Tercera Unidad Dogma central, proliferación celular y apoptosis

REUNION DE
PRACTICA N° 12
- METABOLISMO DE LA HEMOGLOBINA --

INTRODUCCION:
La hemoglobina es una hemoproteína, tetramérica, con dos 2 subunidades alfa y 2 beta, cuya función es el transporte de
oxígeno. Se sintetiza en la médula ósea por una vía común a la síntesis de porfirinas, que termina con la adición del hierro por
la ferroquelatasa.

Los hematíes tienen una vida media de 120 días, al cabo de la cual son destruidos en el sistema retículo endotelial. La
hemoglobina es liberada y se separa la globina del HEM, éste es convertido en biliverdina y luego en bilirrubina. Este pigmento
insoluble en agua es transportado unido a la albúmina. La bilirrubina indirecta o no conjugada llega al hepatocito y se separa
de la albúmina, después de un proceso de captación y conjugación con dos moléculas de ácido glucurónico por la enzima
bilirrubina glucuronil transferasa, se convierte en una forma soluble, denominada bilirrubina directa o conjugada, que es
finalmente excretada con la bilis al intestino por un proceso de transporte activo; da color a las heces y ultrafiltra el glomérulo.

FINALIDAD:
 Realizar la medición sérica de hemoglobina empleando sangre total.
 Realizar la determinación sérica de bilirrubina total y directa.

MATERIAL Y EQUIPOS
 Material de vidrio: tubos de ensayo, pipetas milimétricas.
 Equipo de extracción de muestra: guantes, alcohol, algodón, agujas N° 20, jeringas x 5 cc.
 Equipos: centrífuga, micropipetas x 10 ul, baño maría, espectrofotómetro.

PROCEDIMIENTO 1: Determinación de Hemoglobina.

1) Introducción:
La hemoglobina es la molécula que transporta el oxígeno desde los pulmones a los tejidos y se encuentra en los hematíes,
formados en la médula ósea. Está formada por cuatro subunidades, en el adulto dos alfa y dos beta. Cada subunidad está
formada por una cadena de globina que tiene un núcleo heme con Fe++.
La disminución de la concentración de hemoglobina constituye la anemia. La OMS ha establecido como criterio de anemia <13
g/dl en varones, <12 g/dl en mujeres, <11 g/dl en gestantes. En niños está en función de la edad.
La anemia tiene diversas causas: menor formación por razones nutricionales (deficiencia de hierro, de vitamina B12, de ácido
fólico) o deficiencia de la médula ósea (aplasia), hemólisis por problemas del glóbulo rojo (hemoglobinopatías, esferocitosis,
etc.) o por presencia de anticuerpos (anemia hemolítica autoinmune, eritroblastosis fetal, etc.) o por hemorragia.

La disminución de la síntesis de hemoglobina, por diferentes causas, produce disminución de su concentración dando lugar a la
anemia por menor producción como en la anemia ferropénica, que también puede deberse a problemas en la maduración de los
glóbulos rojos como la deficiencia de ácido fólico. Pero la hemoglobina puede también disminuir por pérdida de sangre como en
las hemorragias o por hemólisis (anemias hemolíticas).

En este último grupo, una causa pueden ser las hemoglobinopatías por defecto en la síntesis de una de las cadenas
(talasemias) o de cambios en la estructura de una de las subunidades por mutaciones que cambian un aminoácido por otro
como en la hemoglobina S. En la hipoxia por altura por otro lado se produce aumento de su síntesis llevando a la policitemia,
que puede tener también otras causas como la Policitemia. En la práctica médica es por ello importante determinar la
concentración de la hemoglobina, que es sin duda uno de los exámenes más solicitados.

2) Fundamento de la Técnica:
El método en que se basa la prueba es el de la cianmetahemoglobina. Los eritrocitos son lisados por acción de un agente
tensioactivo presente en el reactivo, liberando su contenido de hemoglobina en la solución. La hemoglobina liberada es oxidada
a metahemoglobina por el ferricianuro, siendo esta última convertida en cianmetahemoglobina por la presencia de cianuro. La
absorbancia de la cianmetahemoglobina es medida a 540 nm, siendo la intensidad del color obtenida, directamente proporcional
a la concentración de hemoglobina en la muestra.

3) Muestra y Reactivos a emplear:

 Muestra: Sangre total obtenida utilizando anticoagulante.
 S. Estándar: Metahemoglobina disuelta en reactivo hemoglobina. (18 g/dl).
 Reactivo de Drabkin: Ferricianuro de potasio 0.6 mM, cianuro de potasio 0.7 mM, sterox-SE 1 ml/l.

