Unidad 2 – Ácidos nucleicos y enzimas asociadas

2.1. Los ácidos nucleicos (gran importancia biológica)

Los ácidos nucleicos son macromoléculas poliméricas encargadas de almacenar, transmitir y expresar
la información genética de los seres vivos.
Se encuentran en todos los seres vivos bajo dos formas:
• El ácido desoxirribonucleico (ADN), que almacena la información hereditaria y controla su
transmisión a la descendencia.
• El ácido ribonucleico (ARN), que se encarga de la expresión de esta información mediante la
síntesis de proteínas.
2.1.1. Estructura y composición química
El ADN y el ARN se diferencian en su estructura y composición química, pero ambos están formados por
largas cadenas de monómeros denominadas nucleótidos.
Los nucleótidos son las unidades estructurales que se repiten en los ácidos nucleicos y que van a
intervenir en el mecanismo molecular que hace posible la transmisión de la información genética.
Componentes de los nucleótidos
Los nucleótidos son unidades monoméricas constituidas por una base nitrogenada y
una molécula de ácido fosfórico, ambas unidas a una pentosa.
• Base nitrogenada → Son compuestos heterocíclicos planos de carbono y
nitrógeno con diferentes radicales. Pueden ser de dos tipos:
o Bases púricas → Derivan de la purina y son la adenina (A) y guanina
(G).
o Bases pirimidínicas → Derivan de la pirimidina y son la citosina (C),
timina (T).
La adenina, la guanina y la citosina están presentes tanto en el ADN como en el ARN.
La timina solo se encuentra en el ADN y el uracilo solo se encuentra en el ARN.
• Pentosa → Es un glúcido de cinco átomos de carbono que forma parte de la
estructura de un nucleótido. Puede ser de dos tipos:
o D-ribosa, en los nucleótidos que componen el ARN
o 2-desoxi-d-ribosa, en los nucleótidos que componen el ADN.
• Ácido fosfórico → El ácido fosfórico se encuentra en forma de anión fosfato o grupo fosfato.
Tiene carga negativa y es el responsable de que los ácidos nucleicos también tengan carga neta
negativa. Tiene una estructura tetraédrica, con el átomo de fósforo en posición central y los cuatro
átomos de oxígeno ocupando los vértices del tetraedro.
Nucleósidos
Un nucleósido está constituido por la unión de una base nitrogenada con una pentosa.
La combinación de una base nitrogenada con D-ribosa dará lugar a ribonucleósidos y con 2-desoxi-D-
ribosa dará lugar a desoxirribonucleósidos. La unión entre ambos se realiza mediante un enlace N-
glucosídico
Nucleótidos, oligonucleótidos y polinucleótidos
Un nucleótido se forma por la unión de un nucleósido con una molécula de ácido fosfórico en forma de
anión fosfato mediante un enlace éster.
El enlace se origina entre el carbono C5' de la pentosa y el ácido fosfórico, con pérdida de una molécula
de agua.
• Los nucleótidos que contienen 2-desoxi-D-ribosa se denominan desoxirribonucleótidos y son los
integrantes del ADN.
• Los nucleótidos que contienen D-ribosa se denominan ribonucleótidos y son los integrantes del
ARN.
Los nucleótidos se unen entre sí por el grupo fosfato mediante un enlace fosfodiéster entre el carbono
C5’ de un nucleótido y el carbono C3’ del siguiente nucleótido, dando lugar a cadenas lineales
polinucleotídicas que constituyen los polinucleótidos o ácidos nucleicos. Cuando el número de nucleótidos
que integran la cadena no es muy grande, se habla de oligonucleótidos.
Toda cadena de nucleótidos tiene dos extremos libres:
• Extremo 5', con un grupo fosfato unido al C5’ de la pentosa del primer nucleótido.
• Extremo 3', con un radical hidroxilo (-OH) unido al C3’ de la pentosa del último nucleótido.
Nomenclatura de los componentes químicos de los ácidos nucleicos
Los nucleósidos se nombran añadiendo la base nitrogenada:
• La terminación -osina en el caso de las bases púricas.
• La terminación -idina en el caso de las bases pirimidínicas.
• Si la pentosa es la desoxirribosa, se añade el prefijo desoxi- al nombre.
Los nucleótidos se nombran eliminando la “a” final del nombre del nucleósido del que proceden y
añadiendo la terminación - 5’-fosfato.
Pentosa Base nitrogenada Nucleósido Nucleótido Ácido nucleico

Adenina Adenosina Adenosín – 5’ – fosfato

Guanina Guanosina Guanosín – 5’ – fosfato

Ribosa Citosina Citidina Citidín – 5’ – fosfato ARN

Uracilo Uridina Uridín – 5’ fosfato

Adenina Desoxiadenosina Desoxiadenosín – 5’ – fosfato

Guanina Desoxiguanosina Desoxiguanosín – 5’ – fosfato

Desoxirribosa Citosina Desoxicitidina Desoxicitidín – 5’ – fosfato ADN

Timina Desoxitimidina Desoxitimidín – 5’ – fosfato

2.1.2. Propiedades fisicoquímicas

Las moléculas de ácidos nucleicos, constituidas por largas cadenas de nucleótidos, se caracterizan por
las siguientes propiedades físico-químicas:
• Son fuertemente ácidas en solución acuosa debido a los grupos fosfato.
• Presentan una elevada viscosidad incluso a concentraciones bajas.
• Muestran un característico pico de absorción de luz ultravioleta a una longitud de onda de 260
nm. Esta propiedad resulta útil para determinar su concentración: midiendo la absorbancia.
• Las dos cadenas de nucleótidos que forman la doble hélice de una molécula de ADN se pueden
separar elevando la temperatura o aumentando el pH (pH alcalino). Este proceso se denomina
desnaturalización y se produce por la ruptura de los puentes de hidrógeno entre las bases
nitrogenadas complementarias. La desnaturalización es reversible, de manera que al disminuir la
temperatura lentamente o bajar el pH hasta valores neutros, se vuelven a formar los puentes de
hidrógeno entre las bases complementarias y la molécula de ADN recupera su conformación
nativa en doble hélice. Este fenómeno se denomina renaturalización.
• Dos cadenas de ácidos nucleicos con una secuencia de bases nitrogenadas complementaria, en
condiciones adecuadas de temperatura, pH y fuerza iónica, se unen mediante puentes de
hidrógeno entre las bases complementarias en un proceso denominado hibridación.
2.2. El ADN
El ácido desoxirribonucleico (ADN) almacena la información genética de un individuo, la transmite a
los descendientes y dirige la síntesis de las proteínas.
En los organismos eucariotas, el ADN se encuentra principalmente en el núcleo de las células como
parte de los cromosomas, pero también existen pequeñas cantidades dentro de las mitocondrias y en los
cloroplastos.
En los procariotas, la mayor parte del ADN se encuentra en un solo cromosoma y en una menor
proporción en forma de fragmentos pequeños llamados plásmidos. También algunos virus contienen ADN
como material genético.
Los organismos más primitivos son unicelulares procariotas o procariontes. Están formados por una única
célula sin núcleo diferenciado. Son las bacterias y las cianobacterias.
Los virus son estructuras mucho más sencillas, formados por un fragmento de material genético (ADN o
ARN) y una cubierta de proteínas. En algunos casos puede tener una envoltura lipídica. No seres vivos.
2.2.1. Estructura del ADN
El ADN es un polímero formado por largas cadenas de desoxirribonucleótidos (la pentosa es siempre
desoxirribosa) de adenina, guanina, citosina y timina (no contiene uracilo) que puede organizarse en tres
niveles estructurales: estructura primaria, estructura secundaria y estructura terciaria.
Estructura primaria del ADN
Una molécula de ADN se caracteriza por:
• El tamaño, determinado por el número de desoxinucleótidos que contiene. Las moléculas de ADN
que forman los cromosomas son de gran tamaño, conteniendo varios millones de pares de bases.
Los plásmidos y las moléculas de ADN mitocondrial, en cambio, tienen un tamaño de unos pocos
miles de pares de bases.
• La composición, referida a la proporción de cada desoxinucleótido. Los ADN aislados de
diferentes especies de organismos varían en la proporción de desoxirribonucleótidos que
contienen.
• La secuencia de bases nitrogenadas. Además de la proporción de desoxirribonucleótidos, en
los ADN aislados de diferentes especies también varía el orden o secuencia en que se sitúan las
bases nitrogenadas.
De hecho, una molécula de ADN se representa abreviadamente por su secuencia de bases nitrogenadas
colocadas en dirección 5'→3', lo que constituye su estructura primaria.
La estructura primaria de una molécula de ADN es la secuencia de bases nitrogenadas en el esqueleto
de su cadena de desoxinucleótidos.
Estructura secundaria del ADN
A pesar de las variaciones que hay en el tamaño, la composición de bases y la secuencia de las moléculas
de ADN de diferentes especies, todas las moléculas de ADN bicatenario tienen una característica común:
la cantidad de adenina es igual a la de timina y la cantidad de citosina es igual a la de guanina. ¿A qué
se debe esta regularidad? La respuesta se encuentra en el principio de complementariedad y en la
estructura secundaria del ADN.
El principio de complementariedad
Cuando algunos nucleótidos se enfrentan, se mantienen unidos mediante puentes de hidrógeno entre
los grupos polares de sus bases nitrogenadas.
Esto solo se produce entre bases nitrogenadas complementarias en función de su tamaño y su estructura.
Concretamente, son complementarias:
• La adenina y la timina, entre las que se forman dos puentes de hidrógeno (A=T).
• La citosina y la guanina, entre las que se forman tres puentes de hidrógeno (C≡G).
Para que la unión sea estable, es necesario además que los dos nucleótidos que portan las bases
complementarias sitúen sus grupos fosfato en posiciones opuestas.
La doble hélice (1953 Watson y Crick)
La configuración en doble hélice del ADN constituye su estructura secundaria y sostiene que el ADN
está formado por dos cadenas de polinucleótidos que forman una doble hélice alrededor de un eje central.
Así, las moléculas de ADN de los seres vivos son bicatenarias (ADNds), es decir, están constituidas por
dos cadenas polinucleotídicas que cumplen las siguientes condiciones:
• Las dos cadenas son antiparalelas. Los enlaces 5' - 3' están orientados en sentidos opuestos (el
extremo 5' de una cadena se enfrenta al 3’ de la otra).
• La secuencia de bases nitrogenadas de ambas cadenas es complementaria. Es decir, si se
conoce la secuencia de una de las cadenas se puede deducir la secuencia de la otra cadena.
• Ambas cadenas se mantienen unidas por puentes de hidrógeno entre las bases
complementarias.
5'- C T A T G A T A A C T T T G G C G T G C T - 3'
3'- G A T A C T A T T G A A A C C G C A C G A - 5'
• Forman una doble hélice. Las dos cadenas se enrollan alrededor de un eje imaginario formando
una doble hélice. El enrollamiento es dextrógiro (giran hacia la derecha) y plectonémico (para
separar las cadenas hay que desenrollarlas previamente). El diámetro es de 2 nm.
• Las bases nitrogenadas se encuentran en el interior. En el exterior de la doble hélice se sitúan
las cadenas de fosfato y desoxirribosa.
• Un giro de la doble hélice equivale a 10 nucleótidos. La separación entre dos pares de bases
consecutivos es de 0,34 nm. Una vuelta completa de la hélice contiene diez pares de bases y, por
lo tanto, tiene una longitud de 3,4 nm.

