecular se emplean las enzimas de restricción tipo

II:

Cuando se refiere a que el punto de corte se da en sitios

palindrómicos se refiere a: Existe una página (http://nc2.neb.com/NEBcutter2/) que nos
permite saber específicamente el sitio de corte de las enzimas
de restricción, mostrando cuáles generan extremos cohesivos o
romos y cuántos cortes realizan.
17
‣ RFLP (Restriction Fragment Length
Polymosphism: es una técnica de
biología molecular que nos permite
detectar fragmentos de ADN de
diferentes longitudes.

El DNA de un individuo se extrae y se

purifica, luego es amplificado usando
PCR y es tratado con enzimas de
restricción específicas para producir
fragmentos de DNA de diferentes
longitudes. Para identificar un DNA en
particular se hace uso de una sonda
como en la técnica de Southern Blot
aunque no siempre es necesario hacer
Southern Blot, basta con hacer una Para aquellas personas heterocigotas, Sabiendo esto, podemos decir que las
electroforesis para identificar el patrón en la electroforesis demuestrarán dos cepas desde el carril 2 al 6 son clonales
de bandas. bandas ya que poseen ambos alelos. -con una misma secuencia-, así como
Una de las bandas hace referencia al las del carril 7 al 16 y una única cepa en
La técnica RFLP se usa como marcador alelo A que al cortarse genera una el carril 17, única con su patrón.
para pruebas de paternidad como banda de gran tamaño, y el alelo a se
análisis de herencia, para determinar ve de menor tamaño ya que la sonda
alelos heterocigotos u homocigotos. marcada se une a una secuencia de
menor tamaño.
En el caso de la imagen, el alelo
dominante A posee únicamente 2 Estos distintos patrones demostrados
cortes debido a que aquella enzimas e en la electroforesis tras una PCR-RFLP
restrcción que cortaba en el medio no nos indican que las distintas cepas
tiene la capacidad de cortar porque el poseen diferentes secuencias
gen ha sufrido una mutación, haciendo palindrómicas, posiblemente por
dificultosa la identificación de la mutaciones, y con ello, las enzimas de
secuencia. restricción cortan en distintos sitios.

18
Ejercicio: B. Dibujar el patrón esperado para una copia mutante del gen
que ha perdido el primero de los cortes de EcoRI, y otro para
una copia mutante del gen en la que ha aparecido una nueva
Un gen clonado muestra el siguiente mapa de restricción para diana para HindIII en el centro del
las enzimas EcoRI y HindIII: fragmento de 2 kb.

Si la copia mutante del gen pierde

una diana para EcoRI, al cortar
con esta enzima obtendremos
sólo dos fragmentos, siendo uno
de ellos, la suma de los dos (7 kb
A. Dibujar los patrones de los fragmentos de DNA esperados + 1 kb).
con cada enzima al separar los fragmentos mediante
electroforesis en gel de agarosa. Cuando cortamos el gen con
HindIII, al tener una diana más (tres
Para EcoRI el gen puntos de corte) obtendríamos un
tiene dos dianas, por fragmento más. Sin embargo en el
lo que será cortado en gel, no aparecerían 4 bandas una
3 fragmentos de que se han generado dos
tamaños 4 kb, 3 kb y fragmentos de igual tamaño (1 kb).
1 kb. Para HindIII
también se tienen dos
dianas, pero de
diferentes posiciones
por lo que los
fragmentos serán de
tamaños 4,5 kb, 2 kb
y 1,5 kb.

19
‣ Electroforesis de campo
pulsado: las moléculas o
fragmentos de DNA de
longitud superior a
20-40 kb no se pueden
resolver (separar)
empleando la
electroforesis
convencional en gel de
agarosa.

Esto se debe a que el ADN posee un tamaño excesivamente grande para

atravesar los poros del gel y por tanto no se separaran por tamaño. Frente
a ello, empleamos esta electroforesis de campo pulsado.

Esta electroforesis tiene la particularidad de contar con 3 polos negativos

y 3 polos positivos. El frecuente cambio de dirección del campo eléctrico
permite que las moléculas de ADN se desplieguen y avancen a través de
los poros en conformación extendida.

A mayor tamaño se reorientan con mayor dificultad, por lo que avanzan

más despacio.

¿Sería posible diferenciar entre dos bacterias en técnica de campo

pulsado? Deberíamos purificar el genoma de ambas bacterias, amplificar**
y hacer la electroforesis para observar los distintos patrones.

20
 Secuenciación

En la práctica, el TM no secuencia sino que deriva las

muestras a centros que secuencian, el profesional
sólo se encarga de enviar el DNA preparado.

¿Qué precauciones debiésemos tener cuando

deseamos mandar a secuenciar un DNA? Preparar la
muestra con el DNA purificado, primers a una
concentración indicada por el centro y es importante
considerar que, la TAQpol comete errores en 1:1.000
nucleótidos, por lo tanto, debemos adjuntar una
polimerasa que cometa menos errores para que nos
entregue una secuenciación confiable.

Existe una secuenciación química, que hoy en día esta

obsoleta, y un método enzimático -también llamada
secuenciación de Sanger-.