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4) Procedimiento:
 Extracción de muestras: previa limpieza de la zona con alcohol, se extraerá 5 cc de sangre de la flexura del codo con jeringa
hipodérmica de 5 cc y aguja N° 20.
 Una vez obtenida la muestra, colocarla en un tubo de ensayo y dejarlas reposar durante 10 minutos.
 Para la determinación de hemoglobina: En 2 tubos de ensayo marcados con B (Blanco) y D (Desconocido), se debe colocar:
TUBOS DE ENSAYO
COMPONENTES
B D
Muestra (sangre total / ul) -- 10
Reactivo de Trabajo 2.5 2.5
Mezclar e incubar 3 minutos a temperatura ambiente (sobre 20° C), o 10
minutos si la temperatura ambiental es muy baja. Leer las absorbancias
en el espectrofotómetro a 540 nm, llevando a cero el equipo con el
blanco reactivo. El color obtenido es estable por lo menos 1 hora.
 Advertencias y Medidas de Precaución:
 Este reactivo contiene Cianuro, manipular con máxima precaución y en lo posible evitar utilizar la boca.
 No mezclar con ácidos.
 Eliminar residuos junto a grandes volúmenes de agua.

5) Resultados:
 Luego de la incubación de las muestras:

B D

 Lecturas en el espectrofotómetro:

6) Actividades a desarrollar por el alumno:

- Cálculos de resultados: Corregir las lecturas D y T restándoles el blanco (B).
 Cálculo del factor:
18 g /dl
F=
S
 Cálculo de la concentración de Hemoglobina.
Hemoglobina (g/dl) = (D-B) x F

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- Interpretación de los resultados.
 Valores Referenciales:
 Hombres = 14.0 a 18.0 g/dl.
 Mujeres = 12.0 a 16.0 g/dl.

- Explique bioquímicamente lo encontrado.

7) Preguntas de aplicación:
a) Identifique las variables que intervinieron en el experimento realizado en la práctica.
b) Identifique los componentes del sistema empleado en la práctica y señale sus principales características.
c) ¿Cuál es el tipo de anemia más frecuente? Sustente su respuesta con datos epidemiológicos y señale cuales son los
exámenes bioquímicos que se solicitan.
d) Indique algunas hemoglobinas anormales, señalando el cambio de aminoácido y la cadena en que se produce.
e) ¿Cómo se corrige el efecto de la altura sobre la concentración de hemoglobina?
f) Esquematice la síntesis de hemoglobina y señale los defectos enzimáticos y los tipos de porfiria.
g) Elabore un esquema y explique cómo se libera la hemoglobina del glóbulo rojo.

PROCEDIMIENTO 2: Determinación de Bilirrubina.

1) Introducción:
Producto del catabolismo de la hemoglobina (70 a 90%) y de otras hemoproteínas. Cada gramo de hemoglobina degradada
origina 35 mg de bilirrubina. La concentración sanguínea de bilirrubina total es de 1 mg/dl, siendo en su mayoría bilirrubina
indirecta, que no se excreta por orina. La hiperbilirrubinemia puede ser a predominio de la bilirrubina no conjugada como en las
anemias hemolíticas o en los defectos congénitos de conjugación, o de la bilirrubina conjugada en las hepatopatías, donde el
defecto limitante es la excreción, o en las enfermedades extrahepáticas obstructivas

La bilirrubina puede ser determinada en el laboratorio siendo: BILIRRUBINA INDIRECTA que es la recién formada. Requiere un
solvente para unirse al reactivo de van der Bergh. Se transporta unida a la albúmina, no se elimina por la orina. Captada por el
hepatocito a través de un sistema aún no bien dilucidado. En el citosol se une a algunas de las glutatión-5-transferasas. y al
conjugarse con dos ácidos glucurónico se convierte en directa. BILIRRUBINA DIRECTA O CONJUGADA: con una o dos
moléculas de ácido glucurónico por acción de la UDP-glucuronil transferasa formando respectivamente mono o diglucurónidos
de bilirrubina. Es excretada a través de la membrana plasmática de los canalículos, pasando a los propios conductos biliares a
través de un transporte que requiere ATP donde participa MRP2 o proteína ligada a la multidrogo resistencia-2. La bilirrubina
directa es eliminada por la bilis hacia el intestino donde es convertida en estercobilinógeno y luego a estercobilina dando el color
a las heces. La bilirrubina directa es soluble y si aumenta se elimina por la orina y la BILIRRUBINA TOTAL: que es la suma de
la bilirrubina directa e indirecta.