Estructura terciaria del ADN SOLO EN EUCARIOTAS

El último nivel de organización posible del ADN, solo se encuentra en el ADN del núcleo de las células
eucariotas. Así, el ADN presente en otros organismos como virus y procariotas y el que se encuentra fuera
del núcleo de las células eucariotas (mitocondrias y cloroplastos) no llega a tener esta complejidad
estructural.
La estructura terciaria parte de un ADN formado por largas cadenas lineales bicatenarias de ácidos
nucleicos asociadas a proteínas básicas.
Las proteínas que se asocian con el ADN son de dos tipos:
• Histonas, proteínas con una función estructural.
• No histonas, proteínas muy heterogéneas con funciones estructurales, enzimáticas y
reguladoras.
Las moléculas bicatenarias de ADN se enrollan alrededor de octámeros
cilíndricos de histonas, formando unidades estructurales llamadas
nucleosomas. Así, la molécula completa toma forma de «collar de perlas»
y se denomina fibra de cromatina.
Esta fibra, a su vez, se enrolla sobre sí misma, formando una unidad
estructural superior llamada solenoide. Todo este complejo formado por
ADN e histonas constituye la cromatina.
Por tanto, la estructura terciaria del ADN es la configuración
tridimensional de la molécula de ADN formando las fibras de cromatina.
En el momento de la división celular mitótica, las fibras de cromatina se
ordenan y experimentan varios niveles de superenrollamiento de complejidad creciente, hasta formar el
cromosoma metafásico. El número de cromosomas es característico de cada especie.
2.2.2. Otras organizaciones de las moléculas de ADN
Solo el ADN del núcleo de la célula eucariota presenta estructura terciaria, por lo que vamos a ver ahora
cómo se organiza el ADN presente en el resto de organismos y el ADN de mitocondrias y cloroplastos.
ADN de organismos procariotas
En los procariotas la mayor parte del ADN se encuentra en un solo cromosoma y en una menor proporción
en forma de fragmentos pequeños llamados plásmidos.
Cromosoma bacteriano
Los organismos procariotas presentan una única molécula de ADN bicatenaria y circular de gran tamaño
denominada cromosoma bacteriano, que se encuentra en el seno del citoplasma sin membrana nuclear
que lo separe de el.
Esta molécula de ADN contiene varios millones de nucleótidos y sus extremos están unidos
covalentemente, formando un anillo que se superenrolla para poder empaquetarse en el interior de la
célula.
En el microscopio electrónico este ADN empaquetado se observa como una estructura más clara que el
resto, de aspecto fibrilar, que se denomina nucleoide.
Plásmidos
Algunas bacterias, además del cromosoma bacteriano, contienen pequeñas moléculas circulares
bicatenarias de ADN, denominadas plásmidos.
Algunas características de los plásmidos son:
• Están formados por unos pocos miles de nucleótidos.
• Su número oscila entre uno y varios cientos.
• Se replican independientemente del cromosoma bacteriano.
• Habitualmente contienen genes de resistencia a antibióticos y factores de virulencia.
ADN mitocondrial de células eucariotas
EI ADN mitocondrial (ADNmt) consiste en una molécula bicatenaria y circular de ADN de unos miles de
nucleótidos.
Algunas de las características del ADNmt son:
• Contiene genes que codifican para ARN ribosómico, ARN de transferencia y enzimas empleadas
en los procesos metabólicos que tienen lugar en la mitocondria, por lo que se conoce también
como cromosoma mitocondrial (el ADNmt humano codifica 37 genes).
• Se replica de manera independiente respecto al ADN nuclear.
• Su número de copias por mitocondria es muy variable, puede llegar a varios cientos.
ADN de cloroplastos de células eucariotas
De manera análoga al ADN mitocondrial, las células vegetales tienen también ADN en los cloroplastos,
en forma de molécula bicatenaria y circular que codifica enzimas específicas de este orgánulo.
ADN copia
El ADN copia (ADNc) es un tipo de ADN especial obtenido in vitro. No existe como tal en la naturaleza,
se obtiene en el laboratorio a partir del ARN aislado de una célula, mediante una enzima denominada
retrotranscriptasa que sintetiza ADN utilizando como molde ARN.
Esta enzima permite obtener una copia de ADN de todas las moléculas de ARN presentes en una célula
en un estado metabólico concreto, lo que constituye una herramienta muy útil para conocer la información
almacenada en el ADN con los estudios de expresión génica.
ADN de virus
Los virus presentan la mayor diversidad en cuanto a organización de su material genético. En el caso de
los virus que contienen ADN, presentan una única molécula que puede ser lineal o circular, bicatenaria o
monocatenaria.
2.3. El ARN
El ácido ribonucleico (ARN) controla la síntesis de proteínas a partir de la información contenida en el
ADN.
En los organismos eucariotas se encuentra en el núcleo, en el citoplasma y en los ribosomas del
citoplasma, Algunos virus solo contienen ARN, mientras que otros tipos de virus solo contienen ADN.
2.3.1. Estructura del ARN
El ARN es un polímero formado por largas cadenas de ribonucleótidos (la pentosa es siempre ribosa) de
adenina, guanina, citosina y uracilo (no contiene timina).
Salvo en el caso de algunos virus, cuyo material genético es
ARN bicatenario (ARNds), el ARN de los seres vivos es
monocatenario y lineal. Sin embargo, algunas zonas de la
molécula pueden tener secuencias complementarias, de manera
que la cadena puede plegarse para formar regiones de doble
hélice denominadas horquillas. Si las regiones complementarias
están separadas por una secuencia no complementaria, en el
extremo de la horquilla se forma un bucle.
En el ARN, las bases complementarias son adenina y uracilo, entre las cuales se forman dos puentes de
hidrógeno (A=U) y citosina y guanina, entre las que se forman tres puentes de hidrógeno (C≡G).
2.3.2. Tipos y organización del ARN
Existen varios tipos de ARN que podemos clasificar según su estructura y función de la siguiente manera:
• ARN mensajero (ARNm), ARN ribosómico (ANRr) y ARN de transferencia (ARNt), como tipos
principales.
• Con función reguladora de la expresión génica: ARNsi, ARNmi.
• Otros tipos: ARNhn, ARNsn, ARNsno.
ARN mensajero
El ARN mensajero (ARNm) está constituido por múltiples moléculas lineales de diferentes tamaños, cada
una de las cuales porta la información para la síntesis de una proteína.
Su secuencia de bases nitrogenadas, copia exacta de la secuencia de un gen de ADN, determina la
ordenación secuencial de los aminoácidos que constituyen la proteína (un codón constituido por tres
bases codifica un aminoácido).
En consecuencia, el ARNm transmite la información genética contenida en el ADN a la maquinaria celular
de síntesis de proteínas.
Las moléculas de ARNm procariota son policistrónicas, portan información para la síntesis de varias
proteínas distintas. Por el contrario, las moléculas de ARNm eucariota son monocistrónicas, es decir,
contienen información para la síntesis de una única proteína.
ARN ribosómico
El ARN ribosómico (ARNr) es el mayoritario en las células (aproximadamente el 80%). Combinado con
proteínas forma los ribosomas, orgánulos citoplasmáticos responsables de la síntesis de proteínas.
Los ARNr se clasifican según su coeficiente de sedimentación:
• En las células procariotas hay tres tipos: 5S, 16S y 23S.
• En las células eucariotas hay cuatro tipos: 5S, 5.8S, 18S y 28S.
Presentan múltiples regiones complementarias, por lo que tienen una estructura secundaria muy
compleja, con numerosas horquillas y bucles.
ARN de transferencia
Los ARN de transferencia (ARNt) transportan los aminoácidos hasta
los ribosomas para su incorporación en la cadena proteica que se está
sintetizando.
Consisten en cadenas cortas (70-90 nucleótidos) con una estructura
secundaria en forma de hoja de trébol constituida por cuatro horquillas
y tres bucles o lazos. Esta estructura secundaria se pliega
tridimensionalmente en una estructura terciaria en forma de Lo
bumerán.
El extremo 3' de todos los ARNt termina con la secuencia 5'- CCA - 3'
y es el sitio de unión del aminoácido que portan.
Los tres lazos son regiones funcionales de la molécula:
• El lazo D (por contener dihidrouridina) es el sitio de unión de la enzima encargada de unir el
aminoácido correspondiente al extremo 3'.
• El lazo T (por contener la secuencia TΨC) es el sitio de unión al ribosoma.
• El lazo anticodón contiene las tres bases complementarias del codón en el ARNm que codifica
para el aminoácido que porta.
ARN con función reguladora
Los ARN con función reguladora son moléculas pequeñas con secuencias complementarias de
regiones específicas de ARNm que, al unirse, bloquean la traducción a proteína o activan enzimas que
degradan el ARNm.
De estas moléculas son bicatenarias (ARN interferente pequeño o ARNsi) y otras son monocatenarias
con regiones complementarias que forman una horquilla (microARN o ARNmi).
Otros tipos de ARN
Existen otros tipos de ARN, como son:
• ARN heterogéneo nuclear (ARNhn). Es una mezcla de largas moléculas lineales precursoras
del ARNm (pre-ARNm). Se encuentra en el núcleo de la célula y tras un proceso de maduración
dan lugar al ARNm, que sale al citoplasma.
• ARN pequeño nuclear (ARNsn). Es un conjunto de pequeñas moléculas de ARN que se localizan
en el núcleo y se unen a proteínas, dando lugar a ribonucleoproteínas con actividad enzimática.
Concretamente intervienen en la maduración del ARNm.
• ARN nucleolar (ARNn). Se localiza en el nucleolo y es el precursor de varios ARNr.
• ARN pequeño nucleolar (ARNsno). Es un conjunto de pequeñas moléculas de ARN localizadas
en el nucleolo que se unen a proteínas, formando ribonucleoproteínas pequeñas nucleolares
(RNPsno), implicadas en la maduración del ARNr.
2.4. El flujo de la información genética
Para que el ADN pueda transmitir a los descendientes la información genética y dirigir la síntesis de las
proteínas son necesarios tres procesos metabólicos: la replicación, la transcripción y la traducción.
La transmisión íntegra de la información genética de un organismo a la descendencia implica duplicar, en
el caso de las células, o multiplicar, en el de los virus, el material genético mediante un proceso llamado
replicación. Por otro lado, el ADN almacena la información para la síntesis de proteínas.
Pero el ADN está en el núcleo de la célula y la síntesis de proteínas tiene lugar en el citoplasma. En
consecuencia, es necesario un flujo de información genética desde el ADN hasta las proteínas. Esto se
consigue mediante los procesos de transcripción y traducción.