La diferencia de esta electroforesis es que el gel es de

poliacrilamida y altamente concentrada a fin de
generar poros más pequeños. Además, se le adiciona
urea para desnaturalizar la doble hebra de DNA.

Si deseamos ver la secuencia, se debe partir desde

abajo del gel, es decir, desde el polo positivo. Este
método es el manual.

21
 Hoy en día se hace de forma automatizada pero se
conserva el principio. Ahora los didesoxinucleótidos
(ddATP, ddGTP, ddCTP y ddTTP) vienen marcados con
distintos fluorocromos, que son exitados a distintas
longitudes de onda en solo una PCR.

Un sólo secuenciador cuenta con 96 tubos, lo que hace

posible secuenciar muchas muestras a la vez.

‣ MLST (multilocus sequence typing): se hace

principalmente en bacterias. Se tiene el genoma
bacteriano, se amplifica por PCR genes constitutivos
(presentes en todas las bacterias y de función
primordial). Estos genes tienden a ser partícipes de
rutas metabólicas.

Teniéndose amplificados, se envían a secuenciar.

Posteriormente se compara entre las bacterias, es decir,
‘la secuencia que me llego, ¿es exactamente igual entre
las bacterias? ¿O hay variaciones?’. De haber
variaciones, son por mutaciones.

Si hay cambios se se asigna un número de alelo distinto

como se ve en la imagen. De esta forma se genera un
número de 7 cifras que llamamos ‘secuenciotipo’.

Por ejemplo, entre dos bacterias, bacteria A y bacteria B,

y ambas poseen un secuenciotipo de 51 quiere decir que
exactamente esos 7 genes son idénticos -iguales
secuencia-. Si llegasen a tener secuenciotipo distintos es
por variaciones.

22
 Clase 05 - Diagnóstico
molecular de genes de
resistencia
Nuestro interés recae en las enfermedades humanas exógenas
que se adquieren.

En el año 1676 se fabricó el primer microscopio y se describieron

los primeros microorganismos. Alrededor del año 1800 recién se
formuló una posible relación entre estos animáculos y las
enfermedades.

Sanger en el año 1977 logró secuenciar el DNA y cuando Karin

Mullis desarrolló la PCR 3 años después, el avance molecular ha
ido evolucionando de forma exponencial. En muchos hospitales
y clínicas han implementado laboratorios de diagnóstico
molecular, traduciéndose en un mayor dinamismo y crecimiento
23 de esta rama científica.
Sabemos que la biología molecular está liderada por la Existen diversas Southern, Northern y Slot Blot FISH
automatización que nos ayuda a estandarizar procesos y técnicas de Genómica Captura de Híbridos
resultados y lidera la investigación biomédica. Debemos ver la Biología PCR y sus variantes como RT- NASBA
llegada de las máquinas como una revolución en el sistema Molecular para PCR, qPCR, PCR-RFLP, PCR
de salud, más que un enemigo es una herramienta que nos el diagnóstico: Nested, PCR Multiple
ayuda a ser más eficientes. Secuenciación
Aplicación en
¿Qué preguntas nos hacemos en un laboratorio de enfermedades
microbiología cuando recibimos una muestra para analizar? de origen infeccioso:

• Detectar el genoma de los agentes patógenos a través de

secuencias que difieren de las secuencias del Genoma
Humano (epidemiología de brotes de infección y patógenos
emergentes).

• Permite detectar cantidades mínimas del patógeno en

muestras biológicas. Muchas veces por baja carga
patógena o por mal toma de muestra las bacterias mueren
y no logra haber crecimiento en agares, las técnicas
moleculares aún así sí detectan agentes patógenos.

• Diagnóstico de infecciones debidas a microorganismos de

lento crecimiento.

Por ejemplo, un paciente con síntomas de meningitis, realizar • Detección de agentes infecciosos que no pueden ser
estudios microbiológicos no sería la técnica más cultivados como los virus.
recomendable ya que los cultivos tardarán por lo menos 48
horas para tener resultados de identificación y resistencia • Rápida identificación de resistencias a antibióticos.
antimicrobiana. Es aquí cuando consideramos realizar
técnicas moleculares, que nos entregarán un resultado en • Identificación de genes de virulencia o de resistencia a
menos de 4 horas, ayudándonos a optimizar tiempo. drogas. Práctica usualmente realizada en el ISP ya que es
importante hacer una trazabilidad del factor de virulencia de
En la clínica se hace uso de técnicas estandarizadas que STAU con genes mecA para la proteína Phantom Valentine
estén certificadas por la FDA. en los servicios de salud chilenos.
24
• Genotipificación de cepas o subespecies. técnicas microbiológicas. Además nos permite realizar
inmediatamente estudios de resistencia, en este caso,
Cuando uno diagnostica molecularmente es interesante resistencia a rifampicina, antibiótico de uso frecuente para
porque tenemos el diagnóstico hecho, pero también es tratar tuberculosis.
importante la vigilancia, de saber cuáles son los patógenos
que estamos detectando: • Detección de determinantes de resistencia en organismos
en los que se emplean técnicas moleculares para la
Diagnóstico Vigilancia detección bacteriana y no se cuenta con el aislamiento
Precisión (poco tiempo para Se dispone de más tiempo clínico. Las Clamydias, Bordetella de lento crecimiento,
obtener resultados)
Mycoplasma que casi no crecen en medios de cultivo.
Preguntas simples Se pueden obtener más datos
Paciente individual o población Se pueden abordar preguntas más • Estudios epidemiológicos: Detección de elementos
pequeña complejas
genéticos involucrados en acumulación y diseminación de
Se pueden estudiar poblaciones genes de resistencia; y en la diseminación de patógenos
más grandes
resistentes que modulan cambios en la prevalencia,
Precisión emergencia de nuevos mecanismos de resistencia.
Todas estas corresponden a ventajas del diagnóstico
molecular. Es importante saber la epidemiología de un brote en un
servicio en donde varios pacientes se infectan de una bacteria
en especial, por ejemplo, de Klebsiella pneumoniae, ¿serán
¿Cuándo y por qué recurrimos a la detección molecular?
de un mismo linaje? ¿Provienen de un mismo clon?, es decir
que molecularmente son similares.
• Confirmación específica de un mecanismo de resistencia. El
antibiótico Colistín es utilizado en microorganismos que
¿Qué detectamos?
poseen genes mcr con resistencia a carbapenemasas. Esta
resistencia puede ser adquirida por genes cromosomales o
plasmidiales, es importante hacer investigación sobre esto
ya que aquel paciente con genes plasmidiales requiere
aislamiento