2) Fundamento de la Técnica:
La fundamentación del método empleado se basa en que la bilirrubina reacciona específicamente con el ácido sulfanílico
diazotado (reacción de Ehrlich) produciendo un pigmento de color rojo-violáceo (azobilirrubina) que se mide a 530 nm. Si bien la
bilirrubina conjugada (directa) reacciona directamente con el diazorreactivo, la bilirrubina no conjugada (indirecta) requiere la
presencia de un desarrollador acuoso (reactivo A) que posibilite su reacción. De forma tal que, para que reaccione la bilirrubina
total (conjugada y no conjugada) presente en la muestra, debe agregarse benzoato de cafeína al medio de reacción

3) Muestra y Reactivos a emplear:

 Muestra: suero sanguíneo.
 S. Estándar: solución de bilirrubina = 1 mg/l.
 A. Reactivo A: solución acuosa de benzoato de cafeína 0,13 mol/l, tamponada y estabilizada.
 B. Reactivo B: solución de ácido sulfanílico 29 mmol/l y ácido clorhídrico 0.17 mol/l.
 C. Reactivo C: solución de nitrito de sodio 0.07 mol/l.
 Diazorreactivo: de acuerdo al volumen de trabajo, mezclar 1 parte de Reactivo C con 21 partes de Reactivo B. Rotular y
fechar.

4) Procedimiento:
 Extracción de muestra: previa limpieza de la zona con alcohol, se extraerá 5 cc de sangre de la flexura del codo con jeringa
hipodérmica de 5 cc y aguja N° 20, de un paciente en ayunas.
 Una vez obtenida la muestra, colocarla en un tubo de ensayo y dejarlas reposar durante 10 minutos.
 Terminado el reposo, contrapesar los tubos conteniendo las muestras y centrifugarlos a 3000 RPM durante 10 minutos.
 Finalizado el centrifugado separar el suero para trabajar la determinación.
 Para la determinación de Bilirrubinas: En 3 tubos de ensayo marcados con B (Blanco), D (Directa) y T (Total), se debe
realizar lo siguiente:

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TUBOS DE ENSAYO
COMPONENTES
B D T
Muestra (Suero / ul) 100.0 100.0 100.0
Agua destilada (ml) 1.25 1.25 --
Reactivo A (ml) -- -- 1.25
Reactivo B (ul) 100.0 -- --
Diazorreactivo (ul) -- 100.0 100.0
Mezclar de inmediato cada tubo por inversión. Luego de 5 minutos, leer en
espectrofotómetro a 530 nm, llevando el aparato a cero con agua destilada. Las
lecturas pueden efectuarse entre 4 y 15 minutos, excepto para la bilirrubina directa
que debe leerse a los 5 minutos exactos. Si lee antes, habrá subvaloración de los
resultados por reacción incompleta. Si lee después, habrá sobrevaloración porque
comienza a reaccionar la bilirrubina libre.

5) Resultados:
 Luego de la preparación de las muestras:

B D

 Lecturas en el espectrofotómetro:

6) Actividades a desarrollar por el alumno:

- Cálculos de resultados: Corregir las lecturas D y T restándoles el blanco (B).
 Cálculo del factor:
1mg/l
F= El factor debe calcularse con bilirrubina estándar.
S
 Cálculo de la concentración de Bilirrubina.
Bilirrubina Total (mg/l) = (T- B) x F
Bilirrubina Directa (mg/l) = (D – B) x F
Bilirrubina Indirecta (mg/l) = B. Total – B. Directa.

- Interpretación de los resultados.

 Valores Referenciales: Adultos.
 Directa = hasta 2 mg/l.
 Total = hasta 10 mg/l.

- Explique bioquímicamente lo encontrado.

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7) Preguntas de aplicación:
a) Identifique las variables que intervinieron en el experimento realizado en la práctica.
b) Identifique los componentes del sistema enzimático empleado en la práctica y señale sus principales características.
c) ¿Por qué se denomina bilirrubina directa?
d) ¿Por qué se denomina bilirrubina indirecta?
e) ¿Cuál es el riesgo de aumento de bilirrubina no conjugada en el recién nacido?
f) Esquematice y explique el metabolismo de la bilirrubina.
g) Elabore un cuadro y clasifique la hiperbilirrubinemia colocando ejemplos de cada tipo.

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS.
1) Murray R. Harper Bioquímica Ilustrada. 31° edición, México 2019.
2) Nelson D, Cox M. Lehninger. Principios de Bioquímica. 6ta Edición, Editorial Omega, España, 2011
3) Huamán-Saavedra J. Laboratorio clínico. Procedimiento e interpretacion , 2 edición Edit. Universitaria . Trujillo, 2018