2.4.1. Replicación del ADN

La replicación de ADN es el proceso por el cual una molécula de ADN se duplica para dar lugar a dos
moléculas de ADN hijas idénticas, que conservan la misma secuencia de bases que la molécula inicial.
Por lo tanto, mediante la replicación el ADN se copia para transmitirse a la descendencia.
Características generales de la replicación
La replicación presenta varias características comunes a procariotas y eucariotas:
• Es semiconservativa. En cada molécula hija, una de las
cadenas procede de la molécula original que se replica y la otra
cadena es de nueva síntesis.
• Comienza en un origen de replicación. La replicación comienza
en unos puntos de iniciación concretos denominados orígenes
de replicación. El cromosoma bacteriano de procariotas tiene un
único origen de replicación, mientras que en los cromosomas
eucariotas hay muchos, por lo que la replicación se inicia de
manera simultánea en varios puntos de cada cromosoma.
• Es bidireccional y secuencial. A partir del origen de replicación, las dos cadenas de ADN molde
se separan y la síntesis de las nuevas cadenas se produce en ambas direcciones, lo que da lugar
a dos horquillas de replicación.
• Es semidiscontinua. La síntesis de las cadenas nuevas se producen siempre en dirección 5'→3',
por lo que la cadena molde tiene que leerse en dirección 3'→5'. Al ser bidireccional desde el origen
de replicación, se plantea un problema: en uno de los sentidos, la cadena nueva puede crecer de
manera continua a medida que avanza la horquilla de
replicación, puesto que la hebra molde se lee en la
dirección correcta 3 →5, pero en el sentido contrario la
cadena nueva no se puede sintetizar de manera
continua porque se tendría que leer la hebra molde en
la dirección incorrecta 5'→3'. Por ello, a uno de los lados
del origen de replicación, la nueva cadena se sintetiza
de manera discontinua, en forma de fragmentos
denominados fragmentos de Okazaki. La hebra que se
sintetiza de manera continua se llama hebra adelantada o conductora y la hebra que se sintetiza
a fragmentos se denomina hebra retardada.
Las enzimas del proceso de replicación
La replicación del ADN es un proceso complejo que se puede dividir en fases y en el que participan
múltiples enzimas. La explicación de las fases en que se produce será más fácil si se conocen antes las
enzimas que toman parte en él:
 • Helicasa. Desenrolla y separa las dos cadenas de la doble hélice. Empieza en el origen de
replicación y continúa en ambos sentidos a medida que avanzan las horquillas de replicación.
• Proteínas de unión a cadena sencilla (SSBP). Se unen a las cadenas desenrolladas evitando
que se vuelva a formar la doble hélice.
• Girasa y topoisomerasa. La separación de las dos cadenas de ADN en la burbuja de replicación
genera un superenrollamiento en el resto de la doble hélice. Estas dos enzimas relajan la tensión
de la doble hélice mediante cortes y empalmes.
• ADN polimerasa. Es la responsable de la síntesis de la nueva cadena, añadiendo
desoxinucleótidos al extremo 3' de una cadena en crecimiento. La ADN polimerasa no puede
iniciar una cadena, solo puede elongar una preexistente de ADN o ARN, añadiendo
desoxinucleótidos a la posición 3' libre complementarios a los de la secuencia de la cadena molde.
Además, estas enzimas tienen también actividad exonucleasa, es decir, son capaces de eliminar
nucleótidos uno a uno desde un extremo de la cadena para corregir y reparar errores
• Primasa. Es una enzima con función ARN polimerasa que sintetiza cortos fragmentos de ARN
(aproximadamente 10 nucleótidos) denominados cebadores o primers, complementarios de zonas
concretas de la cadena de ADN que se está replicando. De esta manera, se forman cortas regiones
de híbridos ARN-ADN que son reconocidas por la ADN polimerasa para iniciar su función de
elongación.
Para la síntesis de la hebra conductora se requiere un único cebador en el origen de la replicación.
En la hebra retardada, por el contrario, se requiere un cebador para cada fragmento de Okazaki.
• Ligasa. Es la enzima responsable de unir los fragmentos de Okazaki entre sí y los extremos de la
hebra conductora para conseguir la continuidad de las cadenas de nueva síntesis.
Fases de la replicación
Aunque existen diferencias entre el proceso de replicación en procariotas y eucariotas, el desarrollo del
proceso en procariotas nos servirá como explicación de las fases de la replicación.
La replicación en procariotas se puede dividir en dos fases: iniciación y elongación.
Fase de iniciación
La replicación se inicia cuando proteínas específicas reconocen el origen de replicación y se unen a él.
Esta unión activa las helicasas, que rompen los puentes de hidrógeno entre bases complementarias y
separan las dos cadenas de ADN, con lo que se forma una burbuja de replicación.
Las SSBP, se unen a las cadenas separadas e impiden que se vuelva a formar la doble hélice.
Simultáneamente se activan las girasas y topoisomerasas, que relajan la tensión de la zona de doble
hélice próxima a la burbuja de replicación.
La acción de las helicasas, las girasas y las topoisomerasas permite que la burbuja de replicación se
extienda en los dos sentidos a lo largo del cromosoma, generándose dos regiones en forma de Y en los
extremos de la burbuja denominados horquillas de replicación, donde se van a sintetizar las nuevas
cadenas de ADN.
Fase de elongación
1. La primasa sintetiza los cebadores en dirección 5'→3'. En la hebra conductora solo se requiere
un cebador inicial en el origen de replicación, puesto que la elongación de la cadena se produce
en el mismo sentido en que avanza la horquilla de replicación En la hebra retardada, por el
contrario, la primasa sintetiza un primer cebador algo alejada del origen de replicación.
2. La primasa se separa de la cadena molde y entra la ADN polimerasa III que inicia la elongación
del cebador mediante la incorporación de desoxinucleótidos en la posición 3' libre. A medida que
crece la cadena, la ADN polimerasa III se va desplazando sobre la cadena molde, «leyendo» su
secuencia e incorporando secuencialmente los desoxinucleótidos complementarios, En la cadena
conductora, la elongación de la cadena continúa hasta que se fusionan ambas horquillas de
replicación. En la cadena retardada la ADN polimerasa se separa de la cadena molde cuando la
elongación de la cadena alcanza el cebador anterior.
3. La ADN polimerasa I se une a la cadena a nivel de los cebadores, los elimina mediante su
actividad exonucleasa 5'→3' y los sustituye por ADN.
4. La ligasa une los fragmentos de Okazaki consecutivos, dando continuidad a la hebra retardada.
Los posibles errores en la incorporación de bases se reparan gracias a la actividad exonucleasa de la
ADN polimerasa III.
La replicación en eucariotas a grandes rasgos es similar a la de procariotas con algunas peculiaridades:
• Los orígenes de replicación son múltiples, por lo que se inicia simultáneamente en varios puntos
de cada cromosoma.
• Hay cinco tipos de ADN polimerasas, que se reparten las tareas de elongación, eliminación de
cebadores y corrección de errores.
• El ADN eucariota se encuentra unido a histonas, por lo que durante la replicación se van
estructurando también los nucleosomas.

2.4.2. Transcripción del ADN a ARN

La transcripción es el proceso por el cual se sintetiza una molécula de ARN utilizando como molde una
cadena de ADN.
Las enzimas del proceso de transcripción
Este proceso requiere una enzima denominada ARN polimerasa-ADN dependiente o transcriptasa.
En procariontes solo existe un tipo de ARN polimerasa; en cambio en eucariotas existen tres tipos.
Fases de la transcripción
El proceso se realiza en tres fases: iniciación, elongación y terminación.
Fase de iniciación
La transcripción se inicia cuando la ARN polimerasa reconoce y se une a una zona de la molécula de
ADN, llamada promotor.
La unión de la ARN polimerasa al promotor determina que las dos cadenas de la doble hélice se separen
y se pueda iniciar la síntesis de una cadena de ARN mediante la incorporación de nucleótidos.
Fase de elongación
Consiste en la adición secuencial de ribonucleótidos catalizada por la ARN polimerasa. De las dos
cadenas de la molécula de ADN solo se transcribe una de ellas, llamada cadena molde. La cadena que
no se transcribe se denomina cadena no molde, cadena informativa o cadena sin sentido.