• Detección de determinantes de resistencia en organismos

de crecimiento lento. Técnicas rápidas para el diagnóstico
de microorganismos como Mycobacterium tuberculoso,
que nos permiten ahorrarnos 40 días de crecimiento por

25
 ¿Cómo?

• PCR y sus variantes

• Hibridación de ácidos nucleicos que

utilizan sondas únicas (Southern-blot,
Colony-blot, Dot-blot) o sondas
múltiples por MicroArrays.

• Variantes automatizadas que integran la

PCR e hibridación de ácidos nucleicos.

• Secuenciación de genes y genomas.

El FilmArray es una mezcla de 2 rounds

de PCR mas una hibridación con sondas.
La muestra es insertada en una gradilla
que será purificado el material genético.

El primer PCR trae consigo partidores FilmArray es una técnica automatizada de un qPCR que permite detectar hasta 30 patógenos en una sola
generales, no tan esecíficos, y de gran muestra.
tamaño que amplificarán si se encuentra
alguno de los patógenos que se busca. Si
no hay amplificación, pasará al segundo El FilmArray, también llamado como Test
PCR donde no ocurrirá mucho ya que no sindrómico, poseen diversos paneles que
hubo amplificación anteriormente. En la permiten la detección simultánea de
PCR 2 se hace uso de partidores bacterias, virus, levaduras, parásitos y/o
específicos de cada bacteria que genes resistentes a los antimicrobianos.
compone el panel.
Estos paneles integrales para la detección Los genes de resistencia que logra
Los pocillos poseen sondas que de grupos de patógenos asociados a identificar son mecA, KPC, CTX-M y
reconocen a los amplicones, fluorescen y algunos de los desafíos de salud más BLEE.
arroja una alerta de positividad. acuciantes de la actualidad.

26
Dentro de las 13 bacterias que componen el panel El PCR múltiple en tiempo real permite la detección de genes
gastrointestinal se encuentra la especie Campylobacter y las de resistencia sin la identificación de la especie. Es una
diversas cepas patógenas de la Escherichia coli especie de cartucho de tinta que en su interior contiene
enterohemorrágica que son microorganismos difícilmente liofilizado de la mix para PCR, es decir, que contiene dNTPs,
identificables por técnicas microbiológicos. primers, MgCl2, sonda de fluorescencia, etc. Para después
ser llevado a un termociclador.
El hongo incorporado en el panel meníngeo es Cryptococcus
spp. El panel respiratorio inferior está orientado
principalmente a pacientes hospitalizads mientras que el
panel respiratorio es para personas de la comunidad,
pacientes ambulatorios.

Esta técnica permite detectar los genes de

resistencia de IMP, VIM, NDM, KPC y OXA84.

27
 Detección de genes de resistencia a antibióticos Secuenciación de genomas completos (WGS)

Se debe a la difusión de un único clon o de múltiples clones, si

estos llevan un integró con capacidad de incorporar nuevos
genes determinantes de resistencia, o si una especie bacteriana
puede intercambiar con otra especie estos determinantes de
resistencia antimicrobiana.

Permite la detección de:

Esta técnica es utilizada para la identificación d genes de
Staphylococcus aureus resistente a meticilina (MRSA)
resistencia antimicrobiana que explican el fenotipo, así como
Enterococcus resistente a vancomicina (VRE) elementos móviles (transposones, plásmidos, etc) responsables
Resistencia de Mycobacterium tuberculosis a rifampicina e isoniazida. de la difusión horizontal de resistencia y virulencia.

28
Nos permite identificar inserciones/deleciones relacionados a • Mutaciones pueden afectar la unión de un primer y dar
la resistencia o sensibilidad reducida a antimicrobianos y a resultados falsos negativos, o bien, darse resultados
virulencia. Además de comparar combinaciones de genes y positivos cuando un gen es funcional o silencioso. El gen
estructuras con otros descritos en el mundo. ampC, que podía ser hiperproductor, inducible o
constitutivo. Este último puede estar en la bacteria,
El WGS ha mejorado el conocimiento de la evolución y significando que posee el gen de resistencia pero tiene la
distribución del resistoma bacteriano. particularidad de comportarse de manera sensible. Por
técnicas microbiológicas, el hallazgo de este fenotipo se
Ventajas del diagnóstico molecular informa de manera sensible, sin embargo molecularmente,
los equipos sólo al encontrar el gen lo informan como
• Resultados directamente de la muestra clínica, siendo presente, y por lo tanto, resistente.
desde un cultivo positivo de sangre o hisopado rectal, etc.
• Los paneles comerciales de genes no necesariamente
• Rápida y fácil interpretación de resultados: presencia o reflejan la epidemiología local. Estos paneles son fabricados
ausencia del gen. en países europeos, por lo tanto, no reflejan la
epidemiología necesariamente local chilena. Traen en el
sistema los patógenos más importantes y prevalentes de su
• Detección de mecanismos de resistencia con bajo nivel de
país de origen.
resistencia, difíciles de detectar por técnicas de sensibilidad
convencionales.
• La resistencia a un antibiótico puede ser multifactorial.
• El genotipo puede ser evaluado mucho antes que el
fenotipo. • No son de utilidad ante un mecanismo de resistencia no
definido.
Desventajas del diagnóstico molecular
• No existen normas internacionales
• La contaminación de la muestra puede afectar a la
especificidad de la prueba. Pensemos que si la muestra fue • De alto costo.
mal tomada es difícil tener resultados fidedignos.

29
 Clase 06 - Diagnóstico
molecular de infecciones
virales
¿Cuándo elegimos un diagnóstico molecular? Frente a la
necesidad de una identificación rápida o cuando necesitamos
identificar microorganismos fastidiosos, o aquellos agentes que no
son cultivables. Muchas veces debemos reconocer genes de
resistencia.

Ahora bien, optamos por técnicas moleculares cuando nos

enfrentamos a enfermedades producidas por agentes virales ya
que no son cultivables. Lo que se puede hacer es tener un virus e
infectar cultivos celulares para propagar y estudiarlos, pero es una
técnica que toma tiempo
y es desventajoso cuando Resultados más rápidos
debemos dar un Técnicas estandarizadas,
diagnóstico. automatizadas
Microorganismos de difícil crecimiento
Ventajas del diagnóstico Mayor sensibilidad y especificidad
molecular Investogación

Técnicas diagnósticas para detectar virus

• Cultivo viral: técnica introducida en 1940, es considerada una

de las gold standard en el diagnóstico de infecciones virales.

En un pocillo se siembra un cultivo celular para ser infectado con

un virus. Debemos saber de antemano a qué tipo de células
infecta un virus determinado, usualmente se utilizan líneas
celulares cancerígenas como MDCK que es una célula de riñón de
perros, A549 es de adenso carcinoma de alveolos,
30
LL MK2 obtenida de monos, MRC5 es una línea de
fibroblastos de pulmón de humanos, o bien, hacer uso de
huevos embrionados.

Además de chequear el desarrollo de los virus, también se

evalúa el daño celular que produce siendo deformación de la
célula o provocando lisis. Estos efectos citopáticos suelen
revisarse tras 7 a 10 días.

La confirmación final se realiza con microscopía de

inmunofluorescencia. Los receptores de los virus son
reconocidos por anticuerpos específicos conjugados con una
enzima y fluoróforo para confirmar la presencia del virus en el
cultivo. A diferencia del
ELISA, la
• Ensayos de Serología: es posible detectar anticuerpos se inmunofluorescencia
emplea la técnica de ELISA indirecto, o bien detectar en vez de utilizar
directamente los antígenos virales con un ELISA directo. enzimas, hace uso
de fluoróforos, pero
ambas técnicas
comparten el mismo
principio.

Otro test de
serología es la
inmunocromatografía
lateral, también
conocidos como test
rápidos. Hoy en día
Dentro de las enzimas reveladoras que van a cambiar el color
son bastante
del medio por reaccionar con el sustrato encontramos las
utilizados.
fosfatasas alcalinas, peroxidasas, entre otras.

31
• NATs (tests basados en ácidos
nucleicos): uno de los tests más
importantes es el (RT)qPCR o el PCR
convencional. Si el genoma del virus a
investigar aun no se encuentra secuenciado
no será posible hacer los partidores, y en
consecuencia no podremos hacer NATs.

En base a la tabla 2, los BHQ-1, BBQ y TAMRA

corresponden a los quencher de las sondas
Taqman para inhibir la producción de e la
fluorescencia en base a la longitud de onda que
actúan. Aquellos FAM y HEX son los fluoróforos
que emitirán luz a distintas fluorescencias.

Hoy en día existen nuevas técnicas más

automatizadas como el Cobas Liat PCR que lo
vende la empresa Roche Diagnostics. Es una
técnica de point of care, que quiere decir que
se realiza al lado del paciente, con un análisis
rápido de 20 minutos aproximadamente y que
no requiere de un operador experto ni
extracción del DNA, por lo tanto, podemos
decir que es una técnica fácil de usar y es
segura para el operador.