Durante la fase de elongación, la ARN polimerasa se desplaza a lo largo de la cadena molde en dirección
3'→5', «leyendo» la secuencia de bases, seleccionando el ribonucleótido que tiene una base nitrogenada
complementaria de la del ADN e incorporándolo a la cadena de ARN en crecimiento mediante la formación
de un enlace fosfodiéster. En consecuencia el crecimiento de la cadena de ARN tiene lugar en dirección
5'→3'.
Fase de terminación
La síntesis de ARN termina cuando la ARN polimerasa alcanza una secuencia específica en la molécula
de ADN denominada señal o secuencia de terminación.
En ese punto, la cadena de ARN se separa del ADN y de la enzima, la ARN polimerasa se separa del
ADN y la molécula de ADN recupera su estructura en doble hélice.
Maduración del ARN
La maduración es el proceso que requieren las cadenas de ARN transcritas para dar lugar a los tipos
principales de ARN que se han explicado (ARNt, ARNr, ARNm).
Maduración del ARN en procariontes
Los ARNt y ARNr se sintetizan en forma de largas moléculas de ARN, denominadas transcritos primarios,
que contienen numerosas copias de cada uno de ellos. Estos transcritos son posteriormente cortados por
enzimas específicos para dar lugar a los distintos tipos de ARNt y ARNr.
El ARNm transcrito no requiere ninguna modificación, posterior. De hecho la traducción a proteína se
inicia incluso antes de que termine la transcripción, ya que los ribosomas se pueden acoplar al extremo
5' libre de la cadena de ARNm en crecimiento.
Maduración del ARN en eucariontes
La maduración de los ARNt y ARNr es similar como en procariontes, pero por el contrario el ARNm
requiere un proceso complejo de maduración antes de poderse traducir a proteína. Debido a que en la
mayoría de los genes eucariotas se alternan dos tipos de secuencias, denominadas exones e intrones.
Los exones son secuencias que se transcriben y se traducen, ya que portan información para la síntesis
de una región de una proteína.
Los intrones son secuencias que se transcriben pero no se traducen, puesto que no codifican para una
cadena de aminoácidos y, por lo tanto, hay que eliminarlos antes de la traducción...
Por ello, el ARN sintetizado directamente mediante el proceso de transcripción se denomina ARN
heterogéneo nuclear (ARNhn) o pre-ARNm. Este ARNhn, además de contener intrones no codificantes,
no puede salir del núcleo para ir hacia el citoplasma, que es donde se encuentra la maquinaria de síntesis
de proteínas.
La maduración del ARNm se puede esquematizar en tres pasos:
1. Adición de una caperuza en 5’. La maduración se inicia durante la fase de elongación mediante
la adición de una «caperuza» o «casquete» (cap en inglés) en el extremo 5' libre de la cadena en
crecimiento. Esta caperuza consiste en la incorporación de una 7-metilguanosina trifosfato, que
protege al ARN de la degradación,
2. Adición de una cola de poli-A en 3'. Una vez que la molécula de ARN se ha separado del ADN
y de la ARN polimerasa, una enzima denominada poli-A polimerasa añade una cola de poli-A al
extremo 3' de la nueva cadena de ARN. El número de residuos de la cola varía según las especies
desde unas decenas hasta varios cientos. La cola de poli-A permite al ARNm maduro salir del
núcleo al citoplasma.
3. La eliminación de los intrones. Tiene lugar
mediante un proceso de corte y unión
denominado empalme, splicing en inglés. En
este proceso intervienen unas proteínas
denominadas ribonucleoproteínas pequeñas
nucleares (RNPsn), que se sitúan en los
extremos de los intrones y se agrupan formando
un complejo de «corte y empalme» que recibe el
nombre de espliceosoma, de manera que la
secuencia intrónica forma un bucle. Finalmente,
la cadena de ARN se corta en la base del bucle
y se empalman los exones para dar lugar al
ARNm maduro.
2.4.3. Traducción del ARNm
La traducción es el proceso por el cual a partir de una molécula de ARNm se sintetiza una proteína.
Ahora bien, ¿cómo se pasa de un «lenguaje» de cuatro letras (las cuatro bases nitrogenadas del ARN) a
un «lenguaje» de 20 letras, (los 20 aminoácidos que forman las proteínas)? Esto es posible gracias al
código genético.
El código genético
El código genético es el diccionario que permite traducir una secuencia de bases nitrogenadas a una
secuencia de aminoácidos.
Se basa en que una secuencia de tres bases nitrogenadas codifica un aminoácido. Cada triplete de bases
nitrogenadas que codifican un aminoácido se denomina codón. De los 64 codones que se pueden formar
por las variaciones con repetición de cuatro bases tomadas de tres en tres, 61 codifican aminoácidos y 3
son codones de terminación.
Características del código genético
El código genético presenta las siguientes características:
• Es universal. El código genético es el mismo para todos los organismos. Es decir, un codón
específico codifica el mismo aminoácido en un eucarionte, en un procarionte y en un virus.
• No es ambiguo. Cada codón codifica un único aminoácido.
• Es degenerado. Dado que hay 20 aminoácidos y 61 codones codificantes, el código genético
tiene redundancia. Esto es, la mayor parte de los aminoácidos están codificados por más de un
codón. Los distintos codones que codifican un mismo aminoácido se denominan codones
sinónimos.)
• Es continuo y no solapado. En la cadena de ARNm, los codones se disponen de manera
secuencial uno a continuación de otro, sin espacios y sin compartir ninguna base.
Codones para la iniciación y para la terminación
Todas las secuencias de ARNm que se van a traducir empiezan con el codón de inicio AUG, que codifica
para metionina. Los codones UAA, UAG y UGA son codones de terminación.
Fases del proceso de traducción
Para que se lleve a cabo la síntesis de polipéptidos se requiere:
• Una molécula de ARNm, que contiene la información de la secuencia de aminoácidos
• Los 20 aminoácidos, que son los componentes de las proteínas.
• Los ribosomas, que son los orgánulos en los que se realiza el proceso y están constituidos por
ARNr y proteínas.
• Los ARNt, que transportan los aminoácidos hasta los ribosomas.
• Las enzimas que catalizan la unión entre aminoácidos.
Los ribosomas constan de dos subunidades de distinto tamaño: la subunidad menor y la subunidad mayor.
• La subunidad menor tiene un sitio de unión al ARNm.
• La subunidad mayor tiene dos sitios de unión a los ARNt:
o El sitio peptidil o sitio P, donde se sitúa el ARNt que porta la cadena polipeptídica en
crecimiento.
o El sitio aminoacil o sitio A, donde se sitúa el ARNt que porta el siguiente aminoácido que
se va a incorporar a la cadena.
Cada aminoácido se une a su respectivo ARNt por la acción de una enzima aminoacil-ARNt-sintetasa
específica. Cada ARNt tiene en el lazo anticodón un triplete de bases nitrogenadas (anticodón)
complementarias del codón que codifica el aminoácido que porta.
Iniciación
El proceso se inicia con la unión de la subunidad menor del ribosoma a un ARNm, a la altura del codón
de inicio AUG. Se forman puentes de hidrógeno entre el codón AUG y el anticodón UAC del ARNt que
porta el aminoácido metionina. A este conjunto se le denomina complejo de iniciación. Posteriormente se
incorpora la subunidad grande del ribosoma, de manera que el ARNt-Met se sitúa en el sitio P.
Elongación
Comienza con la incorporación al sitio A de un segundo aminoacil-ARNt que tiene un anticodón
complementario al segundo codón del ARNm, La enzima peptidil-transferasa cataliza la formación de un
enlace peptídico entre la metionina (en el sitio P) y el aminoácido que se encuentra en el sitio A. De esta
manera, el ARNt del sitio P queda sin aminoácido y el ARNt del sitio A está ahora unido a un dipéptido.
El ribosoma se va desplazando a lo largo de la molécula de ARNm en dirección 5'→3', en un movimiento
denominado translocación. El primer ARNt, ahora sin aminoácido, se separa del complejo; el ARNt que
porta el dipéptido se traslada al sitio P y en el sitio A entra un nuevo aminoacil-ARNt complementario del
tercer codón del ARNm.
Terminación
Se produce cuando el ribosoma alcanza en el ARNm un codón de terminación (UAA, UGA o UAG). No
existe ningún ARNt que tenga un anticodón complementario de algún codón de terminación.
Por el contrario, existen los llamados factores de liberación, que sí reconocen estas secuencias, se sitúan
en el sitio A y hacen que la peptidil-transferasa hidrolice la unión entre la cadena polipeptídica y el ARNt
que la porta en el sitio P, con lo que dicha cadena se libera del complejo. A continuación, las dos
subunidades del ribosoma se separan y los factores de liberación, el ARNm y el ARNt se liberan.