En el interior de la máquina se realiza una qPCR con

sondas Taqman.

32
Otra técnica NATs es LAMP (amplificación isotermal mediada
por bucles). Es una técnica que amplifica el DNA a
temperatura constante entre 60°C y 65°C, es decir, no
necesita cambios de temperatura como en la PCR.

No necesita de un termociclador y se utilizan 4 partidores

esenciales aunque se recomiendan hasta 6 para amplificar 6
regiones del gen. Aquellos 2 primers son loop primers para
facilitar facilitar la amplificación. Precisamente en este
aspecto, el diseño de los partidores es más complejo y se
hace uso de una página especial, incluso estos pueden llegar
a tener un largo de 70 a 80 nucleótidos. Además, no se utiliza
la TAQpol sino que se utiliza una DNA polimerasa de alta
procesividad obtenida de Bacillus stearothermophilus llamada
BST.

El producto de amplificación se puede detectar por fotometría

a simple vista, evaluando la turbidez del pirofosfato de NASBA
magnesio. Tras agregar todos los reactivos, se vana generar
copias del DNA que van a generar turbidez, o bien, se puede
utilizar fluorescencia en la medición con sondas SYBR green
que se unirán a DNA de hebra doble.

33
Otra técnica conocida son los Microarray que se utiliza sobre En el chip, cada pocillo estará recubiertos con varias sondas
todo para ver la expresión de genes aunque también puede idénticas que son oligonucleótidos que cubren la secuencia
ser usado en la detección de estos. Son una especie de de un gen específico. Se pueden dar los siguientes
vidrios pequeños o chip donde se les coloca la muestra de escenarios:
DNA ordenadas en cada pocillo, pudiendo detectarse miles
de secuencias de DNA o RNA.

Entonces se coloca la muestra en un pocillo para después

agregarle una sonda con una secuencia conocida. El DNA
será marcado con un fluoróforo para que, en el caso de hallar
complementariedad la sonda va a fluorecer y el pocillo se
iluminará de un color distinto significando que se detectó el
DNA viral.

Para ejemplificar esta técnica,

disponemos de dos muestras, la
sonda verde será indicativa de la
célula normal y la sonda roja
refleja el DNA de la célula
tumoral.

34
¿Cómo podríamos utilizar esta técnica de Microarray en la Además, muchas muestras que poseen inhibidores de PCR
detección del DNA de un virus? Debemos utilizar sondas pueden ser analizadas por esta técnica.
específicas a una secuencia particular del virus para que, al
colocar la muestra sobre uno de estos pocillos, debiese
generarse la complementariedad y fluorescencia.

Ahora último salió al mercado una nueva técnica, también de

la categoría de NATs llamada ddPCR -droplet digital PCR-. La
mezcla del reactivo de PCR se divide en 20.000 gotitas
distintas de 1 nL para después pasar por un equipo que mide
la fluorescencia.

Tal como la qPCR, ddPCR usa una preparación sencilla de la

muestra que utiliza Taqman primers y sondas, y un supermix
optimizado. El qPCR provee una cuantificación relativa
mientras que el ddPCR nos permite hacer una cuantificación
absoluta del DNA objeto.
• FilmArray: es otra técnica que suele ocuparse en la
Para generar los resultados digitales, las muestras son detección de virus.
amplificadas en los puntos finales en un termociclador. Las
gotas que contienen la secuencia de DNA objetivo se leen
• CRISPR-CAS: es un mecanismo que fue detectado en
como positivas y
bacterias, se hace la asociación de que es como el sistema
las que no, se leen
inmune bacteriano. CRISPR utiliza unas guías y una
como negativas. La
nucleasa (Cas9) para dirigirse a zonas elegidas del ADN,
fracción de gotitas
inactivar y cortar la secuencia. A partir de estos trozos de
positivas determina
DNA se procesan y colocados como muestra en la región
la concentración de
-llamada región CRISP-. Por lo tanto, poseen secuencias
la secuencia de
de DNA repetidas y entre medio hay DNA viral proveniente
DNA objeto en la
de virus que han infectado a la bacteria con anterioridad.
muestra.
Cuando la bacteria quiere saber que el DNA inyectado lo
Esta técnica más sensible que un qPCR puede emplearse
recibió con anterioridad, va a transcribir la región, otra
cuando sospechamos de baja carga viral en los pacientes.
proteína CRISPR-CAS9 lo procesa y si este trozo de RNA es

35
complementario al DNA quiere decir la
bacteria había sido infectada por ese
fago.

¿Cómo funciona? El RNA guía

reconocerá el RNA viral, se activa la
nucleasa CAS para comenzar a cortar
cualquier RNA que encuentre cerca de
ella. Entre las cosas que puede cortar
esta enzima son las mismas sondas
con el quencher que, al separarse
comienzan a emitir la fluorescencia.
Esto se puede medir en 20 a 30
minutos aproximadamente.

Con este sistema podríamos procesar

y editar cualquier DNA.