2.5. Enzimas empleadas en biología molecular

Las técnicas de biología molecular implican manipulaciones de ácidos nucleicos que solo son posibles
gracias a la actividad catalizadora de enzimas específicas. Estas pueden ser aisladas de todo tipo de
organismos para que realicen in vitro la misma actividad que llevarían a cabo in vivo.
Por tanto, estas enzimas son herramientas importantes en biología molecular. Algunas de las más
habituales son: las nucleasas, las endonucleasas de restricción, las ADN polimerasas, las
retrotranscriptasas, la desoxinucleotidil transferasa terminal, las ligasas y las topoisomerasas.
2.5.1. Nucleasas
Las nucleasas son enzimas que cortan y degradan los ácidos nucleicos mediante hidrólisis del enlace
fosfodiéster entre dos nucleótidos.
Dependiendo de sus características se pueden clasificar de varias maneras:
• Según el tipo de ácido nucleico que atacan:
o Nucleasas de ARN (ARNasa o ribonucleasa). Son enzimas capaces de romper enlaces
fosfodiéster entre ribonucleótidos.)
o Nucleasas de ADN (ADNasa o desoxirribonucleasa). Son enzimas capaces de romper
enlaces fosfodiéster entre desoxirribonucleótidos.
• Según el tipo de cadena que atacan:
o Nucleasas que atacan moléculas bicatenarias, rompiendo enlaces en ambas cadenas
o Nucleasas que solo atacan moléculas monocatenarias, Por ejemplo, la nucleasa S1
degrada ARNss, ADNss y zonas monocatenarias de ADNds, como lazos o bucles.
 • Según la situación del punto de corte:
o Exonucleasas, que eliminan nucleótidos uno a uno desde un extremo (en dirección 5'→3',
3'→5' o en ambas).
o Endonucleasas, que cortan en puntos intermedios de la molécula.
• Según la especificidad del corte:
o Nucleasas que cortan aleatoriamente. Son enzimas que cortan la cadena de nucleótidos
de forma aleatoria.
o Nucleasas que cortan en sitios concretos de la molécula. Son enzimas que se unen a
una cadena de nucleótidos en una secuencia específica y la cortan.
2.5.2. Endonucleasas de restricción
Las endonucleasas de restricción son endonucleasas bacterianas que reconocen secuencias cortas de
ADN bicatenario (de entre 4 y 8 pares de bases) y producen un corte en la doble cadena en esa secuencia
o cerca de ella, fragmentando la molécula,
A las secuencias de ADN específicas que reconocen se las denomina dianas de restricción.)
Tipos de enzimas de restricción
Hay tres tipos de enzimas de restricción:
• Enzimas de restricción tipo I. La enzima reconoce su diana de restricción y efectúa un corte en
una región anterior o posterior de la diana a una distancia aleatoria de hasta 1.000 pb. Estas
enzimas no generan patrones específicos de fragmentos, es decir, cada vez que cortan una misma
molécula de ADN generan fragmentos distintos, por lo que no tienen gran utilidad en biología
molecular.
• Enzimas de restricción tipo II. Reconocen la diana de restricción y cortan en puntos específicos,
generalmente dentro de la misma diana. En consecuencia, estas enzimas generan patrones
específicos y reproducibles de fragmentos, ya que siempre que se enfrentan a la misma molécula
cortan por los mismos puntos, Son una herramienta fundamental en biología molecular y se las
llama tijeras moleculares.
• Enzimas de restricción tipo III. Reconocen dos secuencias invertidas dentro de la misma cadena
y cortan fuera de la diana de restricción.
Tipos de corte
El corte realizado por una enzima de restricción puede ser de dos maneras distintas que se caracterizan
por los extremos generados:
• Extremos romos. El corte se produce en el mismo punto en las dos ca-denas, generalmente en
el centro de la diana de restricción.
• Extremos cohesivos. El corte se produce en puntos distintos de ambas cadenas, normalmente
en los extremos de la diana de restricción. Esto genera en cada extremo sendas regiones
monocatenarias cortas y complementarias entre sí, lo que hace que sean muy reactivos al poderse
adherir a fragmentos de ADN que tengan secuencias de bases complementarias.

Aplicaciones en biología molecular

Dos aplicaciones de las enzimas de restricción de especial importancia en biología molecular son: en la
tecnología del ADN recombinante y en la obtención de patrones de restricción.
Síntesis de moléculas de ADN recombinante
La propiedad de las endonucleasas de restricción de cortar dejando extremos cohesivos o reactivos, es
decir, con regiones monocatenarias cortas de bases desapareadas, es muy útil en biología molecular para
crear moléculas de ADN recombinante.
El procedimiento es el siguiente:
1. Se cortan dos moléculas distintas de ADN con la misma enzima
de restricción.
2. Cuando los fragmentos con extremos cohesivos de ambas
moléculas se mezclan, se unirán por la complementariedad de
bases de sus respectivas regiones monocatenarias generadas
por la enzima de restricción.
3. Finalmente, las mellas que quedan en cada cadena se unen con
una ligasa y se obtiene una molécula híbrida recombinante.
De esta manera se puede insertar un determinado gen de un organismo
(que sea responsable de la producción de una determinada proteína)
en otro diferente, con la finalidad de producirla en grandes cantidades,
Así, por ejemplo, actualmente la insulina humana de uso terapéutico es
producida en gran escala por bacterias gracias a la tecnología del ADN
recombinante.
Patrones de restricción
Para una enzima de restricción concreta una molécula de ADN presenta un número relativamente
pequeño de dianas de restricción, En consecuencia la digestión con esa enzima genera un número
discreto de fragmentos de distintos tamaños. Estos fragmentos se pueden separar según su tamaño
mediante la técnica de electroforesis en gel de manera que se obtiene un conjunto de bandas que es
único para un ADN en particular y que se denomina patrón de restricción.
Conocer el patrón de restricción de una muestra de ADN dada tiene muchas utilidades como pueden ser
la identificación de muestras pertenecientes a un mismo individuo, la realización de estudios filogenéticos
y la detección de posibles anomalías en el diagnóstico prenatal o en la detección de mutaciones.
2.5.3. ADN polimerasas
La mayor parte de las técnicas de análisis de los ácidos nucleicos requiere una fase previa de
amplificación, es decir, obtener un número de moléculas idénticas suficientemente grande para poder
realizar los estudios.
Las ADN polimerasas permiten realizar copias de moléculas de ADN mediante replicación.
De hecho, la técnica básica en biología molecular es la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), que
permite obtener millones de copias de una secuencia de interés.
Las ADN polimerasas más usadas son de los tipos I y III. Para realizar su función requieren que en el
medio de reacción estén presentes:
• Los cuatro desoxinucleótidos trifosfato.
• Un ADN molde.
• Cebadores.
• Mg2+ como cofactor.
Actualmente se dispone de numerosas polimerasas, que se diferencian en:
• La velocidad de polimerización (número de nucleótidos incorporados por segundo).
• La fidelidad en la replicación (proporción de errores).
• La termoestabilidad (la temperatura a la que se inactivan).
• La procesividad (número de nucleótidos que pueden incorporar antes de separarse de la cadena
molde).
• La presencia o ausencia de actividad exonucleasa además de la actividad polimerasa.
Dependiendo de la técnica en la que se vayan a usar, interesarán unos tipos u otros. Por ejemplo:
• En la PCR, las muestras se someten a ciclos de desnaturalización, hibridación y polimerización.
Como en la fase de desnaturalización se alcanzan temperaturas por encima de los 90 °C,
 interesará trabajar con polimerasas de gran termoestabilidad. Además, convendrá que su
procesividad, su velocidad de polimerización y su fidelidad sean altas.
• En el marcaje de sondas mediante la técnica de desplazamiento de mella, los requerimientos son
diferentes. En esta técnica primero se producen mellas en la molécula de ADN que se quiere
marcar con una ADNasa 1 a baja concentración y a continuación se añaden nucleótidos trifosfato
marcados y una ADN polimerasa I para que repare las mellas. La enzima se une a la mella y
empieza a eliminar nucleótidos en dirección 5'→3' a la vez que incorpora nuevos nucleótidos
marcados en dirección 5'→3. De esta manera, la enzima va desplazando la mella y la nueva
cadena queda marcada. En este caso:
o No se requiere que la enzima tenga gran termoestabilidad (la reacción no se realiza a altas
temperaturas) ni alta procesividad (las sondas suelen tener un tamaño limitado) ni elevada
velocidad de polimerización (la técnica se realiza a tiempo final, sin ciclos cortos).
o Sí se requiere actividad exonucleasa 5'→3', alta fidelidad en la polimerización para que no
cometa errores y que la sonda no pierda su especificidad y sea capaz de utilizar nucleótidos
marcados.
2.5.4. Retrotranscriptasas
Las retrotranscriptasas o transcriptasas inversas son ADN polimerasas-ARN dependientes. Es decir,
sintetizan moléculas de ADN utilizando ARN como molde.
El ADN sintetizado se denomina ADN copia (ADNc). Se ha aislado de los retrovirus, virus cuyo material
genético es ARN, el cual se retrotranscribe a ADN en la célula infectada y se integra en el genoma.
El empleo de estas enzimas ha permitido:
• Realizar estudios masivos de ARN.
• La amplificación de ARN.
2.5.5. Desoxinucleotidil transferasa terminal (Tdt)
La desoxinucleotidil transferasa terminal (Tdt) es una ADN polimerasa que cataliza la incorporación
de desoxinucleótidos al extremo 3' de una molécula de ADN.
No requiere de un cebador ni de una cadena molde para ejercer su actividad. En presencia de una
molécula bicatenaria de ADN y desoxinucleótidos, sintetiza colas de ADN monocatenarias en ambos
extremos 3.
Una de sus principales utilidades es el marcaje terminal de sondas con nucleótidos marcados.
2.5.6. Ligasas
Las ligasas unen dos moléculas de ADN mediante formación de enlaces fosfodiéster, entre los extremos
3' de una molécula y 5' de la otra.
Son muy útiles en tecnología de ADN recombinante para unir fragmentos de ADN de distinta procedencia
previamente cortados por la misma enzima de restricción.
2.5.7. Topoisomerasas
Las topoisomerasas relajan la tensión de la doble hélice de ADN próxima a las burbujas de replicación
o transcripción.
Se utilizan para relajar estructuras superenrolladas de ADN, como paso previo a la aplicación de otras
técnicas de biología molecular.
3.1. Pretratamiento de las muestras biológicas
Los ácidos nucleicos se pueden obtener prácticamente de cualquier muestra biológica Pero, dada la gran
diversidad y variabilidad del posible material de partida (sangre, tejidos, biopsias, etc.), en muchas
ocasiones se requiere un pretratamiento específico de la muestra biológica, concreta, que permita obtener
las suspensiones celulares sobre las que se realizará la extracción y purificación de los ácidos nucleicos.
Las suspensiones celulares están formadas por células libres y agregados celulares que flotan
dispersos en el seno de un medio líquido.
A continuación, abordaremos los pretratamientos más habituales de las muestras con que se trabaja en
biología molecular:

• Sangre
• Cultivos celulares
• Tejidos animales o vegetales frescos
• Tejidos fijados en formol e incluidos en parafina
• Otras muestras como esputos, células de la mucosa oral, bacterias y levaduras
• Saliva
• LCR
3.1.1. Sangre
La sangre es una de las muestras biológicas más habituales para estudiar los ácidos nucleicos de un
individuo, purificándolos a partir de uno de sus componentes celulares, los leucocitos. Muchos de los
componentes sanguíneos interfieren en las técnicas de biología molecular. Por ejemplo, el grupo hemo
de la hemoglobina es un potente inhibidor de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), por lo que
un objetivo común en los distintos pretratamientos es la eliminación de la hemoglobina por medio de la
lisis de los hematíes.
Consideraciones sobre la obtención y conservación de la muestra
Lo ideal es partir de sangre total anticoagulada con ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), pero la
heparina y el citrato sódico también se pueden usar como anticoagulantes.
La extracción de ácidos nucleicos es conveniente realizarla en las 24 horas siguientes a la obtención de
la muestra, pero en caso contrario, se puede conservar en refrigeración a 4 °C durante cinco días.
Sin embargo, si se van a aplicar técnicas que requieren moléculas intactas de ADN sin fragmentar, como
el Southern blot, la sangre no debería almacenarse en nevera más de tres días, porque en un periodo
más largo se produce una leve degradación y fragmentación del ADN.
Lisis de los hematíes
El pretratamiento más habitual en muestras de sangre consiste en:
1. Lisis de los hematíes. Consiste en romper los hematíes con una solución o tampón de lisis, en
la proporción 1:3, es decir, un volumen de sangre por tres volúmenes de solución de lisis.
Actualmente hay muchas soluciones de lisis comerciales, la mayoría de ellas basadas en
fenómenos osmóticos y/o en detergentes suaves.
2. Centrifugado de la muestra. Una vez producida la lisis de los hematíes, se centrifuga la muestra
y se obtiene un sedimento o pellet y un sobrenadante.
3. Eliminación del sobrenadante. Consiste en eliminar la fracción líquida sobrenadante con una
pipeta Pasteur, Con esto se eliminarán los componentes del plasma sanguíneo y la hemoglobina,
liberada por la rotura de los hematíes.
4. Conservación del sedimento. Entonces continuaremos el proceso de extracción de los ácidos
nucleicos. En el sedimento habrán quedado los leucocitos.
Este pretratamiento también es válido para muestras de médula ósea.
Obtención de células mononucleadas de sangre periférica
La sangre se puede utilizar también como material de partida para detectar, aislar y estudiar ácidos
nucleicos de algunos retrovirus que infectan linfocitos, como el virus de la inmunodeficiencia humana
(VIH) o los virus linfotrópicos humanos de células T (HTLV).
En estos casos interesa aislar las células mononucleadas de sangre periférica o PBMC, es decir, linfocitos
y monocitos, antes de extraer los ácidos nucleicos. Esto se consigue mediante una centrifugación en
gradiente de densidad que requiere un medio de separación. Se procede de la siguiente manera:
1. Se coloca en un tubo el medio de separación y encima la sangre.
2. A continuación se centrifuga durante 20-30 minutos a 400-800 x g, dependiendo del reactivo
usado.
3. Una vez eliminado el plasma sobrenadante, la capa de células mononucleadas se aspira
cuidadosamente con una pipeta Pasteur, se transfiere a un tubo limpio y se lava con tampón o
solución salina para eliminar restos de plasma y plaquetas.
4. A partir de las células lavadas se puede continuar con el proceso de extracción de ácidos
nucleicos.
3.1.2. Cultivos celulares
Los cultivos celulares son métodos de obtención de células in vitro mediante siembras controladas en
medios adecuados.
El pretratamiento de estas muestras consiste en la recolección de las células antes de seguir con la
extracción de los ácidos nucleicos.
3.1.3. Tejidos animales o vegetales frescos
La obtención de ácidos nucleicos a partir de tejidos frescos animales o vegetales requiere un
pretratamiento previo de homogeneización.
La homogeneización es el tratamiento mecánico o químico al que se somete un tejido para liberar las
células que lo integran.
La cantidad de tejido que se va a procesar dependerá de tipo de tejido, del método de homogeneización
y del procedimiento de extracción y purificación de ácidos nucleicos. Por ejemplo, para tejidos animales,
cantidades entre 10 y 25 mg de tejido suelen bastar para obtener entre 10 y 40 kg de AD. En el caso de
tejidos vegetales suelen requerirse cantidades un poco mayores, entre 100 mg y 1 g, para obtener el
mismo rendimiento.
Homogeneización mecánica
La homogeneización mecánica consiste en someter al tejido a una acción trituradora o abrasiva para
desmenuzarlo. Según la manera de proceder puede ser automatizada o manual (con mortero).
Homogeneización mecánica automatizada
Se procede de la siguiente manera: Se añaden a los agentes abrasivos. Hay que tener en cuenta que el
proceso de rotura mecánica del tejido puede liberar proteasas y enzimas responsables de la degradación
de los componentes celulares. Por ello conviene realizar estos procesos en frío y de forma rápida, o bien
añadir inhibidores enzimáticos.
Homogenización mecánica manual con mortero
Es un método que minimiza el problema de la degradación en frío con nitrógeno líquido.
En algunos protocolos, la homogeneización mecánica se realiza directamente en un tampón de lisis,
simultaneándola con el primer paso del proceso de extracción.
Homogeneización química
La homogeneización química consiste en someter el tejido a la acción de proteasas y detergentes que
degradan los componentes tisulares, disgregando las células.
Se suele realizar para muestras pequeñas y cortes de tejido en congelación obtenidos con un criostato.
Si en la mezcla de incubación se añaden enzimas y detergentes que desestabilizan y rompen las
membranas celulares, se puede también simultanear la homogeneización del tejido con el primer paso
del proceso de extracción.
3.1.4. Tejidos fijados en formol e incluidos en parafina
El tejido fijado en formol e incluido en parafina o tejidos FFPE es un material muy útil para la realización
de estudios retrospectivos, aunque se debe tener en cuenta que la calidad de los ácidos nucleicos
recuperados suele ser peor que la de aquellos purificados a partir de tejidos frescos.
Esta pérdida de calidad tiene lugar porque durante el proceso de fijación con formol el ADN se fragmenta
y el ARN puede ser parcialmente degradado, dependiendo del tiempo que transcurra entre la obtención y
la fijación de la muestra. El pretratamiento que se requiere en los tejidos FFPE para la extracción de
ácidos nucleicos es la desparafinización.
La desparafinización consiste en la eliminación de la parafina en los tejidos FFPE.
Cultivos de bacterias y levaduras
El pretratamiento consiste en situar las bacterias y levaduras en un tampón de suspensión. Según el
medio en el que se encuentra el material de partida, se pueden dar dos situaciones:

• Cultivos en medio líquido:

o Se centrifuga directamente el tubo para eliminar el medio de cultivo sobrenadante.
o El sedimento se resuspende en el tampón de suspensión.
• Colonias aisladas sobre un medio sólido (placa de agar):
o Se recoge una colonia de la superficie de la placa con un asa de siembra estéril.
o Se resuspende la colonia en el tampón de suspensión.
Células de la mucosa oral
En el mercado se encuentran soluciones y kits comerciales para la recogida y conservación de este tipo
de células. Existen diversos sistemas de obtención:

• Mediante raspado de la mucosa oral con torunda o cepillo. En este caso la muestra tomada
directamente del raspado, la torunda o cepillo, se sumerge en una solución conservante, agitando
suavemente para que las células se desprendan.
• Mediante enjuague con una solución conservante que se recoge en un envase adecuado.
• Recolectando directamente saliva.
El pretratamiento de las muestras de células de la mucosa oral, antes de iniciar la extracción, consistirá
en centrifugar la suspensión celular y eliminar el sobrenadante.
Esputo
El esputo puede usarse como material de partida para detectar o confirmar la presencia de
microorganismos patógenos causantes de infecciones respiratorias.
El pretratamiento consiste en la fluidificación con un agente mucolítico de tipo de la N-acetil-L-cisteína
(NALC) en una disolución de citrato sódico. Si el microorganismo que se quiere detectar es una
micobacteria se puede añadir también hidróxido sódico para descontaminar (destrucción flora
acompañante) la muestra.
3.2. Extracción de ácidos nucleicos
Una vez realizado el pretratamiento de la muestra de partida dispondremos de la suspensión celular,
procariota o eucariota, a partir de la cual procederemos a la extracción de los ácidos nucleicos.
El proceso de extracción implica principalmente dos procesos: la lisis celular para liberar los ácidos
nucleicos y la inactivación de nucleasas celulares (ADNasas y ARNasas) para evitar la degradación de
los ácidos nucleicos. Ambos procesos, se consiguen mediante la incubación de la suspensión celular con
una solución de lisis.
Además, en células con pared celular (bacterias, levaduras, hongos y células vegetales) será necesario
aplicar algunas variaciones del tratamiento para vencer la dificultad de lisis que presentan.
El proceso de extracción consiste en la obtención de un lisado celular de aspecto homogéneo en el que
los ácidos nucleicos se encuentran libres de las estructuras celulares en las que se mantenían aislados.
La inactivación de nucleasas es muy importante para obtener una buena cantidad de ácidos nucleicos no
fragmentados. Esto es debido a que:

• La vida media del ARm en condiciones fisiológicas es muy corta, ya que es rápidamente
degradado por ARNasas citoplásmicas necesarias para evitar que la proteína que codifica se
sintetice permanentemente.
• Con la lisis celular, la liberación del ADN de las estructuras que lo contienen lo ponen en contacto
con ADNasas citoplásmicas.
3.2.1. La solución de lisis
La composición de la solución de lisis depende del tipo de célula que se va a lisar y puede incluir:

• Detergentes. Son Ios componentes principales de la solución de lisis. Su función es

desestructurar la bicapa lipídica de las membranas y desnaturalizar las proteínas que se insertan
en ella. Esta lisis celular libera el contenido citoplásmico y nuclear al medio de reacción., SDS +
EDTA
• EDTA. Es un quelante de cationes divalentes, como el calcio y el magnesio. El magnesio es un
cofactor de las ADNasas, necesario para su funcionamiento. En consecuencia, al atrapar los
cationes de magnesio que hay en el medio de reacción, el EDTA inhibe la actividad de las
ADNasas.
• Proteasas. A la solución de lisis se le pueden añadir proteasas, como la proteinasa K, que digieren
tanto las proteínas de la membrana celular como las citoplásmicas y eliminan las nucleasas. Su
empleo es especialmente útil en muestras de tejidos frescos y FFPE para simultanear la digestión
del tejido con la extracción de los ácidos nucleicos.
• Agentes caotrópicos. Otra solución eficaz para inactivar las nucleasas es añadir agentes
caotrópicos que desnaturalizan las macromoléculas impidiendo que realicen su actividad, como el
isotiocianato de guanidi-nio, un potente inactivador de las ARNasas, por lo que se recomienda su
uso siempre que queramos purificar ARN.
3.2.2. Tratamientos en células con pared celular
La presencia de pared celular en bacterias, levaduras, hongos y células vegetales dificulta la lisis celular.
Para degradar esta pared se hacen necesarios otros tratamientos como los tratamientos enzimáticos, los
tratamientos mecánicos o el bromuro de cetil-trimetil-amonio (CTAB).

• Tratamiento enzimático
• Tratamiento mecánico
• Tratamiento con CTAB
3.2.3. Verificación del resultado de la lisis
Finalizada la fase de extracción, deberemos comprobar que se haya conseguido una solución homogénea
que indique que el proceso de lisis celular ha sido eficiente.
Si la lisis celular no resulta suficiente, se deberá prolongar el protocolo hasta conseguir una completa
homogeneización de la muestra. Así, por ejemplo, si se observa presencia de grumos, cuerpos celulares,
etc., transcurrido el tiempo de incubación estándar del protocolo realizado se añadirá más solución de
lisis y reincubará la muestra, incluso a temperaturas elevadas (37-65 °C).
3.2.4. Consideraciones en la extracción del ADN
Cuando se quiere purificar exclusivamente ADN, porque el ARN puede interferir en los estudios
posteriores, una vez finalizada la lisis celular y antes de iniciar la purificación es necesario eliminar el ARN
presente en el lisado, Para ello:

• Se añade al medio de reacción ARNasa A.

• Se incuba a 37 °C durante 15-45 minutos.
Este paso no suele ser necesario en muestras de sangre periférica o médula ósea porque la
contaminación por ARN es mínima, pero sí es aconsejable en otro tipo de muestras como saliva, tejidos
y raspados celulares.
3.3. Purificación de los ácidos nucleicos
Una vez finalizada la lisis, los ácidos nucleicos se encuentran inmersos en un extracto celular complejo
junto con proteínas, sales minerales, componentes celulares solubles y los propios reactivos empleados
en la extracción.
El proceso de purificación consiste en separar los ácidos nucleicos de los demás componentes del
lisado.
A continuación abordaremos:

• Técnicas de purificación basadas en las características físico-químicas de los ácidos nucleicos:

purificación con solventes orgánicos, precipitación con sales (salting-out), cromatografía de
intercambio iónico, cromatografia de adsorción, purificación mediante esferas magnéticas y
ultrafiltración.
• Algunas técnicas para la purificación de plásmidos.
• Algunas consideraciones especiales que se requieren en la purificación del ARN.
3.3.1. Purificación con solventes orgánicos
La purificación con solventes orgánicos se basa en la distinta solubilidad de los compuestos que
integran el lisado celular en solventes orgánicos.
Se puede dividir en cuatro fases: eliminación de compuestos solubles en solventes orgánicos,
precipitación del ADN, lavado del ADN y resuspensión del ADN.
I. Eliminación de compuestos solubles en solventes orgánicos.
El protocolo más habitual de purificación de ADN genómico utiliza una combinación de fenol, cloroformo
y alcohol isoamílico, en proporciones 25:24:1. Se procede de la siguiente manera:
1. Se mezclan volúmenes iguales de lisado y reactivo y se agita vigorosamente con un vórtex. En
esta mezcla:
• El lisado proporciona una fase acuosa.
• El cloroformo disuelve los lípidos, y proporciona la fase orgánica a la mezcla.
• El fenol desnaturaliza y disuelve las proteínas presentes en el lisado y se integra en la fase
orgánica.
2. Se centrifuga. Mediante la centrifugación, la mezcla agitada se separa en dos fases: la acuosa, en
la parte superior del tubo, con los ácidos nucleicos, las sales y los componentes hidrosolubles del
lisado, y la orgánica en la parte inferior del tubo, con las proteínas y lípidos.
II. Precipitación del ADN
La fase acuosa se transfiere a un tubo limpio y el ADN se precipita añadiendo acetato sódico e isopropanol
o etanol al 100% frío.
El ADN es una molécula polianiónica, es decir, tiene una carga fuertemente negativa por los grupos fosfato
que se disponen en el exterior de la doble hélice. En un medio acuoso, esta carga neta negativa hace que
las moléculas de ADN se repelan entre sí y se rodeen de una capa hidratante de moléculas de agua que
las estabilizan. Por esta razón, el ADN es soluble en agua, a pesar del gran tamaño de sus moléculas.
(es soluble en H2O porque se rodea de moléculas de H2O).
Cuando se añade un alcohol (agente deshidratante) al medio acuoso se elimina la capa hidratante que
rodea las moléculas de ADN. La presencia en el medio de reacción de cationes de sodio (proporcionados
por el acetato sódico) neutraliza la carga negativa de los grupos fosfatos del ADN, Por esta razón, las
moléculas de ADN ya no se repelen entre sí y se unen unas a otras formando una maraña visible de finas
hebras blanquecinas.
Mediante centrifugación, el ADN precipitado sedimenta en el fondo del tubo y en el sobrenadante quedan
todos los contaminantes hidrosolubles que había en el lisado de partida.
III. Lavado del ADN
Una vez eliminado el sobrenadante el pellet de ADN se lava con etanol a 70-95% y se vuelve a centrifugar.
El ADN es insoluble en el etanol, permaneciendo en el sedimento, pero los restos de sales y posibles
contaminantes que hayan coprecipitado con el ADN son solubles en etanol, por lo que se eliminan con el
sobrenadante.
IV. Resuspensión del ADN
El etanol interfiere en casi todas las técnicas de biología molecular, por lo que antes de resuspender el
ADN hay que eliminarlo por completo. Los restos que quedan en las paredes del tubo se pueden eliminar
invirtiendo el tubo sobre un material absorbente, como el papel de filtro, y el pellet de ADN se deja secar
completamente a temperatura ambiente con el tubo abierto.
Una vez seco, se resuspende en la cantidad adecuada de agua destilada o en un tampón de baja fuerza
iónica a pH neutro o ligeramente alcalino, como un tampón Tris-EDTA (TE). La rehidratación del ADN es
un proceso lento. Se puede realizar una incubación inicial a 55-65 °C seguido de una intubación a
temperatura ambiente con agitación suave hasta la completa disolución del pellet o una incubación en
nevera a 4 °C hasta el día siguiente.
3.3.2. Precipitación con sales (salting-out)
La precipitación con sales se basa en la precipitación de proteínas en presencia de altas
concentraciones salinas.
3.3.3. Cromatografía de intercambio iónico (más utilizada en hospital, más rápida y reproducible que
las anteriores)
La cromatografía de intercambio iónico se basa en la unión electrostática reversible de iones en
solución a grupos funcionales cargados que están unidos covalentemente a una fase estacionaria.
Cuando los grupos funcionales de la fase estacionaria tienen carga neta positiva, se habla de
intercambiadores aniones, ya que van a unir reversiblemente los iones negativos (aniones) que se
encuentren en la solución.
Cuando los grupos funcionales de la fase estacionaria tienen carga neta negativa se habla de
intercambiadores catiónicos, puesto que van a unir los iones positivos (cationes) presentes en la solución.
Para purificación de ácidos nucleicos se usan matrices de sílice o celulosa (fase estacionaria)
empaquetadas en columnas de polipropileno. A la matriz se le une covalentemente un intercambiador
aniónico, ya que los ácidos nucleicos son polianiones lineales con fuerte carga negativa debido a los
grupos fosfato. Los dos grupos funcionales más utilizados son el metilaminoetanol (MAE) y el
dietilaminoetil (DEAE).
En el procedimiento de la cromatografía se pueden diferenciar tres pasos principales:

1. En un primer paso, la columna de cromatografía se carga con una dilución del lisado en un tampón
de baja salinidad y pH neutro. En estas condiciones, los ácidos nucleicos tienen una carga neta
negativa y se unen a los grupos funcionales del intercambiador, que tienen carga positiva Las
proteínas, los polisacáridos y otros contaminantes del lisado con carga positiva no se unen al
intercambiador y eluyen de la columna.
2. En un segundo paso, la columna se lava con tampones de concentración salina creciente, con lo
que se van eliminando contaminantes con débil carga negativa.
3. En un último paso, el ADN se eluye de la columna con un tampón de máxima salinidad y alto pH.
Para finalizar el proceso de purificación, los ácidos nucleicos se precipitan del eluido con isopropanol o
etanol para eliminar las sales del tampón de elución, se lavan con etanol y se resuspenden en agua
destilada o tampón TE. Estos tres pasos tienen lugar de la misma manera que en los métodos anteriores.
Este método permite purificar de manera individualizada distintos tipos de ácidos nucleicos, en virtud de
la distinta carga neta negativa de cada tipo de molécula. Jugando con la concentración salina de los
tampones de lavado se puede conseguir, por ejemplo, que eluyan el ARNm y los ARN ribosómicos de alto
peso molecular, mientras permanece unido en la columna el ADN.
3.3.4. Cromatografía de adsorción
La cromatografía de adsorción se basa en la capacidad de adsorción de los ácidos nucleicos al vidrio
y a la sílice en presencia de sales caotrópicas.
3.3.5. Purificación mediante esferas magnéticas
La purificación mediante esferas magnéticas se basa en la unión de los ácidos nucleicos a
microesferas magnéticas que pueden ser retenidas mediante un imán.
Las microesferas suelen estar constituidas por nanopartículas de magnetita encapsuladas en una matriz
inerte. La unión de los ácidos nucleicos a las partículas magnéticas puede realizarse por adsorción o por
afinidad.
3.3.8. Consideraciones especiales para la purificación de ARN
El ARN es muy sensible a la acción de la ARNasas y se degrada rápidamente por su acción,
Desgraciadamente, las ARNasas son enzimas muy resistentes que están presentes en todas las
superficies y materiales como consecuencia de la contaminación por bacterias, hongos y células de
descamación de la piel.
La esterilización del material por calor no las elimina, puesto que aunque al desnaturalizarse con las
temperaturas elevadas pierden su actividad, cuando disminuye la temperatura recuperan su conformación
nativa y recobran su actividad Además, no requieren cationes de magnesio como cofactor, por lo que la
presencia de EDTA tampoco las inactiva.
Por ello, la purificación de AR debe hacerse en las condiciones especiales.