• Secuenciación: recordemos la secuenciación. Este complejo será Una vez contando con una cantidad
secuenciación de Sanger que utiliza colocado en una celda que posee considerable de DNA se procede a
didesoxidinucleótidos aunque secuencias de DNA complementarias secuenciar con fluoróforos.
también encontramos otra técnica a los adaptadores.
de secuenciación llamada Next
Generation Sequences (NGS), en Luego comienza a generarse los
español, secuenciación profunda/ puentes de DNA en donde el material
masiva. se dobla y el otro adaptador se hace
complementario. Se amplifica y se
Se toma el material genético del virus repite el procedimiento para recopilar
para fragmentarse con enzimas de varias copias.
restricción, se continúa con la unión de
unos adaptadores que son secuencias
cortas de material genéticos que van a
permitir la hibridación y posterior

36
37
 Clase 07 - Diagnóstico
molecular de
enfermedades metabólicas
Una enfermedad metabólica es una patología que se desarrolla
debido a un trastorno de origen genético (puede ser hereditario
o no) en el que un error en la secuencia de genes provoca
problemas en la síntesis de una enzima determinada.

Las enfermedades metabólicas o errores congénitos del

metabolismo (ECM) son un grupo numeroso de enfermedades
hereditarias, cada una producida por el bloqueo de alguna vía
metabólica en el organismo.

El efecto de estas alteraciones varía según la vía afectada y la

severidad del bloqueo. Tanto los efectos tóxicos de las sustancias
acumuladas, como la deficiencia de los productos son las
principales responsables de las manifestaciones clínicas.

La mayoría de ellas se hereda de forma autosómica recesiva

(ambos padres portadores sin síntomas), algunas de forma
recesiva ligada al cromosoma X, es decir, cuando la madre es
portadora de la enfermedad, y otras con herencia especial
llamada materna
(mitocondrial).

La frecuencia del
conjunto de defectos
se estima entre 1 entre
1.000 a 3.000 recién
nacidos vivos.

38
 ¿Cómo se manifiestan? lugar fundamentalmente en la capa íntima arterial donde
se desarrolla la placa de ateroma.
Se presentan en cualquier etapa de la vida pero más
frecuentemente en la infancia. En algunos casos los niños son Los agresores pueden ser uno o varios factores en un mismo
sanos al nacer y posteriormente tienen algunas individuo: tabaco, hipertensión arterial, diabetesDiabetes
manifestaciones como falta de apetito, vómitos, mellitus, hiperhomocisteinemia, lipoproteínas, ácidos grasos
deshidratación, compromiso de conciencia, hipotonía o libres o ciertas infecciones recurrentes como por Helicobacter
hipertonía, convulsiones, entre otros, de forma aguda o pylori, Chlamydia pneumoniae.
crónica.
3. Enfermedad de
Algunos ni{os después de tener un desarrollo normal, Tay-Sachs: es una
presentan un brusco deterioro con pérdida de todas sus enfermedad rara
habilidades. Un grupo de defectos se caracteriza por un genética que afecta al
curso crónico progresivo con retardo del crecimiento, cerebro y al sistema
aumento del hígado y bazo, alteraciones esqueléticas, nervioso central y es
cambios en la fisonomía y el pelo con o sin retardo mental. de carácter hereditario
autosómica recesivo.
Aunque a veces los síntomas no se inician hasta la vida
adulta, en estos casos son más frecuente las manifestaciones Es provocada por la
psiquiátricas, renales, cardiacas y neurológicas. ausencia de una
enzima que ayuda a
¿Cuáles son los trastornos del metabolismo más comunes? descomponer las sustancias grasas. Estas sustancias grasas,
denominadas gangliósidos, se acumulan en niveles tóxicos en
1. Obesidad el cerebro y la médula espinal, y afectan la función de las
células nerviosas.
2. Ateroesclerosis: es un
proceso inflamatorio 4. Diabetes 5. Hipercolesterolemia
crónico en la pared de
6. Hiperlipidemia 7. Fenilcetonuria
las grandes arterias que
ocurre en respuesta a 8. Intolerancia a la lactosa 9. Porfiria
una agresión sobre el 10. Enfermedad de Wilson
endotelio. El desarrollo
de este proceso tiene

39
 Genética de las enfermedades fundamental del surgimiento de un
metabólicas problema de salud pública.

Son de herencia monogenética Enfermedades metabólicas

(obesidad monogénica y diabetes tipo hereditarias (EMH)
MODY). El riesgo a padecer una EMet
multifactorial es mayor en personas Las enfermedades metabólicas
> 45 años con antecedentes en hereditarias son enfermedades
familiares de primer grado. mendelianas que agrupan a un
colectivo de más de 600 patologías
En aquellas poblaciones diferentes clasificadas en función de la Abordaje del diagnóstico de las EMH
genéticamente heterogéneas como la vía metabólica alterada y su
mexicana, donde la gran mayoría de la patogénesis. La mayor parte cumplen La mayoría de las EMH se
población es mestiza (genes el criterio de enfermedad rara según la diagnostican posnatal ente tras el
amerindios en un 56%, caucásicos definición de la Unión Europea: reconocimiento por parte del clínico de
41% y africanos 3%) el entendimiento enfermedades raras, minoritarias, una serie de síntomas específicos y
de las EMet es aún más complejo. huérfanas o enfermedades poco sugestivos de enfermedad metabólica.
frecuentes, incluidas las de origen Suele comprometer a más de un
Diversos estudios han mostrado que la genético, son aquellas enfermedades sistema simultáneamente siendo el
población es de origen africano y con peligro de muerte o de invalidez SNC el más comúnmente afectado.
amerindio tienen las prevalencias más crónica que tienen una prevalencia
elevadas de EMet como la diabetes. menor de 5 casos por cada 10.000 El diagnóstico exacto de e la proteína/
habitantes. gen afectado permite el acceso a
Esta aseveración se apoya en la opciones preventivas para la familia
hipótesis de un enriquecimiento de La mayoría se heredan de forma que deben darse a conocer a través
alelos “ahorradores de energía” en autosómica recesiva, alrededor del del asesoramiento genético.
poblaciones que han padecido 20% tienen herencia autosómica
hambre y otras penurias. Así, es dominantes, el 10% una herencia
probable que los descendientes de ligada al cromosoma X y una parte La muestra es necesaria según la sospecha
poblaciones como la amerindia sean importante de las denominadas diagnóstica: aangre entera con
más eficientes en el uso y enfermedades mitocondriales tienen anticoagulante, plasma o suero, orina de
almacenamiento de nutrientes pero en una herencia materna ya que afectan una micción o de 24 horas y LCR
un ambiente de exceso calórico como al DNA mitocondrial.
el actual, esta característica puede ser
40
41
42
 Herencia medeliana en el hombre Es una técnica muy reproducible y sensible, Todas las
aminoacidopatías pueden diagnosticarse midiendo
El código MIM es el código de cada enfermedad, aparece en aminoácidos en fluidos biológicos.
primer lugar un símbolo que indica el tipo de entrada:
La cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) es un
método muy versátil, también basado en la separación de
metabolitos según sus propiedades fisicoquímicas. Se hace
pasar las moléculas a través de una columna cromatográfica,
el metabólico se identifica según su tiempo de retención y se
Cada enfermedad y gen tiene asignado un código de seis detecta y cuantifica con distintos detectores. La detección
dígitos en el que el primer número clasifica el método de electroquímica se utiliza en el análisis de neurotransmisores en
herencia. LCR.

Para el análisis de moléculas más grandes como péptidos,

proteínas o glicoproteínas se han desarrollado otras técnicas
como, por ejemplo, la que utiliza el sistema de ionización por
desorción mediante láser asistida por matriz (MALDI) junto
con el analizador de tiempo de vuelo (TOF/MS), en el
diagnóstico de hemoglobinopatías, defectos congénitos de
glicosilación y diferentes enfermedades de depósito lisosomal.

Para la detección de estas enfermedades se utilizan diversas La técnica MALDI-

técnicas analíticas, fundamentalmente cromatografía y TOF es utilizado
espectrometría de masas, cada una de ellas es específica también para la
para un tipo de metabolitos. identificación de
microorganismos.
La cromatografía de intercambio iónico (CIO) es el
método de elección para la separación y cuantificación de
aminoácidos. Está basado en la separación de los
aminoácidos en función de su carga eléctrica en una columna
de intercambio catiónico, elución de los mismos secuencial
ente utilizando tampones de litio a diferentes pH y detección
por colorimetría tiñendo con ninhidrina.

43
 Estudio genético de las EMH en la fase de lectura (frameshift) dando lugar a un codón de
parada prematuro.
La confirmación genética de las EMH se lleva a cabo en los
laboratorios especializados de genética molecular mediante el
análisis de mutaciones del gen correspondiente. El defecto
primario en una EMH es una alteración en la secuencia
nucleotídica del DNA que determina la secuencia de
aminoácidos de una proteína.

Básicamente, el diagnóstico consiste en buscar mutaciones

potencialmente patogénicas del gen afectado en material
genético, ya sea DNA o RNA, del paciente.La muestra a
analizar puede ser sangre con anticoagulante EDTA, sangre
seca impregnada en papel de filtro, tejidos como biopsia de
hígado o muscular, fibroblastos de piel cultivados, biopsia
corial o amniocitos para los estudios prenatales. Etc.
Las mutaciones que afectan al procesamiento del RNAm se
Las mutaciones pueden afectar a secuencias reguladoras denominan mutaciones de splicing, y son causadas por
alterando su expresión, secuencias exóticas, alterando la mutaciones puntuales, deleciones o inserciones bien en la
secuencia de aminoácidos de la proteína que codifica, o a secuencia conservada donadora y aceptora de splicing,
regiones intrónincas, que en general afectan al procesamiento localizadas en la unión exón-intrón o bien en secuencias
(splicing) del RNAm. exótica so intrón I as menos conservadas que stán implicadas
en la regulación del proceso de splicing.
En la secuencia nucleotídica puede haber mutaciones
puntuales que afectan a un sólo nucleótido, deleciones o El efecto es la generación de transcritos aberrantes
inserciones que afectan a uno o unos pocos nucleótidos y portadores de deleciones de secuencias exóticas completas
grandes reordenamientos genómicos. o parciales o inserciones de secuencias intrónicas
(pseudogen), transcritos que si son traducidos, dan lugar, en
En el caso de pequeñas deleciones o inserciones de general a proteínas truncadas debido a cambios en la fase de
nucleótidos, estas pueden ser en fase de lectura si la deleción lectura.
es de 3 o múltiplo de 3 nucleótidos, eliminándose o
insertándose aminoácidos o bien puede producir un cambio