• Se debe trabajar con guantes en cabina de flujo laminar para evitar contaminaciones
• Las superficies deben limpiarse con soluciones comerciales inactivadoras de ARNasas.
• Todo el material que se use (tubos Eppendorf, puntas de pipeta, etc) debe estar certificado
conforme se encuentra libre de ARNasas.
• La solución de lisis tiene que contener un agente caotrópico que inactivo ARNasas.
• Todos los reactivos empleados y el agua destilada deben estar libres de ARNasas.
3.3.9. Automatización del proceso de extracción/purificación
Varias metodologías de las descritas en los apartados anteriores se han automatizado y se han optimizado
con el diseño de robots automáticos de extracción y kits de reactivos específicos para las diferentes
muestra. Actualmente hay soluciones automatizadas prácticamente para cualquier laboratorio de biología
molecular, independientemente del volumen de muestras que se vaya a procesar (desde muestras
individuales hasta 96 muestras simultáneas) y del tipo de muestras: sangre, tejidos animales o vegetales,
tejidos FEPE, cultivos bacterianos, muestras forenses, etc. (Todo lo anterior se puede automatizar).
Una gran parte de los instrumentos automáticos se basan en:

• El uso de partículas magnéticas. Son equipos que utilizan cartuchos cerrados de reactivos con
un compartimento para cada paso de la técnica con el correspondiente reactivo especifico:
lisis/solución de lisis. lavado/solución de lavado, resuspension/solución de resuspensión. El paso
de las esferas magneticas de un compartimento a otro se realiza con émbolos metálicos que
portan un electroiman en el extremo y que funcionan también como agitadores.
• Cromatografía de adsorción en columnas con silica gel. Es una metodología que se adapta
muy bien a la automatización. Las columnas se cargan mediante pipeteo automático y el paso de
los reactivos por la columna se fuerza con sistemas de vacío o por centrifugación.
• Instrumentos modulares. Algunos fabricantes han optado por desarroIlar robots modulares que
se adaptan a distintas metodologías añadiendo brazos manipuladores y módulos específicos para
agitación, vacío, esferas magnéticas, centrifugación, etc.
3.4 Al terminar la purificación
3.4.1 Calidad de los ácidos nucleicos
Una buena calidad de los ácidos nucleicos purificados es sin duda clave para conseguir una adecuada
funcionalidad de estos. La calidad viene determinada por dos parámetros:
 • La integridad
• La pureza
Integridad de los ácidos nucleicos
Interesa saber si el ácido nucleico mantiene su tamaño original. La integridad es el parámetro que
determina si un ácido nucleico conserva su tamaño original.
La mejor manera de valorar la integridad es la electroforesis en gel de agarosa al 0,7-1,2 % (p/V).
• ADN genómico. En las muestras en las que el ADN haya mantenido su integridad, se obtendrá
una banda única de ADN perfectamente definida en la parte superior del gel. Si el ADN se
fragmenta o degrada, aparecerá una estela fluorescente o smear, cuya extensión e intensidad
dependerán del grado de degradación de la muestra.
• ADN plasmídico. Lo ideal es obtener una única banda en la electroforesis, correspondiente al
plásmido con su estructura nativa.
• ARN. Es normal que aparezca un ligero smear, debido al ARNm (con tamaños diferentes), con
dos bandas nítidas, correspondientes a los ARN 28S y 18S.
Pureza de los ácidos nucleicos
La pureza de un ácido nucleico es el parámetro que determina la ausencia de posibles contaminantes
(proteínas, polisacáridos, sales, reactivos usados en la extracción y purificación).
La medida del grado de pureza se basa en una de las propiedades de los ácidos nucleicos: su máxima
absorbancia a una longitud de onda de 260 m
Cociente A260/A280
Se utiliza para valorar la pureza es el cociente entre las absorbancias a 260 nm y 280 m (A260/A280) porque
los principales contaminantes de los ácidos nucleicos tienen un máximo de absorbancia a 280 m.
Por esta razón, las medidas se suelen realizar en muestras diluidas en agua destilada o tampón TE. Antes
de realizar las medidas, se ajusta el cero de absorbancia en el espectrofotómetro con el diluyente
empleado.
A mayor cociente, mayor pureza e inverso.
Cociente A260 A230
Este cociente no es tan específico, a 230 m se detecta la máxima absorbancia de contaminantes menores
como carbohidratos y sales. Y se usa un tampón de resuspensión con sales.
Absorbancia a 320 nm
La absorbancia a una longitud de onda de 320 nm mide la turbidez de la solución, es decir, la presencia
de partículas en suspensión.
3.4.2. Concentración de ácidos nucleicos
La cantidad de ácido nucleico usada en una reacción es un factor importante en la mayor parte de las
técnicas de biología molecular.
La concentración es la cantidad de ácido nucleico por unidad de volumen de solución final.
Para medir la concentración de una solución de ácidos nucleicos son dos: la absorbancia a 260 nm y la
fluorescencia.
Absorbancia a 260 nm
Se mide la absorbancia a 260 m en cubetas de 10 mm de paso óptico:
• Una unidad de absorbancia equivale a 50 ng/ul (o 50 g/ml) de ADNds (doble cadena)
• Una unidad de absorbancia equivale a 33 ng/ul (o 33 pg/ml) de ADNss (monocatenario)
• Una unidad de absorbancia equivale a 40 ng/l (o 40 g/ml) de ARN.
El factor de dilución hay que tenerlo en cuenta para calcular la concentración del ácido nucleico en la
solución original.
Además, si se requiere que el cálculo sea lo más exacto posible, hay que corregir el valor de absorbancia
a 260 m, restándole el valor de absorbancia a 320 nm.
Concentración de ácido nucleico = (A260 – A320) x factor dilución x factor conversión.
Método de fluorescencia
Se utiliza sobre todo con el fin de medir la concentración y se basa en el empleo de colorantes específicos
que emiten fluorescencia.
La técnica requiere la elaboración de una curva de calibración con cantidades de ADN conocidas. Se
hacen reaccionar con el colorante, y se mide la fluorescencia emitida. El valor de fluorescencia se intercala
en la curva de calibración para conocer la concentración de ADN.
Este método es el más indicado para cuantificar el ADN WARN que se van a utilizar en las técnicas de
secuenciación masiva
Conversión de unidades
La conversión entre ambas unidades se calcula:
ADNds, siendo N el número de pares de bases:
• De picomoles a microgramos: ug = pmol • N • 660 / 106
• De microgramos a picomoles: pmol = ug • 106 /N • 660
ADNss, siendo N el número de nucleótidos:
• De picomoles a microgramos: ug = pmol • N • 330 / 106
• De microgramos a picomoles: pmol = ug • 106 / N • 330
3.4.3. Funcionalidad de los ácidos nucleicos purificados
La calidad serán indicadores de buena funcionalidad.
La funcionalidad, a partir de la realización de una PCR o una RT-POR de control. Utiliza el ácido nucleico
purificado como molde que será indicativo de una buena funcionalidad de este.
3.4.4. Almacenamiento de los ácidos nucleicos purificados
Es muy habitual almacenar alícuotas de muestras de ácidos nucleicos purificados.
En cualquier caso, el sistema de almacenamiento debe cumplir con dos objetivos fundamentales respecto
de las muestras:
• Garantizar su integridad.
• Asegurar su completa trazabilidad
Condiciones para la integridad de las muestras
Hay que evitar o reducir al mínimo su degradación en el tiempo. Para esto:
• Se deben usar tubos tipo Eppendorf o criotubos con cierre hermético y libres de nucleasas
(ADNasas y ARNasas).
• Se almacenan en frío (de forma habitual):
o ADN, si se van a utilizar en 4-5 días se pueden almacenar en nevera a 4 °C. Para tiempos
mayores se requiere congelación a -20 °C o preferiblemente a -80 °C.
o ARN siempre en congelación, a -20 °C para tiempos cortos o a -80 °C para tiempos largos.
• Los congeladores utilizados para el almacenamiento conviene que tengan diversos sistemas de
seguridad:
o Sistema de alarma
o Sistema de seguridad de CO
o Sistema de monitorización
Trazabilidad de las muestras
Requiere un sistema de identificación adecuado de cada muestra. Hay varias opciones de complejidad
creciente:
• Rotulación directa de los tubos. Se deben usar tintas indelebles, resistentes a solventes orgánicos
y a bajas temperaturas
• Uso de etiquetas con codificación alfanumérica. Las etiquetas deben aguantar temperaturas de -
80 °C.
• Uso de etiquetas con código de barras (1D) o de puntos (2D), igualmente resistentes a bajas
temperaturas.