44
El conocimiento de las
mutaciones en los afectos de
una determinada EMH es de
gran utilidad para la búsqueda
de una posible correlación
genotipo/fenotipo clínico y
bioquímico, para establecer la
coondición de portador de la
enfermedad de otros miembros
de la familia, para ofrecer un
diagnóstico prenatal rápido y
fiable y consejo genético; por
último, en términos
epidemiológicos, para obtener
información sobre la frecuencia
de alelos mutados y su
distribución geográfica y
poblacional.

Además, en los últimos años el

conocimiento de la naturaleza
de la mutación y su efecto está
permitiendo el desarrollo de
tratamientos personalizados
basados en el genotipo del
paciente.

Técnicas convencionales de diagnóstico genético

Para el análisis de mutaciones de un gen, a partir del DNA se
amplifican por PCR por separado los exones del gen
El desarrollo de la técnica de la PCR en 1986 por Kary Mullís
seleccionado junto con sus secuencias intrónicas flanquean
supuso un hito en el diagnóstico de enfermedades genéticas,
tés, que incluyen las secuencias aceptoras y donadoras de
ya que mediante esta técnica se amplifica hasta 109 veces
splicing o se amplifica el DNA complementario (DNAc),
una región de copia única del genoma partiendo de DNA
obtenido por retrotranscripción con la enzima transcriptasa en
genómico, obteniéndose así grandes cantidades de la
reverso utilizando como sustrato el RNAm.
secuencia a analizar.
45
Existen otras técnicas para el análisis de reordenamientos Por último, existen otras técnicas de rastreo de mutaciones,
genómicos que detectan grandes deleciones, inserciones, hoy ya prácticamente en desuso. LAs técnicas basadas en el
duplicaciones y disomías uniparentales. instinto comportamiento electroforéticos de fragmentos de
DNA según su secuencia en geles desnaturaliza tés o
La técnica de amplificación de sondas dependiente de electroforesis en gel con gradiente desnaturalizante.
ligándoselas múltiples es basa en la hibridación con
sondas específicas para los exones del gen que se va a Otro método de rastreo más actual es el high resolution
analizar, regiones que posteriormente se ligan, amplifican, se melting, basado en las diferentes temperaturas de melting
separan por electroforesis capilar y detectar por fluorescencia. (temperatura a la cual se separan las dos cadenas de DNA),
de un fragmento de DNA que contiene una mutación on
Las técnicas basadas en Arrays son muy versátiles y permiten respecto al fragmento control.
el análisis de todo el genoma y en varias muestras a la vez. En
el caso aso del Array de hibridación genómica Con cualquiera de estas técnicas, se requiere posteriormente
comparada (Array-CGH) se identifican pérdidas o ganancia la secuenciación estándar Sanger del fragmento seleccionado
de material genético en la muestra de DNA del paciente para precisar la mutación específica,
cuando se compara con una muestra de DNA referencia.
Básicamente, se marcan con diferentes fluoróforos el genoma Para un correcto asesoramiento genético en todos los casos
del paciente y del control. Se hibrida con el array de olivos se es imprescindible el análisis de la segregación mendeliana en
las regiones seleccionadas y se compara la fluorescencia muestras de los padres, para confirmar la presencia delas
unida a la región seleccionada lo que permite detectar mutaciones en alelos diferentes en el caso de enfermedades
deleciones (pérdida) o duplicaciones (ganancia). de herencia autosómica recesiva, para detectar posibles
deleciones o disomías uniparentales en los casos en los que
Se utilizan en estudios de: se haya detectado la mutación n homocigosis y para poder
identificar mutaciones de novo en enfermedades autosómica
Ligamiento, mayeó de homozigosidad y detección de disomías dominantes o ligadas al cromosoma X.
uniparentales
Alteración genética producida cuando se heredan dos cromosomas
o segmentos de un cromosoma del mismo progenitor, lo que da
lugar a que aparezca una mutación recesiva en homozigosis cuando
uno de los progenitores no es portador de la misma.

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 Clase 08 - Bases
moleculares del cáncer
El cáncer puede considerarse como una enfermedad genética.
Se produce en organismos superiores en la mayoría de los
tejidos y en todo tipo de células somáticas.

El cáncer engloba un conjunto de enfermedades que tienen en

común un crecimiento celular desordenado (tumor) y una
colonización tisular (metástasis), todo ello determinado por una
mutación inicial seguida de la acumulación de otras mutaciones
sucesivas.

El cáncer está regulado por cambios epigenéticos ***

¿Cuál es el mecanismo de trasnformación de una célula normal

en tumoral?

Las células en situación normal mantiene un equilibrio entre la

proliferación, reposo y muerte celular.

Oncosupresor: evita que la célula prolifere.

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 Etapas características en el desarrollo del
Cáncer

Displasia: cambios en la morfología celular.

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